A floresta plantada de eucalipto representa a maior porcentagem entre as florestas plantadas no Brasil, principalmente para a producao de papel e celulose. Porem, durante todo o seu desenvolvimento, o eucalipto sofre o ataque de diferentes patogenos, e entre eles esta o fungo Puccinia psidii causador da ferrugem, principal doenca do eucalipto em regioes tropicais. Assim, com o intuito de estudar alguns mecanismos de defesa da planta contra a infeccao do fungo, este trabalho visou analisar a expressao genica de enzimas relacionadas ao estresse oxidativo e a atividade das mesmas; e o proteoma de clones de eucalipto resistentes e suscetiveis, ao longo do processo de infeccao, colonizacao e multiplicacao do fungo nas plantas. Foi possivel observar diferencas na expressao dos genes em todos os horarios estudados, principalmente as 24 horas apos inoculacao com o fungo. Alem disso, com a analise do proteoma pode-se observar algumas proteinas de grande relevancia para este trabalho, como algumas relacionadas a estresse oxidativo e a resposta de defesa da planta. / The eucalyptus planted forest represents the major percentage among all planted forests in Brazil, mainly for the production of paper and cellulose. However, during its development, the eucalyptus can be attacked by a large number of different pathogens, like the fungus Puccinia psidii, the causer of the eucalyptus rust, main disease that affects the eucalyptus in tropical regions. Thus, in order to study some plant defense mechanisms against the infection of the fungus, this study aimed to analyse the gene expression of some enzymes related to oxidative stress and their activities, and the proteome of resistant and susceptible eucalyptus clones, during the process of infection, colonization and multiplication of the fungus in the plant. We could observe differences in the gene expression at all times studied, mostly at 24 hours after inoculation with the fungus. Besides, with the proteome analysis we could find the very relevant proteins for this study, for instance some proteins related to the oxidative stress and to the plant defense response.

INTRODUÇÃO: Em grandes cidades, como São Paulo, a pequena porcentagem de matas existentes é representada pelos parques municipais. Estas áreas, além de representarem ambientes de lazer para as pessoas, albergam uma enorme diversidade biológica, desde mosquitos até aves e mamíferos. A interação destas espécies favorece a circulação de Flavivirus, causadores de importantes doenças humanas, que têm nas aves um importante reservatório. Atribui-se às aves migratórias o papel de carreadoras dos vírus, já que as mesmas percorrem longas distâncias para completar seu ciclo biológico. A chegada de aves do Hemisfério Norte ocorre em alguns Parques, o que favoreceria a dispersão de alguns vírus, como o Vírus do Nilo Ocidental, já que nestas áreas estão presentes mosquitos potencialmente vetores. OBJETIVOS: identificar infecção por Flavivírus nas aves dos parques municipais de São Paulo. MÉTODOS: De Março de 2012 a Janeiro de 2013, foram coletadas amostras de swab de cloaca, orofaringe e sangue de aves capturadas em redes de neblina de duas áreas do município de São Paulo: Parque Anhanguera e Fazenda Castanheiras/APA Bororé Colônia. As aves foram anilhadas e liberadas após a coleta do material. Foi realizada técnica de RT-PCR em tempo real, utilizando iniciadores genéricos que amplificam fragmento do gene NS5 de Flavivirus. Amostras positivas foram encaminhadas para sequenciamento. RESULTADOS: Foi capturado um total de 231 aves, em sua maioria da Ordem Passeriformes. De um total de 463 amostras, nenhuma amostra apresentou presença de RNA viral. DISCUSSÃO: Em se tratando de alguns Flavivírus, os passeriformes são considerados os reservatórios mais competentes no ciclo de transmissão, pois atingem altos níveis de viremia. Cabe ressaltar que algumas espécies desta ordem, de ocorrência na cidade de São Paulo, já foram identificadas como portadoras dos vírus Rocio e Ilhéus. A ausência de positividade é esperada, pois embora altamente sensível, a técnica de PCR depende do estado de viremia das aves, que é curta. CONCLUSÃO: Os parques municipais são áreas que aproximam aves, mosquitos e humanos, pelo papel ambiental e de lazer que os mesmos representam. Este fato classifica estas áreas como locais com potencial de transmissão de Flavivirus, o que torna importante a continuação este estudo, aumentando as áreas de abrangência, para conhecer os Flavivírus circulantes e realizar vigilância para vírus que podem ocasionar problemas de Saúde Pública / INTRODUCTION: In big cities, as São Paulo, the little percentage of existing forests is represented by the municipal parks. These áreas, besides acting as entertainment environments to the users, promote a huge biodiversity, including mosquitoes, birds and mammals. These species interaction promotes Flavivirus circulation, viruses responsible for important human diseases. The avian species are important reservoirs for these viruses, specially the migrating birds that can fly for long distances, carrying these viruses to several areas. In some parks, the arrival of migrating birds from the North Hemisphere is documented, fact that can support some viruses dispersion, for example, the West Nile Vírus, considering that in these areas potencial vector for this virus can be found. OBJECTIVES: detect Flavivirus infection in birds captured in municipal parks of São Paulo city. METHODS: from March, 2012 to January, 2013, oropharyngeal and cloacal swabs, and blood samples were collected from birds captured in mist-net webs located in two municipal areas: Anhanguera Park and Castanheiras Farm/APA Bororé Colônia. The birds were ringed and released after samples collection. The real time RT-PCR was performed, using generic primers which