Introduction: Over the past decades, considerable advances in understanding of cell biology at genetic, epigenetic and proteomic levels led to development of new strategies for better outcome of cancer therapy. One of these new strategies is targeting the class I PI3K/Akt/mTOR signaling pathway, in that this pathway plays a key role in regulation of many cellular functions, including proliferation, survival, metabolism, autophagy and motility. Dysregulation of the class I PI3K/Akt/mTOR pathway has been documented in a variety of human tumours and inhibition of this pathway has been observed to hamper tumour proliferation in vitro and prevent tumour progression in vivo and in clinic. More recently, emerging evidence suggests that the class I PI3K/Akt/mTOR pathway is associated with Cancer Stem Cell (CSC) biology, in light of maintenance, viability and conventional therapy resistance of CSCs. The CSC theory conceptualizes that a subset of tumour cells with Stem Cell-like properties, including self-renewal, multipotency, differentiation, and resistance to chemotherapy and radiotherapy, can recapitulate new tumours and resistance to cancer therapy. Materials and Methods: To explore class I PI3K/Akt/mTOR signaling pathway and CSCs as therapeutic targets in canine oncology, in one series of experiments, smallmolecular inhibitors Wortmannin, ZSTK474, KP372-1 and Rapamycin, which selectively target pan-class I PI3K, pan-class I PI3K, Akt and mTOR, respectively, were utilized to treat canine cancer cell lines using inhibitors alone or in combination with conventional therapeutic drugs. The human acute lymphoblastic leukaemia of T-cell origin cell line (Jurkat T cell line) was used as a comparative control. In another, a stem cell culture system was performed to isolate CSCs from canine glioma J3T cell line. Subsequently, microarray analysis of transcriptional expression profiles of J3T spheres (the putative CSCs) versus J3T parental cells was performed. Results: In this study, small molecules ZSTK474 and KP372-1 were found to significantly decrease cell viability at lower micromolar and nanomolar ranges, respectively. Rapamycin decreased cell viability at lower micromolar concentrations. However, the efficacy of Wortmannin varied from one cell line to another. Dissection of the mechanism of these inhibitors using Western Blot analysis and annexin V staining showed that all inhibitors functioned by decreasing phosphorylation of class I PI3K pathway members. Notably, the efficacy of Wortmannin for this pathway inhibition is confined to certain cell lines. In addition, Wortmannin had shorter drug duration than the other three inhibitors. Annexin V staining showed that KP372-1 was a potent inducer of apoptosis, with decreasing potency in hierarchy order, Rapamycin, Wortmannin and ZSTK474. The data obtained from the combination of pan-class I PI3K inhibitor (Wortmannin or ZSTK474) and mTOR inhibitor (Rapamycin) suggested that additive/synergistic effects were, in part, due to inactivation of Akt. The class I PI3K pathway inhibitors enhanced the efficacy of Doxorubicin in SB cells but not in canine REM, 3132 and J3T cells. The CSC colonies of canine glioma J3T cells were successfully isolated and expanded in the neurosphere formation assay. By microarray analysis, several class I PI3K signaling network-associated genes, particularly IGFBP2 (27-fold), FYN (9.3- fold), and DDIT4 (8.5-fold), were found to be highly up-regulated in the J3T CSCs. However, the genes encoding components, such as Akt1 and eIF4E, of class I PI3K/Akt/mTOR axis signaling were either unchanged or down-regulated in the CSCs. The majority of the genes encoding translation initiation factors were also downregulated in the CSCs. Conclusions: This study demonstrates that class I PI3K/Akt/mTOR signaling pathway is critical for proliferation and survival of cell lines derived from human acute lymphoblastic leukemia of T cell origin (Jurkat T cell line) and a variety of canine tumours. However, it appears that this pathway is dispensible for maintainence and viability of the CSCs isolated from canine gloma J3T cell line. This study suggests that the strategy of dual inhibition of class I PI3K and mTOR kinases may have better outcomes than the combination inhibitors of this pathway (such as ZSTK474 and KP372-1) with Doxorubicin in canine oncology.

