Orientador: Wilter Ricardo Russiano Vicente / Banca: Tânia Vasconcelos Cavalcante / Banca: José Wanderley Cattelan / Banca: Lia de Alencar Coelho / Banca: Cintia Lúcia Maniscalco / Resumo: O uso repetido da laparoscopia para aspiração folicular (LAF) associado ou não à estimulação hormonal foi avaliado. Para tanto foram utilizadas 40 fêmeas caprinas sem-raça-definida, divididas aleatoriamente em 4 grupos com 10 animais cada, sendo: Grupo 1 - adultas estimuladas com 80 mg de FSHp e 300 UI de eCG; Grupo 2 - adultas não estimuladas (controle); Grupo 3 - prépúberes estimuladas com metade das doses preconizadas para o G1 e Grupo 4 - pré-púberes não estimuladas. Cada fêmea foi submetida a seis sessões de colheita com intervalo de uma semana entre as intervenções. A estimulação hormonal foi feita em dose única, 36 horas antes do ato operatório. A técnica consistiu do uso de duas punções para a introdução do endoscópio e da pinça de manipulação atraumática. Após a visualização dos ovários, os folículos visíveis na sua superfície foram puncionados com auxílio de agulha de aspiração acoplada a um sistema de vácuo. Os oócitos encontrados foram classificados de acordo com a qualidade, submetidos à maturação in vitro por 27 horas, e posteriormente fixados e corados para avaliação do estádio de maturação. A técnica utilizada, embora tenha apresentado redução da qualidade dos oócitos, não interferiu na taxa de maturação ao longo das seis intervenções. A resposta ovariana diminuiu com o uso repetido da estimulação com FSH exógeno. Não houve comprometimento da condição corporal e da fertilidade dos animais. A avaliação das funções hepática e renal e da analgesia, indica que o protocolo anestésico utilizado é seguro e eficiente para este tipo de procedimento cirúrgico. Diante dos resultados obtidos pode-se concluir que a técnica de laparoscopia para aspiração folicular é adequada para a obtenção de oócitos de fêmeas caprinas pré-púberes e adultas. / Abstract: The repeated use of the laparoscopy to follicular aspiration (LFA) associated or not the hormonal stimulation was evaluated. Forty crossbred goat females were used, divided randomly in 4 groups with 10 animals each, being: Group 1 - adult stimulated with 80 mg of FSHp and 300 UI of eCG; Group 2 - adult not stimulated (control); Group 3 - pre-pubertal stimulated with half of the dose praised for the G1 and Group 4 - prepubertal not stimulated. Each female was submitted the six sessions of harvest with interval of one week between the interventions. The hormonal stimulation was made in only dose, 36 hours before the surgery. The technique consisted of the use of two punctions for the introduction of the endoscopy and the clamp atraumatic manipulation. After the visualization of the ovaries, the visible follicles in its surface were punched with aid of needle of aspiration connected to a vacuum system. The recovery oocytes were classified in accordance with the quality, submitted to in vitro maturation for 27 hours, and later fixed and stained for evaluation of maturation state. The used technique does not interfered in the maturation rate although oocytes quality has reduced. However the ovulatory response diminished with the repeated use of exogenous FSH stimulation. Damage was not observed in corporal condition nor fertility. The evaluation of the hepatic function, renal and pain analysis, showed that the anaesthetic protocol used is safe and efficient for this type of surgery. In conclusion, the technique of laparoscopy to follicular aspiration is adjusted for the attainment of oocytes in goat females adult and prepubertal. / Doutor

Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Development of bovine embryos produced by intracytoplasmic sperm injection (ICSI) is low compared to fertilized embryos. Deficient oocyte activation, inappropriate sperm capacitation, and lack of sperm decondensation are thought to be the main constrains affecting ICSI success in cattle. In the present study, activation compounds were tested to establish an effective protocol for activation of bovine oocytes, and then used for oocyte activation after ICSI. The activation approach consisted of exposing in vitro matured oocytes to Ionomycin (ION) following by a specific CDK1 inhibitor (RO-3306), a specific PKC activator (OAG) or both RO+OAG. In the first experiment, the rate of activation (pronuclear (PN) formation), cleavage, development to the blastocyst stage, and number of cells per blastocyst were evaluated after oocyte treatment. The PN rates were higher (P≤0.01) in the groups activated with ION+RO (48.5 %) and ION+RO+OAG (65.6 %) compared to ION (12.3 %) and ION+OAG (9.2 %). There was no significant effect between the RO concentrations tested (5, 7.5 and 10 μM) on oocyte activation. The PN rate was significantly higher (P≤0.01) when oocytes were exposed to RO for 240 min (84.6 %) compared to 60 (53.6 %) and 120 min (60.0 %). However, there was no difference between groups when treatment with RO started at 0, 30 or 60 min after on ION exposure. Cleavage rate was higher in ION+RO (70.2 %) and ION+RO+OAG (62.4 %) groups compared to ION (11.8 %) and ION+OAG (22.8 %). Blastocyst rate was also higher in the ION+RO+OAG (24.1 %) group, but not statistically different between ION+RO (19.7 %) and ION+OAG (9.5 %) groups. There was no development to the blastocyst stage after treatment with ION alone. The average cell number in blastocysts was not statistically different among treatments. In the second experiment, the effect of activation with ION+RO (10 μM for 240 min) was tested after ICSI using control (ICSI-Cont) or treated by electroporation (ICSI-El) sperm. Most oocytes presented a well-developed female PN (66.4%). Male PN formation was higher (P≤0.05) in the ICSI-El (33.3%) compared to the ICSI-Cont (9.4%) group. In conclusion, this study revealed that the specific inhibition of CDK1 after ION treatment is an effective approach to activate bovine oocytes. Male pronuclear formation after ICSI is increased by sperm electroporation, but is lower than female pronuclear formation. This