Orientador: Cristiane Damas Gil / Banca: Rejane Maira Góes / Banca: Jusciele Brogin Moreli / Resumo: Introdução: A dermatite atópica (DA) é provocada tanto pelo desequilíbrio das respostas imunes quanto pela quebra da barreira epitelial. Embora a galectina-1 (Gal-1), proteína ligante de β-galactosídeos, possua efeitos imunomoduladores em várias doenças inflamatórias, as estratégias terapêuticas baseadas em suas propriedades anti-inflamatórias não são conhecidas na DA. Desse modo, avaliamos o efeito do tratamento farmacológico com a proteína recombinante Gal-1 (rGal-1) na imunomodulação da DA em modelo experimental murino. Métodos: Camundongos Balb/c machos foram imunizados por via subcutânea, com ovalbumina (OVA; 5 μg) nos dias 0 e 7. Após a imunização, os animais foram desafiados com 250 μg de OVA diluída em 50 μL de óleo Johnson's Baby ® nos dias 11, 14 a 18 e 21 a 24. Parte dos camundongos sensibilizados foram tratados intraperitonealmente com a proteína rGal-1 (0,3 ou 3 µg/animal) ou dexametasona (1 mg/kg) diluídos em 0,1 mL de salina estéril, na última semana do protocolo experimental, dias 21 a 24 (uma vez ao dia). Após 24 horas do último período de exposição à OVA, ou apenas óleo (Sham), os animais foram anestesiados para coleta de sangue e, posteriormente, realizada a eutanásia por deslocamento cervical para coleta da pele e baço. As análises posteriores foram realizadas por meio de: análises histológicas e quantitativa de mastócitos e eosinófilos na pele, dosagens de IgE anti-ovalbumina e citocinas no sangue e lisado de pele, imuno-histoquímica e western blotting... / Abstract: Introduction: Atopic dermatitis (AD) is caused by both dysregulated immune responses and an impaired skin barrier. Although beta-galactoside binding protein galectin-1 (Gal-1) has immunomodulatory effects in several inflammatory disorders, therapeutic strategies based on its anti-inflammatory properties have not been explored in AD. Thus, we evaluated pharmacological treatment with recombinant Gal- 1 protein (rGal-1) in the immunomodulation of AD in murine experimental model. Methods: Male Balb/c mice were immunized with ovalbumin (OVA, 5µg) on days 0 and 7. After immunization, animals were challenged with 250µg OVA diluted in 50 µL Johnsons's Baby® oil on days 11, 14-18 and 21-24. A subset of animals was treated intraperitoneally with rGal-1 (0.3 or 3 μg/animal) or dexamethasone (1 mg/kg) diluted in 0,1 mL sterile saline, in last week of the experimental protocol, days 21-24 (once a day). After 24 hours of the last OVA challenge, or oil (Sham), animals were anesthetized for blood collection, and subsequently performed euthanasia by cervival dislocation for colletction of skin and spleen. Subsequent analysis were performed by: histological analysis and quantification of mast cells and eosinophils in skin, dosage of IgE anti-OVA and cytokine levels in blood and skin homogenates, immunohistochemistry and western blot to detect Gal-1 and mitogen-activated protein kinases (MAPKs) expression in skin and spleen. Results: Treatment with rGal-1 decreased the clinical signs of dermatitis in BALB/c mice and diminished local eotaxin and IFN- levels. The treatment also suppressed the infiltration of eosinophils and mast cells, which was verified by reduced expression of mouse mast cell protease 6 (mMCP6) and eosinophil peroxidase (EPX). These localized effects are associated with extracellular signal-regulated kinase (ERK) activation and downregulation of endogenous Gal-1. The ... / Mestre

Nesse estudo in vitro foi avaliado o potencial erosivo do suco de laranja modificado pela adição de caseína, ovalbumina e a combinação entre elas, sobre o esmalte e a dentina humanos. Duas proteínas da dieta, 0.2 g/l de caseína (CAS), 2.0 g/l de ovalbumina (OVA) e a combinação entre elas (CAS + OVA) foram adicionadas a um suco de laranja disponível comercialmente. O suco de laranja sem aditivos foi utilizado como controle negativo (C-) e o suco de laranja com adição de cálcio, também disponível comercialmente, como controle positivo (C+). O potencial erosivo dos sucos experimentais foi primeiramente comparado utilizando o método do pHStat, e em seguida, através de um modelo in vitro de erosão-remineralização. 55 espécimes de esmalte e 55 de dentina radicular (4 x 4 x 2mm) foram obtidos e incluídos em um bloco de resina acrílica. Esses blocos foram então planificados com discos de lixa abrasivos e polidos com disco de feltro e pasta diamantada. As superfícies polidas receberam a aplicação de fitas adesivas, expondo uma janela de 4 x 1mm. Os espécimes foram aleatoriamente distribuídos entre os 5 grupos experimentais (n = 11), e imersos nos respectivos sucos por 5 min, 6x ao dia, durante 5 dias. Entre as imersões e durante o período noturno, os espécimes permaneceram armazenados em saliva artificial. Após a ciclagem, os espécimes de esmalte foram analisados através de perfilometria óptica e microdureza (50 g, 15 s), enquanto que os espécimes de dentina foram analisados apenas por perfilometria óptica. Para o método do pH-Stat foi calculada a média do volume de HCl obtida em triplicata. Para a análise dos dados obtidos através de perfilometria e microdureza, foi utilizado o teste de Análise de Variância, um fator, seguido pelo teste complementar de Tukey, adotando um nível de significância de 5%. As médias do volume de HCl (em ml) obtidas no método do pH-Stat foram: C+ 0,46 (± 0,03); CAS 1,22 (± 0,06); OVA 1,10 (± 0,10); CAS+OVA 1,08 (± 0,01) e C- 1,07 (± 0,02). Na avaliação do esmalte, a perda de estrutura (m) observada foi de: C+ 0,09 (± 0,20); CAS -0,40 (± 0,32); OVA -0,44 (± 0,26); CAS+OVA -0,39 (± 0,25) e C- -1,04 (± 0,36). Quanto a microdureza superficial, os valores de dureza Knoop obtidos foram: C+ 312,68 (± 20,45); CAS 121,99 (± 10,70); OVA 108,87 (± 11,16); CAS+OVA 102,57 (± 11,89) e C- 101,94 (± 8,56). Para a dentina, a perda de estrutura observada foi de: C+ -0,82 (± 0,28); CAS -7,26 (± 0,65); OVA -6,74 (± 1,18); CAS+OVA -7,16 (± 0,75) e C- -7,51 (± 1,26). Conclui-se que para o esmalte, os sucos de laranja modificados pela adição de proteínas apresentaram um potencial erosivo reduzido. A caseína mostrou uma melhor proteção da desmineralização subsuperficial do esmalte; a sua combinação com a ovalbumina não apresentou nenhum benefício adicional. Para a dentina, nenhuma redução no potencial erosivo foi observado para os sucos de laranja modificados pela adição de proteínas. / The erosive potential of a modified orange juice by addition of casein, ovalbumin and its combination, on human enamel and root dentin was evaluated in this in vitro study. Two dietary proteins, 0.2 g/l casein (CAS), 2.0 g/l ovalbumin (OVA) and their combination (CAS + OVA) were added to a commercially available orange juice. The juice with no additives was used as negative control (C-) and a commercially available calcium-modified juice as positive control (C+). The erosive potential of the experimental juices was initially compared by the pH-Stat method, and then, by an in vitro erosion-remineralization cycling model. 55 enamel and 55 root dentin specimens (4 x 4 x 2mm) were obtained and embedded in acrylic resin blocks. These blocks were ground flat with abrasive discs and polished with felt paper and diamond paste. The polished surfaces were covered with an adhesive tape, leaving a central area of 4 x 1mm exposed. The specimens were randomly allocated within the 5 experimental groups (n=11), and immersed in the respective juices for 5 min, 6x/day, for 5 days. Between the immersions and overnight they were stored in artificial saliva. After the cycling, the enamel specimens were analyzed by surface Knoop microhardness (50g, 15s) and optical profilometry, while dentin specimens were analyzed only by profilometry. The mean volume of HCl obtained in triplicate were calculated for the pH-Stat method. The data obtained for profilometry and microhardness were statistically analyzed using ANOVA, one-way, followed by Tukeys test considering a significance level of 5%. The mean volume of HCl (ml) obtained for the pH-stat method were: C+ 0,46 (± 0,03); CAS 1,22 (± 0,06); OVA 1,10 (± 0,10); CAS+OVA 1,08 (± 0,01) e C- 1,07 (± 0,02). For enamel, the surface loss (m) was: C+ 0,09 (± 0,20); CAS -0,40 (± 0,32); OVA -0,44 (± 0,26); CAS+OVA -0,39 (± 0,25) e C- -1,04 (± 0,36). Regarding microhardness, the Knoop hardness values were: C+ 312,68 (± 20,45); CAS 121,99 (± 10,70); OVA 108,87 (± 11,16); CAS+OVA 102,57 (± 11,89) e C- 101,94 (± 8,56). For dentin, the surface loss (m) was: C+ - 0,82 (± 0,28); CAS -7,26 (± 0,65); OVA -6,74 (± 1,18); CAS+OVA -7,16 (± 0,75) and C- -7,51 (± 1,26). It was concluded that protein-modified orange juices presented reduced erosive potential on enamel. Casein showed a better subsurface demineralization protection, and its combination with ovalbumin did not lead to additional benefits. For dentin, any reduction on the erosive potential was observed for protein-modified orange juices.

The interaction between ovalbumin (OVA) and four sulphonamides named sulfathiazole (S1), sulfaquinoxaline (S2), sulfadimethoxine (S3) and sulfamethazine (S4) was investigated employing spectroscopic techniques (molecular fluorescence, UV-Vis and 1H NMR) emulating in natura egg conditions. For the interaction study, the intrinsic fluorescence of the protein (λex = 280 nm / λem= 336 nm) was explored in the ligand’s presence and absence (SFs). The OVA spectrometric titrations (2 μM) with different ligands (0-200 μM) were performed in pH 7.4 (Tris-HCl buffer solution 50 mM, NaCl 100 mM). For the evaluation of the interaction process, it was noticed a decrease in the OVA fluorescent emission as SFs excess was added, due to an energy transfer process (quenching). By using these data, the Stern Volmer constant (Ksv), binding constant (Kb) and stoichiometric ratio (n) were calculated. The Kb values ranged from 3.98 to 27.4 x 105 L mol-1 (30 ºC) and by applying these information, it was observed that the interaction magnitude followed the order: S3 < S4 < S2 < S1. The number of binding sites in every condition applied was close to one. For all SFs evaluated the increase in temperature lead to a decrease in both Ksv and Kb values, indicating that the static quenching mechanism is preferable, with the formation of a non-fluorescent molecular complexes. This result was further confirmed by UV-Vis studies with formation of a fundamental state complex. According to thermodynamic parameters, ΔG < 0 was obtained for all SFs evaluated, indicating that the interaction is thermodynamically spontaneous. For S2 and S3, the main forces acting in the interaction are hydrogen bonds and Van der Waals forces, whereas S1 and S4 have electrostatic forces, predominantly. Through 3D fluorescence studies, it was observed a decrease in the fluorescence intensity of peak 2 and 3, which is related to the tyrosine and tryptophan residue emissions associated with the protein secondary structure in the presence of SFs, respectively. This result indicates that there were conformational changes in the protein native structure. By using synchronized fluorescence, it was possible to deduce that the interaction with OVA exposes the tyrosine and tryptophan residues, increasing the polarity of the micro–environment of those amino acids. Through studies based on FRET (Fluorescence resonance energy transfer), it was possible to calculate the intermolecular distance between the SFs (energy acceptors) and OVA (energy donor), which were smaller than 10 nm. The competition assay with ANS probe, which control the protein hydrophobic regions, indicates that only S2 was capable to shift this marker. Metallic ions were also evaluated and it was observed that Ca(II), Mg(II) and Fe(III) can facilitate the interaction between sulphonamides (S1 and S2) and OVA. The 1H NMR studies showed a signal shift for aromatic hydrogens present in S2 and S3. In nature ovalbumin (from egg white) interacts more effectively with SFs than commercial ovalbumin. Biological studies have shown that E. coli and B. megaterium are sensitive to the sulfonamides tested and the MIC values of these antibiotics in the absence and presence of OVA do not present significant difference. This way, the results indicate that there was interaction between SFs and macromolecule and, thus, conformational changes in the protein structure were identified. So, the presence of SFs in aliments shows a risk to food security, since the OVA has its polypeptide chain modified and can act/treat as a foreigner and cause allergic reactions. / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A interação da ovalbumina (OVA) com quatro sulfonamidas, nomeadamente sulfatiazol (S1), sulfaquinoxalina (S2), sulfadimetoxina (S3) e sulfametazina (S4) foi investigada empregando técnicas espectroscópicas (fluorescência molecular, UV-vis e RMN 1H) simulando as condições in natura do ovo. Para o estudo de interação, explorou-se a fluorescência intrínseca da proteína (λex = 280 nm / λem = 336 nm) na ausência e presença dos ligantes (SFs). As titulações espectrofluorimétricas da OVA (2 μM) com os diferentes ligantes (0-200 μM) foram realizadas em pH 7,4 (tampão Tris 50 mM, NaCl 100 mM). Na avaliação do processo de interação notou-se diminuição na intensidade da emissão da fluorescência da OVA à medida que os excessos das SFs foram adicionados, devido ao processo de transferência de energia (quenching). Por meio destes resultados foi possível calcular a constante de Stern Volmer (Ksv), constante de ligação (Kb) e proporção estequiométrica (n). Os valores de Kb variaram de 3,98 a 27,4x105 L mol-1 (30 ºC) e a partir destes dados observou-se que a magnitude da interação seguiu a seguinte ordem: S1 > S2 > S4 > S3. O número de sítios de ligação em todas as condições foi próximo à unidade. Para todas as SFs avaliadas o aumento da temperatura levou a diminuição dos valores de Ksv e Kb, indicando que o mecanismo de quenching preferencial é estático, com formação de complexos supramoleculares não-fluorescentes. Este resultado foi confirmado pelos estudos de UV-vis com formação do complexo no estado fundamental. Quanto aos parâmetros termodinâmicos, obteve-se ΔG < 0 para todas as SFs avaliadas, indicando que a interação é termodinamicamente espontânea. Para S2 e S3, as forças predominantes na interação são ligações de hidrogênio e forças de Van der Waals, enquanto que para S1 e S4 as forças preferenciais foram eletrostáticas. Através dos estudos por fluorescência 3D observou-se a redução na intensidade de fluorescência dos picos 2 e 3, relativos à emissão dos resíduos de tirosina e triptofano e emissão associada a estrutura secundária da proteína na presença das SFs, respectivamente. Este resultado indica que houve mudanças na estrutura nativa da proteína. Por meio de fluorescência sincronizada foi possível inferir que a interação com a OVA expõe os resíduos de triptofano e tirosina aumentando a polaridade do microambiente destes aminoácidos. Através de estudos baseados em FRET (Fluorescence resonance energy transfer), foi possível calcular a distância intermolecular entre as SFs (receptoras de energia) e a OVA (doadora de energia), as quais foram inferiores a 10 nm. Os estudos de competição com a sonda ANS que monitora regiões hidrofóbicas da proteína indicaram que S2 foi a única sulfa capaz de deslocar este marcador. Já com os íons metálicos, observa-se que Ca(II), Mg(II) e Fe (III) favorecem a interação das sulfonamidas (S1 e S2) com a OVA. A partir dos estudos por ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN 1H) verificou-se deslocamento dos sinais para os hidrogênios aromáticos presentes em S2 e S3. Além disto, foi verificado que a ovalbumina in natura (obtida da clara do ovo) interage com as SFs em maior magnitude quando comparado com a OVA comercial. Por meio de estudos biológicos constatou-se que a E. Coli e B. megaterium são sensíveis as sulfonamidas testadas e que os valores de MIC destes antibióticos na ausência e presença da OVA não diferem. Dessa forma, os resultados obtidos indicam que houve interação entre as SFs e a macromolécula e, consequentemente, mudanças conformacionais na estrutura da proteína foram identificadas. Logo, a presença das SFs em alimentos pode apresentar um risco a segurança alimentar, pois uma vez que há mudança conformacional na cadeia polipeptídica da OVA, esta pode comportar-se como um corpo estranho no organismo e causar/potencializar reações alérgicas.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Com o objetivo de verificar a influÃncia dos hormÃnios tireoideanos no desenvolvimento de hiperreatividade traqueal, ratos machos (200 - 250 g) eutireÃideos, hipotireÃideos (propiltiouracil [PTU] - v.o. 0,05% p/v, durante 4 semanas) ou hipertireÃideos (L- tiroxina [T4] - 0,5 mg/kg s.c., por 7 ou 9 dias) foram sensibilizados à ovalbumina (OVA) e, 14 dias depois, desafiados atravÃs da inalaÃÃo de OVA (1 mg/ml, seguida de 5 mg/ml, 15 min cada). O sacrifÃcio dos animais para a realizaÃÃo dos experimentos ocorreu 24 h apÃs o desafio antigÃnico por anestesia com hidrato de cloral (400 mg/Kg). A traquÃia isolada foi montada em cubas contendo 10 ml de Krebs-Henseleit modificado (37 oC, 5% de CO2 em O2). Foram obtidas curvas concentraÃÃo-efeito (CCE) para cloreto de potÃssio (KCl), carbacol (CCh) ou serotonina (5-HT). TambÃm foram realizadas CCE ao Ca2+ em preparaÃÃes estimuladas por KCl, CCh ou 5-HT e mantidas em soluÃÃo sem Ca2+. A reapresentaÃÃo do antÃgeno promoveu significativo aumento (p < 0,05, two-way ANOVA) da resposta mÃxima (RM) das CCE ao KCl de 0,96  0,10 gF para 1,53  0,11 gF (n = 7), ao CCh de 1,98  0,06 gF para 2,92  0,07 gF (n = 7) e à 5-HT de 1,64  0,14 gF para 2,41  0,15 (n = 6) nos tecidos obtidos de animais sensibilizados ou desafiados, respectivamente. As traquÃias tambÃm apresentaram aumento (p < 0,05, two-way ANOVA) da RM ao Ca2+ quando estimuladas com KCl de 0,54  0,06 gF para 0,86  0,07 gF (n = 6), com CCh de 1,20  0,14 gF para 1,77  0,14 gF (n = 6) ou com 5-HT de 0,59  0,10 gF para 1,15  0,05 gF (n = 6) nos tecidos obtidos de animais sensibilizados ou desafiados, respectivamente. O hipotireoidismo nÃo alterou significativamente a RM induzida por KCl e CCh, enquanto que aquela induzida pela 5-HT foi reduzida de 1,64  0,14 gF nos animais eutireÃideos para 0,34  0,07 gF nos animais hipotireÃideos (p < 0,001, two-way ANOVA). ApÃs desafio, a 5-HT produziu 0,56  0,11 gF (n = 7) no tecido hipotireÃideo (p < 0,001, two-way ANOVA). O hipotireoidismo aboliu o desenvolvimento de hiperreatividade para KCl e CCh. Ocorreu um aumento na CE50 nas CCE obtidas ao CCh de 0,49 x 10-6M para 4,65 x 10-6M (P < 0,05, two-way ANOVA ). O desafio reduziu a CE50 novamente para 1,53 x 10-6M (n = 6, p<0,05, two-way ANOVA). As traquÃias de animais hipotireÃideos desafiados apresentaram diminuiÃÃo da RM ao Ca2+ quando estimuladas com KCl, CCh e 5-HT. Ocorreu aumento na CE50 nas CCE ao Ca2+ em traquÃias desafiadas e estimuladas com CCh de 5,77 x 10-4 M para 22,50 x 10-4 M (n = 6, p<0,01 two-way ANOVA). O hipertireoidismo promoveu um significativo aumento na RM das CCE apenas ao KCl (0,96  0,10 gF no controle versus 1,58  0,15 no tecido hipertireÃideo). NÃo houve desenvolvimento de hiperreatividade apÃs o desafio antigÃnico (RM = 1,87  0,14 gF). Ocorreu diminuiÃÃo da CE50 ao CCh de 0,67 x 10-4 M no controle para 0,14 x 10-4 M apÃs tratamento com T4. Os resultados mostram que hà envolvimento dos hormÃnios tireoideanos no desenvolvimento de hiperreatividade em traquÃia de rato, induzida apÃs reapresentaÃÃo do antÃgeno a animais previamente sensibilizados. / In other to verify the influence of thyroid hormones on the tracheal hyperreactivity development, euthyroid, hypothyroid (propiltiouracil [PTU] - p.o. 0.05% w/v, 4 weeks) or hyperthyroid (L-tiroxine [T4] â 0.5 mg/kg s.c.,7 or 9 days) male rats (200 - 250 g) were sensitized to ovalbumine (OVA) and, 14 days later, challenged with OVA inhalation, (1 mg/ml, followed by 5 mg/ml, 15 min each). Animals sacrifice was carried out 24 later by means of anaesthesia with chloral hydrate (400 mg/Kg). Isolated trachea was mounted in 10 ml bath chamber filled with modified Krebs-Henseleit (37 oC, 5% de CO2 em O2). Concentration-effect curves (CEC) were carried out for potassium chloride (KCl), carbachol (CCh) or serotonin (5-HT). CEC to Ca2+ added in tissues maintained in Ca2+-free medium stimulated with KCl, CCh or 5-HT also were carried out. Antigenic challenge produced significant increase (p < 0.05, two-way ANOVA) of the maximal response (Emax) of the CCE for KCl from 0.96  0.10 gF to 1.53  0.11 gF (n = 7), for CCh from 1.98  0.06 gF to 2.92  0.07 gF (n = 7) and for 5-HT from 1.64  0.14 gF to 2.41  0.15 (n = 6) in tissues obtained from sensitized or challenged animals, respectively. Tracheae also showed increase on the Emax to Ca2+ (p < 0.05, two-way ANOVA) when stimulated with KCl from 0.54  0.06 gF to 0.86  0.07 gF (n = 6), with CCh from 1.20  0.14 gF to 1.77  0.14 gF (n = 6) or with 5-HT from 0.59  0.10 gF to 1.15  0.05 gF (n = 6) on sensitized or challenged tissues, respectively. The hypothyroidism did not modify significantly the KCl- or CCh-induced Emax, while the 5-HT-induced contractile effect was reduced from 1.64  0.14 gF in euthyroid tissues to 0.34  0.07 gF in hypothyroid tissues (p < 0.001, two-way ANOVA). After challenge, 5-HT produced in hypothyroid tissues a contraction corresponding to 0.56  0.11 gF (n = 7, p < 0.001, two-way ANOVA). Hypothyroidism prevented hyperreactivity development for KCl and CCh. It was observed an increased EC50 value in CCE for CCh from 0.49 x 10-6M to 4.65 x 10-6 M (p < 0,05, two-way ANOVA). After challenge, CE50 value was reduced to 1.53 x 10-6 M (n = 6, p < 0,05, two-way ANOVA). Tracheae from challenged hypothyroid animals showed decreased Emax to Ca2+ when they were stimulated with KCl, CCh and 5-HT. It was observed an increased EC50 value in CCE to Ca2+ in challenged tissues stimulated with CCh from 5.77 x 10-4 M to 22.50 x 10-4 M (n = 6, p < 0.01, two-way ANOVA). Hyperthyroidism significantly increased Emax of the KCl-induced CCE (0.96  0,10 gF in control versus 1.58  0.15 on hyperthyroid tissue). Hyperreactivity was not showed after antigenic challenge (Emax = 1.87  0.14 gF). It was observed a reduction of the EC50 value to CCh from 0.67 x 10-4 M in control to 0.14 x 10-4 M after T4 treatment. Our results show that there is a putative thyroid hormones involvement in hyperreactivity development on rat trachea, after an antigenic challenge.

Nesse estudo in vitro foi avaliado o potencial erosivo do suco de laranja modificado pela adição de caseína, ovalbumina e a combinação entre elas, sobre o esmalte e a dentina humanos. Duas proteínas da dieta, 0.2 g/l de caseína (CAS), 2.0 g/l de ovalbumina (OVA) e a combinação entre elas (CAS + OVA) foram adicionadas a um suco de laranja disponível comercialmente. O suco de laranja sem aditivos foi utilizado como controle negativo (C-) e o suco de laranja com adição de cálcio, também disponível comercialmente, como controle positivo (C+). O potencial erosivo dos sucos experimentais foi primeiramente comparado utilizando o método do pHStat, e em seguida, através de um modelo in vitro de erosão-remineralização. 55 espécimes de esmalte e 55 de dentina radicular (4 x 4 x 2mm) foram obtidos e incluídos em um bloco de resina acrílica. Esses blocos foram então planificados com discos de lixa abrasivos e polidos com disco de feltro e pasta diamantada. As superfícies polidas receberam a aplicação de fitas adesivas, expondo uma janela de 4 x 1mm. Os espécimes foram aleatoriamente distribuídos entre os 5 grupos experimentais (n = 11), e imersos nos respectivos sucos por 5 min, 6x ao dia, durante 5 dias. Entre as imersões e durante o período noturno, os espécimes permaneceram armazenados em saliva artificial. Após a ciclagem, os espécimes de esmalte foram analisados através de perfilometria óptica e microdureza (50 g, 15 s), enquanto que os espécimes de dentina foram analisados apenas por perfilometria óptica. Para o método do pH-Stat foi calculada a média do volume de HCl obtida em triplicata. Para a análise dos dados obtidos através de perfilometria e microdureza, foi utilizado o teste de Análise de Variância, um fator, seguido pelo teste complementar de Tukey, adotando um nível de significância de 5%. As médias do volume de HCl (em ml) obtidas no método do pH-Stat foram: C+ 0,46 (± 0,03); CAS 1,22 (± 0,06); OVA 1,10 (± 0,10); CAS+OVA 1,08 (± 0,01) e C- 1,07 (± 0,02). Na avaliação do esmalte, a perda de estrutura (m) observada foi de: C+ 0,09 (± 0,20); CAS -0,40 (± 0,32); OVA -0,44 (± 0,26); CAS+OVA -0,39 (± 0,25) e C- -1,04 (± 0,36). Quanto a microdureza superficial, os valores de dureza Knoop obtidos foram: C+ 312,68 (± 20,45); CAS 121,99 (± 10,70); OVA 108,87 (± 11,16); CAS+OVA 102,57 (± 11,89) e C- 101,94 (± 8,56). Para a dentina, a perda de estrutura observada foi de: C+ -0,82 (± 0,28); CAS -7,26 (± 0,65); OVA -6,74 (± 1,18); CAS+OVA -7,16 (± 0,75) e C- -7,51 (± 1,26). Conclui-se que para o esmalte, os sucos de laranja modificados pela adição de proteínas apresentaram um potencial erosivo reduzido. A caseína mostrou uma melhor proteção da desmineralização subsuperficial do esmalte; a sua combinação com a ovalbumina não apresentou nenhum benefício adicional. Para a dentina, nenhuma redução no potencial erosivo foi observado para os sucos de laranja modificados pela adição de proteínas. / The erosive potential of a modified orange juice by addition of casein, ovalbumin and its combination, on human enamel and root dentin was evaluated in this in vitro study. Two dietary proteins, 0.2 g/l casein (CAS), 2.0 g/l ovalbumin (OVA) and their combination (CAS + OVA) were added to a commercially available orange juice. The juice with no additives was used as negative control (C-) and a commercially available calcium-modified juice as positive control (C+). The erosive potential of the experimental juices was initially compared by the pH-Stat method, and then, by an in vitro erosion-remineralization cycling model. 55 enamel and 55 root dentin specimens (4 x 4 x 2mm) were obtained and embedded in acrylic resin blocks. These blocks were ground flat with abrasive discs and polished with felt paper and diamond paste. The polished surfaces were covered with an adhesive tape, leaving a central area of 4 x 1mm exposed. The specimens were randomly allocated within the 5 experimental groups (n=11), and immersed in the respective juices for 5 min, 6x/day, for 5 days. Between the immersions and overnight they were stored in artificial saliva. After the cycling, the enamel specimens were analyzed by surface Knoop microhardness (50g, 15s) and optical profilometry, while dentin specimens were analyzed only by profilometry. The mean volume of HCl obtained in triplicate were calculated for the pH-Stat method. The data obtained for profilometry and microhardness were statistically analyzed using ANOVA, one-way, followed by Tukeys test considering a significance level of 5%. The mean volume of HCl (ml) obtained for the pH-stat method were: C+ 0,46 (± 0,03); CAS 1,22 (± 0,06); OVA 1,10 (± 0,10); CAS+OVA 1,08 (± 0,01) e C- 1,07 (± 0,02). For enamel, the surface loss (m) was: C+ 0,09 (± 0,20); CAS -0,40 (± 0,32); OVA -0,44 (± 0,26); CAS+OVA -0,39 (± 0,25) e C- -1,04 (± 0,36). Regarding microhardness, the Knoop hardness values were: C+ 312,68 (± 20,45); CAS 121,99 (± 10,70); OVA 108,87 (± 11,16); CAS+OVA 102,57 (± 11,89) e C- 101,94 (± 8,56). For dentin, the surface loss (m) was: C+ - 0,82 (± 0,28); CAS -7,26 (± 0,65); OVA -6,74 (± 1,18); CAS+OVA -7,16 (± 0,75) and C- -7,51 (± 1,26). It was concluded that protein-modified orange juices presented reduced erosive potential on enamel. Casein showed a better subsurface demineralization protection, and its combination with ovalbumin did not lead to additional benefits. For dentin, any reduction on the erosive potential was observed for protein-modified orange juices.

O ferro é essencial para a vida do ser humano, desempenhando um papel fundamental no metabolismo. Contudo, quando não armazenado em compartimentos biológicos adequados, o metal apresenta um potencial tóxico ao organismo, uma vez que contribui para a formação de espécies reativas de oxigênio. A sobrecarga de ferro é uma condição desfavorável para portadores de algumas disfunções genéticas, como a hemocromatose, ou de anemias crônicas que requeiram transfusões de sangue periódicas, como é o caso da talassemia. Os fármacos atuais que controlam a patologia, como a desferrioxamina (DFO), requerem infusão subcutânea lenta, causando desconforto em pacientes e podendo trazer um série de complicações, como insuficiência hepática e renal. A modificação dessas moléculas com biopolímeros é uma proposta para minimizar efeitos colaterais e aumentar a biodisponibilidade do fármaco no organismo. Dentre esses biopolímeros, destacam-se as albuminas proveniente do soro bovino (BSA) e do ovo (OVA), que têm baixa toxicidade, baixo custo e abundância de sítios reativos, que quando modificados, favorecem reação com a desferrioxamina. Como resultado, houve a reação dos biopolímeros com a desferrioxamina, com mudanças em suas estruturas secundárias e possível dimerização, resultando na formação de conjugados possuem afinidade com íon ferro e capacidade antioxidante semelhante ao fármaco original, características que tornam os compostos bons candidatos a uma alternativa à terapia de quelação. Os conjugados BSA-DFO e OVA-DFO podem reagir, além do ferro, com gadolínio, fazendo com o que os complexos tenham uma potencial aplicação como agentes de contraste em ressonância magnética de imagem (MRI). Neste trabalho, vimos que o complexo entre Gd(III) e BSA-DFO apresentou uma relaxatividade de 52,92 s-1 mM-1 para T2 e 45,37 s-1 mM-1 para T1 , um valor bem superior aos fármacos disponíveis no mercado, que apre-sentam relaxatividade entre 4 e 5 s-1 mM-1, o que foi explicado por sua elevada massa molecular, indicando que poderia ter bons efeitos na qualidade de MRI, com menores doses. / Iron is essential for human life, playing a fundamental role in metabolism. However, when not stored in appropriate biological compartments, the metal presents a toxic potential to the body, contributing to the formation of reactive oxygen species (ROS). Iron overload is an unfavorable condition for people with certain genetic disorders, such as hemochromatosis, or chronic anemias that require periodic blood transfusions, as thalassemia. Current drugs that control the pathology, as desferrioxamine, require slow subcutaneous infusion, causing discomfort in patients and may lead to a number of complications, such as hepatic and renal failures. As a result, the biopolymers were reacted with desferrioxamine, with changes in their secondary structures and possible dimerization, resulting in the formation of conjugates with iron ion affinity and antioxidant capacity similar to the original drug, characteristics that make the compounds good candidates for an alternative chelation therapy As a result, the reaction of the biopolymers with desferrioxamine caused a change in the secondary structure, with possible formation of dimers and showing different mobility when exposed to an electric potential difference. Not all polymer chains have reacted with DFO, however BSA-DFO complex has antioxidant capacity similar to the original drug. The BSA-DFO and OVA-DFO conjugates can react, in addition to iron, with gadolinium, making the complexes potential contrast agents for magnetic resonance imaging (MRI). In this work, the complex between Gd(III) and BSA-DFO presented a relaxativity of 52,92 s-1 mM-1 for T2 and 45,37 s-1 mM-1 for T1, values higher than the available drugs in the market (4 - 5 s-1 mM-1) which was explained by the high molecular weight, indicating a good effects on the quality of MRI, with lower doses.

O câncer compreende uma doença multifatorial responsável por altíssimos indíces de mortalidade globalmente. Embora atualmente tenhamos resultados positivos em relação ao tratamento do câncer principalmente voltados à imunoterapia, dados alarmantes ainda são encontrados. Assim, desenvolvemos linhagens tumorais geneticamente modificadas para expressarem ovalbumina (mOVA ou cOVA) e luciferase, a fim de estudarmos as interações do sistema imune com o tumor. Em nossos resultados, a presença da ovalbumina indicou: Alteração no perfil de crescimento tumoral em animais previamente imunizados com OVA e posteriormente desafiados com o tumor, ativação de células TCD8+ citóxicas anti-OVA além de demonstrar também a capacidade imunogênica das linhagens tumorais quando estas são administradas nos animais em estado necrótico. Ao todo, nosso modelo demonstrou que estratégias de vacinação anti-tumorais possuem a capacidade de ativação do sistema imune para na otimização do reconhecimento e resposta anti-tumoral. / Cancer is characterized as a multifactorial disease responsible for many deaths globally. Although nowadays we can find positive perspectives regarding cancers treatment, it is still very common to notice some alarming data. Therefore, our group developed some genetically modified tumoral lineages expressing ovalbumin (mOVA or cOVA) together with luciferase, in order to elucidate the relationship between tumor and the immune system. In our results, the presence of ovalbumin demonstrated: Changes in tumoral growth when animals were previously immunized with OVA and then challenged with our tumoral lineages; TCD8+ lymphocytes anti-OVA activation thus ovalbumin immunogenic potential when lineages were exposed to necrotic death followed by in vivo administration. In summary, our model showed that anti-tumoral vaccinations are indeed capable of promoting immune systems activation and consequently, improving the anti-tumor immunity.

O treinamento físico (TF) melhora a resposta imune de indivíduos saudáveis e traz benefícios para o paciente asmático, mas seu papel na resposta alérgica é desconhecido. Objetivo: Avaliar o papel do TF de moderada intensidade na inflamação pulmonar alérgica crônica. Métodos: 54 cobaias, divididas em 4 grupos: grupo controle (C) (não sensibilizados e não treinados), grupo OVA (sensibilizados à ovalbumina (OVA) e não treinados), grupo treinamento físico (TF) (não sensibilizados e submetidos a um TF), e grupo OVA+TF (sensibilizados à OVA e submetidos a um TF). A sensibilização à OVA teve duração de 8 semanas e o programa de TF de 6 semanas iniciando 15 dias após o início da sensibilização. Cada grupo foi dividido em 2 subgrupos. No primeiro foi avaliada a inflamação pulmonar e os níveis de óxido nítrico exalado (NOex) e no segundo, a hiperresponsividade brônquica à metacolina (Mch). Resultados: A sensibilização à OVA induziu a um aumento da densidade de eosinófilos e linfócitos, expressão de IL(interleucina)-4 e IL-13 e na espessura do músculo liso na via aerea assim como espessura do epitélio comparado aos animais não-sensibilizados (p<0,05). Os animais do grupo OVA+TF apresentaram uma redução da densidade de eosinófilos, linfócitos, IL-4 e IL-13 comparado com o grupo OVA (p<0,05). Nem a sensibilização crônica a OVA ou TF influenciaram a expressão das citocinas Th1 (IL-2 e IFN-) ou a expressão das citocinas regulatórias (IL-10 e IL-1-ra) e nos níveis de NOex. Os grupos que realizaram TF tiveram aumento na espessura do epitélio quando comparados com grupos não-treinados embora não há diferença entre os grupos na avaliação da hiperresponsividade brônquica. Conclusão: Nossos resultados sugerem que o TF reduz a inflamação alérgica sem modificar a hiperresponsividade brônquica e o remodelamento das vias aéreas / Background: Aerobic training (TF) has a positive effects on health subjects and bring benefits on the immune system of asthmatic patients. However, its role on allergic immune response remains poorly understood. Objective: To evaluate the effects of TF in chronic allergic inflammation. Methods: Fiftyfour animals, divided in 4 groups: non-trained and non-sensitized (C), nonsensitized and aerobic exercise (TF), ovalbumin sensitized and non-trained (OVA), and sensitized and aerobic exercise (OVA+TF). OVA or saline sensitization was performed during 8 weeks. TF was performed in a treadmill during 6 weeks beginning in the 3rd week of sensitization. Each group were divided in two groups. In the first one, it was evaluated airway inflammation and levels of exhaleted oxide nitric (NOex), on the second, airway hyperresponsiveness to a methacholine (Mch). Results: OVA sensitization induced an increase in the eosinophils and lymphocytes counting, expression of IL-4 and IL-13 and the amount of airway smooth muscle and epithelium thickness compared to non-sensitized animals (p<0.05). Sensitized animals submitted to TF presented a reduction in the eosinophil and lymphocyte counting, expression of IL-4 and IL-13 compared with OVA group (p<0.05) but not OVA-induced changes in airway remodeling (p>0.05). Neither OVA nor TF induced any difference in the expression of Th1 (IL-2 and IFN-) and regulatory cytokine (IL-10 and IL1-ra) and the levels of NOex. Trained groups presented an increase in epithelium thickness as compared to the nontrained groups however we did not find difference between groups on hyperresponsiveness avaliation. Conclusion: Our results suggest that TF reduces allergic airway inflammation without changes in bronchial hyperresponsiveness and airway remodeling

A administração de Ags solúveis via mucosas, antes da sensibilização com o mesmo Ag, leva a tolerância. Na presente tese estudou-se o efeito do LPS i.n. durante a indução de tolerância nasal a ovalbumina (OVA). A maioria dos modelos murinos de asma utilizam a OVA como alérgeno, desse modo também utilizamos o extrato de Blomia tropicalis (Bt), um ácaro prevalente em pacientes asmáticos. Características da Bt impedem o estabelecimento de tolerância e evidências experimentais indicam que a tolerância a um Ag pode induzir tolerância a um Ag não relacionado (tolerância cruzada). Assim, avaliamos se a tolerância a OVA ou lizozima de ovo (HEL) poderia induzir tolerância cruzada a Bt. Observou-se que o LPS i.n. durante a indução de tolerância a OVA previne o estabelecimento da tolerância, resultando em neutrofilia pumonar, IgG2a, diminuição de IgE com aumento de IgG1 anafilática. Observou-se também que a tolerância nasal, a HEL ou OVA, não é eficaz em induzir tolerância cruzada para as respostas contra Bt. Já, a tolerância oral com OVA induziu tolerância cruzada para Bt. / Mucosal administration of soluble Ags, before the sensitization with the same Ag, leads to mucosal tolerance. We studied the effect of i.n. LPS during the induction of ovalbumin (OVA) nasal tolerance. The majority of murine models of asthma used OVA as allergen,thus, we also used Blomia tropicalis (Bt) extract, a mite more common in asthmatic patients. Features of Bt block the nasal tolerance establishment and experimental data indicates that tolerance towards an Ag can promote tolerance to another not related Ag (cross-tolerance). Therefore, we evaluated if OVA or hen-egg white lisozyme (HEL) tolerance could result in cross-tolerance to the Bt. Our data showed that i.n. LPS during induction of tolerance to OVA prevents the establishment of this tolerance, resulting in neutrophil migration, IgG2a production, decreased levels of IgE and increased anaphylactic IgG1. We verify that nasal tolerance to HEL or OVA is not capable in induce cross-tolerance against the Bt. We also observed that OVA oral tolerance is able to induce cross-tolerance against Bt.

Made available in DSpace on 2015-05-14T13:00:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2644910 bytes, checksum: 94bc3ca3dd5252435423f525d32a2ea9 (MD5) Previous issue date: 2009-04-01 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Asthma is a chronic inflammatory disease characterized by cell migration and bronchial hyperreactivity (HRB). One strategy to treat allergic diseases is the development of new drugs with good efficacy and few side effects. Flavonoids are plant compounds known for its antioxidant, antiallergic and anti-inflammatory activities. Based on this premise, the study aimed to select flavonoids by the immunopharmacological screening and to evaluate prophylactic and therapeutic treatments in the experimental asthma model. For this purpose the flavonoids tested were myricetin, isoramnetin and glycosylated kampherol known as 3-O-[β-D-glycopiranosil-(1→6)-α-L-rhamnopyranosyl]-7-O-α-L-rhamnopyranosyl-kamferol (GRRK). The experimental model was BALB/c mice sensitized and challenged with ovalbumin (OVA) and the treatments were before (prophylactic) or after (therapeutic) to establishment of the experimental asthma model. The three flavonoids inhibited the animal death during the anaphylactic chock reaction induced by OVA and the inflammatory cell migration to the lung; however only the GRRK was used in the following experiments because of its best yield in the purification process. Both prophylactic and therapeutic treatments with GRRK (30 mg/kg) decreased significantly the total number of inflammatory cells (P< 0.05), eosinophils cells (P< 0.05), IL-5 (P< 0.05) and IL-13 (P< 0.05) production from bronchoalveolar lavage (BAL), IgE OVA-specific title (P< 0.01) in the sera, the bronchial hyperreactivity (HRB) (P< 0.05) induced by methacholine and mucus production (P< 0.001) by the globbet cells from the lung as compared with non-treated GRRK animals. The results obtained in the different treatments with GRRK were statistically comparable with that observed in the OVA-sensitized group treated with dexametasone. Moreover, treatment with GRRK was able to reduce the number of CD4+ T cells (p <0.001), B cells (p <0.001), expression of major complex of compatibility II class (MHC II class) and CD40 molecules in the antigen presenting cells (CD11b+ CD11c+) from BAL. Although the GRRK induced a suppressive effect in the Th2 immune response it was not able to exacerbate the Th1 immune response by IFN- production. The production of this cytokine was not modified when compared with non treated animals. The GRRK treatment also was not able to modify the regulatory immune response because there was no significant change in the production of TGF- and the number of TCD4+Foxp3+, a marker of LT regulatory (TReg). These results demonstrated that GRRK treatment before (prophylactic) or after (therapeutic) the establishment of allergic asthma, restored the morpho-functional changes in the airways by Th2-dependent immunossupression, although independent of Th1 and TReg. / A asma é uma doença inflamatória crônica caracterizada por migração celular para os pulmões e hiperreatividade brônquica (HRB). Uma estratégia para o tratamento de doenças alérgicas é o desenvolvimento de novos medicamentos com boa eficácia e poucos efeitos colaterais. Flavonóides são compostos derivados de plantas conhecidos por suas atividades antioxidante, antialérgica e antiinflamatória. Partindo desta premissa, o trabalho teve como objetivo selecionar flavonóides a partir de análises imunofarmacológicas e avaliar os tratamentos profiláticos ou terapêuticos no modelo de asma alérgica experimental. Para tal, os flavonóides testados foram: myricetina, isoramnetina e kanferol glicosilado conhecido por 3-O-[β-D-glycopiranosil-(1→6)-α-L-ramnopiranosil]-7-O-α-L-ramnopiranosil-kanferol (GRRK). O modelo experimental foi realizado em camundongos BALB/c sensibilizados e desafiados com ovalbumina (OVA) e os tratamentos foram antes (profilático) ou após (terapêutico) estabelecer o modelo de asma alérgica experimental. Os três flavonóides inibiram a morte dos animais durante o choque anafilático induzido por OVA e a migração de células da inflamação para os pulmões, entretanto, apenas o GRRK foi usado nos demais experimentos, devido ao seu melhor rendimento no processo de purificação. Os tratamentos profilático e terapêutico com GRRK (30 mg/kg) diminuíram, de forma significativa, o número total de células inflamatórias (P< 0,05), de eosinófilos (P< 0,05) a produção de IL-5 (P< 0,05) e IL-13 (P< 0,05) no lavado broncoalveolar (LBA), o título de IgE-OVA-específica (P< 0,01) no soro, a hiperreatividade brônquica (HRB) (P< 0,05) induzida com metacolina e a produção de muco (P< 0,001) pelas células caliciformes de pulmão quando comparados com os animais não tratados com GRRK e sensibilizado com OVA. Os resultados obtidos nos diferentes tratamentos com GRRK foram comparáveis estatisticamente aos efeitos observados no grupo de animais tratados com a droga padrão dexametasona. Além disso, o tratamento com GRRK foi capaz de diminuir: o número de linfócitos T CD4+ (P< 0,001) e de linfócitos B (P< 0,001), a expressão de moléculas de classe II do complexo principal de histocompatibilidade (MHC II) e da molécula CD40 em células apresentadoras de antígeno (CD11b+CD11c+) do LBA. Embora o tratamento com GRRK tenha induzido um efeito supressor na resposta imune de perfil Th2, não foi capaz de exacerbar a resposta imune Th1 com a produção de IFN- A produção desta citocina se manteve inalterada quando comparada ao grupo de animais não tratados. O tratamento também não foi capaz de alterar a reposta imune reguladora, pois não houve mudança significativa na produção de TGF- e no número de células TCD4+Foxp3+, marcador de LT regulador (LTReg). Esses resultados demonstram que o tratamento com GRRK antes (profilático) ou depois (terapêutico) de estabelecer a asma alérgica experimental, restabeleceu as alterações morfofuncionais das vias aéreas, por um mecanismo modulador das células Th2, embora independente de Th1 e de Treg