A significativa prevalência da infecção pelo HTLV-1/2 no Brasil tornou compulsória a triagem sorológica em bancos de sangue desde 1993. A realização de um diagnóstico eficaz e seguro desta infecção tem importância no correto aconselhamento dos pacientes, bem como na adoção de medidas preventivas em relação à transmissão do HTLV-1/2. Entretanto, a ineficiência dos testes confirmatórios disponíveis somado ao alto custo, são fatores limitantes para a conclusão segura do status clínico do paciente. O objetivo deste trabalho foi desenvolver, padronizar e validar uma plataforma molecular (NAT) multiplex utilizando a metodologia de PCR em tempo real para o diagnóstico confirmatório e discriminatório da infecção pelo HTLV-1/2. Para tanto, foi padronizada a PCR em tempo real utilizando o sistema de sondas de hidrólise (TaqMan®) e a região gênica viral pol foi utilizada como alvo dessas reações. As reações foram otimizadas e validadas em amostras de DNA de controles positivos e negativos, amostras de DNA obtidas a partir do sangue total de indivíduos infectados pelo HTLV-1/2, candidatos à doação de sangue e de pacientes infectados por outras viroses (HIV, HBV e HCV). Após a padronização, a plataforma molecular foi validada em relação aos seguintes parâmetros: sensibilidade analítica, sensibilidade diagnóstica, especificidade analítica, especificidade diagnóstica, precisão e robustez. O limite de detecção do teste (LoD) foi de 3,85 cópias/reação para HTLV-1 e 10,88 cópias/reação para HTLV-2. Para a especificidade, não foi observada reação cruzada com os vírus HAV, HBV, HCV, HIV-1 e HIV-2 e B19V obtidos a partir de um painel de referência viral e nem com amostras de indivíduos portadores de HIV, HBV ou HCV. A sensibilidade diagnóstica foi de 94,6% para HTLV-1 e 78,6% para HTLV-2. O coeficiente de variação encontrado no parâmetro precisão foi de até 0,475%. A metodologia desenvolvida é uma ferramenta simples, de baixo custo, sensível e altamente específica, portanto, adequada para detecção e discriminação da infecção por este retrovírus. A padronização desta plataforma tem um importante impacto no fortalecimento da capacitação tecnológica nacional. Além disso, propõe seu uso no algoritmo diagnóstico, o qual permitirá a conclusão segura do diagnóstico do HTLV-1/2. / The significant prevalence of HTLV-1/2 infection in Brazil has turned the serological testing for this virus mandatory in national blood banks since 1993. The performance of efficient and safe diagnosis of this infection has importance on the correct counseling of the patients and the prevention of the transfusion/hemoderivatives transmitted HTLV-1/2 infection. However, the inefficiency of the available confirmatory tests combined with their high cost present limiting factors for adequate conclusions over the clinical status of the patient. A safe diagnosis of the HTLV-1/2 infection is of crucial importance for the correct counseling of the patients and prevention of the transmission of the infection by blood transfusions, breastfeeding and solid organ transplantations. Therefore, the objective of this study was to develop, optimize and validate a molecular multiplex platform (NAT) utilizing the real-time PCR methodology for confirmatory and discriminatory diagnosis of the HTLV-1/2 infection. DNA samples obtained from HTLV-1/2 positive patients, blood donor candidates, and HIV, HBV and HCV infected patients were used in this study. The real-time PCR was optimized using the TaqMan® system (hydrolysis probes) and the pol gene was a target for real-time amplification. After optimization, the molecular platform was validated by analysis of the analytic and diagnostic sensitivity, analytic and diagnostic specificity, precision, and robustness. The detection limit (LoD) of the test was 3.85 copies/reaction for HTLV-1 and 10.88 copies/reaction for HTLV-2. Evaluation of the specificity did not demonstrate cross reaction with human viruses like HAV, HBV, HCV, HIV-1, HIV-2 and B19V obtained from a diagnostic panel and also with samples obtained from HIV, HBV or HCV positive individuals. The diagnostic sensitivity was 94.6% for HTLV-1 and 78.6% for HTLV-2. The estimated variation coefficient of the precision analysis was not more than 0.475%. Therefore, this methodology presents simple, inexpensive, sensitive and highly specific test, and can be used adequately for the detection and discrimination of this retroviral infection. The optimization of this molecular platform have important impact on the improvement of the technologic capability and it can be used for the definition of a national diagnostic algorithm which will permit a safe conclusion of the HTLV-1/2 diagnosis.

