Background: The major histocompatibility complex (MHC) molecules play an important role in the immune response regulation and in the maintenance of the immune homeostasis. Regulation of their expression is therefore a key factor influencing the adaptive immune response. DNA methylation of gene regulatory regions is one of the mechanisms of gene expression control that affects the accessibility of DNA to transcription factors. Ageing is connected with changes in DNA methylation and increased predisposition to autoimmune diseases in older age could be associated with changes in MHC class II genes methylation. Aims: The aim of this diploma thesis is to analyze the methylation profile of DQA1 and DQB1 genes regulatory regions and to compare its differences between the generations and between individual alleles. The next aim is to compare DQA1 mRNA expression between the generations and between single alleles. Methods: DNA and RNA were isolated from blood of three age group donors. DNA was converted by the bisulfite treatment and regulatory regions of HLA class II genes were amplified and cloned into bacteria. Positive clones were sequenced and then analyzed. RNA was reverse transcribed and its expression level was determined by real-time PCR. Results: Statistically significant differences were found by...

A suspeita de indução de resistência bacteriana a antibióticos melhoradores de desempenho (AMD) e a pressão dos consumidores e dos mercados importadores para a abolição da prática criam a necessidade da descoberta de novas substâncias que funcionem como substitutos aos antibióticos, como os probióticos, prebióticos e simbióticos. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos de probiótico, prebiótico e simbiótico sobre o desempenho zootécnico, os rendimentos de carcaça e de cortes e a morfologia intestinal de frangos de cortes criados de 1 a 43 dias de idade. Foram utilizados 1200 pintos de 1 dia, machos, da linhagem comercial Cobb 500®, distribuídos em delineamento inteiramente casualizado, com 5 dietas experimentais: Controle, Antibiótico (virginiamicina), Probiótico (Bacillus subtilis), Prebiótico (mananoligossacarídeo - parede celular de Saccharomyces cerevisae) e Simbiótico (Bacillus subtilis + mananoligossacarídeo - parede celular de Saccharomyces cerevisae) e 8 repetições de 30 aves cada. Em relação ao desempenho zootécnico, os aditivos testados provaram ser alternativas viáveis ao antibiótico melhorador de desempenho utilizado, uma vez que apresentaram resultados melhores que os do grupo controle e iguais aos obtidos com o uso do AMD. Da mesma maneira, para os rendimentos de carcaça e de cortes, o probiótico, o prebiótico e o simbiótico, mostraram poder ser usados como substitutos ao antibiótico, uma vez que promoveram rendimentos iguais aos do grupo alimentado com AMD. Por fim, para a morfometria intestinal, os dados obtidos mostram não haver uma relação direta entre a presença de aditivo e uma maior altura de vilosidade, menor profundidade de cripta ou maior relação vilo:cripta, uma vez que nem sempre os animais suplementados tiveram melhores resultados que o grupo controle negativo. Desta maneira concluí-se que os aditivos usados podem substituír o antimicrobiano testado, em suas respectivas doses, para as fases de criação consideradas, uma vez que fornecem resultados tão bons quanto aos obtidos com o AMD. / The suspect of the resistance\'s indution of antibiotics (ATB) and the pressure of the consumers and of the importing markets for the abolishment of this kind of practice have criated the necessity of discovering new substances that work like substitutes to antibiotics, just like probiotics, prebiotics and symbiotcs. In this manner, the objective of this study it was evaluate the effects of probiotic, prebiotic and symbiotic on performance, carcass and parts yield and intestinal morphology of broilers from 1 to 43 days of age. There were used 1,200 one-day-old chicks, male, Cobb 500® strain, distributed on a completely randomized design, with 5 experimental diets: Control, Antibiotic (virginiamicin), Probiotic (Bacillus subtilis), Prebiotic (Saccharomyces cerevisae yeast cell) and Symbiotic (Bacillus subtilis + Saccharomyces cerevisae yeast cell) and 8 replicates with 30 chicks each one. Concernig on the performance, the tested additives have been proved to be viable alternatives to used antibiotic, once that they have showed better results than the control group, and similars to the ones that were obtained with the use of antibiotic (ATB). Equally, for the carcass and parts yield, probiotic, prebiotic and symbiotic have showed they can be used like substitutes to antibiotics, once they have promoted equall yields to the group fed antibiotic. At last, for the intestinal morphology, the data haven\'t showed relation between the additive\'s presence and a higher vilo high, a smaller cript depth and a higher vilo:cript ratio, once not always animals fed additives have had better results than the control group. This way, the conclusion is that the substitution of the antimicrobian by the additives, in its respective doses, can be adopted once promotes good results as the antibiotic.