amplify NS5 gene fragment. Positive samples were forwarded to sequence analysis. RESULTS: a total of 231 birds were capture, in which the majority belongs to Passeriforms order. Of 463 samples collected, all samples were negative for the viral RNA presence. DISCUSSION: when talking about Flaviviruses, the passeriforms are considered the most competent reservoirs in the transmission cycle, because they can achieve great viremia levels. Some passeriforms species, endemic in São Paulo city, were identified as Rocio and Ilhéus viruses carriers in previous studies. The negativity is expected, once the Real Time RT-PCR, although highly sensitive, depends on the viremia duration, which is short in avian species. CONCLUSION: the public parks are areas which encloses birds, mosquitoes and the human being, for the environmental and entertainment role they play. This fact classifies these parks as areas with great potencial of Flavivirus transmission, ressalting the great importance to continue this study, increasing the number of areas, to detect the circulating Flavivirus and to perform surveillance for viruses which can cause public health problems

A significativa prevalência da infecção pelo HTLV-1/2 no Brasil tornou compulsória a triagem sorológica em bancos de sangue desde 1993. A realização de um diagnóstico eficaz e seguro desta infecção tem importância no correto aconselhamento dos pacientes, bem como na adoção de medidas preventivas em relação à transmissão do HTLV-1/2. Entretanto, a ineficiência dos testes confirmatórios disponíveis somado ao alto custo, são fatores limitantes para a conclusão segura do status clínico do paciente. O objetivo deste trabalho foi desenvolver, padronizar e validar uma plataforma molecular (NAT) multiplex utilizando a metodologia de PCR em tempo real para o diagnóstico confirmatório e discriminatório da infecção pelo HTLV-1/2. Para tanto, foi padronizada a PCR em tempo real utilizando o sistema de sondas de hidrólise (TaqMan®) e a região gênica viral pol foi utilizada como alvo dessas reações. As reações foram otimizadas e validadas em amostras de DNA de controles positivos e negativos, amostras de DNA obtidas a partir do sangue total de indivíduos infectados pelo HTLV-1/2, candidatos à doação de sangue e de pacientes infectados por outras viroses (HIV, HBV e HCV). Após a padronização, a plataforma molecular foi validada em relação aos seguintes parâmetros: sensibilidade analítica, sensibilidade diagnóstica, especificidade analítica, especificidade diagnóstica, precisão e robustez. O limite de detecção do teste (LoD) foi de 3,85 cópias/reação para HTLV-1 e 10,88 cópias/reação para HTLV-2. Para a especificidade, não foi observada reação cruzada com os vírus HAV, HBV, HCV, HIV-1 e HIV-2 e B19V obtidos a partir de um painel de referência viral e nem com amostras de indivíduos portadores de HIV, HBV ou HCV. A sensibilidade diagnóstica foi de 94,6% para HTLV-1 e 78,6% para HTLV-2. O coeficiente de variação encontrado no parâmetro precisão foi de até 0,475%. A metodologia desenvolvida é uma ferramenta simples, de baixo custo, sensível e altamente específica, portanto, adequada para detecção e discriminação da infecção por este retrovírus. A padronização desta plataforma tem um importante impacto no fortalecimento da capacitação tecnológica nacional. Além disso, propõe seu uso no algoritmo diagnóstico, o qual permitirá a conclusão segura do diagnóstico do HTLV-1/2. / The significant prevalence of HTLV-1/2 infection in Brazil has turned the serological testing for this virus mandatory in national blood banks since 1993. The performance of efficient and safe diagnosis of this infection has importance on the correct counseling of the patients and the prevention of the transfusion/hemoderivatives transmitted HTLV-1/2 infection. However, the inefficiency of the available confirmatory tests combined with their high cost present limiting factors for adequate conclusions over the clinical status of the patient. A safe diagnosis of the HTLV-1/2 infection is of crucial importance for the correct counseling of the patients and prevention of the transmission of the infection by blood transfusions, breastfeeding and solid organ transplantations. Therefore, the objective of this study was to develop, optimize and validate a molecular multiplex platform (NAT) utilizing the real-time PCR methodology for confirmatory and discriminatory diagnosis of the HTLV-1/2 infection. DNA samples obtained from HTLV-1/2 positive patients, blood donor candidates, and HIV, HBV and HCV infected patients were used in this study. The real-time PCR was optimized using the TaqMan® system (hydrolysis probes) and the pol gene was a target for real-time amplification. After optimization, the molecular platform was validated by analysis of the analytic and diagnostic sensitivity, analytic and diagnostic specificity, precision, and robustness. The detection limit (LoD) of the test was 3.85 copies/reaction for HTLV-1 and 10.88 copies/reaction for HTLV-2. Evaluation of the specificity did not demonstrate cross reaction with human viruses like HAV, HBV, HCV, HIV-1, HIV-2 and B19V obtained from a diagnostic panel and also with samples obtained from HIV, HBV or HCV positive individuals. The diagnostic sensitivity was 94.6% for HTLV-1 and 78.6% for HTLV-2. The estimated variation coefficient of the precision analysis was not more than 0.475%. Therefore, this methodology presents simple, inexpensive, sensitive and highly specific test, and can be used adequately for the detection and discrimination of this retroviral infection. The optimization of this molecular platform have important impact on the improvement of the technologic capability and it can be used for the definition of a national diagnostic algorithm which will permit a safe conclusion of the HTLV-1/2 diagnosis.

