Introdução: A inflamação constitui um dos fatores mais importantes da fisiopatologia da asma brônquica, caracterizada por uma resposta eosinofílica com produção de citocinas de perfil Th2. A persistência desta inflamação induz no pulmão um processo de reparo associado à redução progressiva da função pulmonar, que nem sempre é revertida pelos tratamentos disponíveis. O sistema colinérgico anti-inflamatório é descrito como um mecanismo neural que suprime a resposta imune e controla a inflamação principalmente pelo efeito da acetilcolina em receptores nicotínicos do tipo alfa7 (alfa7nAChR) encontrados em células do sistema imune. A acetilcolina (ACh) exerce um importante efeito na asma e recentemente demonstramos que a redução parcial da liberação da acetilcolina induz per se a inflamação pulmonar. Embora se saiba que os receptores muscarínicos (mAChRs) exercem um efeito pró-inflamatório e broncoconstritor na asma, a ativação de receptores nicotínicos (nAChRs) poderia ter um efeito benéfico reduzindo a inflamação pulmonar, fato demonstrado em modelos de inflamação sistêmica e aguda. O efeito da ativação do alfa7nAChR na fisiopatologia da asma ainda não está claramente elucidado. Objetivo: Investigar o efeito do tratamento com PNU-282987 (PNU), um agonista específico do alfa7nAChR, em um modelo murino de inflamação alérgica crônica das vias aéreas. Metodologia: Camundongos BALB/c foram submetidos ao protocolo de indução alérgica crônica das vias aéreas com ovoalbumina (OVA) ou salina intraperitoneal (i.p.) e posterior desafios inalatórios. A partir do 22° dia, os animais receberam diariamente tratamento com PNU ou veículo (Ve) até o 28° dia. Foram testadas três doses de PNU (0,5, 1,0 e 2,0 mg/Kg). A fim de evidenciar se o efeito obtido no tratamento com PNU era dependente do receptor alfa7nAChR, um grupo de animais foi tratado com MLA (antagonista do alfa7nAChR), previamente ao tratamento com PNU. No 29° dia do protocolo, os animais foram eutanasiados e foram avaliados o número de células inflamatórias no lavado broncoalveolar (LBA) e no sangue, os níveis de citocinas no LBA, a expressão do alfa7nAChR e mAchRs do tipo 3 (M3) e a ativação do fator de transcrição nuclear kB (NF-kB) no pulmão. O remodelamento brônquico foi avaliado por morfometria. As análises estatísticas foram realizadas por meio do programa SigmaStat (Jandel Scientific, San Rafael, CA), onde um P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Resultados: Houve expressão do alfa7nAChR e M3 no homogenato de pulmão de animais controle e sensibilizados. Determinamos por meio da redução de eosinófilos que a dose de 0,5 mg/Kg do tratamento com PNU foi a mais efetiva. Assim, observamos que o tratamento com PNU0,5 nos animais sensibilizados reduziu o número de células totais, eosinófilos, neutrófilos, macrófagos e linfócitos no LBA, assim como número de eosinófilos no sangue periférico e ao redor das vias aéreas. O tratamento com PNU reduziu os níveis de IgE no sangue e as citocinas IL-4, IL-13 e IL-17 no LBA. Todos estes efeitos foram revertido com o pré-tratamento com MLA, exceto para a citocina IL-17. Alem disso, o tratamento com PNU reduziu o remodelamento brônquico (área de edema, de epitélio e de músculo liso e deposição de fibras colágenas) assim como o número de células positivas para MMP-9 e TIMP-1 ao redor das vias aéreas. No pulmão a expressão do p-65-NF-kB, STAT3 fosforilado e o SOCS3 foram inibidas pelo PNU. Conclusão: Estes dados claramente demonstram que o alfa7nAChR está envolvido no controle da resposta inflamatória pulmonar alérgica e de remodelamento brônquico em modelo experimental de asma alérgica e portanto é um novo alvo com potencial terapêutico a ser explorado na fisiopatologia da asma brônquica / Background: Inflammation is one of the most important features in asthma pathophysiology, characterized by