Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:59Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-03-06Bitstream added on 2014-11-10T11:57:26Z : No. of bitstreams: 1 000773465_20150110.pdf: 677474 bytes, checksum: 3ab409c79c33f6f910c52214a6fc684c (MD5) Bitstreams deleted on 2015-01-16T10:37:56Z: 000773465_20150110.pdf,Bitstream added on 2015-01-16T10:38:38Z : No. of bitstreams: 1 000773465.pdf: 1856915 bytes, checksum: 31cff2133ada813ddd49b0c93615b201 (MD5) / Neste trabalho foram investigados a fibroína da seda (silk fibroin, SF) com o peptídeo antigênico da proteína NS5A-1 derivado do vírus da hepatite C (HCV) e nanopartículas de vanadato de ítrio dopadas com európio em filmes nanoestruturados. Dois foram os tópicos abordados: i) interação e organização estrutural do peptídeo com a fibroína. ii) imobilização do peptídeo, da fibroína e nanopartículas em filmes automontados (Layer-by-Layer, LbL), visando estudar a interação específica peptídeo antigênico-anticorpo e a produção de protótipos de imunossensores. As interações fibroína-peptídeo foram estudadas em solução e em filmes LbL pelas técnicas espectroscópicas de dicroísmo circular e luminescência. Os resultados indicaram que há uma mudança conformacional da fibroína em solução para a fibroína em filmes, de aleatória para folha-β, respectivamente, e que o filme de fibroína induz a estrutura secundária do peptídeo que não possui uma conformação bioativa em solução. O crescimento dos filmes LbL foi monitorado por espectroscopia UV-visível, e pôde-se observar um crescimento linear a cada deposição realizada. Além do estudo fundamental das interações a nível molecular, os sistemas foram utilizados para o desenvolvimento de protótipos de imunossensores. A interação peptídeo antigênico-anticorpo foi estudada por medidas de detecção eletroquímica, elétrica e óptica. Para a detecção eletroquímica realizou-se medidas de voltametria cíclica, indicando uma diminuição na corrente quando em presença dos anticorpos anti-HCV e testes em amostras reais soropositivas para o vírus, que indicaram uma maior densidade de elétrons nos voltamogramas referentes às amostras infectadas. A detecção elétrica foi analisada por espectroscopia de impedância elétrica, e observou-se que há um aumento no sinal da capacitância e das perdas dielétricas de acordo com o aumento da concentração... / The present study investigated the silk fibroin (SF) with the antigenic peptide of the NS5A-1 protein of the hepatitis C virus (HCV) and nanoparticles of yttrium vanadate doped with europium immobilized on nanostructured films. Two main topics were explored: i) interaction and structural organization of the peptide with fibroin. ii) immobilization of the peptide together with fibroin and nanoparticles in LbL films (Layer- by- Layer), in order to study the specific interaction peptide antigen-antibody and production of prototype immunosensors. The fibroin-peptide interactions were studied in solution and in LbL films by spectroscopic techniques of circular dichroism and luminescence. The results indicate that there is a conformational change of fibroin in the fibroin solution in film, sheet to random coil-B, respectively, and that the fibroin film induces the secondary structure of the peptide does not possess a bioactive conformation in solution. The growth of the LbL films was monitored by UV-visible spectroscopy, and could observe a linear growth every deposit made. Besides the fundamental study of interactions at the molecular level, the systems were used for the development of prototype immunosensors. The peptide antigen-antibody interaction was studied by electrochemical, electrical and optical detection measures. For electrochemical detection, were made cyclic voltammetry measurements indicating a decrease in current when in the presence of anti-HCV antibodies, and were made tests on real samples seropositive for the virus, which indicated a higher density of electrons in voltammograms respect to infected samples. The electrical detection was analyzed by electrical impedance spectroscopy, and it was observed that there is an increase in the signal of capacitance and the dielectric losses in accordance with the increase in antibody concentration. This increase in signal is higher for films containing smaller number of bilayers and...

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2018. / Submitted by Robson Amaral (robsonamaral@bce.unb.br) on 2018-05-09T18:32:58Z No. of bitstreams: 1 2018_AlessaBembomGarcia.pdf: 4531073 bytes, checksum: 3c1b54ef2ea2220db65b1e930489911a (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-06-07T11:37:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_AlessaBembomGarcia.pdf: 4531073 bytes, checksum: 3c1b54ef2ea2220db65b1e930489911a (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-07T11:37:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_AlessaBembomGarcia.pdf: 4531073 bytes, checksum: 3c1b54ef2ea2220db65b1e930489911a (MD5) Previous issue date: 2018-06-07 / Aranhas possuem uma complexa variedade de componentes em sua peçonha. Dentre esses componentes, os peptídeos neurotóxicos destacam-se por sua capacidade de paralisar a presa por meio da interação com canais iônicos dependentes de voltagem e com receptores glutamatérgicos presentes no sistema nervoso central (SNC) e no sistema nervoso periférico (SNP). Estudos prévios no laboratório de Toxinologia da Universidade de Brasília (UnB) verificaram que a peçonha da aranha caranguejeira Acanthuscurria paulensis apresenta cerca de 100 compostos, distribuídos entre intervalos de massa de 635-21.895 Da, sendo a fração com maior abundância, de massa monoisotópica [M+H]+ = 5457,79 Da, denominada Ap1a. Foi evidenciando que o peptídeo Ap1a apresenta 48 resíduos de aminoácidos e três pontes dissulfeto. O objetivo do presente trabalho é descrever o(s) alvo(s) molecular(es) do peptídeo Ap1a, isolado da aranha A. paulensis, através de ensaios eletrofisiológicos em canais de Na+ e K+ , bem como analisar seu efeito em ensaios de ligação