indicates that deficient sperm decondensation and male PN formation rather than deficient oocyte activation is likely the main problem to develop an effective protocol for bovine ICSI. / O desenvolvimento de embriões bovinos produzidos por injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) é baixo em relação aos embriões fertilizados. Deficiência na ativação de oócitos, capacitação inadequada de espermatozóides e falta de descondensação de espermatozóides são os principais transtornos que afetam o sucesso de ICSI em bovinos. No presente trabalho, foram testados métodos de ativação com o intuito de estabelecer um protocolo efetivo para a ativação de oócitos bovinos após a ICSI. Para isso, um inibidor específico de CDK1 (RO-3306) e um ativador específico de PKC (OAG) foram utilizados após a incubação com Ionomicina (ION) para avaliar a retomada da meiose em oócitos bovinos. Além disso, a incubação em meio Fert durante 6 h e a eletroporação (El) de espermatozoides previamente a ICSI foram testadas para verificar o efeito sobre a descondensação do espermatozoide e formação do pró-núcleo (PN) masculino. Inicialmente oócitos bovinos foram incubados, com diferentes concentrações e períodos de exposição aos tratamentos. Foram avaliados conforme a taxa de ativação oocitária (formação de PN), clivagem, desenvolvimento a blastocisto e número de células nos embriões que se desenvolveram a blastocisto. As taxas de PN foram maiores (P≤0,01) nos grupos ativados com ION+RO (48,5 %) e ION+RO+OAG (65,6 %) comparado com ION (12,3 %) e ION+OAG (9,2 %). Não houve efeito significativo entre as concentrações 5,0, 7,5 e 10,0 μM de RO sobre a taxa de ativação. A taxa de ativação foi significativamente maior (P≤0,01) em oócitos tratados com RO por 240 min (84,6 %) comparado a 60 (53,6 %) e 120 min (60,0%). No entanto, não houve diferença significativa na taxa de ativação quando o tratamento com RO foi iniciado a 0, 30 ou 60 minutos após a incubação com ION. A taxa de clivagem foi inferior nos grupos ION (11,8 %) e ION+OAG (22,8 %) comparada aos grupos ION+RO (70,2 %) e ION+RO+OAG (62,4 %). A taxa de blastocistos também foi maior no grupo ION+RO+OAG (24,1 %), mas não houve diferença estatística entre os grupos ION+RO (19,7 %) e ION+OAG (9,5 %). Não houve desenvolvimento a blastocisto quando os oócitos foram tratados somente com ION. Não foi detectada diferença estatística entre os tratamentos sobre o número médio de células por blastocistos. No segundo experimento, espermatozoides não tratados (ICSI-Cont) ou tratados por electroporação (ICSI-El) foram microinjetados em oócitos, os quais foram ativados com ION+RO por 240 min e fixados cerca de 15 h após a injeção para determinar a taxa de formação de PNs masculino e feminino (2PN). A maioria dos oócitos apresentaram o PN feminino bem desenvolvido (66,4 %). A formação de 2PN (masculino e feminino) foi maior no grupo ICSI-El (33,3 %) comparado ao grupo ICSI-Cont (9,4 %). Em conclusão, esse estudo demonstrou que a inibição específica da CDK1 após o tratamento com ION promove a ativação de oócitos bovinos. O tratamento de espermatozoides com eletroporação melhora a formação do PN masculino após ICSI, mas a taxa é inferior a formação do PN feminino. Esses resultados indicam que a deficiente descondensação do espermatozoide é o principal limitante para estabelecer um protocolo eficaz para ICSI em bovinos.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-21Bitstream added on 2014-06-13T19:27:40Z : No. of bitstreams: 1 hainfellner_p_me_jabo.pdf: 1559702 bytes, checksum: 8fd03c9d0af341bc6a7cf1927ef7d4a9 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O desenvolvimento de técnicas para indução à reprodução de peixes migradores (espécies reofílicas) de água doce possibilitou uma produção consistente de larvas destas espécies, embora, seja comum deparar-se com relatos de produtores sobre fêmeas que não ovulam adequadamente ou simplesmente não ovulam após os procedimentos de desova induzida. Algumas evidências sugerem que a origem deste problema pode estar ligada ao manejo inapropriado das matrizes. Infelizmente pouco se sabe sobre o manejo correto de reprodutores de peixes reofílicos em cativeiro. Deste modo, a proposta deste estudo foi avaliar comparativamente o processo de desenvolvimento ovocitário de reprodutores de Prochilodus lineatus mantidos em dois sistemas de criação: viveiros escavados (VE) e tanques rede (TR), seguindo as densidades de 1 peixe.m2 e 17 peixes.m3 respectivamente. A escolha do TR se deu por ser um sistema que simula experimentalmente muitas das condições inapropriadas de manejo empregadas em diversas pisciculturas, tais como: elevadas densidades de estocagem e água de má qualidade. A cada dois meses foram feitas amostragens de 30 animais de cada tratamento, de onde 5 fêmeas foram escolhidas ao acaso e sacrificadas para remoção das gônadas, fígado e vísceras para determinação dos índices gonado (IGS), hepato e viscero-somático, fator K, e para as análises histomorfométricas dos ovários. Amostras de sangue foram coletadas para a determinação da variação anual dos níveis de esteróides gonadais (estradiol e 17-alfa-hidroxiprogesterona)... / The development of techniques of induced breeding of South American migratory fresh water fish (rheophilic species) has enabled a consistent production of fingerlings of these species, however nowadays it is very common to come across reports of fingerling producers about females that do not ovulate properly or just do not ovulate. In this context, some evidences suggest that the origin of such problem may be an inappropriate broodstock management. Unfortunately few is known about the proper management of migratory breeders in captivity, thus the main purpose of this study was to evaluate, comparatively, the process of oocyte production in Prochilodus lineatus breeders kept into two distinct production systems: earthen ponds (EP) and cages (C), with the following stocking densities 1fish.m2 and 17fish.m3 respectively. The reasons for the choice of C was because this system shares a number of inappropriate characteristics employed in diverse fish farms, such as high stocking densities and poor water quality. Every two months thirty specimens of one of the EP and C unities were randomly collected for biometric analysis. After that, five specimens of each treatment were randomly chosen to be sacrificed for removal of gonads, liver and viscera for determination of gonadosomatic index (GSI), hepato-and viscero-somatic indexes, K factor, and also for the histomorphometric analysis of the ovaries. Blood samples were also collected for determining the annual variation in plasma gonadal steroids levels (stradiol and 17 alpha-hydroxyprogesterone).The results showed that the process of ovarian maturation is completely compromised in females kept in C, with significant 30 reduction in the volume of vitellogenic oocytes, estradiol, hydroxyprogesterone, and consequently in the GSI values. Besides the reproductive period is shortened and starts late in relation to that of females of VE... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCV07MA024.pdf: 1167481 bytes, checksum: 8d46ea0fb9ff81da5a38a6f48e0ef3e1 (MD5) Previous issue date: 2007-06-15 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The aims of this work were to perform a breeding soundness evaluation in Devon bulls in the State of Santa Catarina, in Southern Brazil, and to propose alternatives to maximize beef cattle production capacity. The contents of this dissertation were divided in four chapters. Chapter one is a review on the breeding soundness evaluation of bulls, which includes clinical exam, semen collection and evaluation, and serving capacity. In Chapter two, the evaluation of the breeding soundness of 207 Devon bulls was used to determine approval rate, based on clinical and seminal evaluation and serving capacity, and potential causes for failure. The bulls approval mean rate was 71.6%. The mean scrotal circumference (CE), according to distinct age periods, was 35.2 ± 2.93 cm for bulls between 18 to 22 months of age; 37.3 ± 2.75 cm for 23 to 27 months, and 38.2 ± 3.6 cm for 30 months or above. In Chapter 3, the internal artificial vagina (IAV) methodology, designed by Dr. Albert Barth, was tested in Devon bulls, simultaneously evaluating their serving capacity and fertility. Out of 52 bulls tested, 60.0% were satisfactory. A semen sample was obtained with the aid of the IAV in 45 bulls (86.5%), from which, 69.0% were approved in the breeding soundness evaluation, and 31.0% were reproved. When the total umber of bulls (n=52) was considered, 60.0% were approved after semen collection and serving capacity using the IAV. The IAV was an effective alternative for semen collection, allowing the simultaneous evaluation of semen quality and serving capacity. The IAV procedures were proven very effective and important, as 11.1% of failed bulls would have been inadequately approved if only clinical and seminal exams were performed. Chapter 4 reports a study to evaluate OPU recovery and efficiency of vitrification in immature OPU or slaughterhouse oocytes, from Devon viii and Nelore cows. Devon OPU mean collection rate was of 4.6 oocytes/female, hich was significantly lower (p<0.05) than in Nelore cows (16.3 oocytes/female). After warming, in vitro maturation, fertilization and culture of vitrified oocytes, cleavage rates were 17.6% in the OPU/Devon group, 29.1% in OPU/Nelore, 22.8% in the slaughterhouse/Devon, and 14.5% in the slaughterhouse/Nelore group. No statistical difference was observed between groups (p>0.05). Only one embryo developed to the blastocyst stage in the OPU/Devon group. Nelore cows had a higher OPU recovery per session in comparison to Devon. We concluded that immature oocyte vitrification obtained by OPU, under field conditions, did not allow acceptable in vitro embryo developmental rates. In conclusion, this study demonstrated the feasibility oftechnical alternatives to improve bovine reproductive capacity, but such alternatives should be tested beforehand and properly adapted previously to the use under field conditions / O objetivo deste trabalho foi avaliar a capacidade reprodutiva de touros da raça Devon, criados em Santa Catarina, bem como propor alternativas para maximizar a capacidade produtiva de bovinos de corte. Os conteúdos foram agrupados em quatro capítulos. No Capítulo 1, procedeu-se a revisão bibliográfica do exame andrológico do touro, incluindo o exame clínico, a coleta do ejaculado, a avaliação seminal e a avaliação da capacidade de serviço. No Capítulo 2, foram avaliados dados obtidos de exames andrológicos de 207 touros da raça Devon, sendo determinado o percentual de animais aptos à reprodução, com base no exame clinico, exame seminal e comportamento sexual, bem como as potenciais causas de reprovação. A média de touros aprovados foi de 71,6%. A média de circunferência escrotal (CE) nas diferentes faixas etárias foram 35,2 ± 2,93 cm para animais de 18 a 22 meses, 37,3 ± 2,75 cm para animais de 23 a 27 meses e 38,2 ± 3,6 cm para animais com mais de 30 meses. No Capítulo 3, foi avaliada a metodologia da vagina artificial interna (VAI) proposta pelo Dr. Albert Barth, como forma de coleta do ejaculado e simultânea avaliação do comportamento e a fertilidade de touros da raça Devon. Dos 52 animais examinados, 60,0% foram considerados aptos. A VAI possibilitou a coleta do ejaculado de 45 animais (86,5%). Dos touros coletados com a VAI (n=45) 69% foram considerados aptos à reprodução e 31% inaptos. Quando se considerou o total de touros examinados (n=52), 60,0% dos touros foram aprovados após coleta de sêmen e avaliação da capacidade de cópula com a VAI. Concluiu-se que a VAI foi efetiva na coleta dos ejaculados, permitindo a avaliação simultânea da capacidade de serviço. A técnica mostrou-se importante, já que vi 11,1% dos animais reprovados no teste seriam inadequadamente considerados aptos à reprodução, se apenas os exames clínico e de qualidade seminal fossem empregados. O Capítulo 4 reporta um estudo para avaliar a taxa de recuperação e a eficiência da vitrificação de oócitos imaturos obtidos por OPU, ou de ovários de