eosinophilic response with production of Th2 cytokine profile. The persistence of this inflammation can induce a lung repair process associated with a progressive reduction in lung function, which is not always reversed by available treatments. The anti-inflammatory cholinergic system was described as a neural mechanism that suppresses the immune response and controls inflammation mainly by the activaction of acetylcholine alfa7 nicotinic receptors (alfa7nAChR) found on immune cells. Acetylcholine (ACh) is an important mediator in asthma and we recently demonstrated that partial reduction on ACh release induced lung inflammation per se. Although it is known that muscarinic receptors (mAChRs) has a pro-inflammatory action and causes bronchoconstriction in asthma, the activation of nicotinic receptors (nAChRs) could have a beneficial effect reducing pulmonary inflammation as demonstrated in models of acute and systemic inflammation. The effects of alfa7nAChR activation in the pathophysiology of asthma have not been clearly elucidated. Aim: To investigate the effects of PNU- 282987 (PNU) treatment, a specific alfa7nAChR agonist, in a murine model of chronic allergic airway inflammation. Methods: BALB/c mice were subjected to a protocol of chronic allergic inflammation induced by intraperitoneal ovalbumin (OVA) or saline and subsequent challenges with inhalation. From the 22th day, the animals daily received PNU or vehicle (Ve) until the 28th day. PNU were tested in three differents doses (0.5, 1.0 and 2.0 mg/kg). In order to demonstrate that the effects obtained by PNU treatment was dependent on alfa7nAChR, a group of animals was treated with MLA (antagonist of alfa7nAChR) prior to the PNU treatment. On the 29th day of the protocol, the animals were euthanised and the number of inflammatory cells in the bronchoalveolar lavage fluid(BALF) fluid and blood, cytokine levels in BALF, the expression of alfa7nAChR and mAChRs type 3 (M3), and activation of nuclear transcription factor kB (NF-kB) in the lung were evaluated. Bronchial remodeling was assessed by morfometric methods. Statistical analyses were performed using the SigmaStat (Jandel Scientific, San Rafael, CA) and P < 0.05 is considered statistically significant. Results: ?7nAChR and M3 expression was detected in control and sensitized lung homogenate. The most effective dose of PNU treatment was 0.5 mg/kg evaluated by the effects on eosinophil reduction. Thus, we observed that treatment with PNU0,5 reduced the number of total cells, eosinophils, neutrophils, macrophages and lymphocytes in BALF, as well as number of eosinophils in peripheral blood and around the airways of sensitized animals. The treatment with PNU also reduced IgE levels in the blood, and cytokines IL-4, IL-13 and IL-17 in BALF. All these effects were reversed by pretreatment with MLA, except for IL-17 cytokine. Furthermore, treatment with PNU reduced bronchial remodeling (edema, epithelium and smooth muscle area and airway collagen deposition) as well as the number of positive cells for MMP-9 and TIMP-1 around the airways. The lung p-65-NF-kB, phosphorylated STAT3 and the SOCS3 expression were inhibited by PNU-282987. Conclusion: These data clearly demonstrate that the alfa7nAChR is involved in the control of allergic pulmonary inflammatory response and in bronchial remodeling in an experimental model of allergic asthma and it can be a new target with therapeutic potential to be explored in the pathophysiology of asthma

Introdução: A inflamação constitui um dos fatores mais importantes da fisiopatologia da asma brônquica, caracterizada por uma resposta eosinofílica com produção de citocinas de perfil Th2. A persistência desta inflamação induz no pulmão um processo de reparo associado à redução progressiva da função pulmonar, que nem sempre é revertida pelos tratamentos disponíveis. O sistema colinérgico anti-inflamatório é descrito como um mecanismo neural que suprime a resposta imune e controla a inflamação principalmente pelo efeito da acetilcolina em receptores nicotínicos do tipo alfa7 (alfa7nAChR) encontrados em células do sistema imune. A acetilcolina (ACh) exerce um importante efeito na asma e recentemente demonstramos que a redução parcial da liberação da acetilcolina induz per se a inflamação pulmonar. Embora se saiba que os receptores muscarínicos (mAChRs) exercem um efeito pró-inflamatório e broncoconstritor na asma, a ativação de receptores nicotínicos (nAChRs) poderia ter um efeito benéfico reduzindo a inflamação pulmonar, fato demonstrado em modelos de inflamação sistêmica e aguda. O efeito da ativação do alfa7nAChR na fisiopatologia da asma ainda não está claramente elucidado. Objetivo: Investigar o efeito do tratamento com PNU-282987 (PNU), um agonista específico do alfa7nAChR, em um modelo murino de inflamação alérgica crônica das vias aéreas. Metodologia: Camundongos BALB/c foram submetidos ao protocolo de indução alérgica crônica das vias aéreas com ovoalbumina (OVA) ou salina intraperitoneal (i.p.) e posterior desafios inalatórios. A partir do 22° dia, os animais receberam diariamente tratamento com PNU ou veículo (Ve) até o 28° dia. Foram testadas três doses de PNU (0,5, 1,0 e 2,0 mg/Kg). A fim de evidenciar se o efeito obtido no tratamento com PNU era dependente do receptor alfa7nAChR, um grupo de animais foi tratado com MLA (antagonista do alfa7nAChR), previamente ao tratamento com PNU. No 29° dia do protocolo, os animais foram eutanasiados e foram avaliados o número de células inflamatórias no lavado broncoalveolar (LBA) e no sangue, os níveis de citocinas no LBA, a expressão do alfa7nAChR e mAchRs do tipo 3 (M3) e a ativação do fator de transcrição nuclear kB (NF-kB) no pulmão. O remodelamento brônquico foi avaliado por morfometria. As análises estatísticas foram realizadas por meio do programa SigmaStat (Jandel Scientific, San Rafael, CA), onde um P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Resultados: Houve expressão do alfa7nAChR e M3 no homogenato de pulmão de animais controle e sensibilizados. Determinamos por meio da redução de eosinófilos que a dose de 0,5 mg/Kg do tratamento com PNU foi a mais efetiva. Assim, observamos que o tratamento com PNU0,5 nos animais sensibilizados reduziu o número de células totais, eosinófilos, neutrófilos, macrófagos e linfócitos no LBA, assim como número de eosinófilos no sangue periférico e ao redor das vias aéreas. O tratamento com PNU reduziu os níveis de IgE no sangue e as citocinas IL-4, IL-13 e IL-17 no LBA. Todos estes efeitos foram revertido com o pré-tratamento com MLA, exceto para a citocina IL-17. Alem disso, o tratamento com PNU reduziu o remodelamento brônquico (área de edema, de epitélio e de músculo liso e deposição de fibras colágenas) assim como o número de células positivas para MMP-9 e TIMP-1 ao redor das vias aéreas. No pulmão a expressão do p-65-NF-kB, STAT3 fosforilado e o SOCS3 foram inibidas pelo PNU. Conclusão: Estes dados claramente demonstram que o alfa7nAChR está envolvido no controle da resposta inflamatória pulmonar alérgica e de remodelamento brônquico em modelo experimental de asma alérgica e portanto é um novo alvo com potencial terapêutico a ser explorado na fisiopatologia da asma brônquica / Background: Inflammation is one of the most important features in asthma pathophysiology, characterized by eosinophilic response with production of Th2 cytokine profile. The persistence of this inflammation can induce a lung repair process associated with a progressive reduction in lung function, which is not always reversed by available treatments. The anti-inflammatory cholinergic system was described as a neural mechanism that suppresses the immune response and controls inflammation mainly by the activaction of acetylcholine alfa7 nicotinic receptors (alfa7nAChR) found on immune cells. Acetylcholine (ACh) is an important mediator in asthma and we recently demonstrated that partial reduction on ACh release induced lung inflammation per se. Although it is known that muscarinic receptors (mAChRs) has a pro-inflammatory action and causes bronchoconstriction in asthma, the activation of nicotinic receptors (nAChRs) could have a beneficial effect reducing pulmonary inflammation as demonstrated in models of acute and systemic inflammation. The effects of alfa7nAChR activation in the pathophysiology of asthma have not been clearly elucidated. Aim: To investigate the effects of PNU- 282987 (PNU) treatment, a specific alfa7nAChR agonist, in a murine model of chronic allergic airway inflammation. Methods: BALB/c mice were subjected to a protocol of chronic allergic inflammation induced by intraperitoneal ovalbumin (OVA) or saline and subsequent challenges with inhalation. From the 22th day, the animals daily received PNU or vehicle (Ve) until the 28th day. PNU were tested in three differents doses (0.5, 1.0 and 2.0 mg/kg). In order to demonstrate that the effects obtained by PNU treatment was dependent on alfa7nAChR, a group of animals was treated with MLA (antagonist of alfa7nAChR) prior to the PNU treatment. On the 29th day of the protocol, the animals were euthanised and the number of inflammatory cells in the bronchoalveolar lavage fluid(BALF) fluid and blood, cytokine levels in BALF, the expression of alfa7nAChR and mAChRs type 3 (M3), and activation of nuclear transcription factor kB (NF-kB) in the lung were evaluated. Bronchial remodeling was assessed by morfometric methods. Statistical analyses were performed using the SigmaStat (Jandel Scientific, San Rafael, CA) and P < 0.05 is considered statistically significant. Results: ?7nAChR and M3 expression was detected in control and sensitized lung homogenate. The most effective dose of PNU treatment was 0.5 mg/kg evaluated by the effects on eosinophil reduction. Thus, we observed that treatment with PNU0,5 reduced the number of total cells, eosinophils, neutrophils, macrophages and lymphocytes in BALF, as well as number of eosinophils in peripheral blood and around the airways of sensitized animals. The treatment with PNU also reduced IgE levels in the blood, and cytokines IL-4, IL-13 and IL-17 in BALF. All these effects were reversed by pretreatment with MLA, except for IL-17 cytokine. Furthermore, treatment with PNU reduced bronchial remodeling (edema, epithelium and smooth muscle area and airway collagen deposition) as well as the number of positive cells for MMP-9 and TIMP-1 around the airways. The lung p-65-NF-kB, phosphorylated STAT3 and the SOCS3 expression were inhibited by PNU-282987. Conclusion: These data clearly demonstrate that the alfa7nAChR is involved in the control of allergic pulmonary inflammatory response and in bronchial remodeling in an experimental model of allergic asthma and it can be a new target with therapeutic potential to be explored in the pathophysiology of asthma

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:19:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6542.pdf: 976115 bytes, checksum: f044b79bc4aa03baa6d20c50be943d15 (MD5) Previous issue date: 2015-02-06 / Universidade Federal de Sao Carlos / This study investigated the effects of bilateral intra-amygdala microinjections of PNU-282987, which is a nicotinic cholinergic agonist, on anxiety and emotional memory as well as the reversal of amnesia induced by an H1 histaminergic antagonist (CPA) in mice subjected to the elevated plus-maze (EPM). For this purpose, two experiments were performed. The subjects were seventynine adult male Swiss mice weighing 25-40g at testing. Behavioral testing was performed on two consecutive days (T1 and T2). In both experiments, the drugs were administered prior to testing. In Experiment 1, the animals received bilateral microinjections of saline (SAL) or PNU-282987 (0.1 nmol) and four experimental groups were tested; i.e., SAL-SAL, SAL-PNU, PNU-SAL and PNU-PNU groups. In Experiment 2, the animals received combined bilateral microinjections of CPA (0.16 nmol) and PNU-282987 on T1 and they were re-exposed to the EPM 24 hours later. Four experimental groups were tested; i.e., SAL-SAL, PNU-SAL, CPA-SAL and CPA-PNU groups. ANOVA followed by Duncan´s tests revealed no significant differences between the SAL and treated groups at T1 in the measurements of anxiety (i.e., % open arm entries and % open arm time, ANOVA, p > 0.05), which indicates that the CPA and PNU did not induce effects on anxiety. The isolated microinjections of PNU-282987 did not produce effects on emotional memory; however, the combined microinjections of PNU-282987 and CPA were able to reverse the deficit in memory induced by CPA (ANOVA, p < 0.05). There were no significant changes in the numbers of enclosed arm entries which served as a measure of locomotor activity (ANOVA, p > 0.05). Taken together, these results suggest that intra-amygdala injections of PNU-282987 did not induce effects on anxiety and emotional memory per se; however, the combined injections of CPA and PNU-282987 reversed the amnesic effects caused by CPA, which is suggestive of an interaction between the histaminergic and cholinergic systems in the modulation of emotion memory acquisition in mice subjected to the EPM. / Os objetivos do presente estudo foram verificar os efeitos das microinjeções bilaterais de agonista colinérgico nicotínico PNU-282987, na amídala, sobre a ansiedade e memória emocional, e analisar se as microinjeções do PNU-282987 revertem o efeito amnésico provocado pelo antagonista histaminérgico H1 Clorfeniramina (CPA) em camundongos submetidos ao labirinto em cruz elevado (LCE). Para essas investigações foram realizados dois experimentos. Foram utilizados 79 camundongos da cepa Suíço-Albino, machos, pesando entre 25 e 40g. O teste comportamental foi realizado em dois dias consecutivos: T1 e T2. No experimento 1, os animais receberam microinjeções bilaterais intra-amídala de salina (SAL) ou PNU (0,1 nmol) pré-T1 e pré-T2. Após cinco minutos da microinjeção, os animais foram expostos ao LCE. Foram formados quatro grupos experimentais: SAL-SAL; SAL-PNU; PNU-SAL; PNU-PNU. No experimento 2, os animais receberam microinjeções combinadas bilaterais intra-amídala de CPA (0,16 nmol) ou PNU (0,1 nmol) apenas pré-T1 Após cinco minutos os animais foram expostos ao LCE; em T2 houve apenas a reexposição. Foram formados quatro grupos experimentais: SALSAL; PNU-SAL; CPA-SAL; CPA-PNU. Os dados foram analisados usando a ANOVA de duas vias e o teste post hoc Duncan. A ANOVA não mostrou diferenças significativas entre os grupos em T1 para as medidas de ansiedade [% entradas nos braços abertos (%EBA); % tempo gasto nos braços abertos (%TBA), p > 0,05]. O PNU, microinjetado per se, não apresentou efeitos na aquisição da memória emocional, entretanto no experimento 2, as microinjeções combinadas de PNU e CPA, foram capazes de reverter o déficit na memória induzido pela CPA (ANOVA, p < 0,05), sugerindo a interação entre esses sistemas na amídala de camundongos reexpostos ao LCE. Não houve mudanças significativas nas entradas dos braços fechados (ANOVA, p > 0,05), medida representativa da atividade locomotora. Os resultados do presente estudo sugerem que as microinjeções do PNU-282987 intra-amídala não apresentaram efeitos sobre a aquisição da memória emocional, entretanto houve uma interação entre os sistemas histaminérgico e colinérgico na amídala na modulação da aquisição da memória emocional em camundongos reexpostos ao LCE.