Um estudo prévio demonstrou em pacientes com choque séptico a presença de exossomos plasmáticos. Nossa hipótese é que exossomos circulantes poderiam contribuir para a disfunção contrátil da sepse. Foi colhido sangue de 55 pacientes com choque séptico. A incubação de corações isolados com exossomos de pacientes sépticos reduziu significantemente as derivadas da pressão ventricular e aumentou as concentrações de nitrato no miocárdio. A exposição de músculos papilares a exossomos reduziu a tensão desenvolvida. Concluímos que exossomos de pacientes sépticos induzem disfunção inotrópica em corações isolados e músculos papilares, possivelmente contribuindo para a disfunção miocárdica da sepse. / A previous report identified in plasma of septic shock patients the presence of exosomes. We hypothesized that circulating exosomes in sepsis could contribute to inotropic dysfunction. We collected blood samples from 55 patients with septic shock. Incubation of isolated heart preparations with exosomes induced a significant decrease in the derivatives of ventricular pressure and increased myocardial nitrate content. Exposure of isolated rat papillary muscles to exosomes reduced developed tension. We conclude that exosomes from septic patients induce myocardial dysfunction in isolated heart and papillary muscle preparations. Thus, they may contribute to myocardial dysfunction of sepsis.

A doença de Alzheimer (DA) é uma doença neurodegenerativa e a principal causa de demência em idosos. Os mecanismos fisiopatológicos mais envolvidos na DA são: o acúmulo do peptídeo beta amiloide (A?) em agregados extracelulares, e a formação dos emaranhados neurofibrilares (ENF). A Proteína Precursora do Amiloide (APP) é clivada pelas secretases alfa (ADAM10), beta (BACE1) e y (Presenilina 1 [PSEN1]). As plaquetas contêm 95% da APP circulante e possuem toda a maquinaria necessária para estudar perifericamente a APP e suas secretases. A pesquisa de biomarcadores na DA tem como objetivo identificar, em vida, os indicadores do processo patogênico em fluídos corporais e/ou por métodos de imagem cerebral. O objetivo do presente estudo foi investigar proteínas envolvidas no metabolismo da APP em plaquetas de pacientes com DA e o potencial de modificação destas vias pela ação do tratamento com cloridrato de donepezila. Para tanto foram analisadas amostras de 23 pacientes com DA leve ou moderada, avaliados antes e depois de 6 meses de tratamento e 38 indivíduos idosos cognitivamente saudáveis (controles). As variáveis de desfecho estudadas foram: (1) expressão protéica de ADAM10, BACE1 e PSEN1; (2) expressão protéica dos metabólitos secretados da APP de 110 e 130kDa, possibilitando o cálculo da razão de APP (rAPP); e (3) atividade enzimática das APP-secretases ADAM10 e BACE1. Foram utilizados os métodos de western blotting e o fluorimétrico. Encontramos, nos pacientes com DA pré-tratamento, uma diminuição da rAPP em relação aos controles; porém, não identificamos diferenças após seis meses de tratamento. Os níveis de ADAM10 mostraram-se menores em pacientes com DA na avaliação basal quando comparados aos controles, mas também sem modificação com o tratamento, o tratamento mostrou-se associado a uma redução da expressão de BACE1 em pacientes com DA, embora não tenhamos encontrado diferenças entre pacientes e controles na avaliação basal. A expressão de PSEN1 mostrou-se menor nos pacientes com DA pré-tratamento quando comparada aos controles, sem contudo haver alteração em resposta ao tratamento. Quanto à atividade enzimática de ADAM10 e BACE1, não observamos diferenças nos valores pré e pós-tratamento. Nossos achados reforçam a utilidade da utilização de plaquetas como matriz biológica para o estudo do metabolismo da APP em tecidos periféricos e para a investigação de efeitos modificadores da patogenia da DA a partir do tratamento com drogas antidemência / Alzheimer\'s disease (AD) is a neurodegenerative disease and the major cause of dementia in the elderly. The main mechanisms in AD are: extracellular aggregates of beta amyloid peptide (Abeta) and neurofibrillary tangles formation (NFT). Amyloid Precursor Protein (APP) is cleaved by the secretases alfa (ADAM10), beta (BACE1) and ? (Presenilin 1 [PSEN1]). Platelets containing 95% of the circulating APP and possess all the machinery necessary to study peripherically APP and its secretases. The search for biomarkers in AD aims to identify, in life, the pathogenic process indicators in body fluids and/or brain image methods. The aim of this study was to investigate proteins involved in APP metabolism in platelets of AD patients, and the potential modification of these pathways by treatment with Donepezil hydrochloride. Therefore, 23 patients with mild to moderate AD evaluated before and after 6 months treatment and 38 healthy elderly subjects (controls) were analyzed. Outcome variables were: (1) ADAM10, BACE1 and PSEN1 expression; (2) APP secreted metabolites expression (110 and 130kDa), allowing the APP ratio (rAPP) estimate; (3) APP-secretase ADAM10 and BACE1 enzymatic activity. Western blotting and fluorimetric methods were used. We found in AD patients pre-treatment, a decrease of rAPP compared to controls; however, we did not identify differences of this parameter after six months of treatment. The ADAM10 levels were lower in AD patients at baseline when compared to controls, however no differences were observed after treatment. Treatment was associated with a reduction of BACE1 expression in AD patients, although we have not found differences between patients and controls at baseline. PSEN1 expression was lower in pre-treatment AD patients compared to controls. No differences were observed after treatment. Concerning to BACE1 and ADAM10 enzymatic activity, we did not observe differences in pre and post-treatment. Our findings strengthen the use of platelets as a biological matrix for the APP metabolism as well as the modifying effects on AD pathogenicity of antidementia drugs

Plaquetas são fragmentos celulares anucleados, derivados de megacariócitos, que estão envolvidos em diversos processos fisiológicos e patológicos, como coagulação, inflamação, trombose, aterosclerose, e metástase e angiogênese tumorais. Para executar estas funções, plaquetas ativadas secretam uma fração solúvel de moléculas presentes em seus conteúdos granulares, que passam a interagir com outras moléculas e células adjacentes ao local da injúria, e com os próprios receptores plaquetários. No entanto, os mecanismos que regem a secreção em plaquetas ainda são pouco conhecidos. Neste sentido, o objetivo deste estudo foi analisar comparativamente a agregação de plaquetas ativadas por dois diferentes agonistas enzimáticos: a trombina, um dos mais importantes agonistas plaquetários, e a PA-BJ, uma serinoproteinase do veneno da Bothrops jararaca, que assim como a trombina, ativa plaquetas através dos receptores PAR-1 e PAR-4. Neste estudo foram utilizadas abordagens de espectrometria de massas e de bioinformática para caracterizar alterações nos proteomas do sedimento de plaquetas não ativadas e ativadas, e também, para em paralelo analisar as frações proteicas e peptídicas presentes no sobrenadante (secretoma). Nas análises do sedimento de plaquetas ativadas tanto por PA-BJ quanto por trombina, foi verificada a menor abundância das proteínas PBP, PF4, proteína S, fibronectina, fator V e alfa-1 antitripsina, entre outras, e que também foram identificadas no sobrenadante (secretadas), e o aumento de abundância das proteínas ADAM-10, tromboxano A2 sintase, integrina αlIb, miosina-9 e fosforilase b, que estão diretamente envolvidas na ativação/agregação. Por outro lado, verificamos que na secreção plaquetária induzida por trombina ocorreu o aumento de abundância de proteínas envolvidas na regulação da formação do coágulo, como a proteína S, PAI1 e antitrombina III, sugerindo que nos eventos disparados pela trombina, exista uma regulação rigorosa de sua ação no local da injúria vascular. Já na secreção induzida por PA-BJ, verificamos o aumento significativo das proteínas amiloide beta A4 e do fibrinogênio, envolvidas na ativação/agregação plaquetária, além da liberação e ativação de MMP1, indicando que esta metaloproteinase atue sinergicamente com a PA-BJ para a formação e estabilização do agregado plaquetário. Nas análises do secretoma de plaquetas não ativadas, identificamos pela primeira vez, a presença das proteínas catalase, anidrase carbônica, inibidor de elastase leucocitária e a glicoproteína rica em histidina, que estão envolvidas na inibição e regulação da ativação plaquetária. A análise da fração peptídica do sobrenadante plaquetário permitiu avaliar pela primeira vez o degradoma gerado no processo de agregação por PA-BJ e trombina. O conjunto de peptídeos resultante da ativação plaquetária pela PA-BJ é maior e mais complexo do que aquele gerado pela ação da trombina, sugerindo que as vias ativadas por ambas sejam diferenciais e sujeitas a diferentes controles de regulação da proteólise. Além disso, a degradação seletiva de algumas proteínas, e o conjunto de peptídeos gerados, poderiam ter um papel no controle da ativação e agregação plaquetárias. Em conjunto, nossos resultados demostram que, embora a PA-BJ e a trombina induzam a agregação plaquetária mediada pelos receptores PAR-1 e PAR-4, estas enzimas induzem vias diferentes, alterando a secreção plaquetária para levar à agregação. / Platelets are anucleated cell fragments derived from megakaryocytes which are involved in many physiological and pathological processes, such as coagulation, inflammation, thrombosis, atherosclerosis, and tumor angiogenesis and metastasis. To perform these functions, activated platelets secrete a soluble fraction of molecules present in their granules, which then interact with other molecules and cells adjacent to the site of injury, and with platelet receptors. However, the mechanisms governing secretion in platelets are still poorly understood. Therefore, the objective of this study was to comparatively analyze the aggregation of platelets activated by two different enzyme agonists: thrombin, one of the most important platelet agonists, and PA-BJ, a serine proteinase from Bothrops jararaca venom, which, like thrombin, causes platelet aggregation mediated by the receptors PAR-1 and PAR-4. For this purpose, approaches of mass spectrometry and bioinformatics were used to characterize changes in the proteome of non-activated and activated platelets, and also to analyze proteins and peptides present in the supernatant of aggregated platelets (secretome). In the analysis of the sediment of platelets activated by PA-BJ and thrombin, various proteins, such as PBP, PF4, protein S, fibronectin, factor V, and alpha-1 antitrypsin, were detected in lower abundance while they were also identified as secreted, in the supernatant; likewise, proteins that are directly involved in the activation/aggregation, such as ADAM-10, thromboxane A2 synthase, integrin αIIb, myosin-9 and phosphorylase b were identified in higher abundance in platelets activated by PA-BJ and thrombin. Moreover, we found that in the thrombin-induced platelet secretion there was increased abundance of proteins involved in the regulation of blood clot formation, such as protein S, and antithrombin III PAI1, suggesting that in the events triggered by thrombin, there is strict regulation of its action at the site of vascular injury. In the analysis of the secretion induced by PA-BJ, we found a significant increase in amyloid beta A4 protein and fibrinogen, which are involved in the platelet activation/aggregation, in addition to the release and activation of MMP-1, indicating that this metalloproteinase acts synergistically with PA-BJ in the formation and stabilization of the platelet thrombus. In the analysis of the non-activated platelet secretome, we identified for the first time the presence of catalase, carbonic anhydrase, leukocyte elastase inhibitor and histidine-rich glycoprotein, which are involved in the inhibition and regulation of platelet activation. The analysis of the peptide fraction of the supernatant of activated platelets enabled the characterization, for the first time, of the degradome generated in the process of aggregation by thrombin and PA-BJ. The resulting set of peptides generated upon platelet activation by PA-BJ is larger and more complex than that generated by the action of thrombin, suggesting that the pathways activated by both are differential and are subject to different controls of proteolysis. Furthermore, the selective degradation of some proteins, and the set of generated peptides could play a role in the control of platelet activation and aggregation. Taken together, our findings demonstrate that although both PA-BJ and thrombin induce platelet aggregation via PAR-1 and PAR-4, these enzymes activate different pathways to cause platelet secretion and aggregation.

A depressão é o mais comum dos distúrbios afetivos. Afeta ao menos 10% da população idosa do Brasil. Nos idosos, alguns fatores ligados ao metabolismo parecem estar bastante relacionados a esse transtorno, como uma menor concentração de noradrenalina e serotonina (5-HT) e uma maior atividade da monoaminooxidase em relação a adultos jovens. Os inibidores seletivos da recaptação da serotonina (ISRS), principalmente a sertralina, são a primeira opção no tratamento da fase aguda e manutenção dos episódios depressivos em idosos. As plaquetas vêm sendo amplamente utilizadas como modelo para estudar na periferia alterações que ocorrem no sistema nervoso central. A 5-HT apesar de ser primordialmente expressa no cérebro, também pode ser encontrada em plaquetas. Este neurotransmissor está envolvido em inúmeros aspectos do funcionamento normal do cérebro desde a regulação do humor até a regulação hormonal. A deficiência nos níveis de 5-HT pode estar intimamente ligada a alguma anormalidade na atividade da glicogênio sintase quinase 3B(GSK3B). Esta enzima exerce funções no metabolismo celular que vão desde sobrevivência celular, metabolismo e processamento de proteínas, até processos cognitivos. A atividade da GSK3B é estreitamente regulada pela fosforilação. Fosforilação no sítio ser9 inativa a enzima, enquanto que a desfosforilação neste mesmo sítio ativa a enzima. Diversos estudos têm mostrado que a forma inativa da enzima exerce um efeito neuroprotetor. O objetivo do presente estudo foi verificar a influência do tratamento com sertralina, em pacientes idosos com diagnóstico de depressão maior, sobre a 5- HT e GSK3B após 3 e 12 meses de tratamento. A quantificação da 5-HT foi realizada por HPLC e da GSK3B plaquetária, pelos métodos de ELISA e blotting, que se revelaram equivalentes. Após um ano de tratamento encontramos uma diminuição da 5-HT plaquetária nos pacientes com depressão maior com relação aos níveis basais, bem como um aumento da forma total da enzima GSK3B (GSKT), uma diminuição da forma fosforilada (pGSK) e da razão entre pGSK e GSKT (rGSK). Quando comparados os níveis de GSK3B de pacientes tratados por um ano e controles, observamos uma maior expressão de GSKT em pacientes; enquanto a pGSK e rGSK se mostraram equivalentes. Pudemos observar, portanto, uma modulação da 5-HT e da GSK3B pelo uso de sertralina. Essa modulação pode indicar que a ação antidepressiva deste fármaco pode estar associada a essas vias de sinalização / Depression is the most common affective disorders. It affects at least 10% of the elderly population of Brazil. In the elderly, some factors related to metabolism appear to be closely related to this disorder, such as lower concentration of noradrenaline and serotonin (5-HT) and increased monoamine oxidase activity in relation to young adults. The selective serotonin reuptake inhibitors (SSRI), especially sertraline are the first choice in treating acute and maintenance of depressive episodes in the elderly. Platelets have been widely used as a model to study in peripheral changes that occur in Central Nervous System. Although 5-HT is primarily expressed in the brain, it can also be found in platelets. This neurotransmitter is involved in numerous aspects of normal brain function since the regulation of mood to the hormonal regulation. A deficiency in 5-HT levels may be closely related to an abnormality in glycogen synthase kinase 3B (GSK3B) activity. This enzyme plays several functions in cell metabolism, ranging from cell survival, metabolism and protein processing, to cognitive processes. The GSK3B activity is tightly regulated by phosphorylation. Phosphorylation on Ser9 site inactives the enzyme, whereas dephosphorylation in the same site actives the enzyme. Several studies have shown that the inactive form of the enzyme plays a neuroprotective effect. The objective of this study was to investigate the influence of sertraline in elderly patients diagnosed with major depression, on platelet 5-HT and GSK3B after 3 and 12 months of treatment. Quantification of 5-HT was performed by HPLC and GSK3B by ELISA and western blotting. The methods for platelet GSK3B determination showed to be equivalent. After one year of treatment we found a decrease of platelet 5-HT in patients with major depression relative to their baseline levels, as well as an increase in the total form of GSK3B enzyme (GSKT), a decrease in phosphorylated form (pGSK) and the ratio between pGSK and GSKT (rGSK). Comparing the levels of GSK3B of patients with one year of treatment and controls, we found a higher GSKT expression in patients; while pGSK and rGSK showed to be equivalent. Therefore we observed a modulation of 5-HT and GSK3B by sertraline. This modulation may indicate that the antidepressant action of this drug may be associated with these signaling pathways

A esquizofrenia é uma doença crônica, grave e incapacitante que afeta cerca 24 milhões de pessoas em âmbito mundial. É caracterizada por uma desorganização no pensamento que prejudica a funcionalidade do indivíduo. Existem intervenções que são efetivas e contribuem para a diminuição da prevalência do transtorno, pois ajudam o portador a levar uma vida produtiva e integrada à sociedade, porém devem ser ministradas nos estágios iniciais da doença. No entanto, existe uma grande dificuldade em se diagnosticar a esquizofrenia precocemente devido a sua complexidade e às sutilezas dos seus sintomas apresentados antes do surgimento da psicose. O cérebro não é acessível a exames invasivos in vivo e por esse motivo a exploração de fluidos periféricos é de grande importância. As plaquetas e neurônios serotonérgicos possuem características bioquímicas e morfológicas em comum que possibilitam a comparação entre a estrutura e a função de ambos e, por causa dessa similaridade, muitos trabalhos utilizam plaquetas como modelo para o estudo de doenças neuropsiquiátricas, inclusive a esquizofrenia. A detecção precoce da esquizofrenia é um objeto de investigação atual e relevante não somente para revolucionar os meios atuais de diagnóstico, mas também para desenvolver novos tratamentos aplicados aos estágios iniciais da doença, diferenciar os subgrupos de doentes e monitorar as intervenções preventivas. A proposta do presente trabalho é fazer o estudo da expressão de proteínas em plaquetas de pacientes esquizofrênicos e controles com o objetivo de identificar proteínas candidatas a biomarcadores utilizando técnicas proteômicas quantitativas e confiáveis, como 2D-DIGE e a espectrometria de massas. / Schizophrenia is a disabling, serious, and chronic illness, which affects about 24 million people worldwide. It is characterized by a severe disorganization of the thoughts that harms the social life of patients becoming them dependent of the family and/or government. There are effective treatments that contribute to decrease the prevalence of the disorder because they improve the life and social conditions of the patients, but they are only advantageous if the intervention is made in the early stages of the disease. It is difficult to obtain early diagnosis due to the complexity of the disease and its insidious symptoms before the beginning of the psychosis. The brain is not easily accessed in vivo and, because of this, it is very important to study the peripheral tissues like blood, which makes the use of the platelets very interesting. Furthermore, platelets and serotonergic neurons share biochemical and morphological characteristics that allows the comparison between structure and function of both. From these similarities many authors has used platelets as a neuron model to study many neurodegenerative diseases including schizophrenia. The early detection of schizophrenia is a current and suitable goal, not only to improve the early diagnosis but also to develop new treatments, differentiate the subtypes, and monitor the preventive interventions. The purpose of this project is to do a comparative screening of expressed proteins in platelets from schizophrenics and controls with the objective of finding differently expressed proteins that could be candidates to biomarkers using 2D-DIGE and mass spectrometry.

Animais hematófagos possuem em sua saliva substâncias que permitem a fluidez do sangue, para o sucesso de sua alimentação. Com isso, têm sido descritos diversos componentes com atividades nos diferentes processos hemostáticos (coagulação, fibrinólise e agregação plaquetária). O complexo salivar da sanguessuga Haementeria depressa vem sendo estudado através de bioquímica clássica e análises transcriptômica e proteômica deste tecido determinaram o perfil dos transcritos e das proteínas produzidas. Dentre os transcritos mais abundantes foram encontrados três clones (H06A09, H06A02 e L02F02) que apresentaram 45%, 87% e 94% de similaridade ao LAPP, um inibidor de agregação plaquetária da sanguessuga Haementeria officinallis, a produção destes componentes pelo tecido foi confirmada pela análise proteômica. O LAPP é um inibidor que age pela via do colágeno e possui cerca de 14 kDa e pI de 4,0 e inibe a ligação da plaqueta ao colágeno tanto pelo epítopo do FvW quanto pelo domínio <font face=\"Symbol\">a2<font face=\"Symbol\">b1. Assim, o objetivo do presente trabalho foi clonar, expressar e caracterizar a proteína recombinante ativa, a partir do clone H06A09 para estudos de atividade desta molécula. Para obter a proteína recombinante de interesse inicialmente a clonagem do transcrito foi realizada com sucesso em vetor pAE, porém, a expressão em sistema procarioto apresentou alguns obstáculos já que a molécula não tinha atividade. Uma nova estratégia foi proposta, sendo realizada clonagem em vetor pPIC9K e expressão em sistema eucariótico (leveduras Pichia pastoris - GS115). Após a utilização de diferentes metodologias para estabelecimento das melhores condições para expressão neste sistema, foi eleito o protocolo onde a proteína recombinante era expressa a 28 °C, sob agitação de 260 rpm, e indução por 0,5% de Metanol a cada 24h, durante 72h de expressão. A molécula recombinante expressa e secretada foi submetida a diferentes metodologias para purificação, assim, determinou-se que a estratégia utilizada que melhor isolou a proteína foi a submissão do sobrenadante da expressão à diálise e concentração em sistema de ultrafiltração (Amicon 5 kDa Millipore) seguida de uma cromatografia de gel filtração em Superdex 75 (GE), sistema FPLC, com coleta fracionada. Ensaios de agregação plaquetária confirmaram a atividade inibitória da proteína recombinante tanto em sangue total como em PRP (plasma rico em plaqueta) e plaqueta lavada, especificamente quando o agonista era o colágeno, apresentando IC50 para PRP e plaqueta lavada de 20 e 712 ng, respectivamente. Ensaios por citometria de fluxo indicaram que a proteína recombinante, diferente do LAPP, age na inibição da agregação plaquetária induzida por colágeno, pela ligação à subunidade Ib<font face=\"Symbol\">a do complexo GPIb-IX-V, complexo este que usa o FvW como ponte entre a plaqueta e o colágeno, firmando assim a interação da plaqueta ao subendotélio e posterior agregação. Desta forma, o presente trabalho caracteriza o primeiro inibidor recombinante de agregação plaquetária pela via do colágeno proveniente de sanguessugas Haementeria depressa, e comprova que apesar de apresentar 45% de similaridade estrutural ao LAPP é um inibidor com características funcionais diferentes, e com grande potencial a ser estudado. / Hematophagous animals have in their saliva substances that maintain the blood fluidity to the success of their feeding. Therefore, components have been described by their activities in the hemostatic processes (coagulation, fibrinolysis and platelet aggregation).The salivary complex of Haementaria depressa leech has been studied by classical biochemical and transcriptomic and proteomic analysis of this tissue determined the profile of transcripts and proteins produced by it. Among the most abundant transcripts were found three clones (H06A09, H06A02 e L02F02) that showed 45%, 87% e 94% of similarity to LAPP, an inhibitor of platelet aggregation from Haementeria officinallis, the components production was confirmed by proteomic analysis. LAPP is a inhibitor that acts by collagen pathway and has around 14 kDa and pI of 4.0, and inhibits the binding of platelet to collagen by both the epitope domain of vWF as the <font face=\"Symbol\">a2<font face=\"Symbol\">b1. Thereby, the aim of this study was to clone, express and characterize the active recombinant protein from the clone H06A09 for studies of activity of this molecule. To obtain the recombinant protein initially cloning of transcript was successfully performed in pAE vector, however, the protein expressed in prokaryotic system presented some obstacles not presenting activity. A new strategy was proposed, being held in pPIC9K vector and expression in eukaryotic system - yeast Pichia pastoris (GS115). After using different methodologies to establish the best conditions for expression in this system, was elected the protocol where the recombinant protein was expressed in 28 °C, under agitation of 260 rpm, and 0.5% methanol induction every 24 hours during 72 hours of expression. The recombinant molecule was expressed in soluble portion and was subjected to differents methods for purification, so it was determined that the best strategy to isolation of the protein was the concentration and dialysis of the expression supernatant by ultrafiltration system (Amicon 5 kDa Millipore) followed by gel filtration chromatography on Superdex 75 (GE), FPLC system. Tests confirmed the platelet aggregation inhibitory activity of the recombinant protein in whole blood, PRP (platelet rich plasma) and in washed platelets, specifically when the agonist was collagen, with IC50 to PRP and washed platelet of 20 and 712 ng, respectively. Assays by flow cytometry indicated that the recombinant protein, different from LAPP, acts to inhibit platelet aggregation induced by collagen, by the binding to the Ib<font face=\"Symbol\">a subunit of the GPIb-IX-V complex, this complex uses the vWF as a bridge between the platelet and collagen, thus firming the interaction of the subendothelium and subsequent platelet aggregation. Thus, this study characterized the first recombinant inhibitor of platelet aggregation through collagen pathway from Haementeria depressa leeches, and proves that despite having 45% structural similarity to the LAPP is an inhibitor with different functional characteristics, and with great potential to be studied.

INTRODUÇÃO: A interação entre leucócitos e plaquetas é fundamental para o início e a progressão da reestenose e da aterosclerose. Recentemente foi evidenciado em estudos in vitro que a integrina Mac-1 dos leucócitos se liga à glicoproteína Ibalfa (GP Ibalfa) das plaquetas e que esta interação possui uma função central na firme adesão e transmigração de leucócitos em locais de deposição de plaquetas. Entretanto, não há estudos in vivo que avaliam a importância da interação entre a integrina Mac-1 dos leucócitos e a GP Ibalfa das plaquetas (alfaMbeta2-GP Ibalfa) em modelo experimental de lesão vascular. MÉTODO: Um peptídeo denominado M2 ou anticorpo anti-M2 foi desenvolvido para bloquear a interação da integrina Mac-1 dos leucócitos com a GP Ibalfa das plaquetas, visando, deste modo, inibir a adesão de leucócitos na superfície do vaso coberta por plaquetas, a proliferação celular e a hiperplasia neointimal. Este peptídeo foi injetado e comparado com anticorpo-controle em camundongos C57B1/6J submetidos à lesão vascular da artéria femoral com corda-guia. Um dia (controle: n= 6; anti-M2: n= 6), 5 dias (controle: n= 9; anti-M2: n= 9) ou 28 dias (controle: n= 9; anti-M2: n= 9) após a lesão vascular, as artérias femorais foram retiradas para a realização de morfometria e imunohistoquímica. RESULTADOS: O bloqueio da interação alfaMbeta2-GP Ibalfa promoveu redução estatisticamente significativa de 75% do número de leucócitos na camada média no primeiro dia após a lesão vascular (controle: 7,9 ± 5,0% do total de células na camada média; versus anti-M2: 2,0 ± 1,6%; p=0,021), bem como determinou diminuição estatisticamente significativa de 42% em 5 dias (controle: 42,3 ± 12,9% do total de células na neoíntima; versus anti-M2: 24,6 ± 10,8%; p=0,047) e de 58% em 28 dias do acúmulo de leucócitos na neoíntima em desenvolvimento (controle: 7,9 ± 3,0% versus anti-M2: 3,3 ± 1,3%; p=0,012). A proliferação celular na camada média do vaso em 5 dias pós-lesão vascular apresentou redução estatisticamente significativa de 64% com o bloqueio da interação alfaMbeta2-GP Ibalfa (controle: 5,0 ± 2,9% do total de células na camada média; versus anti-M2: 1,8 ± 0,5%; p=0,043), assim como houve diminuição significativa de 47% da proliferação celular na camada íntima do vaso em 28 dias (controle: 3,8 ± 1,7% do total de células na camada íntima; versus anti-M2: 2,0 ± 1,2%; p=0,047). O bloqueio da interação alfaMbeta2-GP Ibalfa também determinou redução estatisticamente significativa de 56% do espessamento intimal em 28 dias (controle: 10.395 ± 3.549um2; versus anti-M2: 4.561 ± 4.915um2; p=0,012). CONCLUSÕES: O recrutamento de leucócitos após a lesão vascular é dependente da interação alfaMbeta2-GP Ibalfa e a neutralização desta interação inibe a proliferação celular e a formação neointimal. / INTRODUCTION: The interaction between leukocytes and platelets is fundamental for the beginning and the progression of restenosis and atherosclerosis. Recent in vitro studies have shown that the leukocyte integrin Mac-1 binds to the platelet glycoprotein (GP) Ibalfa, and this interaction plays a central role in the leukocyte firm adhesion and transmigration at sites of platelet deposition. However, there is no in vivo study evaluating the importance of the integrin Mac-1 and GP Ibalfa (alfaMbeta2-GP Ibalfa) interaction in experimental models of vascular injury. METHODS: A peptide termed M2 or anti-M2 antibody was developed to block the leukocyte Mac-1 and platelet GP Ibalfa interaction, aiming to inhibit the adhesion of leukocytes to the platelet-coated surface of vessels as well as the cellular proliferation and the neointimal hyperplasia. The peptide was injected and compared with a control-antibody in C57B1/6J mice subjected to wire-induced femoral artery injury. One day (control: n= 6; anti-M2: n= 6), 5 days (control: n= 9; anti-M2: n= 9) or 28 days (control: n= 9; anti-M2: n= 9) after vascular injury, the femoral arteries were harvested for morphometry and immunohistochemistry. RESULTS: The alfaMbeta2-GP Ibalfa interaction blockade promoted a statistically significant 75% reduction in leukocytes in the medial layer on the first day after vascular injury (control: 7.9 ± 5.0% out of the total cells in the medial layer versus anti-M2: 2.0 ± 1.6%; p=0.021), as well as determined a statistically significant 42% decrease 5 days later (control: 42.3 ± 12.9% out of the total cells in the neointima versus anti-M2: 24.6 ± 10.8%; p=0.047), and a 58% decrease in leukocyte accumulation in the developing neointima 28 days later (control: 7.9 ± 3.0% versus anti-M2: 3.3 ± 1.3%; p=0.012). The cellular proliferation in the vessel medial layer 5 days after vascular injury presented a statistically significant 64% reduction by the alfaMbeta2-GP Ibalfa interaction blockade (control: 5.0 ± 2.9% out of the total cells in the medial layer versus anti-M2: 1.8 ± 0.5%; p=0.043), and there was also a significant 47% decrease in the vessel intimal layer cellular proliferation 28 days later (control: 3.8 ± 1.7% out of the total cells in the intimal layer versus anti-M2: 2.0 ± 1.2%; p=0.047). Furthermore, the alfaMbeta2-GP Ibalfa interaction blockade determined a statistically significant 56% reduction in the intimal thickening 28 days after vascular injury (control: 10,395 ± 3,549um2 versus anti-M2: 4,561 ± 4,915um2; p=0.012). CONCLUSIONS: The leukocyte recruitment after vascular injury depends on the alfaMbeta2-GP Ibalfa interaction, and its neutralization inhibits cellular proliferation and neointimal formation.

A adesão de plaquetas nas paredes dos vasos sanguíneos e subsequente agregação são eventos cruciais tanto na hemorragia e quanto na trombose. A hiperagregação (agregação excessiva) das plaquetas pode causar a formação de um trombo e a posterior oclusão dos vasos sanguíneos levando a um processo isquêmico. A terapia antiplaquetária com ácido acetilsalicílico reduz em até 25% o risco de infartos do miocárdio não-fatais, acidentes vasculares cerebrais isquêmicos ou mortes de causa vascular em pacientes de alto risco, independentemente do sexo ou idade. Para avaliar laboratorialmente a eficácia dessa terapêutica, o método mais utilizado é o teste de agregação plaquetária, que pode ser feito em duas metodologias, a turbidimétrica e a por impedância elétrica. Com esse cenário, o objetivo do estudo é comparar essas duas metodologias para a monitorização do tratamento. Para isso foram utilizadas amostras de sangue de 30 pacientes adultos (média de 42 anos) de ambos os sexos que fazem uso regular do fármaco e analisadas através das duas metodologias, tendo seus resultados analisados e comparados. Os resultados do estudo mostraram pouca diferença estatística significante (p<0,05) entre os dois métodos nos principais agentes estimulantes, indicando que o método de impedância elétrica pode ser utilizado em rotina laboratorial em substituição, ou em complementação, com a metodologia turbidimétrica para monitorar a terapia antiplaquetária a base de ácido acetilsalicílico / The adhesion of platelets in the blood vessel wall and subsequent aggregation are crucial events in both bleeding and thrombosis. The hyperaggregation (excessive aggregation) of platelets can cause the formation of a thrombus and subsequent occlusion of blood vessels leading to an ischemic process. Antiplatelet therapy with acetylsalicylic acyd reduces by 25% the risk of myocardial infarctions, non-fatal strokes or deaths from vascular causes in patients at high risk, regardless of sex or age. To laboratory evaluation of the effectiveness of this therapy, the method most used is the platelet aggregation test, which can be done in two methods, the turbidimetric and electrical impedance. With this scenario, the objective of the study is to compare these two methodologies for monitoring the treatment. For such purpose, blood samples from 30 adult patients (mean 42 years) of both sexes who make regular use of the drug was analyzed using the two methodologies, and their results was analyzed and compared. The studys results showed little difference statistically significant (p <0.05) between the two methods with the main stimulant agents, indicating that the method of electrical impedance can be used in routine laboratory instead or complementing the methodology of turbidimetric for monitor antiplatelet therapy by acetylsalicylic acyd

Koblasa,Vladimír - Comparison of control measurements on various types of haematology analyzers used by ÚKBLD CHLTC at University Hospital in Prague First Faculty of Medicine, Charles University in Prague, Praha 2, Kateřinská 32 Head of the work: prof. MUDr. Jan Kvasnička, DrSc. Supervisor -consultant: Mgr. Ivana Malíková Blood cell count is essential testing method in hematology, where it is necessary to ensure properquality control. Aim of this study was to compare the results of measurement control materials with defined parameters and the same samples at different haematological analyzers to obtain evidence for the expression of measurement uncertainties. There are used more types of blood analyzers in ÚKBLD CHLTC at University Hospital in Prague, which operate on different principles. For comparsion were selected analyzers using the impedance working principle, where individual blood cell passes between two electrodes controlled by low voltage. Variation of this voltage is recorded and accurately defined for each type of blood cells. It was also chosen analyzer that works with optical detection. Analyzer illuminates the individual blood cell by light beam. A cell that enters into the path of light rays, reduce its optical density incident on the photocell. The change of the light density...

Plaquetas são fragmentos celulares anucleados, derivados de megacariócitos, que estão envolvidos em diversos processos fisiológicos e patológicos, como coagulação, inflamação, trombose, aterosclerose, e metástase e angiogênese tumorais. Para executar estas funções, plaquetas ativadas secretam uma fração solúvel de moléculas presentes em seus conteúdos granulares, que passam a interagir com outras moléculas e células adjacentes ao local da injúria, e com os próprios receptores plaquetários. No entanto, os mecanismos que regem a secreção em plaquetas ainda são pouco conhecidos. Neste sentido, o objetivo deste estudo foi analisar comparativamente a agregação de plaquetas ativadas por dois diferentes agonistas enzimáticos: a trombina, um dos mais importantes agonistas plaquetários, e a PA-BJ, uma serinoproteinase do veneno da Bothrops jararaca, que assim como a trombina, ativa plaquetas através dos receptores PAR-1 e PAR-4. Neste estudo foram utilizadas abordagens de espectrometria de massas e de bioinformática para caracterizar alterações nos proteomas do sedimento de plaquetas não ativadas e ativadas, e também, para em paralelo analisar as frações proteicas e peptídicas presentes no sobrenadante (secretoma). Nas análises do sedimento de plaquetas ativadas tanto por PA-BJ quanto por trombina, foi verificada a menor abundância das proteínas PBP, PF4, proteína S, fibronectina, fator V e alfa-1 antitripsina, entre outras, e que também foram identificadas no sobrenadante (secretadas), e o aumento de abundância das proteínas ADAM-10, tromboxano A2 sintase, integrina &#945;lIb, miosina-9 e fosforilase b, que estão diretamente envolvidas na ativação/agregação. Por outro lado, verificamos que na secreção plaquetária induzida por trombina ocorreu o aumento de abundância de proteínas envolvidas na regulação da formação do coágulo, como a proteína S, PAI1 e antitrombina III, sugerindo que nos eventos disparados pela trombina, exista uma regulação rigorosa de sua ação no local da injúria vascular. Já na secreção induzida por PA-BJ, verificamos o aumento significativo das proteínas amiloide beta A4 e do fibrinogênio, envolvidas na ativação/agregação plaquetária, além da liberação e ativação de MMP1, indicando que esta metaloproteinase atue sinergicamente com a PA-BJ para a formação e estabilização do agregado plaquetário. Nas análises do secretoma de plaquetas não ativadas, identificamos pela primeira vez, a presença das proteínas catalase, anidrase carbônica, inibidor de elastase leucocitária e a glicoproteína rica em histidina, que estão envolvidas na inibição e regulação da ativação plaquetária. A análise da fração peptídica do sobrenadante plaquetário permitiu avaliar pela primeira vez o degradoma gerado no processo de agregação por PA-BJ e trombina. O conjunto de peptídeos resultante da ativação plaquetária pela PA-BJ é maior e mais complexo do que aquele gerado pela ação da trombina, sugerindo que as vias ativadas por ambas sejam diferenciais e sujeitas a diferentes controles de regulação da proteólise. Além disso, a degradação seletiva de algumas proteínas, e o conjunto de peptídeos gerados, poderiam ter um papel no controle da ativação e agregação plaquetárias. Em conjunto, nossos resultados demostram que, embora a PA-BJ e a trombina induzam a agregação plaquetária mediada pelos receptores PAR-1 e PAR-4, estas enzimas induzem vias diferentes, alterando a secreção plaquetária para levar à agregação. / Platelets are anucleated cell fragments derived from megakaryocytes which are involved in many physiological and pathological processes, such as coagulation, inflammation, thrombosis, atherosclerosis, and tumor angiogenesis and metastasis. To perform these functions, activated platelets secrete a soluble fraction of molecules present in their granules, which then interact with other molecules and cells adjacent to the site of injury, and with platelet receptors. However, the mechanisms governing secretion in platelets are still poorly understood. Therefore, the objective of this study was to comparatively analyze the aggregation of platelets activated by two different enzyme agonists: thrombin, one of the most important platelet agonists, and PA-BJ, a serine proteinase from Bothrops jararaca venom, which, like thrombin, causes platelet aggregation mediated by the receptors PAR-1 and PAR-4. For this purpose, approaches of mass spectrometry and bioinformatics were used to characterize changes in the proteome of non-activated and activated platelets, and also to analyze proteins and peptides present in the supernatant of aggregated platelets (secretome). In the analysis of the sediment of platelets activated by PA-BJ and thrombin, various proteins, such as PBP, PF4, protein S, fibronectin, factor V, and alpha-1 antitrypsin, were detected in lower abundance while they were also identified as secreted, in the supernatant; likewise, proteins that are directly involved in the activation/aggregation, such as ADAM-10, thromboxane A2 synthase, integrin &#945;IIb, myosin-9 and phosphorylase b were identified in higher abundance in platelets activated by PA-BJ and thrombin. Moreover, we found that in the thrombin-induced platelet secretion there was increased abundance of proteins involved in the regulation of blood clot formation, such as protein S, and antithrombin III PAI1, suggesting that in the events triggered by thrombin, there is strict regulation of its action at the site of vascular injury. In the analysis of the secretion induced by PA-BJ, we found a significant increase in amyloid beta A4 protein and fibrinogen, which are involved in the platelet activation/aggregation, in addition to the release and activation of MMP-1, indicating that this metalloproteinase acts synergistically with PA-BJ in the formation and stabilization of the platelet thrombus. In the analysis of the non-activated platelet secretome, we identified for the first time the presence of catalase, carbonic anhydrase, leukocyte elastase inhibitor and histidine-rich glycoprotein, which are involved in the inhibition and regulation of platelet activation. The analysis of the peptide fraction of the supernatant of activated platelets enabled the characterization, for the first time, of the degradome generated in the process of aggregation by thrombin and PA-BJ. The resulting set of peptides generated upon platelet activation by PA-BJ is larger and more complex than that generated by the action of thrombin, suggesting that the pathways activated by both are differential and are subject to different controls of proteolysis. Furthermore, the selective degradation of some proteins, and the set of generated peptides could play a role in the control of platelet activation and aggregation. Taken together, our findings demonstrate that although both PA-BJ and thrombin induce platelet aggregation via PAR-1 and PAR-4, these enzymes activate different pathways to cause platelet secretion and aggregation.