de [3,4 3 H]- L- Glutamato. Foram realizadas 48 cromatografias da peçonha bruta de A. paulensis para obtenção da fração de interesse, denominada Ap1a, a qual eluiu, aproximadamente, aos 41% de acetonitrila. Para purificação da fração de interesse realizou- se uma recromatografia com gradiente de acetonitrila otimizado. O peptídeo Ap1a, 1 μM, apresentou efeitos em todos os canais de sódio de mamíferos testados: hNav 1.1, hNav 1.3 e hNav 1.7, sendo que, ao se avaliar a ativação dos canais testados, o canal hNav 1.1 foi o que mais deslocou o potencial de ativação para voltagens mais hiperpolarizadas (ΔV1/2 = - 6,58 mV ± 0,72) quando em presença da Ap1a. Contudo, ao se analisar as alterações na amplitude da corrente iônica, o canal hNav 1.7 apresentou maior efeito (32,43% ± 4,93). O peptídeo Ap1a à 1 μM não apresentou efeito nos canais de sódio tanto de barata (Blattella germanica) quanto de ácaro (Varroa destructor). Além disso, nenhum bloqueio ou modulação nos canais potássio de inseto do tipo Shaker, Shab, Shal, Shaw e hKv 10.1 foi evidenciado. Ensaios de ligação de [3,4 3 H]- L- Glutamato foram realizados em triplicata na presença de concentrações crescentes do peptídeo Ap1a (0,01 a 1000 μM), todavia em nenhuma das concentrações utilizadas foi observado alguma diferença estatística significativa na ligação de [3,4 3 H]-L-glutamato. Com base nisso, o presente estudo contribuiu para a ampliação do conhecimento específico do peptídeo Ap1a, isolado da peçonha da A. paulenis, uma das inúmeras aranhas caranguejeiras endêmicas do Brasil, através da realização de uma ampla investigação eletrofisiológica em diversos canais iônicos dependentes de voltagem, bem como em receptores ionotrôpicos de glutamato. / Spiders have venom composed by several compounds of different chemical classes, among them potentially neurotoxic peptides, which are essencial in the prey paralysis process acting in voltage-dependent ion channels and in glutamatergic receptors present in the central nervous system (CNS) and peripheral nervous system (PNS). Previous studies in the laboratório de Toxinologia da Universidade de Brasília (UnB) found that the venom of the tarantula Acanthuscurria paulensis presents about 100 compounds, distributed between mass intervals of 635-21,895 Da, being the fraction with greater abundance, of monoisotopic mass [ M + H] + = 5457.79 Da, designated Ap1a. It was also found that the Ap1a has 48 amino acid residues and three disulfide bonds. The aim of the present work is to describe the molecular target (s) of the Ap1a, isolated from the A. paulensis tarantula, through electrophysiological recordings on Na + and K + channels, as well as to analyze its effect in binding assays of [3,4 3 H] -L-glutamate. Ap1a was purified through chromatography of the crude venom followed by rechromatography. Ap1a, 1 μM, showed effects on all the mammalian sodium channels tested: hNav 1.1, hNav 1.3 and hNav 1.7, and, when evaluating the activation of the channels tested, hNav 1.1 was the one that displaced the most activation potential for more hyperpolarized voltages (ΔV1 / 2 = -6.58 mV ± 0.72) when in the presence of Ap1a. However, when analyzing the changes in the amplitude of the ionic current, hNav 1.7 had a greater effect (32.43% ± 4.93). Ap1a, 1 μM, also showed no effect on the sodium channels of both cockroach (Blattella germanica) and mite (Varroa destructor). In addition, no blockage or modulation in the Shaker, Shab, Shal and Shaw potassium channels was found. [3,4 3 H] -L-Glutamate binding assays were performed in triplicate in the presence of increasing concentrations of Ap1a (0.01 to 1000 μM), however at any of these concentrations used was no significant statistical difference in binding of [3,4 3 H] -L-glutamate. Based on this, the present study contributed to increase the specific knowledge of Ap1a, isolated from A. paulenis venom, one of the numerous endemic tarantula in Brazil, through a broad electrophysiological investigation in several voltage dependent ion channels, as well as in ionotropic glutamate receptors.

Introdução. O papel da enfermeira na assistência à insuficiência cardíaca (IC) tem sido focado em intervenções terapêuticas e educativas. No entanto, o desempenho diagnóstico clínico de enfermeiras, em pacientes ambulatoriais com IC não está bem explorado. O NT-proBNP é um marcador cardíaco que reflete pressões de enchimento elevadas. O objetivo deste trabalho é comparar uma avaliação clínica sistemática para estimativa de congestão em pacientes com IC realizada por enfermeira, à realizada pelo médico e correlacioná-las a NT-ProBNP. Métodos. Estudo transversal contemporâneo. Pacientes ambulatoriais com IC submetidos a avaliação clínica sistemática para estimativa de congestão (escore clínico de congestão - ECC) por médico e enfermeira. NT-proBNP foi coletado simultaneamente às avaliações. Resultados. Realizou-se 89 avaliações em 63 pacientes com IC. A correlação dos ECC obtidos pela enfermeira com os obtidos pelo médico foi rs=0,86; P≤0,001. O nível plasmático de NT-proBNP foi de 1467,3 ± 1213,7 pg/mL. As correlações dos ECC da enfermeira e do médico com níveis de NT-proBNP foram respectivamente rs =0,45; P< 0,0001 e rs =0,51; P< 0,0001. Pacientes com ECC ≥ 3 apresentam níveis de NT-ProBNP significativamente mais elevados que aqueles com ECC < 3. Tanto pelo médico (1866 ± 1151 vs 757 ± 988 pg/mL; P < 0,0001), como pela enfermeira (1720 ± 1228 vs 821 ± 914 pg/mL; P < 0,0001). Conclusões. Os resultados sugerem que o enfermeiro, após treinamento específico, possui desempenho semelhante ao do médico em detectar estados congestivos de pacientes ambulatoriais com IC.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2017. / Submitted by Priscilla Sousa (priscillasousa@bce.unb.br) on 2017-11-07T11:20:59Z No. of bitstreams: 1 2017_ElaineMariaGuaráLôbo.pdf: 3413466 bytes, checksum: 9abee0f883e0274e43b7f665a94c66b0 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva (patricia@bce.unb.br) on 2018-05-08T18:54:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_ElaineMariaGuaráLôbo.pdf: 3413466 bytes, checksum: 9abee0f883e0274e43b7f665a94c66b0 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-08T18:54:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_ElaineMariaGuaráLôbo.pdf: 3413466 bytes, checksum: 9abee0f883e0274e43b7f665a94c66b0 (MD5) Previous issue date: 2018-05-09 / As doenças periodontais (DPs) apresentam-se como as doenças infecciosas mais comuns da cavidade oral, associadas ao biofilme dento-bacteriano, podendo resultar na destruição dos tecidos de suporte dos dentes e perda dentária. A clorexidina, por sua vez, é o principal agente utilizado para o controle deste biofilme, por ser um antisséptico catiônico de amplo espectro. Entretanto, apresenta efeitos adversos como ardência bucal, manchamento de dentes, aumento do cálculo e perda do paladar em pacientes que fazem seu uso por períodos prolongados. Neste sentido, os peptídeos antimicrobianos (PAMs) têm sido propostos como uma abordagem alternativa ao tratamento de infecções e controle do biofilme dental, com o intuito de evitar a resistência microbiana e consequentemente, os efeitos colaterais do uso da clorexidina. Desta forma, o presente estudo teve por finalidade avaliar in vitro a capacidade antimicrobiana, citotóxica e imunomodulatória do peptídeo synoeca-MP e da clorexidina isolados e em sinergismo contra a bactéria Pseudomonas aeruginosa, além de avaliar a inibição da formação de biofilme e bactérias planctônicas de P. aeruginosa, em diferentes concentrações do peptídeo synoeca-MP e da clorexidina. De acordo com os resultados, infere-se uma comprovada ação antimicrobiana, imunomodulatória e antibiofilme do peptídeo synoeca-MP, assim como também quando combinado com o digluconato de clorexidina. Dessa forma, depreende-se que a atuação sinérgica entre clorexidina e synoeca-MP foi benéfica nos ensaios antimicrobianos in vitro envolvendo a bactéria oportunista P. aeruginosa. Neste contexto, espera-se que os agentes, em conjunto, possam ser capazes de controlar a infecção e sua disseminação, além de potencializar a resposta imune de macrófagos contra o microrganismo estudado. Em adição, a redução da concentração de clorexidina pela adição da synoeca-MP pode minimizar efeitos indesejáveis de ambos em ambiente clínico. / The periodontal diseases (PDs) are the most common oral cavity’s infectious diseases. When associated with the dento-bacterial biofilm, may result in tooth support tissues’ destruction and even, tooth loss. The chlorhexidine, in turn, is the main agent used to control this biofilm, as it is a wide-spectrum cationic antiseptic. However, it has adverse effects such as oral burning, teeth staining, increased calculus and loss of taste in patients who use it for prolonged periods. In this sense, the antimicrobial peptides (AMPs) have been proposed as an alternative approach to the infections’ treatment and control of dental biofilm, in order to avoid microbial resistance and consequently, the side effects of the use of chlorhexidine. Thus, the aim of the present study was to evaluate in vitro the antimicrobial and immunomodulatory capacity and cytotoxicity of synoeca-MP peptide and chlorhexidine isolated and both in synergism against Pseudomonas aeruginosa bacterium, besides evaluating the inhibition of the biofilm formation and planktonic bacteria of P. aeruginosa, in different concentrations of the synoeca-MP peptide and chlorhexidine. According to the results, a proven antimicrobial, immunomodulatory and anti-biofilm action of the synoeca-MP peptide is inferred, as well as, when combined with chlorhexidine digluconate. Therefore, it is concluded that the synergistic action between synoeca-MP and chlorhexidine was beneficial in the in vitro antimicrobial assays involving the opportunistic P. aeruginosa bacterium. In this context, it is expected that the agents, together, could be able to control the infection and its dissemination, besides potentiating the immune response of macrophages against the studied microorganism. In addition, reducing the concentration of chlorhexidine by the addition of synoeca-MP peptide may minimize the undesirable effects of both in a clinical setting.

O peptídeo antimicrobiano P34, produzido por Bacillus sp. P34, bactéria isolada do intestino do peixe Piau-com-pinta da bacia amazônica, tem potencial uso como bioconservante em alimentos, principalmente aqueles que sofrem tratamento térmico. Neste trabalho, foi realizado um estudo da modelagem cinética de inativação térmica do peptídeo antimicrobiano P34, além de calcular os parâmetros cinéticos e termodinâmicos em diferentes condições de estresse. Amostras de 1,0 ml da bacteriocina P34 em solução tampão pH 4,5, 6,0 ou 7,0 ou em solução tampão pH 7,0 com adição de 1 ou 5% de cloreto de sódio ou ainda em leite desnatado ou integral sofreram tratamento térmico entre 90°C e 120°C por até 300 min. Os resultados m ostram que a equação de reação de primeira ordem é a que melhor descreve a cinética de inativação térmica do peptídeo P34. Os valores D em pH 4,5 variaram entre 14 e 192 min, com valor z de 27 °C; em pH 6,0, esse parâmetro variou entre 2 6 e 191 min, com valor z de 33 °C; já em tampão fosfato 10 mM pH 7,0, os va lores D variaram entre 39 e 227 min com valor z de 27 °C; em pH 7,0 com adição de 1% de cloreto de sódio os valores D variaram de 28 a 245 min, com valor z de 37 °C; com a adição de 5% de sal em pH 7,0 os valor es D variaram entre 32 e 698 min, com valor z de 24 °C. A diminuição do pH reduziu a estabilidad e térmica do peptídeo P34. Em altas temperaturas a presença de sal reduziu a estabilidade térmica, enquanto nas menores temperaturas estudadas houve aumento da sua resistência. Resultados similares ocorreram em leite. Em altas temperaturas houve mais rápida inibição da atividade antimicrobiana do peptídeo P34. Os valores D, em leite desnatado, variaram entre 32 a 327 min, enquanto em leite integral, entre 17 a 194 min. Já em leite integral a 90 °C não houve inibição da atividade do peptídeo. A presença de gordura acelerou a inibição da bacteriocina, possivelmente devido ao rompimento da membrana dos glóbulos de gordura, permitindo a adsorção do peptídeo na fração lipídica em altas temperaturas. A análise termodinâmica sugere que o desdobramento da molécula do peptídeo P34 pode ser o passo determinante para a inativação térmica irreversível nas condições testadas. Os resultados mostram que o peptídeo P34 pode ser usado em condições de pasteurização ou de esterilização, mantendo parte de sua atividade antimicrobiana após o tratamento térmico. / The antimicrobial peptide P34, produced by Bacillus sp. P34, a bacterium isolated from the gut of the Piau-com-pinta fish from the aquatic environment of the Amazon basin, has potential use as bioconservante in foods, especially those that suffer heat treatment. In this work, a study was performed to analyse the applicability of various inactivation models available in the literature and their thermodynamic and kinetic parameters under different stress conditions were calculated. Aliquots of 1,0 ml of the bacteriocin at pH 4,5, 6,0 or at sodium phosphate buffer pH 7,0; and at skim or fat milk were heated in sealed tubes (1 mm of in the range of 90-120 °C for over 300 min. T he first-order model provided the best description of the kinetics of inactivation. The D values at pH 4,5 the D values ranged between 14-192 min, with z value of 27 °C; at pH 6,0 ranged from 25 to 191 min, with z value of 33 °C; at phosphate buffer at pH 7,0 ranged between 39-227 min, with z value of 38 °C; at pH 7,0 with addition of 1% of sodium chloride the D values ranged between 28-245 min, with z value of 37 °C; with the addition of 5% of the salt at pH 7,0 the D values ranged from 32 to 698 min, with z value of 24 °C. The low pH reduced the thermal stability of the peptide P34. At high temperatures the presence of salt reduced the thermal stability, while at the lower temperatures studied there was an increase of its resistence. Similar results occurred in milk. At high temperatures there was a faster inhibition of antimicrobial peptide P34. The D values, at skim milk, ranged between 32 and 327 min, while at fat milk, between 17 and 194 min. At 90 °C, in fat milk, the peptide was not inhibited. The presence of fat accelerated the inhibition of bacteriocin, possibly due to disruption of the membrane of fat globules, allowing the adsorption of the peptide in the lipid fraction at high temperatures. The thermodynamic analysis suggests that the unfolding of the molecule of the peptide P34 may be the a determining step for the irreversible thermal inactivation under the conditions tested. The results show that the peptide P34 can be used under pasteurization or sterilization conditions, manteining part of its antimicrobial activity after the thermal processing.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-09-08T12:12:13Z No. of bitstreams: 1 2016_IngridAquinoAmorim.pdf: 1986782 bytes, checksum: d324e2107a1abb4c35c8ea22be35f4de (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-10-13T18:42:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_IngridAquinoAmorim.pdf: 1986782 bytes, checksum: d324e2107a1abb4c35c8ea22be35f4de (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-13T18:42:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_IngridAquinoAmorim.pdf: 1986782 bytes, checksum: d324e2107a1abb4c35c8ea22be35f4de (MD5) / A remodelação óssea representa um processo de suma importância no sistema esquelético humano. Entretanto, um desequilíbrio na função ou ativação excessiva de osteoclastos pode resultar em extensas reabsorções ósseas. Nesse contexto, peptídeos de defesa do hospedeiro (PDHs) podem apresentar um potencial no desenvolvimento de novas terapias. Nessa perspectiva, o presente estudo avaliou o efeito dos peptídeos clavanina A, clavanina MO e LL-37, na supressão da osteoclastogênese in vitro mediada pelo ligante do receptor de ativação do fator nuclear kappa B (RANKL). Estes resultados foram comparados com medicações utilizadas clinicamente, hidróxido de cálcio P.A. e doxiciclina, em terapias endodônticas e periodontais, respectivamente. Os parâmetros analisados em culturas da linhagem celular RAW 264.7, com ou sem recombinante (r) RANKL, PDHs e controles clínicos, foram: (1) viabilidade celular pelo método de MTT; (2) produção de óxido nítrico (NO); e número de osteoclastos diferenciados, após coloração de fosfatase ácida tartarato resistente (TRAP). Os resultados demonstraram que os PDHs e os controles clínicos não foram citotóxicos às células, exceto na presença de 128 μg.mL-1 de doxiciclina após 72 h, na presença e ausência de rRANKL, que apresentou redução de cerca de 50% da viabilidade celular. A produção de NO foi mantida estável ou reduzida na presença de todas as concentrações dos PDHs e controles clínicos, comparados ao grupo controle, na ausência de rRANKL. Como esperado, a presença de rRANKL elevou sutilmente os níveis da produção de NO. No entanto, a presença dos PDHs e controles clínicos permitiram ora estabilidade, ora redução dos níveis de NO, quando comparados ao grupo controle, exceto na presença de 2 μg.mL-1 de doxiciclina após 7 dias, que promoveu aumento significativo na produção de NO. Na osteoclastogênese, todos os PDHs e controles clínicos foram capazes de reduzir a diferenciação de osteoclastos. Em conclusão, os PDHs podem atuar como potenciais supressores da osteoclastogênese in vitro. Dessa forma, o uso dos PDHs se apresenta como uma forma terapêutica promissora para o tratamento de reabsorções ósseas perirradiculares e periodontais. ________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Bone remodeling is an important process in the human skeletal system. Nevertheless, an imbalance in the osteoclast function or its excessive activation, may result in extensive bone resorption. In this context, host defense peptides (HDPs) may have a potential for novel therapies development. This study evaluated the potential of HDPs clavanin A, clavanin MO and LL-37 in down-regulate in vitro receptor activator of nuclear factor kappa B ligand (RANKL)-mediated osteoclastogenesis. HDPs results were compared to currently available medications for endodontic and periodontal therapies, calcium hydroxide P.A. and doxycycline, respectively. The parameters analyzed in cell line RAW 264.7 cultures stimulated with or without recombinant (r) RANKL and HDPs and clinical controls were: (1) cell viability by MTT method; (2) nitric oxide production (NO); and (3) number of differentiated osteoclasts, after tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) staining. Results showed that HDPs and clinical controls were not cytotoxic, except in the presence of 128μg.mL-1 of doxycycline after 72 h, in the presence and absence of rRANKL, which decreased about 50% the cell viability. The NO production was kept stable or reduced in the presence of all concentrations of HDPs and clinical controls, compared to the control group, in the absence of rRANKL. Otherwise, the presence of rRANKL subtly up-regulated the NO production levels. However, the presence of HDPs and clinical controls remained stable or reduced the NO production compared to the control group, except in the presence of 2 μg.mL-1 of doxycycline after 7 days, which up-regulated NO production. During the osteoclastogenesis process, all HDPs and clinical controls were capable of reducing the osteoclasts differentiation. In conclusion, host defense peptides can act as potential suppressors of in vitro osteoclastogenesis. Thus, HDPs represent promising drugs for periradicular and periodontal bone resorption treatments.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-11-24T13:21:34Z No. of bitstreams: 1 2016_LauroAfonsoCôrtesBogniotti.pdf: 1273834 bytes, checksum: 9805ec093e8b9944de77d2b008a90676 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-01-27T19:16:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_LauroAfonsoCôrtesBogniotti.pdf: 1273834 bytes, checksum: 9805ec093e8b9944de77d2b008a90676 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-27T19:16:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_LauroAfonsoCôrtesBogniotti.pdf: 1273834 bytes, checksum: 9805ec093e8b9944de77d2b008a90676 (MD5) / Introdução: Os escores clínicos disponíveis para a predição de risco após o infarto agudo do miocárdio (IAM) têm mostrado um potencial limitado para discriminar pacientes de alto risco. Embora a concentração plasmática de BNP na admissão possa predizer a probabilidade de eventos adversos após IAM, não há informações sobre a sua capacidade preditiva em pacientes com IAM e função ventricular normal na admissão (Killip I). Objetivo: avaliar o BNP e o escore GRACE em pacientes com IAMCSST em uma coorte prospectiva, especificamente naqueles com Killip I à admissão hospitalar Métodos: Pacientes consecutivos com IAM com supradesnivelamento do segmento ST e Killip I (n = 167) foram acompanhados por 12 meses. Foram avaliados os níveis plasmáticos de BNP nas primeiras 24 horas após o início dos sintomas (D1) e no 5º dia (D5) e calculado o escore GRACE com base nos dados da admissão. Resultados: Fatores de risco independentes foram selecionados usando o método bootstrapping com base em regressões de Cox. Sexo, idade, dose de estatina e diagnóstico de diabetes mellitus foram selecionadas como preditores significativos de morte súbita e IAM (MACE) para o modelo multivariado final. Tanto em modelos não-ajustados e ajustados de regressão de Cox, tanto um Delta-BNP acima da mediana (80pg/dL) e o BNP à admissão (D1) acima de 100pg/dL (mediana) foram associados a maior incidência de morte súbita e IAM em 30 dias (OR:10.88, 95%CI: 1.10- 108, p=0.038; OR:1.91, 95%CI: 1.01-4.11, p=0.049, respectivamente). Escore GRACE isolado mostrou uma estatística-C moderada de 0,709 (p=0,029), mas ao se associar o Delta-BNP houve melhora na discriminação do risco (estatística C=0,831, p=0,001), com diferenças significativas entre as áreas sob a curva (p=0,046). A reclassificação liquida (category-free NRI) confirmou uma melhoria significativa na predição do risco em 33,4% (IC 95%: 8-61%) em comparação com o GRACE isolado (p=0,034), com calibração adequada de acordo com critério de informação de Bayes e teste da razão de verossimilhança. A associação entre Delta-BNP + GRACE melhorou a reclassificação especialmente em doentes de risco intermediário [em 62,5% (p=0,0231)]. No entanto, considerando apenas a primeira medida, o BNP no D1 não melhorou a reclassificação de risco em 30 dias quando comparado ao escore GRACE (cfNRI p=0.8), assim como o Delta-BNP não melhorou a previsão de risco no 12o mês de follow-up. Conclusões: A elevação dos níveis plasmáticos de BNP nas primeiras 24h após IAM, assim como o aumento nos níveis de BNP nos dias subsequentes ao evento isquêmico, estão associados a piores desfechos no curto prazo em pacientes Killip I. Entretanto, apenas o Delta-BNP melhora a reclassificação de risco no curto prazo, tanto quando comparado ao escore GRACE como comparado ao GRACE + BNP no D1. / Background: Available clinical scores for risk prediction after acute myocardial infarction (AMI) have a limited potential to discriminate high-risk patients. Although BNP levels at admission can predict the chance of adverse outcomes after AMI, there is no information regarding the changes in BNP levels in risk prediction of patients with AMI and normal ventricular function at admission (Killip I). Objective: Evaluate BNP and GRACE in patients with STEMI in a prospective cohort, specifically in those with Killip I at hospital presentation. Methods: Consecutive patients with ST-elevation AMI and Killip I (n=167) were followed for 12 months. We evaluated plasma levels of BNP in the first 24h after symptoms onset (D1) and at the 5th day (D5) and calculated the GRACE score based on admission data. Results: Independent risk factors were selected using bootstrapping based on Cox-regression analysis. Sex, age, dose of statin and diagnosis of diabetes were selected as significant predictors of sudden death and AMI for the final multivariable model. Both in crude and adjusted Coxregressions, a Delta-BNP above the median (80pg/dL) and a BNP at D1 above 100pg/dL (median) were associated with higher incidence of sudden death and AMI at 30 days (OR:10.88, 95%CI: 1.10-108, p=0.038; OR:1.91, 95%CI: 1.01-4.11, p=0.049, respectively). GRACE score alone showed a moderate C-statistic=0.709 (p=0.029), but adding Delta-BNP improved risk discrimination (C-statistic=0.831, p=0.001), with significant differences between AUCs (p=0.046). Net reclassification (category-free NRI) confirmed a significant improvement in individual risk prediction by 33.4% (95%CI: 8–61%) compared with GRACE alone (p=0.034), with adequate calibration according Bayes information criterion and Likelihood ratio test. Delta-BNP+GRACE improved reclassification especially in intermediate risk patients [by 62.5% (p=0.0231)]. However, considering only the first measurement, BNP at D1 did not improve risk reclassification at 30 days compared to GRACE score (cfNRI p=0.8), nor Delta-BNP has improved risk prediction at 12-month follow-up. Conclusions: Both high BNP levels in the first 24h after AMI and increasing levels of BNP levels in the days following were associated with poorer short-term outcomes in Killip I patients. However, only Delta-BNP improves risk reclassification in the short-term, compared to GRACE score as well compared to GRACE + BNP at D1.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2017-02-07T15:24:34Z No. of bitstreams: 1 2016_LuzNoemíIrazazabal_Parcial.pdf: 4027818 bytes, checksum: a4a17fcf76040cb0870aeda98cdf7b92 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-04-12T20:58:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_LuzNoemíIrazazabal_Parcial.pdf: 4027818 bytes, checksum: a4a17fcf76040cb0870aeda98cdf7b92 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-12T20:58:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_LuzNoemíIrazazabal_Parcial.pdf: 4027818 bytes, checksum: a4a17fcf76040cb0870aeda98cdf7b92 (MD5) / As infecçõesrelacionadas à assistência à saúde e o surgimento de cepas bacterianas resistentes aos antibióticos de uso convencional, representam um dos principais problemas de saúde pública. Neste contexto, os peptídeos antimicrobianos (AMPs) têm sido considerados como uma potencial nova classe de compostos antimicrobianos. Objetivando a geração de novos agentes antimicrobianos potentes e não tóxicos, com potencial terapêutico, estratégias de desenho racional podem ser utilizadas para otimizar AMPs existentes ou para produzir novos AMPs com caraterísticas desejáveis. Nesta perspectiva, foi utilizada uma abordagem racional para gerar três peptídeos sintéticos ([I5, R8] MP, EcDBS1R6 e PaDBS1R1) e avaliar suas propriedades estruturais e funcionais. Mediante a determinação da concentração mínima inibitória (CMI), observou-se que todos os peptídeos mostraram atividade contra bactérias Gram-negativas (CMI = 1,5 – 12,5 μM) e Grampositivas (CMI = 3,125 – 50 μM). Apenas [I5, R8] MP apresentou atividade antifúngica contra Candida albicans com um valor de CMI baixo (12,5 μM). A determinação da concentração de peptídeo capaz de reduzir em 50% a viabilidade celular, revelou baixa ou nula atividade hemolítica (LC50 > 200 μM para os peptídeos [I5, R8] MP e EcDBS1R1; LC50 = 50 μM para PaDBS1R1), e ausência de citotoxicidade frente a células renais embrionárias humanas HEK-293 (LC50 ~ 111 – 143 μM). A cinética da atividade bactericida revelou uma rápida ação bactericida de PaDBS1R1 e [I5, R8] MP frente a E. coli (< 5 e 15 min, respectivamente) e moderada frente a S. aureus (30 e 45 min, respectivamente). No caso de EcDBS1R1, observou-se rápido efeito bactericida para ambas espécies bacterianas (15 min). Os ensaios de permeabilização e despolarização combinados às imagens de microscopia eletrônica de varredura com fonte de emissão de campo (MEV-FEG), indicaram que os peptídeos podem ser capazes de alterar a integridade da membrana bacteriana por meio de um mecanismo membranolítico. A análise da estrutura dos peptídeos por espectroscopia de dicroísmo circular e ressonância magnética nuclear, bem como a simulação por dinâmica molecular in silico em ambiente de membrana, revelou uma conformação α-hélice anfipática. Em conclusão, os resultados indicam que a avaliação estrutural e funcional dos AMPs sintéticos racionalmente desenhados, representa uma estratégia promissora para o desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos como uma nova classe de fármacos com vista a abordar a problemática da resistência aos antibióticos. / Antimicrobial peptides (AMPs) have been considered as a potential novel class of antimicrobial compounds. In order to generate new potent and non-toxic antimicrobial agents, rational design strategies may be employed. In this view, we used a computational method to design three synthetic AMPs ([I5, R8] MP, EcDBS1R6 and PaDBS1R1). By determining the minimum inhibitory concentration, we found that all the peptides were active against Gram-negative and -positive bacteria. Only [I5, R8] MP was found to display antifungal activity. The determination of the peptide concentration producing 50% of cell lysis revealed low or no hemolytic activity, with no cytotoxicity towards human embryonic kidney cells HEK-293. During time-kill assays more rapid bactericidal effects were observed for PaDBS1R1 and [I5, R8] MP against E. coli compared to S. aureus. For the peptide EcDBS1R6, identical killing curves were obtained for both bacterial strains. Membrane permeabilization and depolarization studies combined with field emission gun scanning electron microscopy (SEM-FEG) revealed that a membranolytic mechanism occurs for these peptides. When analyzed by circular dichroism and nuclear magnetic resonance microscopy or by molecular dynamics simulations during interaction with a membrane model, peptides were shown to adopt an amphipathic alpha-helical conformation. In conclusion, our results indicate that the structural and functional evaluation of rationally designed synthetic AMPs represents a promising strategy for the development of potent novel antimicrobial agents. / Les peptides antimicrobiens sont considérés comme une nouvelle classe prometteuse d’agents anti-infectieux. Afin de développer de nouveaux agents efficaces et non toxiques, des stratégies de conception rationnelle peuvent être utilisées. Dans cette perspective, nous avons utilisé une approche computationnelle pour concevoir trois peptides synthétiques ([I5, R8] MP, EcDBS1R6 et PaDBS1R1). En déterminant la concentration minimale inhibitrice, nous avons montré que tous les peptides sont actifs contre les bactéries Gram-négatif et -positif. Seul [I5, R8] MP a montré une activité antifongique. La mesure de la concentration de peptide provoquant 50 % de mortalité cellulaire a permis de montrer que les peptides étaient faiblement ou non hémolytiques, sans toxicité vis-à-vis des cellules embryonnaires rénales humaines HEK-293. La cinétique bactéricide a révélé que PaDBS1R1 et [I5, R8] MP tuent rapidement E. coli en comparaison à S. aureus et que EcDBS1R6 élimine rapidement les deux souches. Des études de perméabilisation et de dépolarisation combinées à de la microscopie électronique à haute résolution (FEG-SEM) ont montré un mécanisme membranolytique des peptides. L’analyse de la structure des peptides par spectroscopie de dichroïsme circulaire et résonance magnétique nucléaire, ainsi que par modélisation moléculaire lors de leur interaction avec une membrane modèle, révèle une conformation en hélice alpha amphipatique. En conclusion, notre étude indique que l’évaluation structurale et fonctionnelle de peptides antimicrobiens synthétiques conçus de manière rationnelle représente une stratégie prometteuse pour le développement de nouveaux agents antimicrobiens.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Química, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2015-12-03T16:47:27Z No. of bitstreams: 1 2015_IaraHolandaValença.pdf: 1038288 bytes, checksum: 2c2ec6fed1c12e7de341a325f0860f59 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-05-19T16:57:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_IaraHolandaValença.pdf: 1038288 bytes, checksum: 2c2ec6fed1c12e7de341a325f0860f59 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-19T16:57:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_IaraHolandaValença.pdf: 1038288 bytes, checksum: 2c2ec6fed1c12e7de341a325f0860f59 (MD5) / Os peptídeos antimicrobianos são importantes moléculas do sistema imune inato dos organismos. Essas moléculas podem interagir com membranas lipídicas, levando a formação de poros ou a desestabilização da mesma, resultando no extravazamento e morte celular. Essa característica revela que os peptídeos antimicrobianos apresentam um possível potencial contra microrganismos patogênicos. No entanto, adquirir essas moléculas para serem imediatamente aplicadas na indústria farmacêutica de seu habitat natural é inviável, já que as quantidades obtidas são muito baixas. Sendo assim, uma opção é a produção por meio da utilização de sistemas heterólogos de expressão. A levedura metilotrófica Pichia pastoris é um dos sistemas de expressão heterólogos mais utilizados. Os peptídeos anticongelantes (antifreeze peptide – AFP), são uma classe de peptídeos antimicrobianos multifuncionais isolados de animais de regiões polares, onde essas moléculas impedem a formação de cristais de gelo nos fluídos corporais desses organismos. O sintético AFP 1.5 é um peptídeo anticongelante retirado do peixe Pleuronectes americanus. Esse peptídeo foi expresso no sistema heterólogo de produção Pichia pastoris. Foi realizada uma expressão com indução por metanol à 0,5% por 48 horas e um ensaio antimicrobiano por disco de difusão contra Escherichia coli. O ensaio antimicrobiano contra E. coli apresentou resultados positivos, com a formação de halos de inibição nos sobrenadantes dos clones 1, 2 e 4. Com o resultado positivo em E. coli se torna necessário novos testes de expressão, a fim de melhorar a produção da proteína recombinante. _______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Antimicrobial peptides are important molecules of the innate immune system of the organisms. These molecules may interact with lipid membranes, leading to pore formation or the destabilization of the membrane, resulting in leakage and cosnequently cell death. This feature reveals that the antimicrobial peptides are potential drug candidates for antimicribal diseases. However, in order to apply those molecules in the pharmaceutical industry it is not feasible to isolate them from its natural habitat since the relevant amounts are very low. Thus, one option is its production using heterologous expression systems. The methylotrophic yeast Pichia pastoris is one of the most utilized heterologous expression systems. The antifreeze peptides - AFP are a class of multifunctional antimicrobial peptides isolated from animals polar regions, where these molecules prevent the formation of ice crystals in the body fluids of these organisms. The synthetic AFP 1.5 is an antifreeze peptide removed from the fish Pleuronectes americanus. This peptide was produced in Pichia pastoris. An expression induction with 0.5% methanol for 48 hours and an antimicrobial disc diffusion assay against Escherichia coli was performed. The antimicrobial test against E. coli showed positive results with the formation of inhibition zones in the supernatants of clones 1, 2 and 4. With a positive result in E. coli, it is necessary to test new expression, in order to improve production of the recombinant protein.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2015-12-17T19:33:21Z No. of bitstreams: 1 2015_FabianoJoséQueirozCosta.pdf: 3573477 bytes, checksum: 03e447fd00fe16402cfa8f66c347ca59 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-12-21T19:20:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_FabianoJoséQueirozCosta.pdf: 3573477 bytes, checksum: 03e447fd00fe16402cfa8f66c347ca59 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-21T19:20:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_FabianoJoséQueirozCosta.pdf: 3573477 bytes, checksum: 03e447fd00fe16402cfa8f66c347ca59 (MD5) / Esse projeto de tese de doutorado tem o apoio financeiro do CNPq, da FAPDF, da FINEP e da FUB-UnB. / Os peptídeos antimicrobianos, compostos encontrados em plantas, insetos e vertebrados, dentre outros, surgem como fortes candidatos na desafiadora busca por novas drogas capazes de combater a diversificada maquinaria bacteriana, principalmente pelo fato da maioria deles apresentarem um mecanismo de ação independente da interação com receptores. Nos últimos anos, o número de novos antimicrobianos licenciados para uso no homem tem sido bem menor que em um passado recente. As indústrias farmacêuticas e o governo não estão dispendendo recursos para a geração de novos antimicrobianos eficazes e seguros, deixando a população suscetível a infecções bacterianas multi-droga-resistentes (MDR), um fenômeno que tem se tornado um dos maiores problemas de saúde pública do século 21. O desenho racional e a síntese química permitem a produção de análogos de peptídeos antimicrobianos com atividade citotóxica diminuída e melhora na potência antimicrobiana, fornecendo drogas eficazes no combate a disseminação da resistência bacteriana. No presente estudo, foram sintetizados dois análogos de peptídeos antimicrobianos de anuros. Os dois análogos, denominados AH_1 e AH_2, foram produzidos por síntese química em fase sólida e purificados por meio de cromatografia líquida de alta eficiência em coluna de fase reversa (RP-HPLC). Seu grau de homogeneidade e pureza foram avaliados por espectrometria de massas do tipo MALDI-TOF. Após confirmação da pureza, estes análogos foram utilizados em ensaios in vitro buscando avaliar suas atividades antibacteriana, fungicida, micobactericida e hemolítica. Os dois análogos apresentaram atividade antimicrobiana contra bactérias Gram positivas e Gram-negativas, inclusive frente a cepas multirresistentes de Staphylococcus aureus meticilina-resistente (MRSA), Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) e Pseudomonas aeruginosa. Também apresentaram atividade contra as espécies de Candida albicans, Candida krusei e Candida parapsilosis, além de atividade micobactericida contra cepas de Mycobacterium tuberculosis H37Rv. O efeito sinérgico entre estes análogos e a polimixina B foi avaliado através do ensaio Checkerboard. Uma cepa de Pseudomonas aeruginosa multirresistente com CIM igual a 8 g/mL para polimixina B, caracterizada como resistente de acordo com breakpoints estabelecidos pelo CLSI 2014 foi utilizada neste ensaio. Os dois peptídeos AH_1 e AH_2 apresentaram ICIF < 0,5 demonstrando assim sinergismo de ação com a polimixina B. Houve uma redução da CIM inicial de 8 g/mL quando a polimixina foi testada sozinha, para 0,0625 g/mL e 0,25 g/mL quando testada em combinação aos dois análogos AH_1 e AH_2, respectivamente. Nestas baixas concentrações ativas exibidas no ensaio Checkerboard, as atividades hemolíticas dos dois análogos foram desprezíveis. Tais resultados confirmam o potencial dos análogos AH_1 e AH_2 como agentes antimicrobianos de interesse para a indústria farmacêutica. O análogo AH_1, apesar de seu maior potencial hemolítico em altas concentrações, exibiu excelente atividade principalmente sobre bactérias gram negativas, responsáveis hoje por grande parte dos casos de infecções hospitalares. ______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Antimicrobial peptides, compounds found in plants, insects and vertebrates, emerge as strong candidates in the challenging search for new drugs. They are able to combat the bacterial machinery, mainly because most of them present a mechanism of action independent of the interaction with receptors. In recent years, the number of new antimicrobial drugs licensed for human use has been smaller than in the recent past. The pharmaceutical industries and government are not expending resources for the generation of new effective and safe antimicrobial agents, leaving the population susceptible to multi-drug-resistant (MDR) bacterial infections, a phenomenon that has become one of the greatest public health problems of the 21st century. Rational design and chemical synthesis allow production of antimicrobial peptides analogues with reduced cytotoxic activity and improved antimicrobial potency, providing effective drugs in combating the spread of bacterial resistance. In this study, two analogues of anurans antimicrobial peptides were synthesized. Both analogues, named AH_1 and AH_2 were produced by chemical solid-phase synthesis and purified by high performance liquid chromatography on reversed-phase column (RP-HPLC).Their degree of homogeneity and purity were assessed by mass spectrometry analysis using MALDI TOF. After confirming their purity, these analogs were tested in vitro to evaluate their antibacterial, fungicidal, mycobactericidal and hemolytic properties. The two analogues showed antimicrobial activity against Gram-positive and Gram negative bacteria, including multidrug resistant strains such as methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA), Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC), and Pseudomonas aeruginosa. Also showed activity against species of Candida albicans, C. krusei and C. parapsilosis, in addition mycobactericidal activity against Mycobacterium tuberculosis H37Rv. The synergistic effect between these analogs and polymyxin B was tested by checkerboard assay. A strain of multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa with MIC equal to 8 g/mL for polymyxin B, characterized as resistant in accordance with breakpoints established by the CLSI 2014 was used in this test. Both AH_1 and AH_2 peptides presented ICIF <0.5 thus demonstrating synergistic action with polymyxin B. There was a reduction of the initial MIC of 8 g/mL when the polymyxin was tested alone to 0.0625 g/mL and 0.25 g/mL when tested in combination to the two analogs AH_1 and AH_2, respectively. In this low active concentrations in Checkboard assay.