Devant l’incidence de la suractivation de la voie PI3K/Akt/mTOR sur les cancers, nous avons choisi d’inhiber cette voie de signalisation. Etant donné la forte analogie structurale qui existe entre les enzymes PI3K et mTOR, nous avons conçu des inhibiteurs doubles ciblant deux kinases majeures de la voie. Ces inhibiteurs possèdent un noyau original pyrido[3,2-d]pyrimidinique. Afin d’apporter de la diversité fonctionnelle et d’engendrer un effet thérapeutique, les sommets C-4, C-2 et C-7 furent fonctionnalisé séquentiellement selon l’ordre suivant. Tout d’abord, la position C-4 fut fonctionnalisée par des hétérocycles par substitution nucléophile aromatique. Puis divers cycles hétéroaromatiques furent introduits en position C-2 par couplage de type Suzuki-Miyaura. Enfin, des groupements variés furent insérés en position C-7 par différentes réactions. Dans l’étude de l’influence du squelette, l’isomère de position pyrido[2,3-d]pyrimidine fut également synthétisé et fonctionnalisé. Afin de tester ces inhibiteurs originaux, une plateforme de tests d’activités in vitro a été mise en place où cinq kits enzymatiques ont été optimisés sur la kinase PI3K, et un test sur mTOR. Ces tests exploitant la méthode de TR-FRET et de bioluminescence ont été validés avec des inhibiteurs de référence basés sur 4 facteurs : la corrélation entre IC50(littérature) et IC50(mesurée), Z’, R², et S/B.Au final, plus de soixante produits finaux ont été évalués in vitro sur PI3K et mTOR. La moitié présentent une IC50 inférieure à 100 nM et 5 ont des IC50 inférieures à 10 nM. Dans le cadre des échanges du Cancéropôle Grand Ouest, les produits ont été testés sur 6 lignées de cellules cancéreuses. / Considering the impact of overactivation of the PI3K/Akt/mTOR pathway in cancer, we chose to inhibit this signaling pathway. Given the high structural similarity between the PI3K and mTOR enzymes, we designed dual inhibitors targeting two of the three major kinases of the pathway. These inhibitors posses an original pyrido[3,2-d] pyrimidine scaffold. In order to provide a functional diversity and generate a therapeutic effect, the peaks C-4, C-2 and C-7 were functionalized sequentially in the following order. Position C-4 was first functionalized with aliphatic heterocycles by nucleophilic aromatic substitution. Then, various heteroaromatic rings were introduced at the C-2 position by Suzuki-Miyaura coupling. Finally, different functions were inserted at the C-7 peak by different reactions. In order to study the influence of the scaffold, the pyrido[2,3-d]pyrimidine isomer was also synthesized and functionalized. To test these original inhibitors a platform testing in vitro activities was set up in which five assay kits were optimized for the kinase PI3K, and one kit for mTOR. These tests exploit the TR-FRET and bioluminescence methods and were validated with commercially available inhibitors based on four factors: the correlation between IC50(literature) and IC50(measured), Z’, R², and S/B. In the end, more than sixty final products were evaluated in vitro on PI3K and mTOR. Half present an IC50 below 100 nM and 5 of them show an IC50 under 10 nM. As part of collaboration within the Cancéropôle Grand Ouest, the products were also tested on six cancer cell lines.

La voie PI3Kinase/AKT/mTOR, est une cible thérapeutique du temsirolimus, un inhibiteur de mTORC1. Dans le but d'obtenir une inhibition plus importante de cette voie j’utilise dans ce projet deux nouvelles molécules :- le NVP-BEZ 235 (BEZ) qui inhibe à la fois mTORC1 et la PI3kinase- l'AZD8055 (AZD), un inhibiteur des complexes mTORC1 et mTORC2. En utilisant différentes lignées de LCM, j’ai démontré que l'effet de ces nouveaux inhibiteurs sur la survie cellulaire est plus important que celui du temsirolimus. Cela est probablement dû à l'inhibition de la phosphorylation de l'AKT et la 4EBP. La deuxième partie de ce projet étudie la synergie entre les inhibiteurs de m-TOR kinase et l'aracytine. Un effet additif important a été démontré. J’ai trouvé en western blot que l’aracytine inhibe la phosphorylation des substrats de la voie Akt –mTOR notamment le 4EBP. L’ibrutinib (un inhibiteur de la voie Btk) a un effet modeste mais j’ai pu démontrer qu'il est capable à induire une inhibition plus importante de la survie cellulaire lorsqu'il est associé à l’aracytine. Cependant il s'est révélé antagoniste aux inhibiteurs de la voie PI3K-AKT-mTOR, cela reste difficile à décortiquer. Enfin, j’ai trouvé un effet additif de l’ibrutinib en combinaison avec la doxorubicine. Cependant les inhibiteurs de m-TOR n'ont pas le même effet. Afin d’expliquer ces résultats, j’ai étudié l’effet de ces molécules sur l’expression de GSTPi, enzyme de détoxification connue pour avoir un rôle important dans la résistance de LCM à l’anthracycline. J’ai mis en évidence une diminution de l’expression de cet enzyme par l’Ibrutinib. En revanche, les inhibiteurs de mTOR n’ont pas un effet sur l’expression de GSTPi. L’ibrutinib pourrait donc sensibiliser le LCM à l’anthracycline en diminuant l’expression de GSTPi. / The PI3K / AKT / mTOR pathway is the target of Temsirolimus. However, important resistance is observed. We tried to obtain a more important inhibition of PI3K / AKT pathway using two new molecules :- NVP-BEZ 235 (BEZ) which inhibits both mTORC1 and PI3K- AZD8055 (AZD) an inhibitor of mTORC1 and mTORC2 complexes. Using different cell lines of MCL, we have shown that the effect of these new inhibitors on cell survival was more important than that of Temsirolimus. This is probably because contrary to Temsirolimus, the two new molecules can inhibit AKT and 4EBP phosphorylation. In the second part of this project we studied the synergy between the m-TOR kinase inhibitors and aracytine (conventional treatment of MCL). We revealed a significant additive effect in MCL cell lines. We demonstrated by Western blot analysis that aracytine inhibits S6 and 4EBP phosphorylation. This may explain the results obtained from this drug association. We then showed that Ibrutinib (an inhibitor of Btk pathway) can induce a significant inhibition of cell survival when combined with aracytine. In this study, Ibrutinib proved antagonist effect to PI3K-AKT-mTOR inhibitors. The mechanisms of these results remain unclear. Finally, we demonstrated an additive effect of Ibrutinib in combination with doxorubicin. We did not obtain the same results when we combined m-TOR inhibitors with doxorubicin. To explain these data, we studied the effect of these drugs on the expression of GSTPi by western blot. This enzyme is known to have an important role in MCL resistance to anthracycline. Importantly, Ibrutinib induced a decrease in the expression of GSTPi but AZD8055, Temsirolimus and NVP-BEZ235 had no effect.

Le chondrosarcome (CHS) est caractérisé par une grande chimio et radiorésistance ; il y a un besoin urgent de nouvelles stratégies thérapeutiques pour cette tumeur. Parmi celles-ci, certaines approches d'immunothérapie pourraient être d'un grand intérêt. Nous étudions actuellement l'implication du système immunitaire dans la progression du CHS et la réponse thérapeutique à la fois sur des échantillons humains et dans le modèle de chondrosarcome de rat (SRC).Dans le CHS humain et de rat, des infiltrats immunitaires composés de lymphocytes et macrophages ont été identifiés dans la zone péritumorale. L’infiltration immunitaire est en corrélation avec l’évolution de la tumeur (grade, envahissement et taille). L'expression de PD1 et PDL1 ont été détectée dans les infiltrats immunitaires et cellules tumorales du CHS chez l’homme et le rat. Le niveau d'expression PD-L1 en corrélation avec la survie des patients et le taux de rechute. Dans le model SRC, la déplétion sélective de lymphocytes T a entrainé une accélération de la progression tumorale, tandis que la déplétion de macrophages l’a ralenti. Les splénocytes isolés de rats porteurs de CHS ont montré une cytotoxicité spécifique dirigée contre les cellules de chondrosarcome (27%), qui a diminué de manière significative avec des rats appauvrie en CD3 (11%). La voie de signalisation PI3K/mTOR ne peut pas être associée à une immunothérapie car elle induit une action immunosuppressive in vivo.L'environnement immunitaire contribue à la progression du CHS à la fois chez l’homme et chez le rat, ce qui suggère que une approche immunomodulatrice avec des anticorps bloquant PDL1 pourrait être testée pour le CHS / Chondrosarcoma is highly resistant to chemotherapy and radiation and there is an urgent need in developing new therapeutic strategies for this malignancy; among these, some immunotherapy approaches could be of great interest. We are currently investigating the immune system implication in chondrosarcoma progression and therapeutic response both on human samples and in rat chondrosarcoma model (SRC). In human and rat chondrosarcoma, immune infiltrates composed of lymphocytes and macrophages were identified in the peritumoral area. Immune infiltrates composition was found correlated with tumors characteristics and evolution (grade, invasiveness and size). Expression of PD-1 and PD-L1 was detected in CHS immune infiltrates, both in human and rat (and on tumor cells). PD-L1 expression level correlated with patients survival and relapse rate. In SRC, T lymphocytes depletion resulted in an accelerated tumor progression, while CD163+ macrophages depletion slowed down tumor progression. Splenocytes isolated from CHS bearing SRC showed a specific cytotoxicity directed against chondrosarcoma cells (27%), which significantly decreased in CD3 depleted SRC (11%). The immune environment contributes to CHS progression in both human and animal models, this associated with expression of immune checkpoint PD1/PDL1 suggest that immunomodulatory approaches with PD-L1 blocking antibody could be applied in CHS; this approach is currently being tested in SRC

Hepatocellular carcinoma (HCC) is the second most common cause of cancerrelated mortality worldwide. AKT pathway has been found activated in 50% of HCC cases, making it promising target. Therefore we assess efficacy of the allosteric AKT inhibitor or the combination of Sorafenib with AKT inhibitor compared to untreated control and to standard treatment, Sorafenib, in vitro and in vivo. AKT inhibitor blocked phosphorylation of AKT in vitro and strongly inhibited cell growth with significantly higher potency than Sorafenib. Similarly, apoptosis and cell migration were strongly reduced by AKT inhibitor in vitro. To mimic human advanced HCC, we used diethylnitrosamine-induced cirrhotic rat model with fully developed HCC. MRI analyses showed that AKT inhibitor significantly reduced overall tumor size. Furthermore, number of tumors was decreased by AKT inhibitor, which was associated with increased apoptosis and decreased proliferation. Tumor contrast enhancement was significantly decreased in the AKT inhibitor group. Moreover, on tumor tissue sections, we observed a vascular normalization and a significant decrease in fibrosis in surrounding liver of animals treated with AKT inhibitor. Finally, pAKT/AKT levels in AKT inhibitor treated tumors were reduced, followed by down regulation of actors of AKT downstream signalling pathway: pmTOR, pPRAS40, pPLCγ1 and pS6K1. In conclusion, we demonstrated that AKT inhibitor blocks AKT phosphorylation in vitro and in vivo. In HCC-rat model, AKT inhibitor was well tolerated, showed anti-fibrotic effect and had stronger antitumor effect than Sorafenib. Our results confirm the importance of targeting AKT in HCC. / Hepatocellular carcinoma (HCC) is the second most common cause of cancerrelated mortality worldwide. AKT pathway has been found activated in 50% of HCC cases, making it promising target. Therefore we assess efficacy of the allosteric AKT inhibitor or the combination of Sorafenib with AKT inhibitor compared to untreated control and to standard treatment, Sorafenib, in vitro and in vivo. AKT inhibitor blocked phosphorylation of AKT in vitro and strongly inhibited cell growth with significantly higher potency than Sorafenib. Similarly, apoptosis and cell migration were strongly reduced by AKT inhibitor in vitro. To mimic human advanced HCC, we used diethylnitrosamine-induced cirrhotic rat model with fully developed HCC. MRI analyses showed that AKT inhibitor significantly reduced overall tumor size. Furthermore, number of tumors was decreased by AKT inhibitor, which was associated with increased apoptosis and decreased proliferation. Tumor contrast enhancement was significantly decreased in the AKT inhibitor group. Moreover, on tumor tissue sections, we observed a vascular normalization and a significant decrease in fibrosis in surrounding liver of animals treated with AKT inhibitor. Finally, pAKT/AKT levels in AKT inhibitor treated tumors were reduced, followed by down regulation of actors of AKT downstream signalling pathway: pmTOR, pPRAS40, pPLCγ1 and pS6K1. In conclusion, we demonstrated that AKT inhibitor blocks AKT phosphorylation in vitro and in vivo. In HCC-rat model, AKT inhibitor was well tolerated, showed anti-fibrotic effect and had stronger antitumor effect than Sorafenib. Our results confirm the importance of targeting AKT in HCC.

Bcl-xL et Mcl-1 sont deux protéines anti-apoptotiques de la famille Bcl-2 dont dépendent les cancers de l’ovaire pour leur survie, leur inhibition semble donc être une stratégie pertinente. La molécule BH3-mimétique ABT 737 (ou son analogue oral, l’ABT-263), est un puissant inhibiteur de Bcl-xL mais l’inhibition de Mcl-1 reste problématique. Les voies de signalisation PI3K/Akt/mTOR et MAPK/ERK régulent l’expression et l’activité de cette dernière protéine et de ses partenaires BH3-only (Bim, Puma, Noxa). Nous nous sommes donc intéressés à l’intérêt de leur inhibition pour sensibiliser les cellules cancéreuses ovariennes à l’ABT-737. La première étude menée avec le BEZ235, double inhibiteur PI3K/mTOR développé par le laboratoire Novartis, montre qu’il inhibe l’expression de Mcl-1 et induit celle de Puma, et qu’il sensibilise les cellules cancéreuses ovariennes à l’ABT-737 à condition que l’expression de Bim soit également induite. La deuxième étude a évalué les effets de l’AZD8055, inhibiteur du site actif de mTOR développé par le laboratoire AstraZeneca, et du trametinib, inhibiteur allostérique de MEK développé par le laboratoire GlaxoSmithKline et actuellement en clinique, sur trois lignées cancéreuses ovariennes. L’inhibition de l’expression de Mcl-1 et l’induction de celle de Puma par l’AZD8055 ne permettent pas de diminuer suffisamment le ratio [Mcl-1/protéines BH3-only] pour sensibiliser les cellules à l’ABT-737. En revanche, la forte induction de Bim sous forme active déphosphorylée par le trametinib permet de diminuer suffisamment ce ratio pour sensibiliser deux des trois lignées testées à l’ABT-737. C’est cependant la triple combinaison AZD8055/trametinib/ABT-737 qui est la plus efficace pour induire une apoptose massive dans les trois lignées. Par ailleurs, de façon intéressante, l’association de l’AZD8055 et du trametinib est cytotoxique sans ABT 737 dans une des lignées testées. Ces résultats mettent en évidence l’efficacité de différentes stratégies thérapeutiques multi-cibles et la nécessité de définir des marqueurs prédictifs de la réponse afin d’évoluer vers un traitement personnalisé pour améliorer la prise en charge des cancers de l’ovaire. / Ovarian cancers depend on Bcl-xL and Mcl-1, two anti-apoptotic protein of the Bcl-2 family, for their survival and their inhibition seems to by a relevant strategy. The BH3-mimetic molecule ABT-737 (or its oral form, ABT-263), is a strong Bcl-xL inhibitor, but Mcl-1 inhibition remains problematic. Signaling pathways PI3K/Akt/mTOR and MAPK/ERK regulate expression and activity of Mcl-1 and its BH3-only partners (Bim, Puma, Noxa). We focused on the interest of their inhibition to sensitize ovarian cancer cells to ABT-737. The first study with BEZ235, a PI3K/mTOR dual inhibitor developed by Novartis, inhibits Mcl-1 expression and induces the one of Puma, and sensitizes ovarian cancer cells to ABT-737 provided that Bim expression is induced. The second study evaluated the effects of AZD8055, mTOR active site inhibitor developed by AstraZeneca, and of trametinib, MEK allosteric inhibitor developed by GlaxoSmithKline and currently in clinic, on three ovarian cancer cell lines. Mcl-1 expression inhibition and Puma expression induction by AZD8055 does not sufficiently reduce [Mcl-1/BH3-only proteins] ratio to sensitize cells to ABT-737. On the other hand, strong Bim induction in its active dephosphorylated form by trametinib sufficiently reduce this ratio to sensitize two of the three cell lines tested to ABT-737. Nevertheless, the triple combination AZD8055/trametinib/ABT-737 is the most efficient to induce massive apoptosis in the three cell lines. Besides, interestingly, AZD8055 and trametinib association is cytotoxic without ABT-737 in one of the tested cell lines. These results highlight the efficacy of different multi-targets therapeutic strategies and the need of predictive marker definition of the response to develop personalized treatment and to improve ovarian cancer management.

Shp-1 (Src homology 2 domain-containing phosphatase 1) est une tyrosine phosphatase retrouvée principalement chez les cellules hématopoïétiques, mais également chez les cellules épithéliales. Bien que Shp-1 soit reconnue comme étant un régulateur négatif de plusieurs voies de signalisation intracellulaire chez les cellules hématopoïétiques, son rôle dans les cellules épithéliales a été jusqu’ici très peu étudié. Afin de mieux comprendre son rôle dans les cellules épithéliales intestinales, nous avons généré un modèle murin de délétion conditionnelle de Shp-1 spécifiquement dans l’épithélium intestinal (Shp-1CEI-KO). De manière intéressante, dès l’âge de 6 semaines, les souris expérimentales présentent une intestinalomégalie associée à une légère augmentation de la prolifération cryptale. La taille des cellules épithéliales est également augmentée, suggérant de l’hypertrophie cellulaire chez les souris invalidées pour Shp-1. Parallèlement, la voie de signalisation PI3K/Akt/mTor est activée dans l’épithélium des souris mutantes. Nous avons également noté une production accrue de cellules caliciformes et de leurs précurseures, les cellules intermédiaires, en absence de Shp-1. Par contre, la maturation des cellules de Paneth semble grandement compromise vu la baisse importante d’expression du lysozyme et des RegIIIβ et RegIIIγ, de même que la faible densité de leurs granules de sécrétion. La comparaison du phénotype intestinal des souris Shp-1CEI-KO avec celui des souris PtenCEI-KO suggère que l’hyperactivation de la voie PI3K/Akt/mTor est responsable en partie des altérations phénotypiques observées chez la souris invalidée pour Shp-1. En conclusion, nos résultats montrent que la tyrosine phosphatase Shp-1 est un régulateur important de l’homéostasie de l’épithélium intestinal en contrôlant notamment la croissance cellulaire et la différenciation des cellules de la lignée sécrétrice.

Producing competent and fertilizable oocytes from in vitro grown primordial follicles could revolutionize female infertility treatment, particularly using fertility preservation approaches that use cryopreserved ovarian tissue. However, the protracted length of folliculogenesis in humans makes follicular culture complex, and the mechanisms controlling the tightly-regulated activation of primordial follicles remain largely unknown. The delicate balance between follicular recruitment and quiescence might be affected by preservation procedures, such as ovarian fragmentation or in vitro culture, that disrupt crucial pathways, such as the Hippo and PI3K/Akt/mTOR signaling pathways, that are involved in this process. When activated, these pathways induce massive recruitment of primordial follicles and accelerate follicular growth in vitro, with potential negative consequences on future oocyte developmental competence. Therefore, we hypothesized that the inhibition of the PI3K/Akt/mTOR pathway might improve follicular growth by slowing down the activation process.In the first part of this thesis, we explored the potential benefit of inhibiting PI3K/Akt/mTOR signaling on the regulation of in vitro follicular activation and growth, as well as its impact on the Hippo pathway. The effect of everolimus (EVE), a specific mTORC1 inhibitor, was compared to the PI3K/Akt activators recently used to reinitiate the growth of residual follicles in the ovarian tissue of patients with premature ovarian insufficiency. We showed that short-term incubation of ovarian cortex with EVE partially delayed follicular recruitment while supporting follicle survival and steroidogenesis. However, morphological abnormalities were observed in all conditions, suggesting that EVE failed to protect follicles from accelerated in vitro growth-related defects.Our findings also provided evidence that ovarian fragmentation, which disrupts the Hippo pathway, contributes to the triggering of primordial follicle recruitment and early development of quiescent human follicles. Moreover, our data suggested that both PI3K/Akt and Hippo signaling could act synergistically to promote follicular activation and growth.In the second part of the project, we further investigated the integrity of EVE-treated follicles based on their ultrastructural and functional status. Our observations indicate that the integrity of oocyte and granulosa cells, as well as their physical contacts, were preserved in EVE and control conditions, although some in vitro grown follicles sustained cryopreservation- and culture- induced damage. We also found that short exposure to EVE allowed the maintenance of intra-follicular communication while preserving follicular developmental potential. Importantly, results obtained suggested that, at a similar developmental stage, cell coupling and oocyte growth may be improved in EVE-treated follicles.Altogether, these data provide better insight into the regulation of the follicular activation process and emphasize the importance of getting closer to physiological conditions to preserve follicle integrity. They also provide proof-of-concept evidence that reducing the initiation of growth is feasible, and suggest that mTORC1 inhibitors are a potentially useful pharmacological tool to regulate in vitro follicular growth. / La production d'ovocytes compétents et fécondables à partir de follicules primordiaux développés in vitro pourrait révolutionner les traitements liés à l'infertilité féminine, en particulier les approches de préservation de la fertilité à partir du tissu ovarien cryopréservé. Cependant, la longue durée de la folliculogenèse chez l'Homme rend la culture folliculaire complexe, et les mécanismes contrôlant l'activation des follicules primordiaux restent largement inconnus. L’équilibre fragile entre quiescence folliculaire et entrée en croissance pourrait être affecté par la fragmentation ovarienne ou la culture in vitro elle-même, qui perturbent deux voies de signalisation cruciales: les voies Hippo et PI3K/Akt/mTOR, respectivement. Lorsqu'elles sont activées, elles induisent un recrutement massif de follicules primordiaux et accélèrent la croissance folliculaire in vitro, avec des conséquences potentiellement néfastes sur la capacité future des ovocytes à devenir compétents. Par conséquent, nous avons émis l’hypothèse que l’inhibition de la voie PI3K/Akt/mTOR pourrait améliorer la croissance folliculaire via un ralentissement du processus d’activation.Dans la première partie de cette thèse, nous avons exploré le potentiel bénéfice d’une inhibition de la voie PI3K/Akt/mTOR sur la régulation de l'activation et de la croissance folliculaire in vitro, ainsi que son impact sur la voie Hippo. L’effet de l’évérolimus (EVE), un inhibiteur spécifique de mTORC1, a été comparé à ceux d’activateurs de PI3K/Akt, récemment utilisés afin d’initier la croissance des follicules résiduels au sein de tissus ovarien de patientes en insuffisance ovarienne précoce. Nous avons montré que l'exposition à court terme de cortex ovarien à l'EVE retardait partiellement le recrutement folliculaire tout en préservant la survie et la stéroidogenèse des follicules. Toutefois, des anomalies morphologiques ont été observées dans toutes les conditions, ce qui suggère que l’EVE ne préserve pas les follicules de défauts liés à une croissance accélérée.Nos résultats ont également prouvé que la fragmentation ovarienne, en perturbant la voie Hippo, contribue au recrutement et au développement précoce des follicules primordiaux. De plus, les données obtenues suggèrent que les voies PI3K/Akt/mTOR et Hippo pourraient agir de manière synergique pour promouvoir l'activation et la croissance folliculaire.Dans la deuxième partie du projet, nous avons étudié la qualité des follicules traités avec de l’EVE en se basant sur des critères ultrastructural et fonctionnel. Nos observations ont indiqué que l'intégrité des ovocytes et des cellules de la granulosa ainsi que leurs contacts physiques était préservée dans les conditions EVE et contrôle, bien que certains follicules en croissance présentent des signes de dommages induits par la cryopréservation et la culture. Nous avons également constaté qu'une courte exposition à l’EVE permettait de maintenir les communications intra-folliculaires tout en préservant le potentiel de développement des follicules. De façon importante, les résultats obtenus suggèrent qu’à un stade de développement similaire, le couplage cellulaire et la croissance des ovocytes pourraient être améliorés dans les follicules traités à l’EVE.En conclusion, ces données contribuent à une meilleure compréhension de la régulation de l'activation folliculaire in vitro, et soulignent l'importance de mimer les conditions physiologiques pour préserver l'intégrité des follicules. Elles apportent également la preuve qu’un ralentissement de l’initiation de la croissance est réalisable, et suggèrent que l’utilisation d’inhibiteurs de mTORC1 pourrait représenter un outil pharmacologique efficace pour réguler la croissance folliculaire in vitro. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

No description available.

No description available.