O cultivo de células humanas para fins experimentais e terapêuticos se firmou como um dos pilares da biologia celular e tem se tornado uma prática laboratorial cada vez mais disseminada. Associada a esse processo está a contaminação por microrganismos, dentre os quais se destacam as bactérias do gênero Mycoplasma spp., os quais são os contaminantes detectados com maior frequência in vitro. Um dos pontos críticos no processo de garantia da qualidade, pureza e segurança para uso destas células é a adoção de uma metodologia analítica, para detecção de Mycoplasma spp., que seja simples e de rápida execução, com sensibilidade e especificidade adequada e economicamente viável. O objetivo desse trabalho foi desenvolver uma plataforma molecular (PCR em tempo real) para detecção de Mycoplasma spp. em culturas celulares. Para tanto, foram testados diversos conjuntos de primers (gene 16S rDNA) dentre os quais um foi selecionado para a plataforma molecular. Foram utilizadas amostras de DNA obtidas a partir do sobrenadante de cultura. A PCR em tempo real in house foi padronizada utilizando o intercalante fluorescente de DNA dupla fita BRYT Green® e produziu um fragmento de 270 pares de bases. A temperatura de melting para as amostras positivas foi definida no intervalo de 81 a 84°C. A plataforma molecular foi validada por meio dos parâmetros sensibilidade analítica e diagnóstica, especificidade analítica, potencial de arraste, precisão e robustez. O limite de detecção do teste (LOD) foi de 5 cópias/5 ?L. Para a especificidade, foi observada reação cruzada com bactérias de relação filogenética próxima e com DNA de célula humana. A sensibilidade diagnóstica foi de 100%. Não foi houve contaminação por arraste. O coeficiente de variação encontrado no parâmetro precisão foi de 0,64% e 1,80% para a avaliação intra-ensaio e inter-ensaio, respectivamente. O coeficiente de variação da análise robustez foi de 5,42%. Ao comparar a plataforma molecular com o teste comercial, observou-se que 29,85% (n=40) das amostras apresentaram resultados falso-negativos pelo teste comercial. Determinou-se ainda que a PCR em tempo real in house foi mais sensível do que o teste comercial. A análise por microscopia eletrônica de varredura demonstrou a presença de estruturas sugestivas de espécies de Mycoplasma spp. na superfície das células. A análise filogenética permitiu a classificação das espécies encontradas. Os resultados obtidos neste trabalho permitiram propor o algoritmo para aplicação de um método de detecção simples e rápido para Mycoplasma spp.; e fazer deste uma ferramenta para o controle de qualidade das células cultivadas, garantindo a eficiência destas células para uso em pesquisa e maior segurança para uso em terapia celular. / The culture of human cells for experimental and therapeutic purposes has been consolidated as one of the foundations of cell biology and has increasingly become a widely used laboratory practice. The contamination by microorganisms is associated with this process, among them we can highlight bacteria of the genus Mycoplasma spp., which are contaminants more frequently detected in vitro. One of the critical points in the process of assuring quality, purity, and safety for the use of these cells is the adoption of an analytical methodology for the detection of mycoplasma that is simple and fast to conduct, with proper sensitivity and specificity and that is also economically viable. The objective of this work was to develop a molecular platform (real time PCR) for the detection of mycoplasmas in cell cultures. Therefore, we tested several sets of primers (16S rDNA gene), among them one was selected for the molecular platform. DNA samples used were obtained from the culture supernatant. In house real time PCR was standardized using BRYT Green® double-stranded DNA intercalating fluorescent and produced a fragment of 270 pair bases. The melting temperature for the positive samples was set in the range 81 to 84°C. The molecular platform was validated through the parameters: analytical and diagnostic sensitivity, analytical specificity, carry-over contamination, precision and robustness. The limit of detection of the test (LOD) was 5 copies/5 ?L. For specificity, it was observed a cross reaction with bacteria of close phylogenetic relationship and with human cell DNA. Diagnostic sensitivity was 100%. There was no carry-over contamination. The coefficient of variation was found in the precision values of 0.64% and 1.80% for intra-assay and inter-assay assessment, respectively. The variance coefficient of the robustness analysis was 5.42%. By comparing the molecular platform with the commercial test, we observed that 29.85% (n=40) of the samples showed false negative results by the commercial test. It has been determined further that the real-time PCR in house was more sensitive than the commercial test. The analysis by scanning electron microscopy demonstrated the presence of suggestive structures of Mycoplasma spp. species in the surface of cells. Phylogenetic analysis allowed the classification of the species found. The results obtained in this work allowed us to propose the algorithm for application of a simple and fast method for mycoplasma detection and making from this tool for quality control for cultured cells, assuring the efficiency of these cells for use in research and greater safety for use in cell therapy more safety to patients subjected to cell therapy.

O Brasil é o maior produtor mundial de feijão com produção média anual de 3,5 milhões de toneladas, entretanto, um dos maiores problemas enfrentados por essa cultura é o déficit hídrico, que leva a uma redução considerável em seu rendimento. Dessa forma, a identificação de genes que controlam os mecanismos de defesa e adaptação do feijoeiro à falta de água durante o seu desenvolvimento é de grande utilidade. E, como a tolerância à seca é um caráter multigênico, genótipos com diferentes graus de tolerância apresentam expressão gênica diferencial, com ativação e/ou repressão de determinados genes. Diante disso, esse trabalho teve como objetivos: (i) identificar genes diferencialmente expressos em dois genótipos de feijoeiro comum, sendo um tolerante (BAT 477) e o outro suscetível (IACCarioca 80SH) à seca; (ii) verificar a expressão gênica espacial (em raízes, caules e folhas) e temporal (cinco níveis crescentes de déficit hídrico - 24 h, 48 h, 72 h, 96 h e 120 h de exposição ao estresse) por meio de RT-qPCR; (iii) predizer a função dos genes identificados, com base nos genes ortólogos de Arabidopsis thaliana, usando dados