O saneamento é uma questão essencial para a qualidade de vida, para condições ambientais salubres, entre outros aspectos. O reconhecimento do saneamento como direito social diante da essencialidade à vida humana e à proteção ambiental ainda não foi contemplado dignamente. A pesquisa tem como objetivo investigar a viabilidade da escola tornar-se Promotora da Saúde implementando práticas sócioeducativas nos ambientes escolar e comunitário visando alcançar melhores condições de saneamento básico com mobilização social. A proposta adota a metodologia da pesquisa-ação com a estratégia da pesquisa social, atendendo os aspectos de interação e de investigação não se limitando a uma forma de ação, mas aumentando o conhecimento do pesquisador e dos atores envolvidos. Para tratar os dados de uma das atividades se utiliza o processo de análise de conteúdo. A pesquisa trata da Promoção da Saúde, da temática escola, do complexo saneamento e recursos hídricos; da mobilização, controle social e aprendizagem social. Definida a bacia hidrográfica do ribeirão da Vargem do Salto em Ibiúna/SP, para desenvolver as atividades previstas na pesquisa onde estão localizadas escolas municipais dos bairros Vargem do Salto, Lageado, Saltinho, Salto e Samano. Há um diálogo estabelecido entre a pesquisa e documentos oficiais legais para fundamentação teórica; e também sustentado pelo pensamento de Paulo Freire, John Dewey, Pedro Roberto Jacobi, Michael Apple, Moacir Gadotti, Leonardo Boff, Henry Giroux, Edgar Morin e Michel Thiollent. Promoção da Saúde definida como o processo de capacitação da comunidade para atuar na melhoria da sua qualidade de vida e saúde, inclui uma maior participação no controle deste processo e a escola pode ser um espaço para se concretizar as ações da Promoção da Saúde, proporcionando a mobilização, participação, o controle social e aprendizagem social. A síntese analítica adota o percurso metodológico de forma cronológica para apresentação dos resultados. Constata-se a função social da escola que adotando os princípios da Escola Promotora da Saúde adquire potencial para gerar processos que fortalecem a convivência, a participação, o diálogo permanente das pessoas e a compreensão consciente da sociedade em que vivem e a possibilidade de efetiva transformação. / Sanitation is essential to quality of life, healthy environmental conditions, among other things. The recognition of sanitation as a social right in light of its essentiality to human life and to environmental protection has not been contemplated in a dignified manner. This research aims to investigate the viability for the school to become a Promoter of Health by implementing socio-educational practices in the school and community environments in order to achieve better conditions of sanitation with social mobilization. The proposal adopts the methodology of research-action with the strategyof social research, taking into account the aspects of interaction and research, not limited to one form of action, but increasing the knowledge of the researcher and all involved. To process the data of one of the activities the content analysis process was used. The research deals with the Promotion of Health, the topic of the school, the sanitation and water resources complex; the mobilization, social control and social learning. The basin of the stream in Vargem do Salto in Ibiúna, SP, was established for the activities set in the survey to be developed, locality where municipal schools of Vargem do Salto, Lageado, Saltinho, Salto and Samanoare located. There is a dialogue between the research and the legal official documents for theoretical foundation; sustained by the points of view from Paulo Freire, John Dewey, Pedro Roberto Jacobi, Michael Apple, MoacirGadotti, Leonardo Boff, Henry Giroux, Edgar Morin and Michel Thiollent. Health promotion, defined as the process of empowerment of the community to work on improving their quality of life and health, includes a greater participation in the control of this process. The school can be a place to achieve the actions of Health Promotion, providing the mobilization, participation, social control and social learning. The analytical overview adopts a methodological path in a chronological way to present the results. It is noted that the schools social function that, adopting the principles of the School as a Health Promoter, gains potential to generate processes that strengthen coexistence, participation, permanent dialogue and the conscious understanding of the community in which they live and the possibility of effective transformation.

Neste trabalho, estudamos duas malformações craniofaciais mendelianas, decorrentes de um distúrbio do desenvolvimento dos primeiro e segundo arcos faríngeos: a síndrome de Treacher Collins (STC) e a síndrome Aurículo-condilar (SAC). A identificação de genes e de mecanismos moleculares associados a essas condições, além de contribuir para a compreensão do desenvolvimento das estruturas derivadas desses arcos faríngeos, é fundamental para o desenvolvimento do diagnóstico molecular, uma ferramenta importante para diagnóstico diferencial e aconselhamento genético. Contribuímos para uma melhor caracterização clínica da SAC com a descrição de uma nova família com 11 afetados. Após excluirmos quatro genes/regiões candidatas para síndromes de 1º e 2º arcos faríngeos, realizamos estudos de ligação usando marcadores polimórficos ao longo do genoma. Mapeamos o primeiro lócus associado à SAC, 1p21.1-q23.3 (lod score=3.0), e nossos dados sugerem que há heterogeneidade genética para essa patologia. Com relação ao estudo da STC, realizamos uma extensa revisão da nomenclatura das mutações patogênicas descritas na literatura, além de investigar mecanismos mutacionais atípicos na STC, corroborando a hipótese de que mutações nos exons que sofrem splicing alternativo são capazes de gerar o fenótipo da síndrome. Demos continuidade à caracterização do espectro de mutações no gene TCOF1 e investigamos a correlação genótipo-fenótipo numa amostra de 58 pacientes com STC. A análise dos dados de polimorfismos da região codificadora do gene permitiu que fizéssemos inferências sobre o regime de seleção ao qual o TCOF1 está submetido, e os resultados sugeriram que o gene TCOF1 está sob seleção purificadora, que atua sobre mutações fracamente deletérias. Também inferimos a fase para um conjunto de polimorfismos da região codificadora, verificando se havia associação de algum haplótipo à gravidade do quadro clínico ou à predisposição para a doença. Dada a observação de ausência de correlação haplótipo/genótipo-fenótipo, testamos a hipótese de que variações nos níveis de expressão do alelo normal poderiam ser responsáveis pela variabilidade clínica observada nos pacientes portadores da STC. Para tanto, iniciamos o estudo funcional das regiões regulatórias do gene TCOF1 , inclusive, de regiões distantes do promotor mínimo, preditas como enhancers. Identificamos polimorfismos em sua região promotora, sendo um deles capaz de diminuir os níveis de transcrição e de afetar a ligação do fator de transcrição YY1 ao promotor do TCOF1 . Caracterizamos a ação de YY1 como repressora in vitro. Testamos também a hipótese de haploinsuficiência como mecanismo associado à STC. Quantificamos os níveis de transcritos do TCOF1 em indivíduos afetados e normais e observamos uma diferença significativa. Nosso trabalho corrobora a hipótese de haploinsuficiência e mostra pela primeira vez que pacientes têm degradação de transcritos. Também investigamos a possibilidade de os níveis de transcritos estarem correlacionados à variabilidade fenotípica. Comparamos os dados de expressão de cada paciente à freqüência de nove sinais clínicos principais da STC, mas nenhuma correlação foi observada. Investigamos o padrão de metilação da ilha CpG do gene TCOF1 em pacientes e em controles, com o intuito de verificar se diferentes níveis de metilação inter-individual estariam associados à grande variação na expressão gênica. Demonstramos que a metilação da ilha CpG não é o mecanismo regulatório por trás dessa ampla variação de expressão do TCOF1 / In the present study, we investigate two craniofacial mendelian disorders, resulting from abnormalities in the development of the first and second pharyngeal arches: the Treacher Collins Syndrome (TCS ) and the auriculo condylar syndrome (ACS). The identification of genes and molecular mechanisms associated to these conditions, in addition to contributing to the understanding of the development of structures derived from these pharyngeal arches, is fundamental for the development of molecular diagnostics, an important tool for differential diagnosis and genetic counseling. We contributed to a better clinical characterization of ACS with a description of a new family with 11 affected individuals. After excluding four candidate genes/regions for syndromes of the 1st and 2nd pharyngeal arches, we carried out linkage studies using polymorphic markers throughout the genome. We mapped the first locus associated to ACS, 1p21.1-q23.3 (lod score=3.0), and our data suggest genetic heterogeneity exists for this pathology. With respect to the study of TCS , we carried out an extensive review of the nomenclature for the pathogenic mutations described in the literature, in addition to investigating atypical mutation mechanisms in TCS , corroborating the hypothesis that mutations in the exons that undergo alternative splicing can result in the TCS phenotype. We continued the characterization of the mutation spectrum for TCOF1 and we investigated the genotype-phenotype correlation in a sample of 58 patients with TCS . The analysis of polymorphisms in the coding region allowed us to make inferences about the selective regime experienced by TCOF1 , and our results suggested that TCOF1 is under purifying selection, which acts upon weakly deleterious mutations. We also inferred the phase for a set of polymorphisms in the coding region, testing whether there was association between any haplotype and the severity of the phenotype or the susceptibility to the disease. Given the observation of no correlation between haplotype/genotype and phenotype, we tested the hypothesis that variation in the levels of expression of the normal allele could be responsible for the clinical variability observed in TCS patients. To do this, we started a functional study of the TCOF1 regulatory regions, including regions distant from the minimal promoter, predicted to be enhancers. We identified polymorphisms in the promoter region, one of which reduced the levels of transcription and affected the binding of the YY1 transcription factor to the TCOF1 promoter. Using an in vitro assay we characterized YY1 as a repressor. We also tested the hypothesis of haploinsufficiency as a mechanism associated to TCS . We quantified the levels of TCOF1 transcripts in normal and affected individuals and found a significant difference. Our study corroborates the haploinsufficiency hypothesis and for the first time shows that patients have transcript degradation. We also investigated the possibility that transcripts levels are correlated to phenotypic variability. We compared the expression data for each patient with the frequency of nine clinical signs of TCS , but no correlation was found. We investigated the pattern of methylation on the CpG island of TCOF1 in patients and controls, in order to test whether different levels of methylation among individuals were associated to the great variation in gene expression. We demonstrated that methylation of the CpG island is not the regulatory mechanisms underlying the broad variation in TCOF1 expression.

Insetos representam a maioria dos seres vivos na Terra. O sucesso biológico desses organismos está, em parte, relacionado às associações com microrganismos que influenciam aspectos de sua bioecologia, incluindo as relações com o primeiro e terceiro níveis tróficos. Assim como os insetos, plantas também apresentam associações com microrganismos que podem interferir na sua nutrição e relação com patógenos e herbívoros. Esse trabalho buscou analisar a capacidade de simbiontes associados a insetos de atuar como endofíticos de planta e influenciar, assim, o potencial biótico da planta e a sua capacidade de defesa contra a herbivoria, utilizando o modelo milho - Spodoptera frugiperda (J.E. Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae). Quatro simbiontes de insetos foram selecionados. Três deles (IIL-Sfm05, IILSfc-sus01 e IIL-Sfb05) associados ao trato digestivo de S. frugiperda e outro (IIL-ASP45) de Acromyrmex coronatus (IIL-ASP45). Adicionalmente, um endofítico (IILzm-Idp03) isolado do próprio milho foi adicionado como controle positivo. Os ensaios foram conduzidos após cultivo de sementes inoculadas com os diferentes microrganismos via bio-priming, aplicação no solo e aplicação foliar. Dos cinco isolados testados, três (IILSfc-sus01, IIL-Sfb05 e IILzm-Idp03) induziram maior crescimento em plantas de milho; porém, a forma de disponibilização dos microrganismos influenciou a resposta da planta. O isolado IILzm-Idp03 induziu o maior crescimento da planta pela sua disponibilização via bio-priming; IILzm-Idp03 e IIL-Sfb05 via inoculação do solo; e o isolado IILSfc-sus01 via inoculação foliar. Testes biológicos com S. frugiperda em plantas de milho inoculadas ou não com os microrganismos selecionados indicaram que dois deles (isolados IIL-Sfb05 e IIL-ASP45) resultaram em relações patogênicas, chegando à induzir a completa mortalidade de insetos alimentados em tecidos foliares de plantas inoculadas com esses microrganismos. Testes de preferência alimentar demonstraram que as lagartas não foram influenciadas pela alimentação com folhas de plantas inoculadas com as bactérias via bio-priming. Estudos comparativos dos índices nutricionais de plantas tratadas com as diferentes bactérias, indicaram que aquelas tratadas com IIL-ASP45 resultaram no menor crescimento e desenvolvimento larval de S. frugiperda, corroborado pelo menor consumo e índices nutricionais alcançados nessa fonte de alimento. A alimentação em plantas tratadas com IIL-Sfb05 causou 100% de mortalidade larval, não sendo possível a avaliação dos índices nutricionais. Os resultados desse trabalho demonstram o potencial de manipulação da planta hospedeira por bactérias associadas ao herbívoro, bem como o potencial biocida de microrganismos associados a insetos. / Insects represent most of the living things on Earth. The biological success of these organisms is in part related to associations with microorganisms that influence aspects of their bioecology, including relationships with the first and third trophic levels. Like insects, plants also have associations with microorganisms that may interfere in their nutrition and interactions to pathogens and herbivores. This work sought to assess the potential of symbionts associated with insects to act as plant endophytes and thus to influence plant growth and its utilization by the herbivory using the maize - Spodoptera frugiperda (JE Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae) model system. Four insect symbionts were selected. Three of them (IIL-Sfm05, IILSfc-sus01 and IIL-Sfb05) associated with the digestive tract of S. frugiperda and another (IIL-ASP45) with the cuticle of Acromyrmex coronatus (IIL-ASP45). Additionally, an endophyte (IILzm-Idp03) from maize was added as a positive control. Experiments were conducted after inoculation of the different microorganisms via bio-priming, soil application and foliar application. Of the five isolates tested, three (IILSfc-sus01, IIL-Sfb05 and IILzm-Idp03) induced higher growth in maize plants; however, the inoculation of the seeds with the microorganisms influenced the plant response. The isolate IILzm-Idp03 induced the highest plant growth when inoculated via bio-priming; IILzm-Idp03 and IIL-Sfb05 via soil inoculation; and IILSfc-sus01 via foliar inoculation. Biological tests with S. frugiperda on maize plants inoculated or not with the selected microorganisms indicated that two of them (IIL-Sfb05 and IIL-ASP45 isolates) were highly pathogenic, inducing very high larval mortality. Our analysis indicated no changes in larval feeding preference. Comparative analysis of larval food consumption and utilization indicated that plants inoculated with IIL-ASP45 resulted in the lowest growth and larval development of S. frugiperda, corroborated by the lower consumption and nutritional indexes reached in this food source. Feeding in plants inoculated with IIL-Sfb05 caused 100% larval mortality, and it was not possible to evaluate the nutritional indexes. Our data demonstrate the potential for manipulation of the host plant by bacteria associated with the herbivore, as well as the biocidal potential of insect - associated microorganisms.

A citricultura brasileira é a maior produtora e exportadora de citros e tem sido afetada por doenças que causam sérios prejuízos a produção e a qualidade dos frutos. No entanto, a cultura apresenta grandes problemas, entre eles, os fatores fitossanitários, que vem dizimando milhares de plantas e afetando a produtividade e a competitividade do setor. Atualmente, o huanglongbing (HLB), associado às bactérias de floema Candidatus Liberibacter spp., é considerado uma das mais destrutivas doenças de citros. A inexistência de cultivares de laranja doce resistentes ao HLB torna a transformação genética de citros uma ferramenta importante no controle desta doença. Para se defender do ataque de pragas e patógenos as plantas desenvolveram, durante o processo evolutivo, uma série de mecanismos de defesa, no qual pode-se incluir a produção de peptídeos com atividade antimicrobiana. As defensinas vegetais são peptídeos pequenos relacionadas à patogênese (PR), que possuem atividade antimicrobiana associada aos mecanismos de defesa das plantas. Assim, o objetivo deste trabalho foi a obtenção de plantas transgênicas de laranja doce (Citrus sinensis L.) cvs. \'Hamlin\', \'Natal\', \'Valência\' e \'Pera\', via Agrobacterium tumefaciens, superexpressando o gene codificador de defensina (def), isolado de Citrus sinensis cv. \'Valência\', dirigido pelo promotor com expressão preferencial no floema AtSUC2 (transportador de sacarose, clonado de Arabidopsis thaliana) ou pelo promotor constitutivo CaMV 35S (clonado do vírus do mosaico da couve-flor). Os explantes utilizados na transformação genética foram segmentos de epicótilo obtidos de plantas germinadas in vitro. A identificação das plantas transgênicas foi realizada por meio da análise da PCR, utilizando-se primers para a detecção do fragmento do gene de seleção nptII. As plantas PCR+ foram aclimatizadas e transferidas para casa-de-vegetação. A análise de Southern blot confirmou a integração do transgene em 36 plantas. Foram obtidas 7 plantas transgênicas da cultivar \'Hamlin\', 9 da cultivar \'Natal\', 1 da cultivar \'Pera\' e 9 da cultivar \'Valência\' contendo a construção gênica pC35S/def, e 3 plantas transgênicas da cultivar \'Hamlin\', 6 da cultivar \'Natal\' e 1 da cultivar \'Valência\' contendo a construção gênica pcAtSUC2/def. Os resultados obtidos neste trabalho serão importantes para futura avaliação e estudo visando o controle de Candidatus Liberibacter spp.. / The Brazilian citrus industry is the world\'s largest producer and exporter of citrus, however, it has been affected by diseases that cause serious production losses and damages to fruit quality. However, the culture faces problems, namely phytosanitary issues that have been damaging thousands of plants, affecting yield and competitiveness of the sector. Currently, Huanglongbing (HLB), associated with phloem bacteria Candidatus Liberibacter spp., is considered one of the most destructive citrus diseases. The lack of sweet orange cultivars resistant to HLB makes genetic transformation an important tool in the disease control. To defend from pest and pathogen attack, plants developed a series of defense mechanisms during the evolutionary process, which may include the production of peptides with antimicrobial activity. Plant defensins are small peptides related to pathogenesis (PR) which have antimicrobial activities, associated with plant defense mechanisms . The objective of this study was to obtain transgenic plants of sweet orange (Citrus sinensis L.) cultivars \'Hamlin\', \'Natal\', \'Valência\' and \'Pera\' with Agrobacterium tumefaciens overexpressing the defensin gene (def), isolated from Citrus sinensis cv. \'Valência\', controlled by the promoter with preferential expression in the phloem AtSUC2, (sucrose transporter, cloned from Arabidopsis thaliana) or by the constitutive promoter CaMV 35S (cloned from the mosaic virus of cauliflower). The explants used in genetic transformation were epicotyl segments obtained from germinated plants in vitro. The identification of transgenic plants was accomplished by PCR analysis using primers for the detection of nptII gene fragment. The PCR+ plants were acclimatized and transferred to greenhouse. The analysis of Southern blot confirmed the transgene integration in 36 plants. Seven transgenic plants were obtained for the cultivar \'Hamlin\', nine for \'Natal\', one for \'Pera\' and nine for \'Valência\' containing the gene construct pC35S/def and three transgenic plants for \'Hamlin\', six for \'Natal\' and one for \'Valência\' containing the gene construct pcAtSUC2/def. The results obtained in this work are important for future evaluation of the plants for resistance to Candidatus Liberibacter spp..

As rizobacterias promotoras do crescimento de plantas (RBCP) colonizam as raízes de plantas e induzem um aumento no crescimento vegetal por diversos mecanismos. A rizobacteria Bacillus subtilis é capaz de atuar como agente de controle de doenças de várias plantas cultivadas, como também promotor de crescimento vegetal. Diante disso, este trabalho teve como objetivos, nos quatro capítulos apresentados, de avaliar o crescimento micelial de patógenos, com a capacidade dos isolados de B. subtilis em inibir esses patógenos; avaliar a capacidade dos isolados de B. subtilis, inoculados em solo adubado com fosfato natural e sem adubação, em disponibilizar P e no crescimento da soja e feijão caupi em condições de casa de vegetação; avaliar a eficiência da inoculação de B. subtilis como promotor de crescimento vegetal na cultura do milho, em casa de vegetação; e avaliar a eficiência da inoculação de B. subtilis no desempenho agronômico da soja em condições de campo em duas localidades. Foram testados sete isolados de B. subtilis contra os patógenos Fusarium subglutinans, Curvularia lunata e Bipolaris spp., avaliando a capacidade de controle biológico in vitro. Na avaliação da capacidade de inibição do crescimento dos patógenos utilizando quatro métodos os isolados de B. subilis UFTBs 03, UFTBs 05, UFTBs 06, UFTBs 07 foram eficazes. Os isolados UFTBs 01, UFTBs 03, UFTBs 04, UFTBs 05, UFTBs 06 e UFTBs 07 foram capazes de inibir o crescimento micelial dos patógenos testados por metabólitos termoestáveis, sendo a antibiose seu principal mecanismo de ação. Quanto à eficiência da inoculação de B. subtilis em soja e feijão caupi com adubação de fosfato natural e sem adubação, em casa de vegetação, utilizando sete isolados e um MIX, observou-se que a maioria dos tratamentos onde recebeu a inoculação de B. subtilis proporcionou o crescimento da cultura da soja e do feijão caupi, também a maioria do isolados testados proporcionaram um maior teor de P disponível no solo e na parte aérea das plantas, tanto em solo suplementado com fosfato natural como também em solo sem adubação, em ambas as culturas. Em casa de vegetação testando inoculante de B. subitilis, composto por três cepas (UFTBs 01, UFTBs 02, UFTBs 03), em milho, mostrou que sementes de milho inoculadas com B. subtilis resultaram em plantas com maior acúmulo de biomassa, em estádio inicial de crescimento. No experimento de campo, onde foi testado inoculante de B. subtilis, composto por três cepas (UFTBs 01, UFTBs 02, UFTBs 03), na cultura da soja em duas localidades na safra 2013/1014, a inoculação com B. subtilis proporcionou aumento da biomassa e produtividade da soja nas duas regiões onde foram avaliadas. Os resultados do presente trabalho comprovam a eficiência de B. subtilis nativos, isolados de solos do Tocantins, no controle biológico de fitopatogênos, bem como a capacidade como promotores de crescimento de feijão caupi, milho e soja, e aumento de produtividade da cultura da soja. / The rhizobacteria promote plant growth (RBCP) colonize roots of plants and induce an increase in plant crecimento by different mechanisms. The rizobacteria Bacillus subtilis is able to act as a control agent of several cultivated plant diseases, as well as plant growth promoter. Thus, this study aimed to the four chapters presented, to evaluate the mycelial growth of pathogens such as the ability of isolates of B. subtilis to inhibit these pathogens; evaluate the effect of isolates of B. subtilis inoculated in soil fertilized with rock phosphate and without fertilization, as its ability to provide P, the growth of soybean and cowpea at home conditions of vegetation; evaluate the efficiency of B. subtilis inoculation as plant growth promoter in corn in a greenhouse; and evaluate the efficiency of inoculation of B. subtilis the agronomic performance of soybeans under field conditions in two locations. They tested seven isolates of B. subtilis pathogens Fusarium subglutinans, Curvularia lunata and Bipolaris spp., assessing the biological control capacity in vitro. In the evaluation of growth inhibition ability of the pathogens using four methods isolates of B. subilis UFTBs 03, UFTBs 05, UFTBs 06, UFTBs 07 were effective. Isolated UFTBs 01, UFTBs 03, UFTBs 04, UFTBs 05, UFTBs 06 and 07 UFTBs were able to inhibit the mycelial growth of the pathogens tested by thermostable metabolites, antibiose being its main mechanism of action. As the efficiency of inoculation of B. subtilis in soybean and cowpea with natural phosphate fertilizer and no fertilization in a greenhouse, using seven isolates and MIX, it was observed that most of the treatments which received inoculation of B. subtilis provided the growth of soybean and cowpea, also most of the isolates tested provided a higher P content available in soil and shoots of plants, both in soil supplemented with rock phosphate as well as in soil fertilization in both cultures. In greenhouse testing inoculant B. subitilis, composed of three strains (UFTBs 01, UFTBs 02, UFTBs 03) in corn, showed that maize seed inoculated with B. subtilis resulted in plants with higher biomass accumulation in stadium initial growth. In the field trial, where he was tested inoculant B. subtilis, composed of three strains (UFTBs 01, UFTBs 02, UFTBs 03) in soybean at two sites in the harvest 2013/1014, inoculation with B. subtilis gave rise biomass and soybean yield in the two regions where they were evaluated. The results of this study demonstrated the efficacy of B. subtilis native isolated from the Tocantins soil, the biological control of plant pathogens, as well as the capacity and bean growth promoters cowpea, corn and soybeans, and increased the soybean yield.

Heavy metals from natural and man-made sources can be a great threat to human and animal life. As small inorganic ions they are challenging to detect, usually requiring expensive and complicated machinery. Several heavy metals can accumulate in the human body, leading to long term toxic effects on the nervous system. Many bacteria have developed strategies to survive in heavy metal rich environments. One of these strategies is a bacterial operon containing genes for detoxification mechanisms controlled by a promoter and a regulatory protein. In this work some of these promoter-protein pairs, Pars-ArsR, PcopA-CueR, PmerTPAD-MerR and PzntA-ZntR from Escherichia coli have been employed in the design and construction of a set of biosensors aimed at the detection of heavy metals in drinking water. Biosensors usually employ biological recognition elements, transducing the signal from these to produce an output that can be integrated into electronic circuitry. The sensors presented in this work focus on reducing complexity and on providing a controlled sensor reaction. The arsenic biosensor ‘AsGard’ is based on the Pars-ArsR pair and functions by making the dissociation of an ArsR-mCherry fusion protein from its binding site in the Pars promoter visible. In the cell, ArsR dissociates from Pars upon binding of trivalent arsenic ions. Immobilising the relevant part of the Pars sequence on a solid plastic support allows for the mobilisation of previously bound ArsR-mCherry proteins in the presence of arsenic to become the sensor output. The AsGard sensor detects arsenic within minutes in a concentration range overlapping with the arsenic thresholds for drinking water as set by the World Health Organisation. Additional prototype sensors are presented bringing a reporter gene under the control of the aforementioned promoters. These sensors have been tested in vivo and in vitro in a cell free transcription translation system and partially detect metal concentrations close to relevant ranges. The Pars based sensor is tuneable in vitro by modifying the ratio of the supplied regulatory protein ArsR and is able to detect arsenic well within the relevant range. Spinach2, a fluorescent RNA aptamer, may make future designs independent from translation, drastically reducing complexity of cell free biosensors based on cis-trans transcriptional regulation.

Apesar da eficácia dos antimicrobianos como melhoradores no desempenho animal, questões relativas à seleção de microorganismos resistentes e transferência desses para o consumo humano de carne vêem trazendo uma crescente preocupação que tem provocado diminuição do seu uso. Assim, há necessidade da busca de alternativas, destacando-se as ervas medicinais, as quais apresentam ações, antimicrobiana, antioxidante, imunomodulatória e ainda, estimulante da secreção de enzimas digestivas. O objetivo do estudo foi avaliar a ação de um fito composto, produzido pela adição de partes aéreas secas e trituradas de plantas medicinais (Rosmarinus officinalis, Mentha piperita, Lippia sidoides e Lychnophora pinaster), em leitões, desde a creche até o abate, sobre parâmetros de desempenho, freqüência de diarréia, eliminação fecal de salmonelas, lesões histopatológicas intestinais e oxidação lipídica da carcaça. Os animais foram submetidos a duas situações: uma de desafio experimental (D, com inoculação de Salmonella typhimurium aos 35 dias de idade) e outra sem desafio (SD), permanecendo ambos grupos em salas isoladas. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com arranjo fatorial 3x2, sendo um fator o desafio, e outro, a suplementação de aditivos na ração (fito composto FITO; antibióticos ATB; e controle negativo, sem adição de promotores CTRL). Foram alojados 120 leitões recém-desmamados aos 21 dias de idade, na unidade de creche do Laboratório de Pesquisa em Suínos. Os animais foram pesados aos 21, 35, 49, 63 dias (creche) aos 96 e 106 dias (crescimento) e 131 dias de idade (terminação), e verificado o consumo de ração. Foi avaliada a freqüência de dias com diarréia (FDD) na creche, além da eliminação fecal de S. typhimurium, observando-se lesões histopatológicas causadas pela bactéria no trato entérico, e oxidação lipídica da carcaça aos 131 dias de idade. Não houve interação entre aditivos e desafio para nenhuma variável estudada. O peso médio (PM) do grupo ATB foi mais elevado durante todos os períodos em relação a FITO e CTRL, e estes não diferiram entre si; no entanto, aos 96 e 106 dias, o PM dos animais CTRL foi maior que FITO. De 21 a 35 dias de idade, a conversão alimentar (CA) do grupo ATB foi significativamente menor que CTRL; no entanto, FITO promoveu valor intermediário, não diferindo estatisticamente de ambos. O desafio experimental levou à queda no consumo diário de ração (CDR) de 35 a 48 dias. No entanto, no período final de crescimento, houve um efeito compensatório sobre as variáveis de desempenho, sendo PM, ganho diário de peso (GDP), CDR e CA significativamente melhores na sala D. Ainda, nesse período, na sala D, todas essas variáveis foram melhores para FITO, apesar da diferença ser meramente numérica, sugerindo efeito compensatório desse aditivo. O ATB promoveu menor FDD dos 21 aos 48 dias; no entanto, dos 35 aos 48 dias, FITO promoveu uma melhora mais rápida no quadro que CTRL. Não houve influência dos aditivos sobre a eliminação fecal de salmonelas, lesões histopatológicas no trato entérico ou sobre a oxidação lipídica na carcaça. Assim, a melhor CA na creche, e o efeito compensatório no final da fase de crescimento justificam futuras pesquisas sobre a ação do produto. / Despite the proven efficiency of antibiotics as growth promoters, issues associated to selection of microbial resistance and its impact over human health are rising concern between consumers and decreasing their use. Therefore, alternatives must be found, and medical herbs, with antimicrobial, antioxidant, immunomodulatory and stimulatory of digestives enzymes properties, seem promising. This study was carried out in order to evaluate the action of a phyogenic compound of medical herbs (Rosmarinus officinalis, Mentha piperita, Lippia sidoides and Lychnophora pinaster) towards piglets from weaning to slaughter, on performance parameters (body weight BW; average daily gain ADG; average daily feed intake ADFI; and feed conversion FC), frequency of diarrhea, fecal shedding of salmonellas, gut hystopatological lesions and lipid oxidation of meat, either under a challenged condition (C) or a non-challenged condition (NC). Experimental challenge consisted of oral administration of Salmonella typhimurium to piglets, at 35 days of age. Both groups were kept in isolated rooms. Experimental design was at random, and the treatments distributed in a 3x2 factorial arrangement. Factors were: challenge (C and NC) and additives (phytogenic compound PHYTO; antibiotic ATB; and control CTRL). 120 weaned piglets (21 days years old) were housed at nursery unit of Laboratory of Researche in Swine (LPS), and weighted at 21, 35, 49, 63 (nursery), 96, 105 (growing) and 131 (finishing) days of age. There was not interaction between factors. BW of ATB group was higher througout the experimental period. From 21 to 35 days of age, FC of ATB group was significantly lower than CTRL; however, PHYTO showed intermediary value, which did not statistically differ from both ATB and CTRL. Challenge caused lower ADFI from day 35 to 48. Nevertheless, at the final of growing period (96 to 105 days of age), there was a compensatory effect on performance, and animals out of C room had showed better values of BW, ADG, ADFI, FC than NC. At C room, such parameters were better for animals out of PHYTO group (although the differences were merely numerical), suggesting thus a compensatory effect of this compound. ATB has lead to lower FDD from day 21 to 48; however, from day 35 to 48, FDD of PHYTO group was lower than CTRL. There was not effect of additives on fecal shedding of salmonellas and on lipd oxidation of carcass. Further studies on the effect of the phyto compound must be carried out, especially during the growing and finishing periods.

A cana-de-açúcar possui uma característica única entre as plantas de interesse econômico mundial: a capacidade de acumular altos níveis de sacarose no colmo. No Brasil, em virtude do aumento da demanda interna e mundial por fontes energéticas renováveis, é nítida a expansão da cultura canavieira para regiões menos propícias para cultivo, como as regiões secas do centro-oeste brasileiro. O déficit hídrico é um dos principais agentes que afetam o desenvolvimento das plantas e a obtenção de variedades melhor adaptadas é fundamental para a sustentabilidade e expansão da agroindústria canavieira. Neste sentido, genes regulados por seca são alvos importantes para a obtenção de plantas transgênicas mais tolerantes ao estresse. Como a expressão constitutiva do transgene pode causar efeitos indesejáveis nas plantas transgênicas, também é necessária a identificação de promotores induzíveis pelo estímulo ambiental. O objetivo deste trabalho é a identificação de genes e sequências promotoras reguladas pela seca em cana-de-açúcar que, além de contribuir com o entendimento dos mecanismos envolvidos na tolerância ao estresse, podem ser utilizados como alvos para obtenção de plantas transgênicas mais resistentes. Para a identificação de genes diferencialmente regulados por seca, utilizamos diferentes plataformas de microarranjo: SUCAST (com 1.830 genes relacionados à transdução de sinal), SUCAMET (com 4.594 genes relacionados a metabolismo) e CaneRegNet (com sondas para a identificação de transcritos senso e antisenso que correspondem a 14.522 genes únicos). Nestas plataformas, analisamos a expressão dos genes de quatro variedades de cana-de-açúcar, duas tolerantes e duas sensíveis à seca, submetidas a 24, 72 e 120 h de déficit hídrico. Dos genes diferencialmente expressos (alguns identificados como transcritos pelas fitas senso e/ou antisenso), 53 foram selecionados para validação por PCR em tempo real. As regiões promotoras de quatro dos genes selecionados foram identificadas por meio das técnicas de andamento cromossômico, de seleção e sequenciamento de cromossomos artificiais de bactéria contendo DNA de cana-de-açúcar e de análise de contigs obtidos por Whole Genome Shotgun. Sete sequências promotoras foram selecionadas e clonadas em um vetor contendo o gene repórter gus. As atividades promotoras destas sequências foram testadas e verificadas em transformações transientes de calos embriogênicos de cana-deaçúcar. Para obtenção de plantas de cana-de-açúcar transgênicas, selecionamos o gene induzido por seca que codifica uma PP2C. Através da transformação de calos embriogênicos de cana-de- açúcar com vetor de silenciamento de pp2c, obtivemos algumas plantas com expressão de pp2c reduzida. O transcriptoma das plantas transgênicas foi avaliado. Em comparação com plantas controles e em condições normais de irrigação, identificamos 352 transcritos com expressão alterada. As plantas transgênicas com pp2c silenciado e plantas controles também foram estudadas num experimento de supressão de rega. Os dados fisiológicos e as observações morfológicas demonstraram que um dos eventos transgênicos apresentou tolerância à seca. A comparação do transcriptoma das plantas irrigadas contra as submetidas à seca e da planta tolerante contra não tolerantes ao estresse mostrou que diversos genes estavam diferencialmente regulados, inclusive aqueles envolvidos na sinalização por ABA, via no qual o gene pp2c atua. / Sugarcane has a unique characteristic among crop plants in the world: the ability to accumulate high levels of sucrose in its stems. In Brazil, due to the local and global increasing demand for renewable energy sources, it is notable the expansion of sugarcane cultivation to areas less favorable for cultivation, such as the dry regions of central-western Brazil. Water deficit is one of the main agents that affect plant development. The production of better varieties is critical to the sustainability and expansion of the sugarcane industry. In this way, genes regulated by drought are important targets for obtaining transgenic plants tolerant to stress. Since transgene constitutive expression may cause unwanted effects in transgenic plants, it is also important to identify of stress inducible promoters. The goal of this work is the identification of genes and promoters regulated by drought in sugarcane that, in addition to contributing to the understanding of the mechanisms involved in stress tolerance, can be used as targets for the production of transgenic plants more resistant to water stress. For the identification of genes differentially expressed in response to drought, we have used different microarray platforms: SUCAST (contains 1,830 genes related to signal transduction), SUCAMET (contains 4,594 genes related to metabolism) and CaneRegNet (contains probes for the identification of sense and antisense transcripts that correspond to 14,522 unique genes). In these platforms we analysed gene expression of four different sugarcane varieties, two tolerant and two sensitive to drought, after 24, 72 and 120 h of water deficit. From the genes differentially expressed (some transcribed by the sense and/or antisense strand), 53 were selected for qPCR validation. Promoter regions of four genes were identified by Chromosome Walking, selection and sequencing of BACs and the analyses of Whole Genome Sequencing contigs. Seven promoter sequences were selected and cloned into a vector containing the gus reporter gene. Promoter activity was tested and verified through the transient transformation of sugarcane embryogenic calli. For sugarcane transgenics production we selected the drought-induced pp2c gene. Through the transformation of sugarcane embryonic calli with a vector for pp2c silencing we obtained transformed plants with pp2c gene expression reduced. The transcriptome of transgenic plants was analysed. In comparison with control plants and in irrigated conditions, we identified 352 differentially expressed transcripts. Transgenic plants with silenced pp2c and control plants were studied in a pilot drought experiment. Physiological data and morphological observations indicated that one of the transgenic events presented tolerance to drought. The comparison between irrigated and drought plants and between tolerant and no tolerant showed that a large number of genes was differentially regulated including genes related to the ABA signaling, pathway in which pp2c acts.