Les microsporidies sont des parasites intracellulaires obligatoires caractérisés par un mode d'infestation original, et pour certaines espèces, par un très fort degré de compaction du génome nucléaire. Des travaux portant sur les mécanismes de régulation transcriptionnelle chez Encephalitozoon cuniculi montrent qu'une organisation polycistronique des gènes est présente. Une maturation aléatoire des messagers conduit à la formation d'une population d'ARNm comprenant des ARNm monocistroniques et polycistroniques. Afin d'améliorer nos connaissances sur la structure des génomes microsporidiens et leur capacité d'adaptation, le sequençage du génome de Brachiola algerae a été initié : 30 bandes d'ADN chromosomiques ont pu être visualisées (taille du génome estimée à 23Mb). Les premières données de séquence ont révélées la présence de plusieurs classes d'éléments transposables ainsi que des gènes codant des enzymes impliquées dans le processus d'ARN interférence

Streptococcus agalactiae, appelé aussi Group B Streptococcus (GBS), est une bactérie commensale du tractus digestif et génital de diverses espèces animales dont l’espèce humaine. Elle représente la première cause d’infections néonatales et est aussi un pathogène émergent chez l’adulte immunodéprimé. L’objectif de ma thèse est la caractérisation fonctionnelle et mécanistique des ARNrég. J’ai étudié plus particulièrement l’ARNrég CetR (pour «cell-envelope-targeting RNA»). Il module la résistance au peptide antimicrobiens (PAM) et la virulence à travers la régulation post-transcriptionnelle de l’ARNm dltD codant une protéine de biosynthèse de l'acide D-alanyl-lipotéichoïque. La délétion de cetR induit des changements dans la morphologie cellulaire, une diminution de la formation du biofilm et de la résistance aux PAM. Une zone d’interaction, CetRdltD, de 27 nucléotides a été prédite in silico. Des mutations compensatoires chez GBS montrent que CetR interagit directement avec l’ARNm dltD et que la perturbation de la zone d’appariement est suffisante pour observer les phénotypes associés à CetR. La quantification des niveaux d’ARNm et de la protéine DltD nous a permis de montrer que CetR active la traduction de dltD et que la perturbation du duplex CetR-dltD induit une diminution spectaculaire de la protéine DltD. De plus, en utilisant un modèle murin d’infection et en quantifiant la survie des bactéries dans les macrophages, nous avons montré que CetR et DltD sont cruciaux pour la virulence de GBS. Enfin, une approche protéomique globale nous a permis de montrer que CetR joue un rôle important dans l’expression des protéines dites « moonlighting » et de certains facteurs de virulence potentiels. Cet ARNrég peut jouer un rôle important dans la capacité de S. agalactiae à s'établir dans son biotope et à exprimer ses facteurs de virulence. Enfin, les résultats de ces recherches sont des prérequis au développement de stratégies permettant de réduire le risque des infections néonatales dues à S. agalactiae. / The opportunistic pathogen group B Streptococcus (GBS) is the leading cause of neonatal infections. The aim of this work is the characterization of a 680 nt-long regulatory RNA, CetR (cell-envelope-targeting RNA). It modulates antimicrobial peptides (AMPs) resistance and virulence through posttranscriptional regulation of dltD mRNA which encodes a D-alanyl-lipoteichoic acid biosynthesis protein. Deletion of cetR leads to cell morphology changes, reduced biofilm formation and AMPs resistance. A 27 nt-long CetR-dltD interacting region is predicted in silico. Compensatory base pair exchanges in GBS demonstrate that CetR interacts directly with dltD mRNA and that disruption of this RNA pairing is sufficient to observe the CetR-associated phenotypes. By quantifying both mRNA and protein, we demonstrate that CetR enhances dltD translation and disruption of the CetR/dltD mRNA interaction results in a dramatic decrease in DltD protein. Moreover, using an infection murine model and quantifying bacterial survival in macrophages, we observe that both CetR and DltD are crucial for GBS virulence. Finally, we highlight CetR pleiotropic role in the expression of several moonlighting proteins and potential virulence factors. This regulatory RNA may play an important role in the ability of GBS to settle in its biotope and express its virulence factors.

Notre travail montre la prédominance du clone « Lyon » parmi les souches de Staphylococcus aureus responsables d’infections invasives (i.e. bactériémies). Il est caractérisé par la présence du gène codant la «staphylococcal enterotoxin » (SE) A. Afin de mieux comprendre le lien éventuel entre la prédominance de la SEA et la gravité des infections induites, nous avons orienté nos travaux sur le versant immuno‐inflammatoire des SE. L’étude des répertoires Vβ induits par l’ensemble des SE s’est révélée peu discriminante. A l’aide d’approches génomiques et protéiques réalisées sur des lymphocytes et monocytes humains, nous avons observé le puissant potentiel inflammatoire de la SEA en particulier par rapport à la SEG (SE appartenant à l’opéron egc retrouvé dans les infections de faible sévérité) et la prédominance de la réponse lymphocytaire T. Enfin, afin de mieux comprendre la spécificité des effets observés, nous avons conduit des expériences sur lymphocytes purifiés en ciblant les Ly T effecteurs (CD4+CD25‐) et Ly T régulateurs (CD4+CD25+FOXP3+). Nos travaux ont confirmé l’induction par la SEA d’une forte réponse inflammatoire, associant une synthèse de cytokines de type Th1 et Th17 dans les deux lignées lymphocytaires. De plus, nos résultats suggèrent que les SE provoquent une perte des fonctions suppressives des Ly T régulateurs ouvrant de nouvelles perspectives quant à l’implication des SAgs dans de nombreuses situations cliniques en particulier le choc septique, et les infections chroniques / Our work shows the prevalence of the “Lyon” clone among Staphylococcus aureus strains responsible for severe systemic infections (i.e. bacteremia). This clone is characterized by the presence of the staphylococcal enterotoxin (SE) A coding gene. To better understand the possible link between the prevalence of SEA and the severity of infections, we focused our work on the immuno inflammatory responses of SE. By using genomic and protein studies, in human lymphocytes and monocytes, we observed the potent inflammatory property of SEA (especially in comparison with SEG ‐ belonging to the egc cluster mainly found in less severe infections) mainly targeting T cell response over monocytes. Finally, to better understand the specificity of these effects, we performed experiments on purified lymphocytes and targeted effectors (CD4+CD25‐) and regulatory T lymphocytes (CD4+CD25+FOXP3+). Our works confirmed the induction by SEA of a strong inflammatory response, characterized by the release of Th1 and Th17 cytokines in both lymphocyte lineages. Furthermore, our results also showed the loss of the regulatory T cell suppressive functions after SE stimulation. Collectively, these results offer new perspectives for the implication of the SAgs in numerous clinical situations in particular toxic shock and the chronic infections.

Cette thèse s'inscrit dans le cadre de l'analyse structurelle des réseaux biologiques. Nous proposons une nouvelle définition de motif dans le contexte des réseaux métaboliques. Un réseau métabolique est modélisé par un graphe coloré et un motif est défini comme un multiensemble de couleurs (une couleur correspond ici `a un mécanisme réactionnel). Une occurrence d'un motif est définie comme un ensemble de noeuds connectés et colorés par les couleurs du motif. Nous proposons des algorithmes pour rechercher et inférer de tels motifs, ainsi qu'un critère statistique permettant de décider si un motif est sur-représenté. L'application de nos méthodes au métabolisme d'Escherichia coli révèle des structures locales répétées. Nous argumentons que ces structures peuvent être interprétées comme des blocs fontionnels et/ou évolutifs du métabolisme.

Le modèle Aevol est un modèle d'évolution expérimentale in silico développé par Carole Knibbe et Guillaume Beslon pour étudier l'évolution de la structure des génomes. Aevol a permis d'identifier une très forte pression de sélection indirecte vers un certain niveau de variabilité mutationnelle du phénotype : la survie à long terme d'une lignée étant conditionnée à sa capacité à produire des mutations avantageuses sans pour autant produire trop de mutations délétères, un certain compromis entre robustesse et évolvabilité est indirectement sélectionné. Une conséquence de cette pression de sélection indirecte est le rôle central joué par le taux spontané de réarrangements chromosomiques dans la détermination de la structure du génome. Dans ce travail, nous avons modifié le modèle Aevol pour introduire d'une part un processus explicite de régulation de l'expression des gènes et d'autre part, une sensibilité aux similarités entre séquences dans les événements de recombinaison de l'ADN. Nous avons ainsi pu étudier l'effet de ces variations sur la sélection de second-ordre. Nous avons en particulier observé que celle-ci est extrêmement robuste aux choix de modélisation : les effets liés aux réarrangements sont en effet observés de la même façon lorsque les organismes possèdent un réseau de régulation (qui plus est, ces effets sont visibles sur le réseau lui-même), lorsque les réarrangements se produisent préférentiellement entre séquences similaires et lorsque les transferts horizontaux sont possibles. De plus, les effets de cette pression de sélection de second-ordre ne sont pas limités au niveau génomique : de forts taux de réarrangements tendent à donner lieu à des génomes présentant beaucoup d'opérons, très peu d'ARNs non-codants et des réseaux de régulation très simples. Au contraire, chez les organismes ayant évolué avec de faibles taux de réarrangement, la plupart des gènes sont transcrits sur des ARNs monocistroniques. Ces organismes possèdent un grand nombre d'ARNs non-codants et présentent des réseaux de régulation très complexes. Ces effets observés dans le modèle à différents niveaux d'organisation peuvent s'apparenter à de nombreuses caractéristiques observées chez les organismes réels. Ainsi les pressions sélectives indirectes observées grâce au model Aevol permettent de reproduire un large spectre de propriétés biologiques connues en ne modifiant que le seul taux de réarrangements dans le modèle. Ces mécanismes de sélection indirecte apparaissent donc comme de bons candidats pour expliquer ces mêmes observations sur les organismes réels.

Le modèle Aevol est un modèle d'évolution expérimentale in silico développé par Carole Knibbe et Guillaume Beslon pour étudier l'évolution de la structure des génomes. Aevol a permis d'identifier une très forte pression de sélection indirecte vers un certain niveau de variabilité mutationnelle du phénotype : la survie à long terme d'une lignée étant conditionnée à sa capacité à produire des mutations avantageuses sans pour autant produire trop de mutations délétères, un certain compromis entre robustesse et évolvabilité est indirectement sélectionné. Une conséquence de cette pression de sélection indirecte est le rôle central joué par le taux spontané de réarrangements chromosomiques dans la détermination de la structure du génome. Dans ce travail, nous avons modifié le modèle Aevol pour introduire d'une part un processus explicite de régulation de l'expression des gènes et d'autre part, une sensibilité aux similarités entre séquences dans les événements de recombinaison de l'ADN. Nous avons ainsi pu étudier l'effet de ces variations sur la sélection de second-ordre. Nous avons en particulier observé que celle-ci est extrêmement robuste aux choix de modélisation : les effets liés aux réarrangements sont en effet observés de la même façon lorsque les organismes possèdent un réseau de régulation (qui plus est, ces effets sont visibles sur le réseau lui-même), lorsque les réarrangements se produisent préférentiellement entre séquences similaires et lorsque les transferts horizontaux sont possibles. De plus, les effets de cette pression de sélection de second-ordre ne sont pas limités au niveau génomique : de forts taux de réarrangements tendent à donner lieu à des génomes présentant beaucoup d'opérons, très peu d'ARNs non-codants et des réseaux de régulation très simples. Au contraire, chez les organismes ayant évolué avec de faibles taux de réarrangement, la plupart des gènes sont transcrits sur des ARNs monocistroniques. Ces organismes possèdent un grand nombre d'ARNs non-codants et présentent des réseaux de régulation très complexes. Ces effets observés dans le modèle à différents niveaux d'organisation peuvent s'apparenter à de nombreuses caractéristiques observées chez les organismes réels. Ainsi les pressions sélectives indirectes observées grâce au model Aevol permettent de reproduire un large spectre de propriétés biologiques connues en ne modifiant que le seul taux de réarrangements dans le modèle. Ces mécanismes de sélection indirecte apparaissent donc comme de bons candidats pour expliquer ces mêmes observations sur les organismes réels. / The Aevol model is an in silico experimental evolution model that was specifically developped by Carole Knibbe to study the evolution of the structure of the genome. Using Aevol, a very strong second-order selective pressure towards a specific level of mutational variability of the phenotype was revealed: it was shown that since the survival of a lineage on the long term is conditionned to its ability to produce beneficial mutations while not loosing those previously found, a specific trade-off between robustness and evolvability is indirectly selected. A consequence of this indirect selective pressure is the central role played by the spontaneous rate of chromosomal rearrangements in determining the structure of the genome. More specifically, it was shown that because some rearrangements (large duplications and large deletions) have an impact not only arround their breakpoints but on the whole sequence between them, non-coding sequences are actually mutagenic for the coding sequences they surround. The consequence is a clear trend for organisms having evolved under high rearrangement rates to have very short genomes with hardly any non-coding sequences while organisms evolving in the context of low rearrangement rates have huge, mostly non-coding genomes. Here, we modified the Aevol model to introduce an explicit regulation of gene expression as well as a sensitivity to sequence similarity in DNA recombination events. We observed that the effects of the second-order pressure mentioned above are very robust to modelling choices: they are similarly observed when gene regulation is made available, when rearrangements occur preferentially between similar sequences and even when a biologically plausible process of horizontal transfer is allowed. Moreover, the effects of this second-order selective pressure are not limited to the genomic level: high rearrangement rates usually lead to genomes that have many polycistronic RNAs, almost no non-coding RNAs and very simple regulation networks. On the contrary, at low rearrangement rates organisms have most of their genes transcribed on monocistronic RNAs, they own a huge number of coding RNAs and present very complex and intricate regulation networks. These astounding effects at different levels of organization can account for many features found on real organisms. Thus, the indirect selective pressure that was identified thanks to the Aevol model allows to reproduce a large panel of known biological properties by changing the sole spontaneous rearrangement rate, making this pressure a good candidate for explaining these observations on real organisms.

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