O cultivo de células humanas para fins experimentais e terapêuticos se firmou como um dos pilares da biologia celular e tem se tornado uma prática laboratorial cada vez mais disseminada. Associada a esse processo está a contaminação por microrganismos, dentre os quais se destacam as bactérias do gênero Mycoplasma spp., os quais são os contaminantes detectados com maior frequência in vitro. Um dos pontos críticos no processo de garantia da qualidade, pureza e segurança para uso destas células é a adoção de uma metodologia analítica, para detecção de Mycoplasma spp., que seja simples e de rápida execução, com sensibilidade e especificidade adequada e economicamente viável. O objetivo desse trabalho foi desenvolver uma plataforma molecular (PCR em tempo real) para detecção de Mycoplasma spp. em culturas celulares. Para tanto, foram testados diversos conjuntos de primers (gene 16S rDNA) dentre os quais um foi selecionado para a plataforma molecular. Foram utilizadas amostras de DNA obtidas a partir do sobrenadante de cultura. A PCR em tempo real in house foi padronizada utilizando o intercalante fluorescente de DNA dupla fita BRYT Green® e produziu um fragmento de 270 pares de bases. A temperatura de melting para as amostras positivas foi definida no intervalo de 81 a 84°C. A plataforma molecular foi validada por meio dos parâmetros sensibilidade analítica e diagnóstica, especificidade analítica, potencial de arraste, precisão e robustez. O limite de detecção do teste (LOD) foi de 5 cópias/5 ?L. Para a especificidade, foi observada reação cruzada com bactérias de relação filogenética próxima e com DNA de célula humana. A sensibilidade diagnóstica foi de 100%. Não foi houve contaminação por arraste. O coeficiente de variação encontrado no parâmetro precisão foi de 0,64% e 1,80% para a avaliação intra-ensaio e inter-ensaio, respectivamente. O coeficiente de variação da análise robustez foi de 5,42%. Ao comparar a plataforma molecular com o teste comercial, observou-se que 29,85% (n=40) das amostras apresentaram resultados falso-negativos pelo teste comercial. Determinou-se ainda que a PCR em tempo real in house foi mais sensível do que o teste comercial. A análise por microscopia eletrônica de varredura demonstrou a presença de estruturas sugestivas de espécies de Mycoplasma spp. na superfície das células. A análise filogenética permitiu a classificação das espécies encontradas. Os resultados obtidos neste trabalho permitiram propor o algoritmo para aplicação de um método de detecção simples e rápido para Mycoplasma spp.; e fazer deste uma ferramenta para o controle de qualidade das células cultivadas, garantindo a eficiência destas células para uso em pesquisa e maior segurança para uso em terapia celular. / The culture of human cells for experimental and therapeutic purposes has been consolidated as one of the foundations of cell biology and has increasingly become a widely used laboratory practice. The contamination by microorganisms is associated with this process, among them we can highlight bacteria of the genus Mycoplasma spp., which are contaminants more frequently detected in vitro. One of the critical points in the process of assuring quality, purity, and safety for the use of these cells is the adoption of an analytical methodology for the detection of mycoplasma that is simple and fast to conduct, with proper sensitivity and specificity and that is also economically viable. The objective of this work was to develop a molecular platform (real time PCR) for the detection of mycoplasmas in cell cultures. Therefore, we tested several sets of primers (16S rDNA gene), among them one was selected for the molecular platform. DNA samples used were obtained from the culture supernatant. In house real time PCR was standardized using BRYT Green® double-stranded DNA intercalating fluorescent and produced a fragment of 270 pair bases. The melting temperature for the positive samples was set in the range 81 to 84°C. The molecular platform was validated through the parameters: analytical and diagnostic sensitivity, analytical specificity, carry-over contamination, precision and robustness. The limit of detection of the test (LOD) was 5 copies/5 ?L. For specificity, it was observed a cross reaction with bacteria of close phylogenetic relationship and with human cell DNA. Diagnostic sensitivity was 100%. There was no carry-over contamination. The coefficient of variation was found in the precision values of 0.64% and 1.80% for intra-assay and inter-assay assessment, respectively. The variance coefficient of the robustness analysis was 5.42%. By comparing the molecular platform with the commercial test, we observed that 29.85% (n=40) of the samples showed false negative results by the commercial test. It has been determined further that the real-time PCR in house was more sensitive than the commercial test. The analysis by scanning electron microscopy demonstrated the presence of suggestive structures of Mycoplasma spp. species in the surface of cells. Phylogenetic analysis allowed the classification of the species found. The results obtained in this work allowed us to propose the algorithm for application of a simple and fast method for mycoplasma detection and making from this tool for quality control for cultured cells, assuring the efficiency of these cells for use in research and greater safety for use in cell therapy more safety to patients subjected to cell therapy.

Submitted by Jorge Silva (jorgelmsilva@ufrrj.br) on 2017-06-26T17:32:22Z No. of bitstreams: 1 2015 - Thamyris Sampaio Vilela.pdf: 3001387 bytes, checksum: d945149445f8ee2765222f5475c7eaa2 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-26T17:32:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015 - Thamyris Sampaio Vilela.pdf: 3001387 bytes, checksum: d945149445f8ee2765222f5475c7eaa2 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / CAPES / CNPq / FAPERJ / This study aimed to develop a real-time PCR (qPCR) assay for diagnosis of Plasmodium spp. using as target the 18S rDNA and Cyt b genes. A range of 101 blood samples were collected from Gallus gallus in poultry rustic breeds of in Rio de Janeiro, Brazil. The collected bloods were used to prepare blood smears and to extract the deoxyribonucleic acid (DNA) of these samples. There with, molecular protocols were tested, such as the already published conventional PCR (cPCR) and nested PCR (nPCR), designed for Plasmodium spp. In this study two qPCR protocols were developed using primers targeting the Cyt b and 18S rDNA genes. The qPCR detection limit for both genes was 10 copies of the target DNA, which were higher than the detection limit observed in nPCR and cPCR. In qPCR, 69.30% (n = 70/101) samples were positive targeting 18Sr DNA gene and 59.40% (n = 60/101) samples were positive targeting Cyt b gene. In nPCR and cPCR, 54.45% (n = 55/101) and 52.47% (n= 53/101) samples were positive, respectively. In blood smear microscopy, 31 (30.69%) samples were positive. There was no disagreement between the results (p > 0.05) of qPCR for 18Sr DNA and Cyt b genes. Additionally, qPCR was more sensitive than the other techniques discussed, mostly related to blood smear microscopy (p < 0.05). Therefore, the two qPCR developed in the study showed more sensitivity than other techniques and enabled the detection of Plasmodium spp. in poultry even in low parasitemia. / Este estudo teve como objetivo desenvolver um ensaio de PCR em tempo real (qPCR) para o diagn?stico de Plasmodium spp. utilizando os genes 18S rDNA e cyt b. Foram coletadas 101 amostras de sangue de aves da esp?cie Gallus gallus de cria??o r?stica ou org?nica no munic?pio de Serop?dica, Rio de Janeiro. Os sangues coletados foram utilizados na prepara??o de esfrega?os de sangue e para extra??o do ?cido desoxirribonucl?ico (DNA) destas amostras. Protocolos de ensaios moleculares foram testados, tal como o PCR convencional (cPCR), nestedPCR (nPCR) e qPCR para Plasmodium spp. Neste estudo dois protocolos de qPCR foram desenvolvidos utilizando oligoiniciadores desenhados com alvo no citocromo b e 18S rDNA. O limite de detec??o para os dois genes qPCR foi de 10 c?pias do alvo de DNA, que foram maiores do que o limite de detec??o observado em nPCR e cPCR. Em qPCR, 69,30% (n = 70/101) amostras foram positivas com alvo no gene 18SrDNA e 59,40%(n = 60/101) amostras positivas com alvo no gene cyt b. Em nPCR e cPCR, 54,45% (n = 55/101) e 52,47% (n = 53/101) amostras foram positivas, respectivamente. Em microscopia de esfrega?o de sangue, 31 (30,69%) amostras foram positivas. N?o houve discord?ncia entre os resultados (p> 0,05) de qPCR para os genes 18SrDNA e cyt b.. Al?m disso, qPCR foi mais sens?vel do que as outras t?cnicas discutidas, principalmente relacionado com a microscopia ?ptica (p <0,05). Portanto, os dois ensaios de qPCR desenvolvidos neste estudo mostraram mais sensibilidade do que outras t?cnicas e permitiu a detec??o de Plasmodium spp. em aves de cria??o r?stica mesmo com baixa parasitemia.

Devido à sua múltipla utilidade, a cana-de-açúcar (Saccharum spp.) é amplamente cultivada em mais de 127 países tropicais e subtropicais. No Brasil, a cultura apresentou expansão em área plantada nos últimos anos em virtude da crescente demanda por biocombustíveis. Porém, a produção de mudas sadias tende a ser um fator limitante a este aumento de demanda, já que diversas doenças são transmitidas por toletes contaminados. Dentre estas, destaca-se o raquitismo da soqueira (RSD), causado pela bactéria fastidiosa Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) (KAO e DAMANN, 1980). De acordo com a literatura, a transmissão de Lxx se dá através de toletes contaminados e/ou instrumentos de corte, não havendo relatos sobre sua transmissão por sementes. Desta forma, seu controle se baseia no princípio da exclusão, através do uso de toletes tratados termicamente como fonte de material propagativo. Porém, não se conhece o efeito do tratamento no título de Lxx, uma vez que os relatos de eficiência da termoterapia baseiam-se em avaliações qualitativas. Em face destas informações, este estudo objetivou avaliar a transmissão de Leifsonia xyli subsp. xyli por sementes e também quantificar o efeito da termoterapia no título de Lxx em duas variedades de cana-de-açúcar através da PCR quantitativa em tempo real. No ensaio de transmissão via sementes, a bactéria foi detectada em altas incidências (>87%) em plantas de 90 dias oriundas de sementes coletadas de plantas infectadas e em quantidades estimadas superiores a 51 células por 100ng de DNA total de sementes. Além disso, aos 270 dias após o plantio, a bactéria foi isolada de 6 plantas. A identidade das colônias foi comprovada através de PCR convencional utilizando primers específicos para Lxx. Dois ensaios foram conduzidos para quantificar o efeito da termoterapia na população bacteriana. O título de Lxx foi determinado em folhas de plantas de duas variedades de cana-deaçúcar oriundas de toletes tratados termicamente ou não aos 90 dias após o plantio. O título inicial presente nos colmos utilizados como fonte de toletes interferiu na eficiência do tratamento, que reduziu a população bacteriana somente no ensaio onde os colmos apresentaram elevado título bacteriano inicial. Além disso, 70 e 55% das plantas oriundas de toletes tratados termicamente no primeiro e no segundo ensaio, respectivamente, apresentavam células de Lxx, porém em menores quantidades quando comparadas a plantas oriundas de toletes não tratados. Com isso, conclui-se que Lxx é transmitida em elevada frequência via sementes e a termoterapia, embora não tenha efeito erradicante pronunciado, é capaz de reduzir o título bacteriano no tecido vegetal. / Due to its multiple uses, sugarcane (Saccharum spp.) is widely cultivated in more than 127 tropical and subtropical countries. In Brazil, sugarcane cropping has increased in recent years because of the growing demand for biofuels. However, the production of healthy