abatedouro, de fêmeas bovinas das raças Devon e Nelore. O número médio de oócitos por sessão de OPU foi de 4,6 na raça Devon, sendo inferior (p<0,05) aos 16,3 obtidos na raça Nelore. Após o reaquecimento, maturação, fecundação e cultivo dos oócitos vitrificados, foram observadas taxas de clivagem de 17,6% no grupo OPU / Devon, 29,1% no grupo OPU / Nelore, 22,8% no grupo ovários abatedouro / Devon e 14,5% no grupo ovários abatedouro / Nelore, não havendodiferença (p>0,05) entre os grupos. Na avaliação do desenvolvimento embrionário, apenas um embrião atingiu o estágio de blastocisto, no grupo OPU / Devon. As fêmeas da raça Nelore possibilitaram um número significativamente maior de oócitos recuperados por sessão quando comparadas com fêmeas da raça Devon. Concluise que a associação da técnica de OPU com vitrificação dos oócitos, em condições de campo, não produz taxas aceitáveis de desenvolvimento embrionário. O estudo demonstra que existem alternativas para melhorar a capacidade reprodutiva de bovinos que, todavia, devem ser previamente avaliadas e adequadas às condições existentes

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCV07MA024.pdf: 1167481 bytes, checksum: 8d46ea0fb9ff81da5a38a6f48e0ef3e1 (MD5) Previous issue date: 2007-06-14 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The aims of this work were to perform a breeding soundness evaluation in Devon bulls in the State of Santa Catarina, in Southern Brazil, and to propose alternatives to maximize beef cattle production capacity. The contents of this dissertation were divided in four chapters. Chapter one is a review on the breeding soundness evaluation of bulls, which includes clinical exam, semen collection and evaluation, and serving capacity. In Chapter two, the evaluation of the breeding soundness of 207 Devon bulls was used to determine approval rate, based on clinical and seminal evaluation and serving capacity, and potential causes for failure. The bulls approval mean rate was 71.6%. The mean scrotal circumference (CE), according to distinct age periods, was 35.2 ± 2.93 cm for bulls between 18 to 22 months of age; 37.3 ± 2.75 cm for 23 to 27 months, and 38.2 ± 3.6 cm for 30 months or above. In Chapter 3, the internal artificial vagina (IAV) methodology, designed by Dr. Albert Barth, was tested in Devon bulls, simultaneously evaluating their serving capacity and fertility. Out of 52 bulls tested, 60.0% were satisfactory. A semen sample was obtained with the aid of the IAV in 45 bulls (86.5%), from which, 69.0% were approved in the breeding soundness evaluation, and 31.0% were reproved. When the total number of bulls (n=52) was considered, 60.0% were approved after semen collection and serving capacity using the IAV. The IAV was an effective alternative for semen collection, allowing the simultaneous evaluation of semen quality and serving capacity. The IAV procedures were proven very effective and important, as 11.1% of failed bulls would have been inadequately approved if only clinical and seminal exams were performed. Chapter 4 reports a study to evaluate OPU recovery and efficiency of vitrification in immature OPU or slaughterhouse oocytes, from Devon viii and Nelore cows. Devon OPU mean collection rate was of 4.6 oocytes/female, which was significantly lower (p<0.05) than in Nelore cows (16.3 oocytes/female). After warming, in vitro maturation, fertilization and culture of vitrified oocytes, cleavage rates were 17.6% in the OPU/Devon group, 29.1% in OPU/Nelore, 22.8% in the slaughterhouse/Devon, and 14.5% in the slaughterhouse/Nelore group. No statistical difference was observed between groups (p>0.05). Only one embryo developed to the blastocyst stage in the OPU/Devon group. Nelore cows had a higher OPU recovery per session in comparison to Devon. We concluded that immature oocyte vitrification obtained by OPU, under field conditions, did not allow acceptable in vitro embryo developmental rates. In conclusion, this study demonstrated the feasibility of technical alternatives to improve bovine reproductive capacity, but such alternatives should be tested beforehand and properly adapted previously to the use under field conditions / O objetivo deste trabalho foi avaliar a capacidade reprodutiva de touros da raça Devon, criados em Santa Catarina, bem como propor alternativas para maximizar a capacidade produtiva de bovinos de corte. Os conteúdos foram agrupados em quatro capítulos. No Capítulo 1, procedeu-se a revisão bibliográfica do exame andrológico do touro, incluindo o exame clínico, a coleta do ejaculado, a avaliação seminal e a avaliação da capacidade de serviço. No Capítulo 2, foram avaliados dados obtidos de exames andrológicos de 207 touros da raça Devon, sendo determinado o percentual de animais aptos à reprodução, com base no exame clinico, exame seminal e comportamento sexual, bem como as potenciais causas de reprovação. A média de touros aprovados foi de 71,6%. A média de circunferência escrotal (CE) nas diferentes faixas etárias foram 35,2 ± 2,93 cm para animais de 18 a 22 meses, 37,3 ± 2,75 cm para animais de 23 a 27 meses e 38,2 ± 3,6 cm para animais com mais de 30 meses. No Capítulo 3, foi avaliada a metodologia da vagina artificial interna (VAI) proposta pelo Dr. Albert Barth, como forma de coleta do ejaculado e simultânea avaliação do comportamento e a fertilidade de touros da raça Devon. Dos 52 animais examinados, 60,0% foram considerados aptos. A VAI possibilitou a coleta do ejaculado de 45 animais (86,5%). Dos touros coletados com a VAI (n=45) 69% foram considerados aptos à reprodução e 31% inaptos. Quando se considerou o total de touros examinados (n=52), 60,0% dos touros foram aprovados após coleta de sêmen e avaliação da capacidade de cópula com a VAI. Concluiu-se que a VAI foi efetiva na coleta dos ejaculados, permitindo a avaliação simultânea da capacidade de serviço. A técnica mostrou-se importante, já que vi 11,1% dos animais reprovados no teste seriam inadequadamente considerados aptos à reprodução, se apenas os exames clínico e de qualidade seminal fossem empregados. O Capítulo 4 reporta um estudo para avaliar a taxa de recuperação e a eficiência da vitrificação de oócitos imaturos obtidos por OPU, ou de ovários de abatedouro, de fêmeas bovinas das raças Devon e Nelore. O número médio de oócitos por sessão de OPU foi de 4,6 na raça Devon, sendo inferior (p<0,05) aos 16,3 obtidos na raça Nelore. Após o reaquecimento, maturação, fecundação e cultivo dos oócitos vitrificados, foram observadas taxas de clivagem de 17,6% no grupo OPU / Devon, 29,1% no grupo OPU / Nelore, 22,8% no grupo ovários abatedouro / Devon e 14,5% no grupo ovários abatedouro / Nelore, não havendo diferença (p>0,05) entre os grupos. Na avaliação do desenvolvimento embrionário, apenas um embrião atingiu o estágio de blastocisto, no grupo OPU / Devon. As fêmeas da raça Nelore possibilitaram um número significativamente maior de oócitos recuperados por sessão quando comparadas com fêmeas da raça Devon. Concluise que a associação da técnica de OPU com vitrificação dos oócitos, em condições de campo, não produz taxas aceitáveis de desenvolvimento embrionário. O estudo demonstra que existem alternativas para melhorar a capacidade reprodutiva de bovinos que, todavia, devem ser previamente avaliadas e adequadas às condições existentes

Submitted by Giovana Barros Nunes (giovanabnunes@hotmail.com) on 2018-04-12T15:28:06Z No. of bitstreams: 1 GBN VERSÃO FINAL DISSERTAÇÃO P IMPRESSÃO.pdf: 1111649 bytes, checksum: f77c4c688d28fc8ca13182c8832085f8 (MD5) / Rejected by Alexandra Maria Donadon Lusser Segali null (alexmar@fcav.unesp.br), reason: Solicitamos que realize correções na submissão seguindo as orientações abaixo: No arquivo submetido ao repositório deve estar inserido o certificado de aprovação (documento obrigatório). A informação sobre a lombada não precisa conter no arquivo pdf inserido. Favor inserir o certificado de aprovação e submeter novamente a sua dissertação no repositório. Agradecemos a compreensão on 2018-04-13T11:25:20Z (GMT) / Submitted by Giovana Barros Nunes (giovanabnunes@hotmail.com) on 2018-04-13T14:08:12Z No. of bitstreams: 1 Dissertação GIOVANA BARROS NUNES VERSÃO DEFINITIVA Repositório.pdf: 1276204 bytes, checksum: 3aba64a51e863966cadeab46cfa01561 (MD5) / Approved for entry into archive by Alexandra Maria Donadon Lusser Segali null (alexmar@fcav.unesp.br) on 2018-04-13T17:17:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 nunes_gb_me_jabo.pdf: 1276204 bytes, checksum: 3aba64a51e863966cadeab46cfa01561 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-13T17:17:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 nunes_gb_me_jabo.pdf: 1276204 bytes, checksum: 3aba64a51e863966cadeab46cfa01561 (MD5) Previous issue date: 2018-02-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Este estudo foi desenvolvido com o objetivo de avaliar o efeito do precursor do peptídeo natriurético tipo C (NPPC) durante o cultivo de pré-maturação in vitro (pré-MIV) de oócitos bovinos sobre: 1) a progressão da maturação nuclear; 2) a expressão gênica das células do cumulus e 3) a aquisição da competência do oócito para o desenvolvimento embrionário in vitro. Os complexos cumulus-oócito (CCOs) foram pré-MIV com 100 nM NPPC por 8 horas (grupo NPPC) e, ao final do período, foram lavados para completa remoção do NPPC e submetidos à MIV por 22h. Após 8h de pré-MIV e após 8h de pré-MIV seguidas de 22h de MIV (duração total do cultivo = 30h) foram avaliadas a progressão da maturação nuclear e a expressão relativa de mRNA nas células do cumulus. O grupo controle (C) foi maturado na ausência de NPPC por até 30h, e as mesmas avaliações anteriores foram realizadas imediatamente após a remoção do ambiente folicular (C0), após 8h de cultivo (C8), após 22h de cultivo (C22) e após 30h de cultivo (C30). Em outro experimento, cujos tratamentos foram idênticos aos supramencionados, os oócitos foram fecundados ao término da MIV e foi avaliado o desenvolvimento embrionário até a fase de blastocistos. Após 8h de cultivo de pré-MIV, a análise da progressão da meiose demonstrou que o grupo C0 apresentou 58,9% de estruturas com configuração de GV1, enquanto que o grupo C8 apresentou apenas 13,9% de estruturas nesta configuração (P<0,05). A proporção de GV1 no grupo NPPC foi semelhante a ambos estes grupos (22,8%; P>0,05). Por outro lado, o grupo C8 apresentou maior taxa de GV3 em relação ao C0 (53,1% vs. 3,62%; P<0,05), sem diferenças com o grupo NPPC (38,7%; P>0,05). Ao final do cultivo de MIV, não foi observada diferença entre os grupos (C22 vs. NPPC vs. C30) com relação à maturação nuclear, todavia, houve maior taxa de oócitos degenerados no C30 em comparação com C22 (11,4% vs. 2,8%; P<0,05). A análise da expressão relativa de genes das células do cumulus após 8h de pré-MIV com NPPC evidenciou aumento (P<0,05) na expressão de genes relacionados à expansão destas células (GREM1, PTGS2/COX2, PTX3, TNFAIP6 e VCAN), à maturação oocitária (BDNF, EGFR, NOS3, PDE5A, PRKCD e STAT3) e ao desenvolvimento embrionário (IGF1R, KRT8 e LUM). Ao final do cultivo de MIV, observou-se no grupo NPPC que o gene PTX3, relacionado à expansão das células do cumulus, além dos genes AREG e BDNF, relacionados à maturação oocitária, e o gene LUM, relacionado ao desenvolvimento embrionário estavam mais expressos em comparação com o grupo C30 (P<0,05). Com relação ao desenvolvimento embrionário, os grupos experimentais não apresentaram diferença (P>0,05) quanto à taxa de clivagem (média de 73,22%). Embora o grupo NPPC não tenha diferido (P>0,05) de C22 e C30 quanto à taxa de blastocistos, houve diferença entre C22 e C30 (69,3 vs. 37,4; P<0,05). Todavia, não houve diferença entre os grupos com relação ao número de células totais (blastômeros) e apoptóticas (P>0,05). Em conclusão, o cultivo de pré-MIV de oócitos bovinos por 8h com 100nM NPPC não bloqueou a retomada da meiose, mas a progressão da meiose ocorreu de forma mais lenta e impediu o envelhecimento e degeneração dos oócitos. O cultivo de oócitos por tempo prolongado (30h) na ausência de NPPC foi prejudicial para o desenvolvimento embrionário, mas o tratamento com NPPC (8h pré-MIV+22h MIV = duração total de 30h) reverteu parcialmente este índice. / The aim of this study was to evaluate the effect of the C-type natriuretic peptide precursor (NPPC) during pre in vitro maturation culture (pre-IVM) of bovine oocytes on: 1) nuclear maturation progress; 2) gene expression in cumulus cells and 3) acquisition of competence for in vitro embryo development. Cumulus oocyte complexes (COCs) were pre-IVM with 100 nM NPPC for 8 hours (NPPC group) and then were washed for the complete removal of NPPC and submitted to IVM for 22h. After 8h pre-IVM followed by 22h IVM (total culture time = 30h) oocytes were evaluated for nuclear maturation progress and cumulus cells for relative mRNA expression. Control group (C) was IVM in the absence of NPPC for up to 30h and the same evaluations were made immediately after follicle removal (C0) and after 8h (C8), 22h (C22) and after 30h of culture (C30). In another experiment with the same treatment, the oocytes were fertilized at the end of IVM and embryo development to the blastocyst stage was evaluated. After 8 hours of pre-IVM culture, meiosis progression analysis showed 58.9% of oocytes in GV1 configuration in C0, while C8 had only 13.9% (P<0.05). The GV1 rates in NPPC did not differ from any group (22.8%; P>0.05). On the other hand, C8 showed higher rates of GV3 in comparison with C0 (53.1% vs. 3.62%; p<0.05) and no differences compared to NPPC (38.7%; P<0.05). At the end of IVM culture, no differences between groups (C22 vs. NPPC vs. C30) were observed in nuclear maturation, however, higher rates of degenerated oocytes were observed in C30 in comparison with C22 (11.4% vs. 2.8%; P<0.05). The relative gene expression analysis in cumulus cells after 8h pre-IVM with NPPC showed an up-regulation in genes related to cumulus cells expansion (GREM1, PTGS2/COX2, PTX3, TNFAIP6 and VCAN), oocyte maturation (BDNF, EGFR, NOS3, PDE5A, PRKCD e STAT3) and embryo development (IGF1R, KRT8 and LUM). At the end of IVM culture, the cumulus cells expansion related gene, PTX3, the oocyte maturation genes, AREG and BDNF, and the embryo development gene, LUM, were up-regulated in NPPC in comparison with C30 (p<0.05). Regarding embryo development, the cleavage rates did not differ in experimental groups (mean around 73,22%). Besides, blastocyst rates did not differ between NPPC (P>0.05) and the other groups, but there was a difference between C22 and C30 (69.3 vs. 37.4%; P<0.05). There was no difference between the groups in total cell number (blastomeres) and apoptotic cells (P<0.05). In conclusion, the pre-IVM culture of bovine oocytes for 8h with 100nM NPPC did not block meiosis resumption, but meiosis progression occurred more slowly and prevented aging and degeneration of the oocytes. The prolonged time of oocyte culture (30h) in the absence of NPPC was detrimental to embryo development, but NPPC treatment (8h pre-IVM + 22h IVM = total duration of 30h) partially reversed this effect.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-10Bitstream added on 2014-06-13T18:39:05Z : No. of bitstreams: 1 miguel_mcv_me_jabo.pdf: 1104174 bytes, checksum: b2be0e2d9f0acd211260bc64835b4e10 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O presente trabalho teve como objetivo avaliar, em novilhas da raça Nelore (n=84) mantidas em duas alturas de pasto (15 e 35 cm) e com suplementação isoproteica (26%PB) ou com dois níveis de proteína (24,7%PB e 13,1%PB) associada à gordura insaturada protegida, as concentrações plasmáticas de progesterona, do colesterol, da glicose, do peso e da qualidade do complexo cumulus oophorus. Os suplementos do experimento 1 foram isoproteicos e divididos em: SL1: Grupo controle suplementado com sal mineral; FA1: Grupo suplementado com alta relação PDR/NDT composto por polpa cítrica, farelo de algodão, Megalac-E®, minerais e uréia (26% PB e 81% NDT) e GT1: Grupo suplementado com baixa relação PDR/NDT composto por polpa cítrica, glutenose, Megalac-E®, minerais e uréia (26% PB e 81% NDT). Os suplementos do experimento 2 diferiram na porcentagem de PB divididos em: SL2: Grupo controle suplementado com sal mineral; FA2: Grupo suplementado com alta relação PDR/NDT composto por polpa cítrica, farelo de algodão, Megalac-E®, minerais e uréia (24,7% PB e 89,4% NDT) e GT2: Grupo suplementado com baixa relação PDR/NDT composto por polpa cítrica, glutenose, Megalac-E®, minerais e uréia (13,1% PB e 95% NDT). Para mensuração das concentrações de progesterona, glicose e colesterol foram realizadas coletas de sangue por venopunção da veia jugular no início do experimento e, posteriormente, a cada período de 28 dias juntamente com as pesagens (Dezembro a Maio). As análises plasmáticas de glicose foram determinadas pelo método God-Trinder, as análises séricas de colesterol pelo método Enzimático-Trinder e a concentração de progesterona plasmática foi determinada por RIA. As três mensurações foram realizadas utilizando kits comerciais. No momento do abate, os ovários das novilhas foram coletados, separados nos três... / This study aimed to evaluate in Nelore heifers (n=84) under two different grass heights (15 and 35cm) and supplemntes with isinitrogenous (26 % CP) or two protein leves (24,7 % CP and 13,1% CP) associated with unsaturated fat protected to assess plasma concentrations of progesterone, cholesterol, glucose, weight and quality of the cumulus oophorus complex. Supplements isonitrogenous of Experiment 1 were divided into SL1: control group supplemented with mineral salt; FA1: group supplemented with high for RDP / TDN composed of citrus pulp, cottonseed meal, Megalac-E®, minerals and urea (26 % CP and 81% TDN) and GT1: group supplemented with low ratio RDP / TDN composed of citrus pulp, corn gluten meal, Megalac-E®, minerals and urea (26% CP and 81% TDN). Supplements of Experiments 2 differed in the percentage of CP were divided into SL2: control group supplementes with mineral salt; FA2: group supplementes with high ratio for RDP/TDN composed of citrus pulp, cottonseed meal, Megalac -E® , minerals and urea (24,7% CP e 89,4% TND) and GT2: Group supplemented with low ratio RDP/TDN composed of citrus pulp, corn gluten meal, Megalac-E®, minerals and urea (13,1% CP e 95% TND). To measure the concentrations of progesterone, glucose and cholesterol blood was collected from the jugular vein at baseline each 28 days together the weights (December to May).The analysis of serum glucose were determined by God-Trinder method and analysis of cholesterol by the enzyme-Trinder method using the commercial kits. Plasma progesterone concentration was determined using a commercial kit for RIA. At the time of slaughter, the ovaries of heifers were collected, separated into three groups of supplementation, and transported to the laboratory in saline solution at 32-36ºC. The antral follicles with diameters between 3 and 8 mm were... (Complete abstract click electronic access below)

Resumo: O presente trabalho teve como objetivo avaliar, em novilhas da raça Nelore (n=84) mantidas em duas alturas de pasto (15 e 35 cm) e com suplementação isoproteica (26%PB) ou com dois níveis de proteína (24,7%PB e 13,1%PB) associada à gordura insaturada protegida, as concentrações plasmáticas de progesterona, do colesterol, da glicose, do peso e da qualidade do complexo cumulus oophorus. Os suplementos do experimento 1 foram isoproteicos e divididos em: SL1: Grupo controle suplementado com sal mineral; FA1: Grupo suplementado com alta relação PDR/NDT composto por polpa cítrica, farelo de algodão, Megalac-E®, minerais e uréia (26% PB e 81% NDT) e GT1: Grupo suplementado com baixa relação PDR/NDT composto por polpa cítrica, glutenose, Megalac-E®, minerais e uréia (26% PB e 81% NDT). Os suplementos do experimento 2 diferiram na porcentagem de PB divididos em: SL2: Grupo controle suplementado com sal mineral; FA2: Grupo suplementado com alta relação PDR/NDT composto por polpa cítrica, farelo de algodão, Megalac-E®, minerais e uréia (24,7% PB e 89,4% NDT) e GT2: Grupo suplementado com baixa relação PDR/NDT composto por polpa cítrica, glutenose, Megalac-E®, minerais e uréia (13,1% PB e 95% NDT). Para mensuração das concentrações de progesterona, glicose e colesterol foram realizadas coletas de sangue por venopunção da veia jugular no início do experimento e, posteriormente, a cada período de 28 dias juntamente com as pesagens (Dezembro a Maio). As análises plasmáticas de glicose foram determinadas pelo método God-Trinder, as análises séricas de colesterol pelo método Enzimático-Trinder e a concentração de progesterona plasmática foi determinada por RIA. As três mensurações foram realizadas utilizando kits comerciais. No momento do abate, os ovários das novilhas foram coletados, separados nos três... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: This study aimed to evaluate in Nelore heifers (n=84) under two different grass heights (15 and 35cm) and supplemntes with isinitrogenous (26 % CP) or two protein leves (24,7 % CP and 13,1% CP) associated with unsaturated fat protected to assess plasma concentrations of progesterone, cholesterol, glucose, weight and quality of the cumulus oophorus complex. Supplements isonitrogenous of Experiment 1 were divided into SL1: control group supplemented with mineral salt; FA1: group supplemented with high for RDP / TDN composed of citrus pulp, cottonseed meal, Megalac-E®, minerals and urea (26 % CP and 81% TDN) and GT1: group supplemented with low ratio RDP / TDN composed of citrus pulp, corn gluten meal, Megalac-E®, minerals and urea (26% CP and 81% TDN). Supplements of Experiments 2 differed in the percentage of CP were divided into SL2: control group supplementes with mineral salt; FA2: group supplementes with high ratio for RDP/TDN composed of citrus pulp, cottonseed meal, Megalac -E® , minerals and urea (24,7% CP e 89,4% TND) and GT2: Group supplemented with low ratio RDP/TDN composed of citrus pulp, corn gluten meal, Megalac-E®, minerals and urea (13,1% CP e 95% TND). To measure the concentrations of progesterone, glucose and cholesterol blood was collected from the jugular vein at baseline each 28 days together the weights (December to May).The analysis of serum glucose were determined by God-Trinder method and analysis of cholesterol by the enzyme-Trinder method using the commercial kits. Plasma progesterone concentration was determined using a commercial kit for RIA. At the time of slaughter, the ovaries of heifers were collected, separated into three groups of supplementation, and transported to the laboratory in saline solution at 32-36ºC. The antral follicles with diameters between 3 and 8 mm were... (Complete abstract click electronic access below) / Orientadora: Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima / Coorientador: Guilherme de Paula Nogueira / Coorientador: Ricardo Andrade Reis / Banca: Roberto Sartori Filho / Banca: Wilter Ricardo Russiano Vicente / Mestre

Orientador: Fernanda da Cruz Landim-Alvarenga / Coorientador: Anthony César de Souza Castilho / Banca: Mariana Fernandes Machado / Banca: Ester Siqueira Caixeta / Resumo: O fator de crescimento semelhante à insulina-1 recombinante-3 (IGF-LongR3), um análogo sintético do IGF-1 de maior biodisponibilidade, ainda não foi utilizado no meio de maturação in vitro (MIV) de complexos cumulus-oócito (CCOs). Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar e comparar os efeitos da adição de IGF-LongR3 e do fator de crescimento semelhante à insulina-1 (IGF-1) na MIV de CCOs bovinos, sobre a progressão meiótica, apoptose e expressão de genes nos oócitos (GDF9, BMP15, BAX, BCL2, OOSP1, IGFBP2, IGBFP4 e IGFBP5) e respectivas células do cumulus (AREG, EGFR, FSHR, COX2, BAX, BCL2, IGFBP2, IGFBP4 e IGFBP5). Ovários bovinos foram coletados em abatedouro, sendo selecionados 739 CCOs após aspiração de folículos de 2-8mm de diâmetro. A MIV foi realizada em meio base de maturação contendo IGF-1 (100ng/mL), IGF-LongR3 (100ng/mL), e dois grupos controles: 0,1% de álcool polivinílico (PVA) ou 10% de soro fetal bovino (SFB), durante 22-24 horas em estufa a 38,5ºC e 5% de CO2. Posteriormente os oócitos foram desnudados e preparados para a técnica de TUNEL, coloração Hoechst 33342 e RT-qPCR, intencionando-se avaliar a apoptose, maturação nuclear e a expressão gênica, respectivamente. A análise estatística foi realizada por um modelo linear de efeitos mistos, o qual relacionou a mudança de estádio de metáfase 1 para metáfase 2 e a ausência de apoptose entre os grupos experimentais, pelo programa lmer4. Os testes ANOVA e Tukey foram utilizados para análise dos resultados obtidos pelo RT-qPCR. Ao final de dez réplicas de MIV foram avaliados 339 (n= 5 réplicas) oócitos quanto à progressão meiótica e apoptose e 400 (n= 5 réplicas) quanto à expressão gênica. Não foi observada diferença significativa (P<0,05) entre os grupos experimentais com relação à progressão meiótica e apoptose. Foi possível detectar a expressão de mRNA para todos os genes avaliados nos oócitos e respectivas células... / Abstract: The insuline like growth factor-1 recombinant-3 (LongR3-IGF-1) a synthetic analogue of IGF-1 with greater bioavailability has not yet been used in in vitro maturation medium of cumulus-oocyte complexes (COCs). Therefore the aim of this study was to evaluate and compare the effects of LongR3-IGF-1 and insulin-like growth factor-1 (IGF-1) addition in the IVM of bovine oocytes on meiotic progression, apoptosis, and genic expression COCs (GDF9, BMP15, BAX, BCL2, OOSP1, IGFBP2, IGBFP4 e IGFBP5) and their respectively cumulus cells (AREG, EGFR, FSHR, COX2, BAX, BCL2, IGFBP2, IGFBP4 e IGFBP5). Bovine ovaries were collected in slaughterhouse being selected 739 oocytes after aspiration of follicles from 2-8mm diameter. In vitro maturation (IVM) was performed on basic maturation medium containing IGF-1 (100 ng/ml), LongR3-IGF-1 (100ng/ml), and two control groups: 0.1% polyvinyl alcohol (PVA) or 10% fetal bovine serum (FBS), for 22-24 hours in an incubator at 38.5°C and 5% CO2. Subsequently oocytes were denuded and prepared for TUNEL technique, staining Hoechst 33342 and RT-qPCR, intending to evaluate apoptosis, nuclear maturation and gene expression, respectively. Statistical analysis was performed using a linear mixed effects model, which correlated the change in metaphase stage 1 to 2 and the absence of apoptosis among the experimental groups. ANOVA and Tukey tests were used to analyze the results obtained by RTqPCR. After ten replicas of IVM, 339 oocytes (n=5 pools) were evaluated for meiotic progression and apoptosis and 400 (n=5 pools) for gene expression. There was no statistical difference (P>0,05) between the experimental groups with respect to meiotic progression and apoptosis. It was possible to detect mRNA expression of all evaluated genes in the oocyte and its cumulus cells in all experimental groups. There was statistical difference between the group 10% FBS and IGF-1 and LongR3-IGF-1 groups for the expression of gene IGFBP4 in ... / Mestre

Orientador: Joaquim Mansano Garcia / Banca: Flávio Vieira Meirelles / Banca: Claudia Lima Verde Leal / Banca: Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima / Banca: Gisele Zoccal Mingoti / Resumo: A maturação oocitária é marcada pela retomada da primeira divisão da meiose, com progressão do estádio de Vesícula Germinativa (GV) da Prófase I até a Metáfase II (MII), e inclui todos os eventos necessários para que o oócito expresse seu potencial máximo de desenvolvimento após a fecundação. Para avaliarmos a eficiência da maturação in vitro (MIV), utilizamos oócitos classificados em viáveis (graus I, II e III) e inviáveis (atrésico e desnudo), e acompanhamos a progressão nuclear e a distribuição dos grânulos corticais (GC) como indício de maturação citoplasmática, após MIV em TCM 199 com soro fetal bovino, hormônios, antibiótico e piruvato, por 24h em 5% de CO2 em ar. Maturação nuclear (78,4-87,8%) e citoplasmática (GC periféricos; 67,2-79,3%) foram semelhantes entre as diferentes classes de oócitos e apresentaramse como eventos independentes. Para o acompanhamento dos eventos desencadeados pelo espermatozóide, avaliamos a dinâmica nuclear e de microtúbulos, em intervalos de 2h, após fecundação in vitro (FIV), em meio TALP com heparina, PHE e sêmen preparado em gradiente de Percoll. Observamos que o estádio de MII foi predominante de 2 a 8h; MII e Anáfase/Telófase (A/T) predominaram às 10h; MII, A/T e estádio pronuclear (PN) de 14 a 16h; e PN a partir de 18h. A penetração do espermatozóide ocorreu após 4h da inseminação dos oócitos; a diferenciação dos PN 14 masculino e feminino pelo tamanho foi possível de 14 a 18h e a singamia ocorreu a partir de 24h. O período de 10h pode ser suficiente para que a FIV seja efetiva em oócitos bovinos, nas condições aqui descritas. / Abstract: We aimed to evaluate events involved in in vitro maturation, fertilization and development, and parthenogenetic activation of bovine oocytes assessed by nuclear-cytoplasmic interaction and gene expression. Oocyte morphological selection did not affect nuclear maturation (78.4-87.8%) and cytoplasmic cortical granule distribution (67.2-79.3%). Following nuclear and microtubular dynamics after fertilization (IVF), we observed sperm penetration 4h after insemination; male and female pronuclei differentiation by size from 14 to 18h; syngamy after 24h; and sufficient co-incubation of spermatozoa and oocytes for 10h. Pronuclear transfer to study the interaction between nucleus (N) and cytoplasm (C) in parthenogenetic embryos produced by ionomycin followed by strontium (S) or 6-DMAP (D) was assessed by cleavage, eight-cell, and blastocyst development rates: CSND (76.5, 36.4, and 6.8%) and CDNS (69.5, 25.0, and 4.9%). S cytoplasm promoted dominant effect on D nucleus. Higher rates of developmental arrest up to the eight-cell stage were observed by the combination of cytoplasm and nucleus produced by the two different activation treatments. We recovered parthenogenetic D fetuses on Day 35, which were small but normal in formation and in appearance of chorio-alantoic membranes. Genomic imprinting of IGF2 was observed, but XIST was maternally expressed in extra-embryonic tissues. In vitro culture promoted higher expression of IGF2 and H19 genes and also increased IGF2/IGF2r ratio in IVF embryos compared to in vivo produced ones. / Doutor