Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-02-01T08:34:02Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Danielle de Freitas Mizoguti - 2013.pdf: 1318732 bytes, checksum: 8084d20c2bec9e4264a71581ca4d04b2 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-02-01T08:37:28Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Danielle de Freitas Mizoguti - 2013.pdf: 1318732 bytes, checksum: 8084d20c2bec9e4264a71581ca4d04b2 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-01T08:37:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Danielle de Freitas Mizoguti - 2013.pdf: 1318732 bytes, checksum: 8084d20c2bec9e4264a71581ca4d04b2 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2014-02-21 / Introduction: Leprosy Type 1 ( T1R) and type 2 reactions ( T2R) are considered the major complicators in the clinical management of leprosy patients. Leprosy reactions can occur before, during or after multidrug therapy (MDT). T1R is associated with exacerbated Th1 type cell mediated immunity (CMI) whereas T2R is associated with Th2 type immunity characterized by strong antibody production and in some cases transitory CMI to M. leprae antigens. Objective: Assess the serological reactivity to LID-1 fusion protein and to PGL-I M. leprae antigens among multibacillary (MB), paucibacillary (PB) leprosy patients that developed reaction at diagnosis or during MDT compared to reaction free MB and PB patients. Material and Methods: Paired serum samples from 73 leprosy patients were tested by ELISA to detect IgG antibodies to LID-1 and IgM responses to PGL-I. Leprosy patients included MB that developed T1R or T2R at diagnosis or during MDT and PB patients that developed T1R at diagnosis or during MDT compared to reaction free MB and PB patients. For T1R and T2R patients, samples collected during reactions and in the absence of reactions were tested and for reaction free patients samples collected at diagnosis and after MDT were tested. Results: The decline of anti LID-1 and anti PGL-I antibodies levels was significant among MB patients with T1R at diagnosis (p <0,05). Among MB patients with T2R at diagnosis and non reactional MB leprosy patients, the decline of antibodies was significant only to LID-1 (p <0,05). Higher levels of anti LID-1 antibodies were observed in MB patients who developed T2R at diagnosis compared with unreactional patients (p = 0.020) and patients who developed T1R at diagnosis (p = 0.008). Moreover, different antibody levels were seen in patients who developed T2R during MDT compared with unreactional MB patients after MDT (p = 0.020). Conclusions: Our data suggest that high anti LID-1 antibody levels may be associated with higher risk of T2R in MB patients. / Introdução: As reações hansênicas (tipo 1/RT1 e tipo 2/RT2) são as principais complicações no manejo clínico de pacientes com hanseníase e podem ocorrer antes, durante e após multidrogaterapia (MDT). A RT1 está associada a exacerbação da imunidade mediada por células (CMI) do tipo Th1 para antígenos do Mycobacterium leprae. Já a RT2 está associada com a resposta imunitária do tipo Th2, caracterizada por forte produção de anticorpos e em alguns casos ativação transitória da CMI. Objetivo: Avaliar a reatividade sorológica a proteína de fusão LID-1 e ao PGL-I do M. leprae em pacientes com hanseníase multibacilares (MB) e paucibacilares (PB) com reação hansênica e em pacientes MB e PB que não desenvolveram reação. Materiais e Métodos: Foram testadas amostras um total de 73 pacientes com hanseníase MB que desenvolveram RT1 ou RT2 ao diagnóstico ou durante MDT e em pacientes PB que desenvolveram RT1 ao diagnóstico ou durante MDT comparados com pacientes MB e PB que não desenvolveram reação hansênica ao diagnóstico nem durante MDT. A presença de IgG anti LID-1 e IgM anti PGL-I foi testada por ELISA. Resultados: O declínio dos níveis de anticorpos anti LID-1 e anti PGL-I foi significativo dentre os pacientes MB que estavam em RT1 ao diagnóstico (p< 0.05). Dentre os pacientes MB que estavam em RT2 ao diagnóstico e pacientes MB não reacionais, o declínio dos anticorpos foi significante apenas para LID-1 (p< 0.05). Níveis mais altos de anticorpos anti LID-1 foram observados nos pacientes MB que desenvolveram RT2 ao diagnóstico quando comparados com pacientes MB que desenvolveram RT1 ao diagnóstico (p=0.008) ou pacientes MB não reacionais (p=0.020). Pacientes MB que desenvolveram RT2 durante a MDT também apresentaram níveis mais altos de anticorpos anti LID-1 comparados com pacientes MB não reacionais após MDT (p=0.020). Conclusões: Nossos resultados sugerem que altos níveis de anticorpos anti LID-1 podem estar associados ao maior risco de desenvolvimento de RT2 em pacientes MB.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-10-05T14:30:57Z No. of bitstreams: 2 Dissertaçao - Adriano Badotti Grassi - 2007.pdf: 1439206 bytes, checksum: 031af098879a0122f9c34462d0323a5f (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-10-05T14:31:18Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertaçao - Adriano Badotti Grassi - 2007.pdf: 1439206 bytes, checksum: 031af098879a0122f9c34462d0323a5f (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-05T14:31:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertaçao - Adriano Badotti Grassi - 2007.pdf: 1439206 bytes, checksum: 031af098879a0122f9c34462d0323a5f (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2008-02-25 / Objectives: This study compared two leprosy rapid tests detecting (1) IgM against PGL-I (ML-Flow test, KIT, Amsterdam, Netherlands) or (2) IgM, IgG and IgA against PGL-I (ML-ICA, Yonsei University, South Korea). Methods: Whole blood and serum from untreated multibacillary (MB; n=50) and paucibacillary (PB; n=48) leprosy patients (Reference Center for Diagnosis and Treatment, Goiania, central Brazil), MB household contacts (HHC; n=35) and healthy endemic controls (EC; n=50) were tested. Leprosy patients were classified by dermato-neurological evaluation, bacillary index (BI) and histopathology. Median age was 29 years, 39.9% males. MB patients had BB-BL-LL leprosy (median BI=2.0), PB patients had TT-BT leprosy. Results: (1) Using sera, ML Flow positivity of MB patients was comparable to ML-ICA positivity. (2) For ML-Flow tests, the positivity was comparable with whole blood and serum. (3) Among PB leprosy ML- flow positiviy was comparable for whole blood and serum but it was higher than the ML-ICA seropositivity in whole blood and serum. (4) Among MB leprosy patients positivity of ML Flow test in serum and whole blood was comparable to the positivity of ML-ICA in serum. Conclusion: ML-Flow test is more field applicable than ML-ICA since high positivity was observed among MB patients using whole-bood. / Objetivos: Este estudo comparou dois testes rápidos para hanseníase que detectam (1) IgM anti-PGL-I (ML-Flow test, KIT, Amsterdam, Holoanda) ou (2) IgM, IgG e IgA anti-PGL-I (ML-ICA, Yonsei University, Coréia do Sul). Materiais e Métodos: Foram testados sangue-total e soro de pacientes com hanseníase multibacilar (MB; n=50) e paucibacilar (PB; n=48), virgens de tratamento (Centro de Referência em Diagnóstica e Terapêutica, Goiânia, GO), contactantes intradomiciliares de MB (CD; n=35) e indivíduos saudáveis de área endêmica (CS; n=50). Pacientes com hanseníase foram classificados segundo avaliação dermato-neurológica, índice baciloscópico (IB) e exame histopatológico. A mediana da idade foi de 29 anos, 39.9% do sexo masculino. Pacientes MB apresentavam as formas BB-BL-LL (mediana do IB=2.0), Pacientes PB apresentavam as formas TT-BT. Resultados: (1) Para o grupo MB não observamos diferença significante entre os resultados dos testes ML-Flow em amostras de sangue-total e soro e os resultados do ML-ICA em amostras de soro; (2) Em todos os grupos (MB, PB, CD e CS) que não observamos diferença estatisticamente significativa entres os resultados do ML-Flow em sangue-total ou soro; (3) Entre os pacientes PB o ML-Flow apresentou sensibilidade significativamente maior que o teste ML-ICA, em amostras de sangue-total e em soro; (4) O teste ML-ICA em soro discriminou melhor os pacientes MB e PB. Conclusão: O teste ML-Flow mostrou-se melhor para utilização em situações de campo que o ML-ICA, pois apresentou alta reatividade em sangue-total em pacientes MB.

Submitted by Elizabete Silva (elizabete.silva@ufes.br) on 2015-03-26T20:31:18Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Brunela Pitanga Ramos Madureira.pdf: 595292 bytes, checksum: 91d4c514416e14264549113d0ff5dea1 (MD5) / Approved for entry into archive by Elizabete Silva (elizabete.silva@ufes.br) on 2015-04-09T19:24:46Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Brunela Pitanga Ramos Madureira.pdf: 595292 bytes, checksum: 91d4c514416e14264549113d0ff5dea1 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-09T19:24:46Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Brunela Pitanga Ramos Madureira.pdf: 595292 bytes, checksum: 91d4c514416e14264549113d0ff5dea1 (MD5) Previous issue date: 2015-02 / Esse estudo investiga a infecção subclínica de Mycobacterium leprae em pacientes infectados e não infectados pelo HIV, através da dosagem de anticorpos anti-PGL-I, e avalia se existe uma possível correlação dos resultados sorológicos encontrados com o estado de imunossupressão dos pacientes infectados pelo HIV. Foi realizado um estudo transversal analítico em 350 pacientes infectados pelo HIV e em 350 pacientes não infectados pelo HIV para detecção de anticorpos IgM anti-PGL-I em região endêmica para hanseníase. Avaliou-se uma possível correlação do estado de imunossupressão dos pacientes infectados pelo HIV (contagem de linfócitos CD4+, carga viral e uso ou não de terapia antirretroviral) com a soropositividade para PGLI. Dentre os pacientes infectados pelo HIV, 6% (21/350) apresentaram sorologia positiva para PGL-I e dos indivíduos não infectados pelo HIV, 29,1% (102/350) tinham PGL-I positivo. O grupo controle apresentou cerca de cinco vezes mais indivíduos com anticorpos anti-PGL-I do que o grupo infectado pelo HIV. Não houve diferença estatisticamente significativa na correlação do estado de imunossupressão do paciente com o resultado da sorologia anti-PGL-I. Houve uma menor produção de anticorpos anti-PGL-I em indivíduos infectados pelo HIV, o que pode indicar uma baixa taxa de infecção subclínica por M. leprae, ou uma baixa produtividade específica desses anticorpos, ou ambas as hipóteses. A desregulação de linfócitos B em indivíduos infectados pelo HIV pode ser a causa da baixa produção de anticorpos anti-PGL-I. Não houve correlação do estado de imunossupressão do paciente com o resultado da sorologia anti-PGL-I. / The present study investigated subclinical Mycobacterium leprae infection in human immunodeficiency virus (HIV) infected or uninfected individuals by measuring antibodies against M. leprae phenolic glycolipid I (PGL-I). It also sought to establish whether the serology results correlated with the HIV-infected participants’ state of immunosuppression. This was a cross-sectional study that analysed the anti-PGL-I immunoglobulin M antibody levels in 350 HIV-infected and 350 non-HIV-infected individuals residing in an area endemic for the two investigated conditions. The possible correlation between the state of immunosuppression of the HIV-infected participants (CD4+ cell count, viral load and the use or not of antiretroviral therapy) and anti-PGL-I seropositivity was assessed. Approximately 6% (21/350) of the HIVinfected and 29.1% (102/350) of the non-HIV-infected participants were anti-PGL-I antibody seropositive. The number of anti-PGL-I antibody seropositive individuals was approximately five-fold higher in the non-HIV-infected group, compared with the HIV-infected group. There was no significant correlation between the state of immunosuppression of the HIV-infected participants and the anti-PGL-I serology results. The HIV-infected individuals exhibited less anti-PGL-I antibody production relative to the control group, which may indicate a lower rate of subclinical M. leprae infection and/or lower specific production of this antibody. B cell dysregulation might cause the low anti-PGL-I antibody production in HIV-infected individuals. The patients’ state of immunosuppression did not correlate with the anti-PGL-I serology results.

CHAPTER II: Objective: Our aim was to compare the performance of three serological assays in leprosy patients and their household contacts utilizing two quantitative ELISA tests using native PGL-I (PGL-1 ELISA), synthetic ND-O-HSA (ND-O-HSA ELISA), and the semi-quantitative lateral flow test (ML-Flow). Methods: Compare the performance of three immunological assays, PGL-I ELISA, ND-O-HSA ELISA, and ML-Flow were evaluated in 156 leprosy patients and 191 household contacts. Results: The sensitivity results of the PGL-1, ND-O-HSA, and ML-Flow were 68.83%, 63.65%, and 60.65%, respectively. The native and synthetic PGL-I ELISA assays detected antibodies in 22.73%, 31.82% of the paucibacillary (PB) patients, and the ML Flow test did not detect antibodies in this group. The ML-Flow test was able to discriminate patients into PB and multibacillary (MB) forms, while the native PGL-I and ND-O-HSA correlated with the bacillary load and the Ridley-Jopling clinical forms. In household contacts, the native PGL-I, ND-O-HSA, and ML-Flow assays detected seropositivity of 25%, 17%, and 10%, respectively. Conclusions: The use of ELISA and ML-Flow tests are thus recommended as additional tools in the diagnosis and classification of the clinical forms, aiding in prescribing the correct treatment regimen to prevent subsequent nerve damage and disability. CHAPTER III: Host pathogen interactions are mainly mediated by specialized molecules of the cell envelope. One of these essential mycobacterial cell wall components is the lipoarabinomannan (LAM). LAM has immunomodulatory roles, but its heterogeneity may be responsible for the differential immune response in leprosy patients and contacts. The research to structural motifs that could contribute as virulence factors and/or protective epitopes, and thereby derive effective biomarkers for diagnosis, drugs and/ or vaccines against leprosy has been very developed. Therefore, our aim was to develop specific mimetic peptides to this lipoglycan by using Phage Display of a random heptamer peptide library that may recognize a differential response in patients and contacts. We have used the anti-LAM CS-35 monoclonal antibody as a target for three rounds of selection. After sequencing and translation, peptides were pre-validated by ELISA and compared to the synthetic LAM-BSA antigen. The most reactive and repetitive peptide motif (A9) was subsequently tested against serum from 54 leprosy patients and 27 endemic controls by ELISA. The A9 phage-displayed peptide clone presented high levels of IgG antibodies in paucibacillary patients, from which 50% of them presented highly reactive sera. This reactivity has also been detected in tuberculoid, borderline-borderline and lepromatous patients. High levels of IgG1 were most frequent in endemic controls and reactional patients. On the other hand, the IgG profile and its subclasses in patients presented high levels of IgG and IgG2 and low levels of IgG1. The A9 clone presented a significant correlation with the synthetic LAM-BSA, for the IgG1 response. The highly reactive IgG response against the A9 clone was associated with the tuberculoid clinical form diagnosis, and detection of both IgG1 and IgG3 against this clone was associated with protection in endemic controls. CHAPTER IV: Heat Shock Proteins (HSPs), GroES and GroEL, are targets of strong human T-cell response, and a third of the cells responsive to M. leprae, recognize these proteins. Monoclonal antibodies mAbs CS-01 and CS-44 selected mimetic peptides that are ligands of their Fab portions, by phage display technique. Sera from 54 patients, 48 household contacts and 27 endemic controls were submitted to ELISA with B2 and A1 mimetic clones of the GroES and GroEL proteins, respectively, for detection of IgG and its subclasses. Using the mimetic clone of B2 GroES, the ELISA detected IgG antibodies present in sera of patients, contacts and endemic controls. The IgG antibodies were abundant in sera from multibacillary patients, especially in lepromatous (LL). A decline of IgG1 was found in patients and household contacts that became sick with leprosy and a raise of this subclass was present in sera of household contacts that did not develop the disease. With the mimetic clone of GroEL A1, the reactive antibodies were abundant in multibacillary patients, with a correlation with the bacillary load. In this study we observed that IgG antibodies against GroEL and GroES can be detected in the diagnosis of leprosy in serological tests produced with clones mimetics of these proteins. And the subclasses of IgG antibodies to GroES can demonstrate a targeting of antigenic molecules that induce the production of protective antibodies. / CAPÍTULO III: Objetivo: O objetivo do trabalho foi comparar a performance de três testes sorológicos em pacientes e seus contatos domiciliares utilizando dois testes quantitativos ELISA, um com o antígeno PGL-1 nativo (ELISA PGL-1), com o antígeno ND-O-HSA sintético (ELISA ND-O-HSA), e o teste semi-quantitativo do fluxo lateral (ML-FLow). Métodos: Os três testes imunológicos ELISA PGL-I, ELISA ND-O-HSA, e ML-Flow foram realizados utilizando soros de 156 pacientes com hanseníase e 191 contatos domiciliares. Resultados: Os resultados da sensibilidade dos testes ELISA PGL-1, ND-O-HSA e ML-FLow foram de 68.83%, 63.65%, e 60.65%, respectivamente. Os testes ELISA PGL-1 nativo e sintético detectaram anticorpos em 22,73% e 31,82% dos soros de pacientes paucibacilares (PB),e o teste ML-FLow não apresentou reatividade em nenhum soro. O ML-Flow foi capaz de discriminar entre os pacientes com as formas PB e multibacilares (MB), enquanto que o ELISA PGL-1 e ND-O-HSA correlacionaram com a carga bacilar e as formas clínicas de Ridley-Jopling. Em contatos domiciliares, os testes ELISA PGL-1 nativo, ND-O-HSA e Ml-FLow detectaram soropositividade de 25%, 17%, e 10%, respectivamente. Conclusões: O uso do teste ELISA e ML-Flow são recomendados no diagnóstico e classificação das formas clínicas, auxiliando na prescrição do tratamento correto e na prevenção do dano neural e da incapacidade. CAPÍTULO IV: Interação patógeno-hospedeiro é mediada principalmente por moléculas especializadas do envelope celular. Um dos componentes essenciais da parede celular das micobactérias é a lipoarabinomanana (LAM). A LAM tem um papel imunomodulador, mas a sua heterogeneidade pode ser responsável pela resposta imune diferenciada em pacientes com hanseníase e contatos. Espera-se que a pesquisa por motivos estruturais de M. leprae possam contribuir, como fatores de virulência ou epítopos de proteção, e assim, derivar biomarcadores eficazes para o diagnóstico, drogas e vacinas contra a hanseníase. Portanto, nosso objetivo foi desenvolver peptídeos miméticos específicos à LAM utilizando Phage Display de uma biblioteca aleatória de peptídeos heptameros que possam reconhecer uma resposta diferencial em pacientes com hanseníase e contatos. Nós utilizamos o anticorpo monoclonal anti-LAM, CS-35, como um alvo de três rodadas de seleção. Após seqüenciamento e tradução, os peptídeos foram pré-validados por ELISA e comparados com o antígeno sintético LAM-BSA. O motivo peptídeo mais reativo e repetitivo (A9) foi posteriormente testado contra o soro de 54 pacientes com hanseníase e 27 controles endêmicos por ELISA. O clone mimético A9 apresentou altos níveis de anticorpos IgG em pacientes paucibacibacilares (PB), sendo que 50% destes soros foram altamente reativos. Esta reação também ocorreu em pacientes tuberculóides, dimorfo-dimorfo e virchowiano. Controles endêmicos e pacientes reacionais apresentaram altos níveis de IgG1 no soro. Por outro lado, o perfil de IgG e suas subclasses em pacientes apresentou altos níveis de IgG e IgG2 e baixos níveis de IgG1. O clone A9 apresentou uma correlação positiva significativa com o antígeno LAM-BSA sintético para a resposta IgG1. A resposta de IgG altamente reativa contra o clone A9 foi associada com o diagnóstico da forma clínica tuberculóide, e a detecção de ambos, IgG1 e IgG3, contra esse clone foi associado à proteção nos controles endêmicos. CAPÍTULO V: Interação patógeno-hospedeiro é mediada principalmente por moléculas especializadas do envelope celular. Um dos componentes essenciais da parede celular das micobactérias é a lipoarabinomanana (LAM). A LAM tem um papel imunomodulador, mas a sua heterogeneidade pode ser responsável pela resposta imune diferenciada em pacientes com hanseníase e contatos. Espera-se que a pesquisa por motivos estruturais de M. leprae possam contribuir, como fatores de virulência ou epítopos de proteção, e assim, derivar biomarcadores eficazes para o diagnóstico, drogas e vacinas contra a hanseníase. Portanto, nosso objetivo foi desenvolver peptídeos miméticos específicos à LAM utilizando Phage Display de uma biblioteca aleatória de peptídeos heptameros que possam reconhecer uma resposta diferencial em pacientes com hanseníase e contatos. Nós utilizamos o anticorpo monoclonal anti-LAM, CS-35, como um alvo de três rodadas de seleção. Após seqüenciamento e tradução, os peptídeos foram pré-validados por ELISA e comparados com o antígeno sintético LAM-BSA. O motivo peptídeo mais reativo e repetitivo (A9) foi posteriormente testado contra o soro de 54 pacientes com hanseníase e 27 controles endêmicos por ELISA. O clone mimético A9 apresentou altos níveis de anticorpos IgG em pacientes paucibacibacilares (PB), sendo que 50% destes soros foram altamente reativos. Esta reação também ocorreu em pacientes tuberculóides, dimorfo-dimorfo e virchowiano. Controles endêmicos e pacientes reacionais apresentaram altos níveis de IgG1 no soro. Por outro lado, o perfil de IgG e suas subclasses em pacientes apresentou altos níveis de IgG e IgG2 e baixos níveis de IgG1. O clone A9 apresentou uma correlação positiva significativa com o antígeno LAM-BSA sintético para a resposta IgG1. A resposta de IgG altamente reativa contra o clone A9 foi associada com o diagnóstico da forma clínica tuberculóide, e a detecção de ambos, IgG1 e IgG3, contra esse clone foi associado à proteção nos controles endêmicos. / Doutor em Genética e Bioquímica