seedlings tends to be a limiting factor to this increase, since contaminated setts transmit many diseases. Among these, the Ratoon Stunting Disease (RSD) is a major disease caused by the fastidious bacterium Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) (KAO and DAMANN, 1980). According to the literature, the transmission of Lxx occurs through contaminated setts and/or cutting tools, but there are no reports of its transmission by seeds. Therefore, its control is based on the principle of exclusion using heat-treated setts as source of propagative material. However, the quantitative effect of the treatment on the bacterial titer is not known, since reports of thermotherapy efficiency are based on qualitative assessments. This study aimed to evaluate the transmission of Leifsonia xyli subsp. xyli by seeds and to quantify the effect of thermotherapy on Lxx in two sugarcane varieties using real-time quantitative PCR. In the test of disease transmission by seeds, the bacterium was detected in high incidences (>87%) in 90-day old plants generated from seeds collected from infected plants in quantities exceeding 51 cells per 100ng of total DNA of seeds. In addition, at 270 days after planting, the bacterium was isolated from six plants. The colony identity was confirmed by conventional PCR using Lxx-specific primers. Two trials were conducted to quantify thermotherapy effect on bacterial population. Lxx titers were determined 90 days after planting in plant leaves of two sugarcane varieties originated from setts subjected or not to heat-treatment. The initial bacterial titer in the stalks affected the treatment efficiency, which significantly reduced Lxx titers only in the trial where the stalks presented high initial bacterial levels. Moreover, 70 and 55% of the plants originated from heat-treated setts in the first and second tests, respectively, were infected with Lxx, cells; however, in smaller amounts compared to plants from untreated setts. Thus, it is concluded that Lxx is transmitted in high frequency by seeds and that the thermo treatment, although not efficient as an eradicating treatment, reduces the bacterial population in the plant tissue.

As tonsilas palatinas e adenoides são órgãos linfoides epiteliais do trato respiratório superior, onde ocorre o primeiro contato entre antígenos inalados e células de defesa do hospedeiro. O tecido adenoamigdaliano está em contato constante com uma grande diversidade de bactérias e vírus, que se reflete na elevada taxa de detecção de patógenos bacterianos e virais nesses tecidos, mesmo que saudáveis. Infecções crônicas ou repetidas nas mucosas dos tecidos linfoides podem desencadear o desenvolvimento de um estado inflamatório crônico e a presença de hiperplasia tecidual. Esse estado está associado com inúmeras complicações como rinussinusites de repetição, ronco, obstrução nasal, disfunção da tuba auditiva, apnéia obstrutiva do sono, otite média, alterações do desenvolvimento facial, desenvolvimento comportamental. Por isso, este trabalho tem como objetivo principal analisar co-detecções das principais bactérias da microbiota respiratória humana (Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Haemophylus influenzae, Moraxella catahrralis e Pseudomonas aeruginosa) de pacientes com e sem adenoamigdalite crônica através da técnica de PCR em tempo real. Tivemos como principal bactéria detectada em nosso estudo H. influenzae, que foi encontrada em altos níveis na amígdala e adenoide. Já nas secreções, a bactéria de maior frequência encontrada foi S. pneumoniae. Os resultados de comparação entre os 2 grupos (pacientes com a doença e sem a mesma) não foram estatisticamente significantes, porém não menos importante, mostrando que os principais agentes comensais que colonizam o trato aéreo superior (Streptococcus pneumoniae, Haemophylus influenzae e Moraxella catahrralis) sao elevados em ambos os grupos, e que provavelmente não são fundamentais na fisiopatogenia da hipertrofia adenoamigdaliana/tonsilites de repetição. Como conclusão podemos observar que as bactérias H. influenzae, M. catarrhalis e S. pneumoniae tiveram altas frequências de detecção em amígadalas, adenoides e lavados nasofaríngeo de crianças sem hipertrofia tonsilar e sintomatologia de infecção respiratória. Além disso, não houve maiores frequências de detecção de bactérias presentes na microbiota em pacientes com hipertrofia tonsilar do que em controles e diferentemente das demais bactérias, houve concordância moderada ou boa nas detecções de M. catarrhalis e H. influenzae entre adenoide e amígdada de indivíduos sem sintomas respiratórios. / The tonsils and adenoids are lymphoid epithelial organs of the upper respiratory tract, where the first contact between inhaled antigens and host defense cells occurs. In fact, the adenoid and tonsillar tissue is in constant contact with a wide variety of bacteria and viruses, which is reflected in the high rate of detection of bacterial and viral pathogens in these tissues, even if healthy. Chronic or recurrent infections of mucosal lymphoid tissues may trigger the development of a chronic inflammatory condition and the presence of tissue hyperplasia. This condition is associated with numerous complications such as rinussinusites repeat, snoring, nasal congestion, Eustachian tube dysfunction, obstructive sleep apnea, otitis media, abnormal facial development, behavioral development. Therefore, this study aims to analyze co-detections of the major human respiratory microbiota bacteria (Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Moraxella catahrralis and Pseudomonas aeruginosa) in patients with and without chronic adenoamigdalite using the technique of real time PCR. We had the main bacteria detected in our study H. influenzae, which was found in high levels in the amygdala and adenoids. Already in the secretions, the bacterium most frequently found was S. pneumoniae. In conclusion we can see that the bacteria H. influenzae, M. catarrhalis, and S. pneumoniae had high frequency of detection in amígadalas, adenoids and nasopharyngeal washed children without tonsillar hypertrophy and symptoms of respiratory infection. In addition, there were no major frequency detection of bacteria present in the microbiota in patients with tonsillar hypertrophy than in controls, and unlike the other bacteria, there was moderate to good agreement in the detection of M. catarrhalis and H. influenzae between adenoid and amígdada of individuals without respiratory symptoms.

A floresta plantada de eucalipto representa a maior porcentagem entre as florestas plantadas no Brasil, principalmente para a producao de papel e celulose. Porem, durante todo o seu desenvolvimento, o eucalipto sofre o ataque de diferentes patogenos, e entre eles esta o fungo Puccinia psidii causador da ferrugem, principal doenca do eucalipto em regioes tropicais. Assim, com o intuito de estudar alguns mecanismos de defesa da planta contra a infeccao do fungo, este trabalho visou analisar a expressao genica de enzimas relacionadas ao estresse oxidativo e a atividade das mesmas; e o proteoma de clones de eucalipto resistentes e suscetiveis, ao longo do processo de infeccao, colonizacao e multiplicacao do fungo nas plantas. Foi possivel observar diferencas na expressao dos genes em todos os horarios estudados, principalmente as 24 horas apos inoculacao com o fungo. Alem disso, com a analise do proteoma pode-se observar algumas proteinas de grande relevancia para este trabalho, como algumas relacionadas a estresse oxidativo e a resposta de defesa da planta. / The eucalyptus planted forest represents the major percentage among all planted forests in Brazil, mainly for the production of paper and cellulose. However, during its development, the eucalyptus can be attacked by a large number of different pathogens, like the fungus Puccinia psidii, the causer of the eucalyptus rust, main disease that affects the eucalyptus in tropical regions. Thus, in order to study some plant defense mechanisms against the infection of the fungus, this study aimed to analyse the gene expression of some enzymes related to oxidative stress and their activities, and the proteome of resistant and susceptible eucalyptus clones, during the process of infection, colonization and multiplication of the fungus in the plant. We could observe differences in the gene expression at all times studied, mostly at 24 hours after inoculation with the fungus. Besides, with the proteome analysis we could find the very relevant proteins for this study, for instance some proteins related to the oxidative stress and to the plant defense response.

O Brasil é o maior produtor mundial de feijão com produção média anual de 3,5 milhões de toneladas, entretanto, um dos maiores problemas enfrentados por essa cultura é o déficit hídrico, que leva a uma redução considerável em seu rendimento. Dessa forma, a identificação de genes que controlam os mecanismos de defesa e adaptação do feijoeiro à falta de água durante o seu desenvolvimento é de grande utilidade. E, como a tolerância à seca é um caráter multigênico, genótipos com diferentes graus de tolerância apresentam expressão gênica diferencial, com ativação e/ou repressão de determinados genes. Diante disso, esse trabalho teve como objetivos: (i) identificar genes diferencialmente expressos em dois genótipos de feijoeiro comum, sendo um tolerante (BAT 477) e o outro suscetível (IACCarioca 80SH) à seca; (ii) verificar a expressão gênica espacial (em raízes, caules e folhas) e temporal (cinco níveis crescentes de déficit hídrico - 24 h, 48 h, 72 h, 96 h e 120 h de exposição ao estresse) por meio de RT-qPCR; (iii) predizer a função dos genes identificados, com base nos genes ortólogos de Arabidopsis thaliana, usando dados públicos de microarranjo disponíveis na plataforma Genevestigator. Para atingir esses objetivos, foi conduzido um experimento em casa-de-vegetação, sendo induzido o déficit hídrico, por meio da suspensão da irrigação, quando as plantas atingiram o estádio fenológico R5, mantendo sob suprimento hídrico adequado as plantas-controle. Foi então utilizada a técnica de cDNA-AFLP para isolar os transcritos diferencialmente expressos entre os dois genótipos, sob seca, a qual aliada ao sequenciamento possibilitou a identificação e anotação de 45 transcritos, sendo 21 exclusivamente expressos no genótipo tolerante e 24 no genótipo suscetível. Dentre os transcritos identificados no genótipo tolerante, podem ser listados pelo menos 11, com potencial de serem usados para transformação genética (chlorophyll A-B binding protein, HSP40, HSP70, glycosyl hydrolase, serine/threonine protein kinase, trehalose-6-phosphate synthase, E3 ubiquitin ligase, fructose biphosphate aldolase, mediator complex subunit 13, aquaporin nodulin MTN-3-related e TCP transcription factor), e no genótipo suscetível, podem ser listados nove (coatomer protein complex, monoamine-oxidase A repressor R1, synaptobrevin, haloacid dehalogenase-like hydrolase, ADP-ribosylation factor, mTERF, serine protease S1C HtrA-related, legume lectin e SWI/SNF-related chromatin binding). Na análise de expressão gênica espacial e temporal, os transcritos mais promissores para uso em trabalhos futuros de transformação genética foram: aquaporin nodulin MTN3, E3 ubiquitin ligase, serine/threonine protein kinase, glycosyl hydrolase e HSP 70 protein, uma vez que tiveram uma expressão bastante pronunciada no genótipo tolerante. Através das análises in silico, baseadas nos genes ortólogos de A. thaliana, foram descobertos processos e vias metabólicas que podem estar envolvidos na resposta do feijoeiro comum ao déficit hídrico. Além disso, foram identificados genes associados com a tolerância à seca, corroborando os dados experimentais. Sendo assim, os resultados obtidos nesse trabalho fornecem o entendimento necessário ao desenvolvimento de ferramentas moleculares (marcadores para genes diferencialmente regulados) para serem utilizados em programas de melhoramento, bem como para informação genética básica na anotação funcional do genoma do feijoeiro e também para utilização desses genes candidatos em trabalhos de transformação genética para obtenção de plantas mais tolerantes à seca. / Brazil is the largest producer of common beans, with average annual production of 3.5 million tonnes; however, one of the biggest problems faced by this crop is drought, which leads to a considerable reduction in their yield. Thus, the identification of genes that control the defense mechanisms and adaptation of common bean to drought during its development is very useful. Drought tolerance is a multigenic character, so genotypes with different degrees of water deficit tolerance exhibit differential gene expression, with activation and/or repression of certain genes. Therefore, this study aimed to: (i) identify differentially expressed genes in two common bean genotypes, one tolerant (BAT 477) and other susceptible (IAC-Carioca 80SH) to drought, (ii) verify the spatial (root, stem and leaves) and temporal (five increasing levels of water deficit - 24 h, 48 h, 72 h, 96 h and 120 h of stress exposition) gene expression by RTqPCR (iii) predict the genes function, based on Arabidopsis thaliana orthologous genes, using available data in the public microarray platform Genevestigator. To achieve these objectives, an experiment was conducted in a green house, being induced water deficit, by withholding water when the plants reached growth stage R5, maintaining adequate water supply under the control plants. To isolate transcripts differentially expressed between the two genotypes under drought was used the cDNA-AFLP technique, which coupled with sequencing enabled the identification and annotation of 45 transcripts, 21 exclusively expressed in the tolerant genotype and 24 in the susceptible one. Among the transcripts identified in the tolerant genotype, may be listed at least 11, with potential to be used in genetic transformation (chlorophyll A-B binding protein, HSP40, HSP70, glycosyl hydrolase, serine/threonine protein kinase, trehalose-6-phosphate synthase, E3 ubiquitin ligase, fructose biphosphate aldolase, mediator complex subunit 13, aquaporin nodulin MTN-3-related and TCP transcription factor), and in the susceptible genotype, can be listed nine (coatomer protein complex, monoamine-oxidase A repressor R1, synaptobrevin, haloacid dehalogenase-like hydrolase, ADP-ribosylation factor, mTERF, serine protease S1C HtrA-related, legume lectin and SWI/SNF-related chromatin binding). In the spatial and temporal gene expression analysis, the transcripts that stood out for use in genetic transformation future studies were: aquaporin nodulin MTN3, E3 ubiquitin ligase, serine/threonine protein kinase, glycosyl hydrolase and HSP 70 protein, since it had an expression quite pronounced in the tolerant genotype. Through the in silico analysis, based on orthologous genes of A. thaliana, was discovered processes and metabolic pathways that may be involved in the common bean response to drought. In addition, we identified genes associated with drought tolerance, corroborating the experimental data. Thus, the present results provide the necessary understanding to develop molecular tools (markers for differentially regulated genes) to be used in breeding programs, as well as basic genetic information in the common bean functional genome annotation and also to use these candidate genes for genetic transformation to obtain drought-tolerant plants.

O objetivo do estudo foi avaliar, o efeito do laser de Diodo 808nm como coadjuvante ao tratamento periodontal na redução de periodontopatógenos Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola e Tannerella forsythia pela técnica da Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real. Foram selecionados vinte e quatro pacientes portadores de periodontite crônica neste estudo de boca dividida, duplo cego e randomizado. Dois sítios uniradiculares de cada paciente foram utilizados e divididos em dois grupos experimentais: TESTE - raspagem alisamento polimento corono radicular (RAPCR) associado à duas aplicações de laser de Diodo de alta potência (comprimento de onda de 808nm, 1,5 Watts, 597,1 W/cm2, durante 20 segundos no modo contínuo). A primeira aplicação foi realizada 24 horas após RAPCR e a segunda após sete dias; CONTROLE foi realizado o mesmo procedimento porém sem a aplicação do laser. O biofilme subgengival foi coletado antes do tratamento e seis semanas após a segunda aplicação do laser. A avaliação microbiológica foi feita através da Reação em Cadeia da Polimerase em tempo real para a quantificação de Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola e Tannerella forsythia. A comparação entre os grupos não demonstram diferenças estatisticamente significantes (p<0,05). Concluiu-se que, dentro dos limites deste estudo, a aplicação do laser de Diodo de 808nm como coadjuvante ao tratamento periodontal não reduziu de forma significativa os periodontopatógenos: Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola e Tannerella forsythia quando comparado à RAPCR. / The aim of this study was to evaluate, by real-time polymerase chain reaction, the effect of Diode laser 808nm as an adjuvant in the reduction of Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola and Tannerella forsythia in to periodontal treatment. Twenty-four patients with chronic periodontitis the study designs was split-mouth, double blind and ramdomized controlled trial. Two sites from uniradicular teeth of each patient were used and divided in two experimental groups: TEST scalling and root planing (SRP) associated with two high power Diode laser application (wavelength of 808nm, 1,5W at the display (597,1 W/cm2) for 20 seconds in the continuous-wave mode) the first laser application was 24 hours after SRP and the second seven days later; CONTROL a similar procedure without laser application. The subgingival biofilm was colleted before treatment and six weeks after the second laser application. The microbiologic evaluation was done by real-time polymerase chain reaction for the quantification of Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola and Tannerella forsythia. The comparison between the groups did not show significant differences (p<0,05). Within the limits of this study, it can be concluded that Diode laser 808nm application as an adjuvant in the periodontal treatment did not reduce the periodontal pathogens Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola e Tannerella forsythia when compared by scaling root planning.