públicos de microarranjo disponíveis na plataforma Genevestigator. Para atingir esses objetivos, foi conduzido um experimento em casa-de-vegetação, sendo induzido o déficit hídrico, por meio da suspensão da irrigação, quando as plantas atingiram o estádio fenológico R5, mantendo sob suprimento hídrico adequado as plantas-controle. Foi então utilizada a técnica de cDNA-AFLP para isolar os transcritos diferencialmente expressos entre os dois genótipos, sob seca, a qual aliada ao sequenciamento possibilitou a identificação e anotação de 45 transcritos, sendo 21 exclusivamente expressos no genótipo tolerante e 24 no genótipo suscetível. Dentre os transcritos identificados no genótipo tolerante, podem ser listados pelo menos 11, com potencial de serem usados para transformação genética (chlorophyll A-B binding protein, HSP40, HSP70, glycosyl hydrolase, serine/threonine protein kinase, trehalose-6-phosphate synthase, E3 ubiquitin ligase, fructose biphosphate aldolase, mediator complex subunit 13, aquaporin nodulin MTN-3-related e TCP transcription factor), e no genótipo suscetível, podem ser listados nove (coatomer protein complex, monoamine-oxidase A repressor R1, synaptobrevin, haloacid dehalogenase-like hydrolase, ADP-ribosylation factor, mTERF, serine protease S1C HtrA-related, legume lectin e SWI/SNF-related chromatin binding). Na análise de expressão gênica espacial e temporal, os transcritos mais promissores para uso em trabalhos futuros de transformação genética foram: aquaporin nodulin MTN3, E3 ubiquitin ligase, serine/threonine protein kinase, glycosyl hydrolase e HSP 70 protein, uma vez que tiveram uma expressão bastante pronunciada no genótipo tolerante. Através das análises in silico, baseadas nos genes ortólogos de A. thaliana, foram descobertos processos e vias metabólicas que podem estar envolvidos na resposta do feijoeiro comum ao déficit hídrico. Além disso, foram identificados genes associados com a tolerância à seca, corroborando os dados experimentais. Sendo assim, os resultados obtidos nesse trabalho fornecem o entendimento necessário ao desenvolvimento de ferramentas moleculares (marcadores para genes diferencialmente regulados) para serem utilizados em programas de melhoramento, bem como para informação genética básica na anotação funcional do genoma do feijoeiro e também para utilização desses genes candidatos em trabalhos de transformação genética para obtenção de plantas mais tolerantes à seca. / Brazil is the largest producer of common beans, with average annual production of 3.5 million tonnes; however, one of the biggest problems faced by this crop is drought, which leads to a considerable reduction in their yield. Thus, the identification of genes that control the defense mechanisms and adaptation of common bean to drought during its development is very useful. Drought tolerance is a multigenic character, so genotypes with different degrees of water deficit tolerance exhibit differential gene expression, with activation and/or repression of certain genes. Therefore, this study aimed to: (i) identify differentially expressed genes in two common bean genotypes, one tolerant (BAT 477) and other susceptible (IAC-Carioca 80SH) to drought, (ii) verify the spatial (root, stem and leaves) and temporal (five increasing levels of water deficit - 24 h, 48 h, 72 h, 96 h and 120 h of stress exposition) gene expression by RTqPCR (iii) predict the genes function, based on Arabidopsis thaliana orthologous genes, using available data in the public microarray platform Genevestigator. To achieve these objectives, an experiment was conducted in a green house, being induced water deficit, by withholding water when the plants reached growth stage R5, maintaining adequate water supply under the control plants. To isolate transcripts differentially expressed between the two genotypes under drought was used the cDNA-AFLP technique, which coupled with sequencing enabled the identification and annotation of 45 transcripts, 21 exclusively expressed in the tolerant genotype and 24 in the susceptible one. Among the transcripts identified in the tolerant genotype, may be listed at least 11, with potential to be used in genetic transformation (chlorophyll A-B binding protein, HSP40, HSP70, glycosyl hydrolase, serine/threonine protein kinase, trehalose-6-phosphate synthase, E3 ubiquitin ligase, fructose biphosphate aldolase, mediator complex subunit 13, aquaporin nodulin MTN-3-related and TCP transcription factor), and in the susceptible genotype, can be listed nine (coatomer protein complex, monoamine-oxidase A repressor R1, synaptobrevin, haloacid dehalogenase-like hydrolase, ADP-ribosylation factor, mTERF, serine protease S1C HtrA-related, legume lectin and SWI/SNF-related chromatin binding). In the spatial and temporal gene expression analysis, the transcripts that stood out for use in genetic transformation future studies were: aquaporin nodulin MTN3, E3 ubiquitin ligase, serine/threonine protein kinase, glycosyl hydrolase and HSP 70 protein, since it had an expression quite pronounced in the tolerant genotype. Through the in silico analysis, based on orthologous genes of A. thaliana, was discovered processes and metabolic pathways that may be involved in the common bean response to drought. In addition, we identified genes associated with drought tolerance, corroborating the experimental data. Thus, the present results provide the necessary understanding to develop molecular tools (markers for differentially regulated genes) to be used in breeding programs, as well as basic genetic information in the common bean functional genome annotation and also to use these candidate genes for genetic transformation to obtain drought-tolerant plants.

O gênero Hantavírus está incluído na família Bunyaviridae que são vírus emergentes associados a roedores que podem infectar o homem causando graves doenças. Nas Américas, os Hantavírus causam uma síndrome pulmonar e cardiovascular (SPCVH) com alta letalidade. Cerca de 1600 casos de SPCVH já foram notificados no Brasil causando mais de 600 óbitos. Sete espécies de Hantavírus são conhecidas no Brasil incluindo o vírus Araraquara que circula nas regiões de cerrado do país associado ao roedor Necromys lasiurus. Para o desenvolvimento de uma RT-PCR em tempo real para detecção e quantificação de Hantavírus, mostramos as etapas para o desenvolvimento de uma one-step RT-PCR em tempo real SYBR Green I para Hantavírus Araraquara que se mostrou específica para o gênero e capaz de detectar até 10 cópias por mL de RNA viral na amostra. Além disso, realizamos um estudo filogenético utilizando algoritmos bayesianos, com 190 sequências completas do gene da nucleoproteína, oriundas de 30 países durante um período de 25 anos (1985-2010) que encontravam-se disponíveis no GenBank (NCBI). Baseando-se em uma taxa média de 6.8 x 10-4 (2.5 x 10-4 - 1 x 10-3) substituições nucleotídicas por sítio/ano, foi possível inferir que os Hantavírus teriam aproximadamente 1917 anos. O processo de dispersão dos Hantavírus pelo mundo teria ocorrido há aproximadamente 500 anos, e a introdução destes vírus nas Américas teria ocorrido há 549 anos (95% HPD 1555-341 anos), via América Central ou México, originando os Hantavírus adaptados aos roedores da subfamília Neotominae, e pelo Brasil surgindo há 406 anos (95% HPD 1150-250 anos) os Hantavírus associados a roedores da subfamília Sigmodontinae, e posteriormente dispersaram para todo o continente sul-americano. O trabalho contribui de forma relevante para o diagnóstico das infecções por Hantavírus com a one-step RT-PCR em tempo real SYBR Green I e também, contribui para o entendimento da filogenia e história destes vírus, oferecendo subsídios ao entendimento sobre como teria ocorrido o espalhamento dos Hantavírus pelo mundo. / The genus Hantavirus is included in the family Bunyaviridae are viruses emerging carried by rodents, which can infect humans causing serious illness. In the Americas, the Hantavirus causing a pulmonary syndrome (HPS) with high lethality. About 1,600 cases of HPS have been reported in Brazil, cause over 1600 deaths. Seven species of Hantavirus are known in Brazil, including Araraquara virus circulating in Cerrado regions (or Savannah regions) of the related in rodents Necromys lasiurus. The development of a real-time RT-PCR for detection and quantitation of Araraquara virus, here we show the steps for developing a one-step SYBR Green real-time RT-PCR for virus Araraquara which proved to be specific for the genus and capable of detecting up to 10 copies of viral RNA per ml in the sample. Furthemore, we performed a phylogenetic analysis using Bayesian algorithms, with 190 complete sequences of the nucleoprotein gene, originating from 30 countries over a 25 year period (1985-2010) that were available in GenBank (NCBI). Based on an average rate of 6.8 x 10-4 (2.5 x 10-4 - 1 x 10-3) nucleotide substitutions per site/year, it was possible to infer that the Hantavirus would be about 1917 years old. The Hantavirus spreading in the world have occurred for nearly 500 years, and the introduction of these viruses have occurred in the Americas 549 years ago (95 years% HPD 1555-341) bye Central America or Mexico, causing the Hantavirus adapted to rodents subfamily Neotominae, and Brazil emerged 406 years ago (95% HPD 1150-250 years) the Hantavirus associated with rodents subfamily Sigmodontinae, and subsequently disseminated to South America. The work contributes significantly to the diagnosis of Hantavirus infections with one-step SYBR Green real-time RT-PCR and also contributes to an understanding of the phylogeny and evolutionary history of these viruses, offering subsidies have occurred understanding of how the Hantavirus spread of the worldwide.

A diarréia neonatal é o principal problema sanitário que acomete os bezerros nas primeiras semanas de vida, causando grandes prejuízos devido à morbidade, mortalidade, custos com tratamento e atraso no desenvolvimento. Os rotavírus são os mais importantes agentes virais causadores de gastroenterites em crianças e diarreia em diferentes espécies animais. Além do seu impacto econômico na produção animal, os bovinos podem atuar como reservatórios da diversidade genética e antigênica para humanos. Assim, o diagnóstico deste agente é fundamental para o desenvolvimento de medidas profiláticas mais especificas visando o seu controle. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um método de PCR em Tempo Real para a detecção de rotavírus bovinos em sistema Taqman® tendo como alvo, a proteína não-estrutural 5 (NSP5). Para isso, 113 amostras de fezes bovinas foram coletadas de reabanhos do estado de São Paulo, e previamente testadas por PCR convencional. Para a padronização da PCR em Tempo Real, a estirpe padrão foi clonada, gerando um plasmídeo com 3x1010 cópias/reação. Como controle exógeno foi utilizado β-actina. O limite de detecção foi determinado por diluições seriadas na base 10, detectando até 6x101 cópias/µl. A curva padrão da PCR em Temo Real para a detecção do segmento codificador da proteína NSP5 teve como resultados, uma eficiência de 100,47%; com slope igual a -3,18 e R2 de 1,0. De um total de 113 amostras testadas pela PCR convencional 63 delas (55,7%) foram consideradas positivas para rotavírus. Dessas mesmas amostras testadas, 5 não amplificaram para β-actina e não foram incluídas nas análises posteriores. Para a PCR em Tempo Real o limite de detecção foi considerado o valor de 6x101 cópias/reação, sendo definido o ponto de corte o ciclo (Ct) de número 36 para o teste com a amostra viral a partir do DNA ligado em vetor plasmidial. Considerando-se o ponto de corte de 60 (6x101) cópias/reação, das 108 amostras testadas, 63 (58,3%) foram consideradas positivas ao teste. O valor de concordância obtido através do teste Kappa, a um intervalo de confiança de 95%, a partir dos resultados gerados entre os testes de PCR convencional e PCR em foi de 0.279 (baixa concordância). Os resultados obtidos nesse estudo demonstrou que o teste foi eficiente podendo ser utilizado para um diagnóstico rápido e eficiente do rotavirus do grupo A, aumentando assim o repertório dos testes já estabelecidos / Neonatal diarrhea is the main health problem affecting the calves in the first weeks of life, causing major losses due to morbidity, mortality, treatment costs and delayed development. Rotaviruses are the most important causative agents of viral gastroenteritis in children and in different animal species. In addition to its economic impact on livestock, cattle can act as reservoirs for genetic and antigenic diversity for human samples. Therefore, the diagnosis of this agent is critical to the development of more specific preventive measures for their control. The objective of this work is to develop a method of PCR for rotavirus detection in cattle using TaqMan® system targeting the 5 nonstructural protein (NSP5). For this, 113 samples of cattle feces were collected from farms of São Paulo, and previously tested by convencional PCR. To PCR standardization, the standard sample was cloned, generating plasmid 3x1010 copies/reaction. The β-actin was usede as exogenous control. The limit of detection was determined by serial dilutions, to detect 6 x101 copies/µl. The standard curve of PCR to encoding segment detection NSP5 protein had as a result, an efficiency of 108.5%; with slope equal to -3.18 and R2 equal 1.. From a total of 113 samples tested by conventional PCR 63 (55.7%) were positive for rotavirus. From these samples 5 not amplifyed for β-actin gene and were not included in subsequent analyzes. For detection limit of Real-Time PCR was considered the amount of 6x101 copies / reaction, the cut-off being defined cycle (Ct) number 36 to the test with a viral sample from the DNA ligated into plasmid vector. Considering the cut-off 60 (6x101) copies/reaction of the 108 samples tested, 63 (58.3%) were positive to the test. The correlation value obtained by the Kappa test, at a 95% confidence interval, based on results generated between the conventional and PCR testing PCR was 0.279 (low agreement). The results of this study demonstrated that the probe can be efficiently used for a fast and efficient diagnosis of rotavirus of group A, thereby enhancing the repertoire of the established tests

Submitted by Pós Imunologia (ppgimicsufba@gmail.com) on 2017-02-14T17:42:57Z No. of bitstreams: 1 TESE PAULO CIRINO.pdf: 7207721 bytes, checksum: ef397ea71a14afb1814dc8df4c501c60 (MD5) / Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2017-03-23T12:45:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TESE PAULO CIRINO.pdf: 7207721 bytes, checksum: ef397ea71a14afb1814dc8df4c501c60 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-23T12:45:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE PAULO CIRINO.pdf: 7207721 bytes, checksum: ef397ea71a14afb1814dc8df4c501c60 (MD5) / CAPES / A periodontite é uma doença multifatorial, com participação significativa do hospedeiro, fatores ambientais e bacterianos. Sua fase inicial é resultante de uma microbiota multiespécie sinérgica e disbiótica, onde patógenos conhecidos como patógenos-chave possuem efeitos em toda comunidade e são componentes críticos no desenvolvimento do processo disbiótico. Nesta categoria encontra-se Porphyromonas gingivalis, um bacilo gram-negativo anaeróbico, associado as formas crônicas generalizadas da doença. A resposta do hospedeiro durante a periodontite é complexa, com elementos da imunidade inata e adaptativa que levam à inflamação crônica e destruição progressiva dos tecidos periodontais de suporte. O presente estudo objetivou avaliar a produção de citocinas e o perfil de expressão gênica em cultura de Células Mononucleares de Sangue Periférico (CMSP) de indivíduos com periodontite crônica, frente à proteína recombinante HmuY (rHmuY) de Porphyromonas gingivalis. As células de 46 voluntários, 26 sem periodontite (SP) e 20 com periodontite crônica (PC), foram cultivadas in vitro na ausência de estimulação antigênica e sob estímulos de Pokeweed e de rHmuY por 48 horas. Após o cultivo celular, foi realizado o ensaio imunoenzimático ELISA para avaliar a produção das citocinas IL-1beta, IL-4, IL-10 e IL-18 por CMSP nos sobrenadantes de cultura. Ainda, foi utilizado o arranjo de PCR em tempo real customizado para avaliar a expressão de mRNA de genes relacionados à apoptose, citocinas, quimiocinas e receptores, além de proteínas de choque térmico, fatores de transcrição e inibidor de transcrição. Não foram encontradas diferenças entre os grupos SP e PC na produção de IL-4 e IL- 1beta por CMSP estimuladas com rHmuY. Níveis mais elevados de IL-18 foram significativamente induzidos por HmuY e na ausência de estimulação em células do grupo PC. Os níveis de IL-10 foram reduzidos no grupo PC nas células estimuladas com HmuY e houve uma tendência para significância estatística para níveis baixos desta citocina nas células não estimuladas do grupo PC. A expressão de mRNA para CCL2 aumentou significativamente em CMSP sob estímulo HmuY e o mRNA para NFKBIL1 diminuiu significativamente nestas células sob o mesmo estímulo no grupo PC. Entretanto, houve uma tendência para significância estatística para níveis baixos de expressão de mRNA para IL-10 e IL-18 em CMSP em PC. Em comparação com os controles SP, os pacientes do grupo PC apresentaram baixos níveis de expressão de genes relacionados a apoptose (FAS, FAS-LG, TNFSF10 (TRAIL), BAK1, CASP9 e APAF1) quando as CMSP foram estimuladas com HmuY. Ainda, as células de pacientes do grupo PC apresentaram baixos níveis de expressão do gene CASP7 quando as células não foram estimuladas. Nossos achados sugerem que HmuY de Porphyromonas gingivalis pode ter um papel importante na modulação das vias intrínseca e extrínseca de apoptose e que esta proteína estimula resposta inflamatória no hospedeiro. / Periodontitis is a multifactorial disease, with significant participation of the host, environmental factors and bacterial. Its early stage results from a synergistic and disbiotic multispecies microorganisms where known as “keystone” have effects throughout the community and are critical components in the development of disbiotic process. This category is Porphyromonas gingivalis, an anaerobic gram-negative bacilli associated chronic generalized forms of the disease. The host response during periodontitis is complex with components of the innate and adaptive immune system that lead to chronic inflammation and progressive destruction of periodontal tissue support. This study aimed to evaluate the production of cytokines and the profile of gene expression in culture of Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC) of patients with chronic periodontitis, under stimulation of Porphyromonas gingivalis recombinant protein HmuY (rHmuY). The cells of 46 volunteers, 26 non-periodontitis (NP) and 20 chronic periodontitis (CP) were cultured in vitro in the absence of antigenic stimulation and under Pokeweed and rHmuY stimuli for 48 hours. After cell culture, the enzyme immunoassay ELISA was conducted to evaluate the production of cytokines IL-1b, IL-4, IL-10 and IL-18 by PBMC in culture supernatants. Further, PCR was used arrangement in real time customized to evaluate the mRNA expression of apoptosis related genes, cytokines, chemokines and receptors, and heat shock proteins, transcription factors and transcription inhibitor. No differences were found between the NP and CP groups in IL-4 and IL-1beta by PBMC stimulated with rHmuY. Higher levels of IL-18 were significantly induced HmuY in the absence of stimulation in cells of CP group. IL-10 levels were reduced in CP group in cells stimulated with HmuY and there was a trend towards statistical significance for low levels of this cytokine in unstimulated cells CP group. The expression of mRNA for CCL2 increased significantly in PBMC under HmuY stimulus and the mRNA for NFKBIL1 decreased significantly in these cells under the same stimulus in the CP group. However, there was a borderline significance for low levels of mRNA expression for IL-10 and IL-18 in PBMC of CP. Compared to the NP controls, patients in the CP group had low gene expression levels related apoptosis (FAS, FAS-LG, TNFSF10 (TRAIL), BAK1, CASP9 and APAF1) when PBMC were stimulated with HmuY. Further, cells in the CP group patients showed low levels of expression of the gene CASP7 when the cells were not stimulated. Our findings suggest that HmuY of Porphyromonas gingivalis can play an important role in the modulation of intrinsic and extrinsic pathways of apoptosis and that this protein stimulates inflammatory response in the host.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2014-05-20T17:14:19Z No. of bitstreams: 1 Adenizar Delgado das Chagas Jr. Avanços... 2014..pdf: 11153892 bytes, checksum: 48154dea65a7a4a32a54408e694c5d30 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-20T17:14:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Adenizar Delgado das Chagas Jr. Avanços... 2014..pdf: 11153892 bytes, checksum: 48154dea65a7a4a32a54408e694c5d30 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / A leptospirose é uma zoonose causada por espiroquetas patogênicas pertencentes ao gênero Leptospira. O modelo da doença em camundongos tem vantagens devido à ampla gama de ferramentas genéticas e imunológicas disponíveis para pesquisas básicas. A maior limitação na conduta clínica e na pesquisa experimental da leptospirose é o fraco desempenho dos métodos disponíveis para detecção direta e para quantificação de leptospiras. Foi incluído nesta tese um conjunto de três manuscritos que visam investigar o desfecho da infecção pela cepa virulenta de Leptospira interrogans nas linhagens de camundongos selvagens (A, CBA, BALB/c e C57BL/6), em camundongos óxido nítrico sintase induzível (iNOS) Knockout (KO), camundongos gene ativador de recombinação 1 (RAG1) KO , camundongos CB17 com imunodeficiência combinada grave (SCID), e os seus respectivos controles selvagens C57BL/6 e BALB/c. Investigar a confiabilidade do método de quantificação do imprint (IM), comparando os resultados obtidos com esta técnica aos obtidos com a utilização do PCR em tempo real (qPCR) para detectar e quantificar leptospiras em amostras de rim de ratos e hamsters experimentalmente infectados. Como esperado, nenhuma das linhagens de camundongos selvagens foram suscetíveis à leptospirose letal. A linhagem A e C57BL/6 exibiram altas cargas de Leptospira nas amostras de rim e as linhagens CBA e C57BL/6 desenvolveram lesões inflamatórias graves, enquanto a linhagem BALB/c provou ser a mais resistente apresentando leptospirose subclínica. Os camundongos iNOS KO e selvagem sobreviveram sem sintomas clínicos de leptospirose. A frequência e gravidade das nefrites foram significantemente menores nos camundongos iNOS KO. Todos os animais RAG1 KO e SCID morreram de leptospirose aguda, enquanto que todos os camundongos selvagens sobreviveram. A hemorragia pulmonar foi observada em 57 e 94% dos camundongos RAG 1 KO e em 83 e 100% dos camundongos SCID, usando doses de inóculos de 107 e 106 leptospiras, respectivamente. Não houve evidências de hemorragia pulmonar nos controles selvagens. Nos modelos de infecção agudo e crônico, houve correlação positiva estatisticamente significante (P < 0,05) na quantificação de leptospiras pelos métodos do qPCR e do IM. Como conclusão geral, a linhagem de camundongos A pode ser a linhagem de escolha em estudos na qual se pretende recuperar um grande número de leptospiras de rins colonizados. As linhagens CBA e C57BL/6 desenvolveram, com maior frequência, lesões inflamatórias e podem ser as mais adequadas para estudos de leptospirose associados com nefrite intersticial. A linhagem BALB/c é a mais indicada para estudar mecanismos que envolvam a imunidade inata e/ou a rápida resposta imune adaptativa. A ausência do gene do iNOS no modelo murino resultou em uma diminuição significativa da suscetibilidade para o desenvolvimento da nefrite intersticial. Além disso, a ausência de linfócitos B e T funcionais não impediu a ocorrência de hemorragia pulmonar. Estes dados fornecem fortes evidências de que a hemorragia pulmonar na leptospirose não está relacionada apenas a mecanismos autoimunes. Para a detecção e quantificação de leptospiras o método do imprint foi equivalente ao qPCR. / Leptospirosis is a zoonosis caused by pathogenic spirochaetes belonging to the genus Leptospira. The mouse disease model is advantagous due to the broad array of immunological and genetic tools available for basic research. A major limitation in the clinical management and experimental research of leptospirosis is the poor performance of the available methods in the direct detection and quantification of leptospires. This thesis includes three manuscripts that investigate the outcome of infection by a virulent strain of Leptospira interrogans in wildtype mice strains: A, CBA, BALB/c and C57BL/6; in iNOS knockout (KO) mice, recombination activating gene 1 (RAG1) KO mice and CB17 severe combined immunodeficiency (SCID) mice. To investigate whether the imprint method (IM) of quantification was reliable we compared it with against real time PCR (qPCR) for the detection and quantification of leptospires in kidney samples from rats and hamsters. As expected, none of the wildtype mice were susceptible to lethal leptospirosis. The A and C57BL/6 strains exhibited high leptospiral loads in the kidney samples and the CBA and C57BL/6 strains developed severe inflammatory lesions, whilst the BALB/c strain proved to be the most resistant to subclinical leptospirosis. The iNOS KO mice survived with no clinical symptoms of leptospirosis. The frequency and severity of nephritis was significantly lower in the iNOS KO mice. All of the RAG 1 KO and SCID animals died of acute leptospirosis, whereas all of the wildtype mice survived. Pulmonary haemorrhage was observed in 57 and 94% of Rag1 KO mice and in 83 and 100% of SCID mice, using inoculum doses of 107 and 106 leptospires, respectively. There was no evidence of pulmonary haemorrhage in the wildtype controls. In both the acute and chronic infection models, the correlation between quantification by qPCR and the IM was found to be positive and statistically significant (P < 0.05). In conclusion, the mouse A strain would be the strain of choice in studies requiring the recovery of a large number of leptospires from colonized kidneys. The CBA and C57BL/6 strains developed more inflammatory lesions and would be the most suitable for studies of leptospirosis associated with interstitial nephritis. The BALB/c strain appeared to be the most suitable for studying mechanisms involving innate immunity and/or rapid adaptive immune response. The absence of the iNOS gene in the murine model resulted in a significant decrease in susceptibility to the development of interstitial nephritis. Furthermore, the absence of functional B and T lymphocytes did not prevent the occurrence of pulmonary hemorrhage. These data provide strong evidence that pulmonary hemorrhage in leptospirosis is not only related to autoimmune mechanisms. For the detection and quantification of leptospires the imprint method was quivalent to that of qPCR. Keywords:

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-04-29. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:21Z : No. of bitstreams: 1 Publico-178.pdf: 625763 bytes, checksum: bd311a8cd3f7ff010bc833233dd4c82b (MD5) / Objetivo: Desenvolvimento e aplicação de protocolos de Nested Multiplex PCR e PCR em Tempo Real para a detecção bacteriana e classificação de Gram em amostras de humor aquoso e vítreo coletadas de pacientes com suspeita clínica de endoftalmite. Métodos: Especificidade analítica foi estabelecida utilizando 31 microrganismos clinicamente importantes, 20 gram-positivos e 11 gram-negativos. Reação cruzada com DNA humano e DNA fúngico foi testada. Amostras controles de humor aquoso coletadas após facoemulsificação foram incluídas. Sensibilidade analítica para as metodologias de PCR foram determinadas utilizando diluição seriada 1:10 de DNA extraído de S. epidermidis e E. coli. As técnicas foram posteriormente aplicadas e testadas em amostras de humor aquoso e vítreo coletadas de pacientes com diagnóstico clínico de endoftalmite. Preparações comerciais de Taq DNA polimerase foram pré-tratadas com DNaseI. Resultados: Amplificação genérica do gene 16S rDNA foi positiva para todos os isolados bacterianos. Classificação de Gram pela técnica de Nested Multiplex PCR não foi possível apenas para isolados de Acinetobacter spp. Utilizando PCR Multiplex em Tempo Real, todos os isolados foram classificados por Gram, sendo que P. acnes exibiu um padrão misto de amplificação. Limite de detecção da metodologia de Nested Multiplex PCR foi de 1 fg/μl para S. epidermidis e E.coli. A sensibilidade de detecção para S. epidermidis e E. coli utilizando reação para detecção universal bacteriana por PCR em Tempo Real com SYBR Green foi de 100 fg/μl (E = 0,82 e 0,86; r2 = 0,99) e 1 pg/μl utilizando metodologia de PCR Multiplex em Tempo Real com Sondas TaqMan (E = 0,66 e 0,77; r2 = 0,99). A positividade da cultura para detecção bacteriana a partir de amostras de humor aquoso e vítreo foi de 47,6% e pelas metodologias de Nested Multiplex PCR e PCR em Tempo Real foi de 100% e 95,2% respectivamente. Entre as amostras negativas por cultura (n=10), a metodologia de Nested Multiplex PCR foi positiva para todas (100%) e PCR em Tempo Real em 90% dos casos (9/10). Entretanto, a proporção de falso-positivos pela metodologia de Nested Multiplex PCR (65,4%) foi superior aos valores obtidos por PCR em Tempo Real (7,7%). A classificação de gram foi obtida em 88,8% dos casos por Nested PCR e 100% por PCR em Tempo Real. A correlação entre a identificação clássica e classificação de Gram molecular foi 63,6% para ambas as técnicas. A identificação pelo sequenciamento dos produtos obtidos por Nested Multiplex PCR e PCR em Tempo Real apresentou correlação de 100% e 88,8%, respectivamente, quando comparada a identificação fenotípica. Conclusões: As metodologias de PCR apresentaram boa correlação quando comparadas com os resultados da cultura e a detecção passou de 47,6% por cultura para 100%, demonstrando serem testes viáveis e mais sensíveis para a caracterização laboratorial de endoftalmite. / Objective: Development and application of Nested Multiplex PCR and Real Time PCR assays for detection and Gram classification of bacteria using aqueous and vitreous humor collected from patients with suspected endophthalmitis. Methods: Analytical specificity was established using 31 clinically important pathogens, 20 gram-positive and 11 gram-negative. Specificity was also tested using human DNA and fungal DNA. Control samples of non-infected aqueous humor collected at the end of phacoemulsification surgery were included. Analytical sensitivity was determined using a 10-fold dilution of S. epidermidis and E. coli DNA. After, methodologies were tested in aqueous and vitreous humor collected from patients with clinical diagnosis of endophthalmitis. Comercial Taq polymersase preparations were DNA decontaminated using DNaseI pretreatment. Results: Universal amplification of 16S rDNA was achieved for all bacterial isolated. Nested Multiplex PCR failed only to determine the Gram status of Acinetobacter spp. Gram classification was achieved for every bacterial isolates using a Multiplex Gram-Specific TaqMan-based PCR, and only a P. acnes isolate showed a mixed signal. Limit of detection using Nested Multiplex PCR was 1 fg/μl for both S. epidermidis and E. coli. Sensitivity for detection of S. epidermidis and E. coli DNA using a SYBR Green 16S rDNA-based universal PCR was 100 fg/μl (E = 0.82 and 0.86; r2 = 0.99) and 1 pg/μl using a Multiplex Gram-Specific TaqMan-based PCR (E = 0.66 and 0.77; r2 = 0.99). Culture was positive in 47.6% of aqueous and vitreous humor analysis. Nested Multiplex PCR and Real Time PCR assays were positive in 100% and 95.2% of these cases, respectively. Among negative culture samples, Nested Multiplex PCR was positive for all (100%) and Real Time PCR assays in 90% of cases (9/10). Gram classification was completed for 88.8% and 100% samples using Nested Multiplex PCR and Real Time PCR methodologies, respectively. Correlation of 63.6% between microbiological and molecular Gram classification was observed using both molecular assays. 16S rDNA sequence-based identification using Nested Multiplex PCR and Real Time PCR products showed 100% and 88.8% correlation respectively when compared with phenotypic identification. Conclusions: Both PCR methodologies presented good correlation when compared with culture-proven results and bacterial detection was improved from 47.6%% to 100% showing to be feasible tests for laboratorial characterization of bacterial endophthalmitis. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações