Thesis (M.S.)--University of Missouri-Columbia, 2008. / The entire dissertation/thesis text is included in the research.pdf file; the official abstract appears in the short.pdf file (which also appears in the research.pdf); a non-technical general description, or public abstract, appears in the public.pdf file. "August 2008" Includes bibliographical references.

Thesis (Ph. D.)--University of Missouri--Columbia, 1999. / "December 1999." Typescript. Vita. Includes bibliographical references (leaves 98-104). Also available on the Internet.

Thesis--Carleton University. / Also available in electronic format on the Internet.

L'îlot génomique Salmonella Genomic Island 1 (SGI1) est un élément intégratif et mobilisable, support de nombreux gènes de résistance aux antibiotiques, et identifié chez de nombreux genres bactériens. Le transfert de SGI1 requiert spécifiquement la présence d'un plasmide conjugatif du groupe d'incompatibilité IncA/C. Les régulateurs globaux AcaCD des plasmides IncA/C activent l’excision de SGI1 qui, une fois sous forme d’un intermédiaire extrachromosomique circulaire, va pouvoir être transféré en utilisant la machinerie de conjugaison encodée par les plasmides IncA/C (mobilisation conjugative en trans). Depuis la description de SGI1, plusieurs études ont relaté une apparente stabilité de SGI1 au cours des générations bactériennes. Cependant, des observations préliminaires indiquaient des difficultés de cohabitation entre SGI1 et les plasmides IncA/C. L’objectif de ce travail était d’étudier la stabilité de SGI1 et sa compatibilité avec les plasmides conjugatifs IncA/C dont dépend sa mobilité. L’opéron putatif S026- S025 de SGI1 a été identifié comme constituant un système Toxine-Antitoxine (TA) qui a été appelé sgiAT. Le rôle de ce système TA dans la stabilité de SGI1 a été mis en évidence en présence d'un plasmide IncA/C. De plus, l’incompatibilité entre SGI1 et les plasmides IncA/C a été démontrée expérimentalement pour la première fois. La stabilité de SGI1 est liée à son intégration chromosomique. Cependant, lorsque SGI1 est excisé du chromosome et donc vulnérable (il peut être perdu), c’est-à-dire en présence d’un plasmide IncA/C, le système TA sgiAT joue un rôle important dans le maintien de SGI1 dans les populations bactériennes. / The multidrug resistance Salmonella Genomic Island 1 (SGI1) is an integrative mobilizable element identified in several enterobacterial pathogens. This chromosomal island requires specifically the presence of a conjugative IncA/C plasmid to be excised and transfered by conjugation (mobilization in trans). Preliminary observations suggest stable maintenance of SGI1 in the bacterial host but paradoxically also incompatibility between SGI1 and IncA/C plasmids. Here, using a Salmonella enterica serovar Agona clonal bacterial population as model, we demonstrate that a Toxin-Antitoxin (TA) system encoded by SGI1 plays a critical role in its stable host maintenance when an IncA/C plasmid is concomitantly present. This system, designated sgiAT for Salmonella genomic island 1 Antitoxin and Toxin respectively, thus seems to play a stabilizing role in a situation where SGI1 is susceptible to be lost through plasmid IncA/C-mediated excision. Moreover and for the first time, the incompatibility between SGI1 and IncA/C plasmids was experimentally confirmed.

Nanoemulsões catiônicas têm sido recentemente propostas como sistemas carreadores de DNA. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a influência de diferentes fosfolipídeos sobre propriedades dos complexos formados entre nanoemulsões e pDNA (pTracerTMCMV2). Em uma primeira etapa, nanoemulsões catiônicas constituídas de triglicerídeos de cadeia média, estearilamina, lecitina de gema de ovo ou fosfolipídeos isolados (DSPC, DOPC, DSPE ou DOPE), glicerol e água foram preparadas através do procedimento de emulsificação espontânea. Independente do tipo de fosfolipídeo empregado, esse procedimento conduziu à obtenção de nanoemulsões catiônicas monodispersas com diâmetro de gotícula e potencial zeta de cerca de 250 nm e +50 mV, respectivamente. A complexação do pDNA com as nanoemulsões catiônicas, avaliada através do retardamento de migração do pDNA em gel de agarose por eletroforese, foi total quando o complexo apresenta uma relação de cargas [+/-] ≥ 1,0. Nestas condições, os complexos formados foram protegidos da degradação pela enzima DNase I. Em uma segunda etapa, a citotoxicidade das nanoemulsões e dos complexos com o pDNA sobre células Hep G2 foi avaliada, através do ensaio de MTT. Os resultados obtidos demonstraram que a adição de quantidades crescentes das nanoemulsões, conduz a uma toxicidade progressiva sobre as células, independente do pH do meio. Dentre as formulações estudadas, aquelas estabilizadas pelos fosfolipídeos DSPC e DSPE, de elevada temperatura de transição de fases, foram marcadamente menos tóxicas, em comparação com as formulações obtidas com lecitina, DOPC e DOPE. Essa mesma tendência foi detectada para os complexos formados com o pDNA. Em uma última etapa, foi realizado um estudo preliminar de transferência gênica em células Hep G2, utilizando a técnica de PCR em tempo real. Dentre as diferentes formulações testadas, a maior quantidade de DNA de GFP detectada parece ser para a formulação obtida com o fosfolipídeo DSPC, ilustrando as potencialidades de uso das nanoemulsões desenvolvidas como reagentes de transfecção de pDNA em células Hep G2. Em conclusão, o conjunto dos resultados obtidos demonstra o efeito dos fosfolipídeos empregados sobre propriedades físico-químicas, complexação, estabilidade, citotoxicidade e transfecção de nanoemulsões catiônicas como sistemas carreadores de pDNA. / Cationic nanoemulsions have been recently considered as potential delivery systems for DNA. The aim of the present work was to evaluate the influence of different phospholipids on the properties of complexes formed between nanoemulsions and pDNA (pTracerTM-CMV2). First, cationic nanoemulsions composed of medium chain triglycerides, stearlyamine, egg lecithin or isolated phospholipids (DSPC, DOPC, DSPE or DOPE), glycerol and water were prepared through spontaneous emulsification process. Independently of the type of phospholipid used this procedure results in monodisperses cationic nanoemulsions with droplet size and zeta potential of about 250 nm and +50 mV, respectively. The complexation of pDNA with cationic nanoemulsions, analyzed by agarose gel retardation assay was total when the complex possesses a charge relation [+/-] ≥ 1.0. In these conditions the complexes were protected from enzymatic degradation by DNase I. After that, the cytotoxicity of the nanoemulsion and the complexes with pDNA in Hep G2 cells was evaluated through MTT assay. The results showed that the addition of increasing amount of nanoemulsion leads to a progressive toxicity on the cells independently of the media’s pH. Among the studied formulations the ones stabilized with the phospholipids DSPC and DSPE, that have elevated phase transition temperatures, were much less cytotoxic in comparison with the formulations obtained with lecithin, DOPC and DOPE. This same trend was detected for the complexes formed with pDNA. Finally a preliminary study of gene transfer to Hep G2 cells was performed using real-time PCR technique. Among the different formulations tested, the major quantity of reporter DNA detected seems to be for the formulation obtained with the DSPC phospholipid. This shows the potentialities of the use of nanoemulsions as transfection reagents of pDNA in Hep G2 cells. In conclusion, the overall results show the effect of the phospholipids on physicochemical properties, complexation, stability, cytotoxicity and transfection of cationic nanoemulsions as delivery systems for pDNA.

SILVA, Camila Magalhães. Detecção de Aeromonas spp. em amostras de água superficial e sedimento ao longo de um gradiente de salinidade no estuário do Rio Cocó - Ceará. 2009. 86 f. : Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências Agrárias, Departamento de Engenharia de Pesca, Fortaleza-CE, 2009 / Submitted by Nádja Goes (nmoraissoares@gmail.com) on 2016-07-11T15:14:11Z No. of bitstreams: 1 2009_dis_cmsilva.pdf: 1804188 bytes, checksum: cd5c4f372d190f7b3e2f64821e983185 (MD5) / Approved for entry into archive by Nádja Goes (nmoraissoares@gmail.com) on 2016-07-11T15:14:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_dis_cmsilva.pdf: 1804188 bytes, checksum: cd5c4f372d190f7b3e2f64821e983185 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-11T15:14:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_dis_cmsilva.pdf: 1804188 bytes, checksum: cd5c4f372d190f7b3e2f64821e983185 (MD5) Previous issue date: 2009 / This research work was designed to detect the presence of Aeromonas in the Cocó River estuary, Fortaleza, Ceará State, Brazil. The database consisted of 30 samples of the river’s surface water and 30 samples of the river’s sooil, in the period from September, 2007 to April, 2008.. They were amenable, simultaneously, to counting of bacteria on Agar Gelatin Phosphate Salt (GSP) plus 20μg/mL of ampicilim (UFC/mL or UFC/g) The results showed dissemination of Aeromonas in the estuary. The counts for the water samples varied from 10 to 7,050 and from 25 to 38,500 UFC/mL at points A and B respectively; and from 100 to 37,500 UFC/g, and 1,200 to 43500 UFC/g at points A and B respectively. At point C, the counts for water and sediment were smaller than 10 UFC per ml or gram in all samples The occurrence of the greatest indices of Aeromonas in April, at the height of the rainy season, and the lowest in Septemer, at the height of the dry season, suggests there to be a probable seasonality of bacteria density in the studied environment. Among the 41 isolated strains were found the species A. caviae, A. sobria, A. trota, A. salmonicida and A. allossacharophyla. All the strains of Aeromonas sp. were found to be sensitive to cloranfenicol and ceftriaxona except for ampicillim, to which they showed 100% resistance.All the stirps showed resistance to two out of the nine tested antibiotics. After the Curing’ technique, the eritromicina resistance seems to be of plasmidian origin. / Este projeto teve como objetivo principal a pesquisa de Aeromonas spp. em água de superfície e sedimento em três pontos distintos ao longo do rio Cocó, Ceará. Foram realizadas coletas no período de outubro de 2007 a abril de 2008 gerando um total de 30 amostras de água e 30 de sedimento. A quantificação da comunidade bacteriana pertencente ao gênero Aeromonas foi feita através de plaqueamento direto sobre Agar Gelatina Fosfato Sal (Agar GSP acrescido de 20μg/mL de ampicilina). Nas amostras de água, os valores obtidos variaram de 10 a 7.050 UFC/mL e de 25 a 38.500 UFC/mL nos pontos A e B, respectivamente. Nas amostras de sedimento, as contagens variaram de 100 a 37500 UFC/g e 1.200 a 43.500 UFC/g nos pontos A e B, respectivamente. Nas amostras de água e sedimento do ponto C, os valores foram menores que 10 UFC (por mL ou g) em todas as coletas. As maiores contagens foram verificadas no mês de abril, período de chuva, e as menores no mês de setembro, período de estiagem. Foram feitos isolamentos e após identificação as estirpes foram submetidas à teste de antibiograma e à técnica da “cura” do plasmídio. Dentre as 41 cepas isoladas, foram identificadas as espécies A. caviae, A. sobria, A. trota, A. salmonicida e A. allossacharophyla. Todas as cepas se mostraram sensíveis ao cloranfenicol e ceftriaxona. Todas as estirpes apresentaram resistência a, pelo menos, dois dos nove antibióticos testados. Após a técnica de cura, a maior parte da resistência a eritromicina ficou caracterizada como de origem plasmidial.Conclui-se que o estuário do Rio Cocó está contaminado por Aeromonas e que muitas delas apresentam resistências a antibióticos denotando um ambiente poluído e de risco para a população que usa suas águas para lazer, pesca ou outra atividade qualquer.

Nanoemulsões catiônicas têm sido recentemente propostas como sistemas carreadores de DNA. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a influência de diferentes fosfolipídeos sobre propriedades dos complexos formados entre nanoemulsões e pDNA (pTracerTMCMV2). Em uma primeira etapa, nanoemulsões catiônicas constituídas de triglicerídeos de cadeia média, estearilamina, lecitina de gema de ovo ou fosfolipídeos isolados (DSPC, DOPC, DSPE ou DOPE), glicerol e água foram preparadas através do procedimento de emulsificação espontânea. Independente do tipo de fosfolipídeo empregado, esse procedimento conduziu à obtenção de nanoemulsões catiônicas monodispersas com diâmetro de gotícula e potencial zeta de cerca de 250 nm e +50 mV, respectivamente. A complexação do pDNA com as nanoemulsões catiônicas, avaliada através do retardamento de migração do pDNA em gel de agarose por eletroforese, foi total quando o complexo apresenta uma relação de cargas [+/-] ≥ 1,0. Nestas condições, os complexos formados foram protegidos da degradação pela enzima DNase I. Em uma segunda etapa, a citotoxicidade das nanoemulsões e dos complexos com o pDNA sobre células Hep G2 foi avaliada, através do ensaio de MTT. Os resultados obtidos demonstraram que a adição de quantidades crescentes das nanoemulsões, conduz a uma toxicidade progressiva sobre as células, independente do pH do meio. Dentre as formulações estudadas, aquelas estabilizadas pelos fosfolipídeos DSPC e DSPE, de elevada temperatura de transição de fases, foram marcadamente menos tóxicas, em comparação com as formulações obtidas com lecitina, DOPC e DOPE. Essa mesma tendência foi detectada para os complexos formados com o pDNA. Em uma última etapa, foi realizado um estudo preliminar de transferência gênica em células Hep G2, utilizando a técnica de PCR em tempo real. Dentre as diferentes formulações testadas, a maior quantidade de DNA de GFP detectada parece ser para a formulação obtida com o fosfolipídeo DSPC, ilustrando as potencialidades de uso das nanoemulsões desenvolvidas como reagentes de transfecção de pDNA em células Hep G2. Em conclusão, o conjunto dos resultados obtidos demonstra o efeito dos fosfolipídeos empregados sobre propriedades físico-químicas, complexação, estabilidade, citotoxicidade e transfecção de nanoemulsões catiônicas como sistemas carreadores de pDNA. / Cationic nanoemulsions have been recently considered as potential delivery systems for DNA. The aim of the present work was to evaluate the influence of different phospholipids on the properties of complexes formed between nanoemulsions and pDNA (pTracerTM-CMV2). First, cationic nanoemulsions composed of medium chain triglycerides, stearlyamine, egg lecithin or isolated phospholipids (DSPC, DOPC, DSPE or DOPE), glycerol and water were prepared through spontaneous emulsification process. Independently of the type of phospholipid used this procedure results in monodisperses cationic nanoemulsions with droplet size and zeta potential of about 250 nm and +50 mV, respectively. The complexation of pDNA with cationic nanoemulsions, analyzed by agarose gel retardation assay was total when the complex possesses a charge relation [+/-] ≥ 1.0. In these conditions the complexes were protected from enzymatic degradation by DNase I. After that, the cytotoxicity of the nanoemulsion and the complexes with pDNA in Hep G2 cells was evaluated through MTT assay. The results showed that the addition of increasing amount of nanoemulsion leads to a progressive toxicity on the cells independently of the media’s pH. Among the studied formulations the ones stabilized with the phospholipids DSPC and DSPE, that have elevated phase transition temperatures, were much less cytotoxic in comparison with the formulations obtained with lecithin, DOPC and DOPE. This same trend was detected for the complexes formed with pDNA. Finally a preliminary study of gene transfer to Hep G2 cells was performed using real-time PCR technique. Among the different formulations tested, the major quantity of reporter DNA detected seems to be for the formulation obtained with the DSPC phospholipid. This shows the potentialities of the use of nanoemulsions as transfection reagents of pDNA in Hep G2 cells. In conclusion, the overall results show the effect of the phospholipids on physicochemical properties, complexation, stability, cytotoxicity and transfection of cationic nanoemulsions as delivery systems for pDNA.