A dengue é uma doença infecciosa de transmitida pela picada de mosquitos do gênero Aedes. O vírus da dengue (DENV), pertencente ao gênero Flavivirus, família Flaviviridae, é atualmente um importante problema de saúde pública em todo o mundo. São reconhecidos quatro sorotipos antigenicamente distintos (DENV-1, -2, -3 e -4). A doença causada por qualquer um dos sorotipos cursa de forma assintomática ou com quadro clínico que varia desde uma febre indiferenciada e autolimitada, passando pela febre clássica da dengue (FD) até quadros graves de febre hemorrágica da dengue (DHF). O diagnóstico clínico é difícil de ser realizado principalmente na fase aguda da doença em que os sintomas são muito similares aos de outras infecções febris agudas, ficando a cargo do laboratório o diagnóstico definitivo. Os métodos sorológicos para detecção de anticorpos IgM/IgG são os mais amplamente utilizados, mas inadequados para diagnóstico precoce uma vez que detectam anticorpos a partir do sexto dia do início dos sintomas. Os métodos moleculares estão sendo cada vez mais utilizados para o diagnóstico precoce por serem mais rápidos e sensíveis que a sorologia e o isolamento viral. Neste estudo comparamos a sensibilidade de uma RT-PCR em tempo real gênero específica com um ELISA para detecção da proteína NS1 comercialmente disponível analisando amostras de soro de pacientes com dengue. Também foram desenvolvidos dois protocolos de RT-PCR em tempo real para identificação do sorotipo viral, uma contendo primers para extremidade 5 do genoma viral e outra contendo primers para a região codificadora da proteína NS5. A RT-PCR em tempo real gênero específica mostrou-se mais sensível que o ELISA, principalmente nas amostras que apresentavam baixa carga viral. A RT-PCR em tempo real contendo os primers para a extremidade 5 apresentou uma sensibilidade baixa quando comparada com a RT-PCR genérica, porém foi mais sensível que aquela contendo os primers para a região codificadora da proteína NS5. Considerando os resultados obtidos, sugerimos uma estratégia de triagem dos casos suspeitos de dengue utilizando a RT-PCR genérica para posteriormente identificar o sorotipo viral com o protocolo que utiliza os primers da extremidade 5. Embora este último protocolo tenha sido pouco sensível, a identificação do sorotipo infectante em algumas amostras é suficiente para definir qual o sorotipo circulante durante uma epidemia. / Dengue is an infectious disease transmitted by the biting of mosquitoes of Aedes genus. Dengue virus (DENV), belonging to the Flavivirus genus, Flaviviridae family, is an important public health problem worldwide. Four antigenically distinct viruses are recognized (DENV-1, -2, -3, e -4). Infection with any of the virus serotypes causes a spectrum of the illness ranging from inapparent or mid viral syndrome to classic dengue fever (DF) and severe hemorrhagic disease (DHF). The clinical diagnosis is difficult especially in the acute phase of the disease when the symptoms are very similar to other febrile illness, corresponding to the laboratory the definitive diagnosis. Serological methods detecting antibodies IgM/IgG are the more widely used; however, they are inappropriate for early diagnosis since these methods detect antibodies after six day of the onset of symptoms. The molecular methods are more frequently used for the early diagnosis because they are faster and more sensitive than serological methods and virus isolation. In this study, we have compared the sensitivity of a generic real time RT-PCR with a commercial ELISA for the NS1 protein analyzing serum samples from patients with dengue virus infection. We have also developed two protocols of real time RT-PCR to identify dengue serotype, one of them containing primers to the 5 end and the other, primers to the NS5 coding region. The generic real time RT-PCR showed to be more sensitive than the ELISA, principally, between the samples with low viral load. The real time RT-PCR containing primers to the 5 end showed a lower sensitivity than the generic real time RT-PCR; however, it was more sensitive than that containing primers to the NS5 coding region. Considering these results, we suggest the use of the generic real time RT-PCR to screen the dengue suspected cases and then to identify the serotype using the protocol that include the primers to the 5 end. Although the last protocol has shown a low sensitive, the identification of the infecting serotype in some of the samples is enough to define which serotype is circulating during the epidemic period.

Nos últimos anos, o Brasil tem liderado a produção e exportação mundial de cana-de-açúcar e seus derivados. Com isso, a produtividade agrícola aumenta necessitando-se ampliar as pesquisas de caráter sócio-ambiental, a fim de modelar um desenvolvimento tecnológico mais próximo do sustentável. Desta forma, torna-se necessário conhecer a contribuição do plantio da cana-de-açúcar com o aumento da concentração de gases de efeito estufa na atmosfera, especialmente no que se refere ao óxido nitroso (N2O), derivado do uso de fertilizantes nitrogenados. Sabe-se que na ausência de oxigênio, bactérias específicas passam a reduzir compostos nitrogenados, formando este poderoso gás de aquecimento global durante as etapas decorrentes de um processo conhecido como desnitrificação biológica. Através dos avanços nas áreas da biologia molecular, tornou-se possível conhecer os microorganismos não cultiváveis e suas respectivas funções em um determinado ambiente. Este trabalho teve como objetivo estimar as emissões de N-N2O nos solos de cana-de-açúcar derivadas da aplicação de fertilizantes nitrogenados durante um período de trinta dias, em duas situações de manejo da cultura: I- Sem queima: colheita mecanizada com a manutenção da palha da cana; II-Com queima: colheita manual precedida pela queima da palha da cana. Simultaneamente, os genes envolvidos na desnitrificação e produção de N2O no solo (norB, nirK, nirS e nosZ) foram quantificados por PCR quantitativo em tempo real em condições de laboratório e de campo. Sob condições de laboratório, pode-se observar que as emissões de NN2O atingiram 0,8 mg.m-2 h-1 em solos com a manutenção da palha, tanto com a aplicação de uréia quanto de nitrato de amônio. Os mesmos produtos, quando aplicados em solos sem a presença da palha emitiram 0,45 mg.m-2 h-1. No campo, os maiores fluxos de N-N2O foram encontrados no período de elevada precipitação pluviométrica, que ocorreu na primeira semana após a aplicação do fertilizante nitrato de amônio, chegando a 0,7 mg.m-2 h-1 nos solos com palha e 0,37 mg.m-2 h-1 nos solos sem a palha. Tanto no campo quanto no laboratório foram encontradas as maiores quantidades dos genes envolvidos na desnitrificação em solos com a permanência da palha, com valores próximos de 107 genes por grama de solo. A atual tendência a substituir a colheita manual da cana pela colheita mecanizada favorece a agregação do solo, diminui o grau de erosão e aumenta os estoques de carbono, mas também pode resultar em aumento das emissões de N-N2O e do fator de emissão dos fertilizantes nitrogenados, conforme encontrado para o nitrato de amônio aplicado no campo, onde o valor obtido foi de 0,3% para os solos sem a palha e 0,7% para solos com palha. Sendo assim, é fundamental estudar as melhores condições do uso da terra e o papel exercido pela microbiota que nela existe, proporcionando um tratamento mais adequado aos resíduos culturais, diminuindo assim as emissões de gases estufas. / In recent years, Brazil has led the production and worldwide export of sugarcane and its products. Thus, agricultural productivity increases need to expand research of socio-environmental, in order to model a technology development closer sustainable. Therefore, it is necessary to know the contribution of planting sugarcane with increasing concentration of greenhouse gases in the atmosphere, especially with regard to nitrous oxide (N2O), derived from nitrogenous fertilizer use. It is known that in the absence of oxygen, bacteria are specific to reduce nitrogen, forming this powerful global warming gas arising during the stages of a biological process known as denitrification. Through advances in molecular biology, it has become possible to know the non-cultivable micro-organisms and their functions in a given environment. This study aimed to measure the emissions of N-N2O in soils of sugarcane derived from the application of nitrogen fertilizers for a period of thirty days, in two situations crop management: I-No burning: mechanized harvesting with maintaining cane straw; II-With burning: manual harvest preceded by burning the straw. Simultaneously, the genes involved in denitrification and N2O production in soil (norB, nirS, nirK, and nosZ) were quantified by real-time quantitative PCR in the laboratory and the field. Under laboratory conditions, it can be seen that the N-N2O reached 0,8 mg.m-2 h-1 in soils with maintaining the straw, either with the application of urea and ammonium nitrate. The same products, when applied to soils without the presence of straw delivered 0,45 mg.m-2 h-1. In the field, the highest N-N2O fluxes were found in the period of high rainfall, which occurred in the first week after application of ammonium nitrate, reaching 0,7 mg.m-2 h-1 in soils with straw and 0,37 mg.m-2 h-1 in the soil without straw. Both in the field and in the laboratory were found greater amounts of genes involved in denitrification in soils fertilized with the permanence and straw, with values close to 107 per gram of soil. The current trend is to replace manual harvesting of sugarcane by mechanized harvesting promotes soil aggregation, decreases the degree of erosion and increases carbon stocks, but can also result in increased emission factor of nitrogen fertilizers, as found for nitrate applied in the field, where the value was 0,3% for the soil without straw and 0.7% for soils with straw. Therefore, it is essential to study the best conditions of land use and the role played by the microbiota that is therein, providing appropriate treatment to crop residues, thus reducing greenhouse gas emissions.