Einen Aspekt dieser Arbeit stellt die Analyse der Stimulation von Ratten-Calvaria-Osteoblasten (RCA) mit den beiden Wachstumsfaktoren TGF-b1 und BMP-4 während der Proliferations- sowie Differenzierungs- und Mineralisierungsphase dar. Hierfür soll die Phosphorylierung und Aktivierung von Erk1 und Erk2, sowie von Smad1 und Smad2 mit Hilfe eines Kinase-Aktivitätsassays sowie der Westernblot-Analyse untersucht werden. Im Rahmen dieser Arbeit soll weiterhin untersucht werden, welche Bedeutung die Wachstumsfaktoren TGF-b1 und BMP-4 auf die Aktivität der alkalischen Phosphatase (ALP), einem wichtigen Differenzierungsmarker in Osteoblasten, ausüben. Enzymatische Aktivitätsbestimmungen und zytochemische Färbung aktiver ALP sollen darüber Aufschluss geben. Weiterhin soll der Gehalt an ALP-mRNA durch PCR bestimmt werden. Ein weiteres wichtiges Ziel dieser Arbeit ist die Analyse der Bedeutung von Erk1, Erk2, Smad1 und Smad2 auf die Aktivität der ALP. Dafür sollen Inhibitoren eingesetzt werden. Die enzymatische Aktivitätsbestimmung soll darüber aufklären. Außerdem soll mit Hilfe von kurzen, doppelsträngigen RNA-Molekülen (siRNA) ein knock down der Kinasen herbeigeführt werden und dessen Auswirkung auf die Aktivität der ALP enzymatisch bestimmt werden. Dafür muss zunächst die Wirksamkeit der siRNA auf RNA-Ebene mittels PCR und auf Proteinebene mittels Westernblot-Analysen überprüft werden. Zusätzlich soll die Bedeutung der Wachstumsfaktoren und der Kinasen Erk1 und Erk2 auf die Mineralisierung der RCA analysiert werden. Dafür wird die Menge des zellassoziierten Kalziums und Phosphats experimentell bestimmt, wodurch der Mineralisationsgrad der Zellen wiedergegeben werden kann.

Despite the continued development of specialized immunosuppressive therapies in the form of monoclonal antibodies, glucocorticoids remain a mainstay in the treatment of rheumatological and auto-inflammatory disorders. Therapeutic glucocorticoids are unmatched in the breadth of their immunosuppressive properties and deliver their anti-inflammatory effects at unparalleled speed. However, long-term exposure to therapeutic doses of glucocorticoids decreases bone mass and increases the risk of fractures – particularly in the spine – thus limiting their clinical use. Due to the abundant expression of glucocorticoid receptors across all skeletal cell populations and their respective progenitors, therapeutic glucocorticoids affect skeletal quality through a plethora of cellular targets and molecular mechanisms. However, recent evidence from rodent studies, supported by clinical data, highlights the considerable role of cells of the osteoblast lineage in the pathogenesis of glucocorticoid-induced osteoporosis: it is now appreciated that cells of the osteoblast lineage are key targets of therapeutic glucocorticoids and have an outsized role in mediating their undesirable skeletal effects. As part of this article, we review the molecular mechanisms underpinning the detrimental effects of supraphysiological levels of glucocorticoids on cells of the osteoblast lineage including osteocytes and highlight the clinical implications of recent discoveries in the field.

Im Verlauf der Knochenbildung und Frakturheilung kommt es zu einem Zusammenwirken verschiedener Zell- und Gewebearten. Die beteiligten Zellen unterliegen dabei der Regulation von Wachstumsfaktoren (WF), Zytokinen und Hormonen, die den regelhaften Ablauf kontrollieren und steuernd in Proliferation und Differenzierung von Zellen und deren Matrixsynthese eingreifen. Neben einer optimalen Osteosynthese zur Frakturstabilisation stellt die biologische Beeinflussung der Knochenheilung ein großes Forschungsfeld dar. In Vorarbeiten wurde ein Applikationssystem entwickelt, das mittels einer biodegradierbaren Polymerbeschichtung auf Osteosynthesematerialien die lokale Applikation von WF in biologisch aktiver Form ermöglicht. In vivo wurde an Ratten- und Schweinemodellen erfolgreich die Stimulation der Knochenheilung durch lokal applizierte Wachstumsfaktoren IGF-I, TGF-ß1 und BMP-2 gezeigt. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung zellulärer Prozesse während der beeinflussten und unbeeinflussten Knochenheilung sowie des Effektes der lokalen Applikation von Wachstumsfaktoren von beschichteten Osteosyntheseplatten. Anhand histologischer und immunhistochemischer Untersuchungen, der in situ Hybridisierung an Knochenschnitten und der ELISA-Methode konnte ein früherer Reifungsbeginn des Kallus durch die Wachstumsfaktorenapplikation gezeigt werden, ohne dass es zu Veränderungen der physiologischen Gewebszusammensetzung und der endogenen Wachstumsfaktoren-Expression kam. Durch Zellkulturstudien an primären Osteoblasten und Osteoklasten wurde an isolierten Zelltypen die Wirkung der applizierten WF untersucht und ihr Effekt auf die Zelltypen dargestellt. Die Bildung ektoper Ossifikation im Weichgewebe durch die Wachstumsfaktoren wurde im Schafsmodell ausgeschlossen. Dies stellt einen wichtigen Sicherheitsaspekt beim Einsatz von Wachstumsfaktoren zur Stimulation der Knochenheilung dar. Die lokale Applikation der Wachstumsfaktoren von einer Plattenosteosynthese zur Osteotomiestabilsierung im Rattenmodell zeigte eine signifikante Verbesserung der biomechanischen Stabilität und der Kallusheilung 42 Tage nach Osteotomie Die aus diesen Studien gewonnenen Erkenntnisse liefern Aufschluss zur Weiterentwicklung biologischer Einflussmöglichkeiten auf den Knochenstoffwechsel und die Rolle von WF während der Frakturheilung. / In the process of bone formation and healing, different cell- and tissue types are formed. The cells involved are regulated by growth factors (GF), cytokines and hormones, which control the healing and affect the proliferation and differentiation of cells and their matrix synthesis. Besides the use of the optimal osteosynthesis for fracture stabilization, the biological influence of the bone healing represents a large research field. In previous work an application system for local application of GF in biologically active form was developed. In vivo studies revealed a stimulating effect of locally applied IGF-I and TGF-ß1 in a rat and a pig model. Goal of this work was the investigation of cellular processes during the influenced and uninfluenced bone healing. A further aim was the transfer of the local application method to further stabilization systems (plate osteosynthesis). On the basis of the histology, the immunohistology, in situ hybridizing and ELISA methods an earlier beginning of maturing of the callus by the growth factors could be shown, without changes of the physiological callus composition and the endogenous growth factors expression. In further cell culture studies on primary osteoblasts and osteoclasts the effect of the applied growth factors was examined and their effect on the cell types analyzed. The avoidance of ectopic ossification, an important safety aspect with the use of growth factors to stimulate bone healing, was investigated in a sheep model. It was also possible to proof the efficacy of locally applied growth factors delivered extramedullary from plates. The results of these studies provide further explanations for the action of the used growth factors and are necessary for the ongoing development of the application of growth factors for a clinical use.

Die Basis für den therapeutischen Einsatz elektrischer Felder bei der Behandlung von Knochenbrüchen liegt in der Existenz von belastungsabhängigen elektrischen Potentialen im Knochen. Die zellulären Wirkungsmechanismen sind jedoch unverstanden. Um zu untersuchen, ob und wie elektrische Felder Wachstum und Differenzierung von Knochenzellen beeinflussen, wurden humane Osteosarcomazellen (HOS TE85) und aus Minischweinen isolierte primäre Osteoblasten mit elektrischen Feldern im Frequenzbereich von 0.1 Hz bis 100 kHz befeldet und verschiedene zelluläre Parameter zeitabhängig gemessen. Das elektrische Feld wurde mittels platinierten Platinelektroden appliziert, um ausreichend hohe Feldstärken bei gleichzeitig guter Kontrolle über die im Gewebe erzeugte Wellenform zu gewährleisten. Beim Einsatz von Elektroden müssen jedoch elektrochemische Reaktionen an der Elektrodenoberfläche berücksichtigt werden. Daher wurden verschiedene Elektroden für die in vivo- und in vitro-Stimulation mit elektrischen und numerischen Methoden untersucht und verglichen. Das führte einerseits zur Erarbeitung verschiedener Kriterien zur Auswahl geeigneter Elektrodenmaterialien und -geometrien. Andererseits konnten detaillierte Angaben zur effektiven Feldstärke und Feldverlauf in der Zellebene sowie zu elektrochemisch bedingten Nebenwirkungen gemacht werden. Es konnte gezeigt werden, dass elektrische Felder das Signalsystem und den Stoffwechsel von Knochenzellen im gesamten untersuchten Frequenzbereich beeinflussen. Die Richtung des Nettoeffekts war jedoch im oberen und im unteren Frequenzbereich unterschiedlich. Im Frequenzbereich über 1 kHz fanden wir immer eine Erhöhung des Wachstums und der Konzentration der "second messenger" und eine Herabsetzung der Konzentration der reaktiven Sauerstoffverbindungen (ROS). Bei Frequenzen unter 1 kHz wurde dagegen eine Erhöhung der Aktivität der alkalischen Phosphatase und des oxidativen Stress beobachtet. Signifikante Effekte traten jedoch nur bei Feldstärken oberhalb 100 V/m auf. Hinweise auf bevorzugte Frequenzen oder Wellenformen, die für "Fenstereffekte" sprechen würden, konnten nicht gefunden werden. Da alle zellulären Parameter an einem einheitlichen System gemessen wurden, ließen sich die Ergebnisse in ein Modell der feldinduzierten Signaltransduktion integrieren. Prinzipiell muss man von einem gemeinsamen Effekt mehrerer Signalwege ausgehen. Dabei kann die Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration als ein genereller Mechanismus der Feldwirkung angesehen werden. Dafür sind sowohl der Influx als auch die Freisetzung von Kalzium aus intrazellulären Speichern verantwortlich. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass auch cGMP und Prostaglandin E2, jedoch nicht cAMP an der Vermittlung der Feldwirkung beteiligt ist. Außerdem wurde die Translokation der mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK) beeinflusst. Trotzdem sind die beobachteten Effekte relativ schwach im Vergleich zu publizierten klinischen Erfolgen. Es muss daher in vivo Verstärkungsmechanismen geben, die durch Untersuchungen an Zellkulturen nicht erfasst werden können. / The therapeutic use of electric fields in the treatment bone fracture healing is based on the existence of different load dependent electric potentials in bone. However, the cellular mechanisms of field action are still not understood. We investigated the effect of electric fields on proliferation and differentiation of human osteosarcoma cells (HOS TE85) and primary osteoblasts isolated from mini pigs. The cells were exposed to electric fields (0.1 Hz - 100 kHz) and various cellular parameters were measured. The field was applied using platinized platinum electrodes ensuring sufficiently strong electric fields and a well controlled wave form in the tissue. Nevertheless, in this case electrochemical reactions which occur at the electrode surface have to be taken into account. That’s why various electrodes for in vivo and in vitro stimulation are characterized by electrical and numerical methods leading not only to criteria for choosing electrode materials and geometries, but also providing detailed knowledge about the electric field induced in the tissue and electrochemically induced side effects. We found that cellular signaling as well as proliferation and differentiation of bone cells are influenced by electric fields in the whole investigated frequency range. Proliferation and the second messenger concentrations are increased at frequencies above 1 kHz, whereas below 1 kHz the alkaline phosphatase activity is increased. Significant effects were found only for electric fields above 100 V/m, but we could not find any hints on preferred frequencies or wave forms ruling out "window effects". Because all cellular parameters were measured within one experimental system, the results can be summarized in a signal transduction model for the action of electric fields. Generally, a common action of multiple signaling pathways has to be assumed. The increase of the intracellular calcium concentration can be considered as a general mechanism of field action. This increase is caused by calcium release from intracellular calcium stores as well as influx of extracellular calcium. Additionally, the concentration of cGMP and prostaglandin E2, but not that of cAMP is increased by the electric field. Furthermore, the translocation of the mitogen activated protein kinase (MAPK) is influenced. Nevertheless, the field effects found are weak compared to those published in clinical studies. We suppose that there are amplifying mechanisms in vivo which could not be seen during in vitro investigations.

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