Para a transformação tradicional da levedura Saccharomyces cerevisiae são empregadas cepas hospedeiras que devem necessariamente conter um marcador de auxotrofia, de forma que as células transformadas possam ser selecionadas posteriormente por complementação gênica. Em nosso trabalho construímos um vetor, que dispensa a necessidade destas marcas de auxotrofia, permitindo transformar cepas de leveduras selvagens e, portanto, até mesmo algumas cepas de interesse industrial. Este vetor é composto por um cassete de expressão de interesse (promotor, gene estrutural e terminador) ladeado por dois fragmentos do gene CAN1 de S. cerevisiae. Uma vez que as extremidades deste fragmento, são homólogas às sequências do gene CAN1 da levedura a ser transformada, este irá causar a disrupção genética na região homóloga. Por sua vez, o gene CAN1, quando funcional, é responsável pela permease do aminoácido arginina. Este aminoácido é análogo à canavanina, que entra na célula pelo mesmo mecanismo da arginina, e é uma droga com efeito letal à S. cerevisiae. Após a introdução deste novo vetor, a célula torna-se resistente à canavanina, por impedir a entrada de arginina e, consequentemente de canavanina na célula, permitindo a seleção dos transformantes e mantendo a informação genética adicional clonada 100% estável. Em nosso trabalho, para analisar esta proposta, empregamos o cassete de expressão em que a sequência sinal e estrutural da glicoamilase encontram-se clonadas sob a regulação das sequências promotoras e terminadoras da PGK de S. cerevisiae. Obtivemos sucesso na transformação, tanto de uma cepa de laboratório com marcas auxotróficas, como de células de cepas selvagens, sem nenhuma marca de auxotrofia , utilizadas em processos industriais, FTPT e HTYM-81 que originalmente são sensíveis à canavanina. / Traditionally auxotrophic mutants of Saccharomyces cerevisiae are used as host cells for transformation since the selection of transformants is based on genetic complementation by a marker gene carried on the vector. In this work a vector was constructed which overcomes the need for auxotrophic mutants allowing selection of transformed wild-type strains, including some strains of industrial interest. The vector contains an expression cassette (promoter, structural gene and terminator) which is flanked by two fragments of the CAN 1 gene of S. cerevisiae. Since the ends of this fragment are homologous to the host <i.CAN 1 gene, it disrupts that gene upon transformation. The CAN 1 gene codes for the permease of the amino acid arginine which is analogous to canavanine and enters the cell by the same mechanism. Canavanine, however, is a lethal drug for S. cerevisiae. Since tranformants become resistant to canavanine, because no permease is synthesized, and thus canavanine cannot enter the cell, transformants are easily selected and the additional cloned genetic information is 100% stable. In this work, we employed the expression cassette containing the signal and the coding sequences of glucoamylase of Aspergillus awamori under the control of the promoter and the terminator of phophoglycerate kinase (PGK) of S. cerevisiae. We successfully transformed a laboratory yeast strain carrying auxotrophic markers, as well as two wild-type strains, employed in industrial processes, which originally were sensitive to cananvanine.

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:37:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:00:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 05328.pdf: 3991490 bytes, checksum: 1e2ba0f78984c357870199648df69c55 (MD5) / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

Submitted by Claudinei Pracidelli (cpracide@ipen.br) on 2015-11-12T10:39:15Z No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2015-11-12T10:39:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Tese (Doutorado em Tecnologia Nuclear) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP