Made available in DSpace on 2015-04-20T12:31:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Liliane Coelho da Rocha.pdf: 1977290 bytes, checksum: 135132c02bcd9e4dc7368e1a021d52b4 (MD5) Previous issue date: 2011-05-30 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / Variations in clinical manifestations of leishmaniasis suggest the existence of a differentiation species dependent in the ability of the Leishmania parasites cause lesions in the host. The search for factors that differentiate the species of this genus and its virulence and infectivity is needed to better understand the mechanisms by which these parasites cause damage to the reservoir hosts, thus enabling the discovery of new tools for immunological and therapeutic potential against leishmaniasis. Although many aspects of immune response to this parasite already known, there are several gaps in knowledge related to the characteristics of the parasite itself, that are related to infection. The in vitro and in vivo assays with axenic promastigotes of Leishmania (Leishmania) amazonensis in logarithmic phase, maintained for long periods in culture, macrophages incubated with strain and inoculated in susceptible mammals, were unable to infect macrophages and hamsters. The loss of infectivity and virulence of promastigotes grown continuously, probably due to selection in the sample initially stable, and infective to a population of non-infective promastigotes. The decoded genome of Leishmania (Leishmania) major and Leishmania (Leishmania) infantum and functional studies of many genes by different research groups, as well as other species of the genus, coupled with the simultaneous advance of proteomics, and accelerated favored significantly study the biology of the genus Leishmania. The use of proteomics technique for the study of proteins related to the infectivity of Leishmania, using 2-DE maps for the detection of protein expression profiles of infected and non infected forms of L. (L.) amazonensis coupled with mass spectrometry ESI-QTof (Electrospray Ionization) for identification of proteins were used in this study. Were detected 251 and 145 spots of proteins differents in promastigotes infective and non-infective, respectively. The two dimensional (2-DE) proteins of L. (L.) amazonensis promastigotes infective and non infective indicated differences in protein expression among the forms studied, revealing the absence of expression of some proteins in the non infective samples. Most of the proteins identified in this study is involved in metabolic processes related to the infectivity and virulence of Leishmania such as: heat shock - HSP83 and HSP70, enzymes - nucleoside diphosphate kinase, protein disulfide isomerase, enolase, trypanothione reductase, mitochondrial tryparedoxin peroxidase and ATPase, cytosolic tryparedoxin and the elongation factor-α. These data confirm the feasibility of doing a sweep of the protein profile of an organism related to its infectivity/virulence protein profiles based on 2-DE. Given the results presented in 2-DE maps and the identification of proteins present in the forms studied we can conclude that the infectivity and virulence of promastigotes of L. (L.) amazonensis is related to a number of factors and proteins whose expression has fundamental importance for the survival/multiplication of the parasite in the reservoir-host / Variações nos quadros clínicos da leishmaniose sugerem a existência de uma diferenciação, dependente da espécie e na capacidade de parasitos do gênero Leishmania causar lesões no hospedeiro. A busca por fatores que diferenciam as espécies deste gênero quanto a sua infectividade e virulência se faz necessária para uma melhor compreensão dos mecanismos pelos quais esses parasitos causam danos aos seus hospedeiros, possibilitando assim a descoberta de novas ferramentas de potencial imunológico e terapêutico contra a leishmaniose. Embora muitos aspectos, da resposta imune a esse parasito, já sejam conhecidos, existem diversas lacunas no conhecimento relacionadas às características do próprio parasito que estejam envolvidas com a infecção. Ensaios in vitro e in vivo com promastigotas axênicas de fase logarítmica de Leishmania (Leishmania) amazonensis, mantidas por longos períodos em cultivo, incubados com macrófagos de linhagem e inoculados em mamíferos suscetíveis, mostraram-se incapazes de infectar macrófagos e hamsters. A perda da infectividade e virulência de formas promastigotas continuamente cultivadas provavelmente ocorreram devido à seleção na amostra inicialmente estável e infectiva para uma população de formas promastigotas não-infectivas. O genoma decifrado de Leishmania (Leishmania) major e Leishmania (Leishmania) infantum e os estudos funcionais de vários genes, por diferentes grupos de pesquisa, bem como de outras espécies do gênero, aliado ao avanço simultâneo da proteômica, acelerou e favoreceu de forma significativa o estudo da biologia do gênero Leishmania. O uso da técnica proteômica para o estudo de proteínas de Leishmania relacionadas à infectividade, através do uso de mapas 2-DE para a detecção dos perfis de expressão protéica das formas infectivas e não infectivas de L. (L.) amazonensis aliado a espectrometria de massas por ESI-QTof (Electrospray Ionization) para identificação das proteínas, foram utilizados nesse estudo. Foram detectados 251 e 145 spots protéicos diferentes nas formas promastigotas infectiva e não infectivas, respectivamente. A análise bidimensional (2-DE) de proteínas de promastigotas de L. (L.) amazonensis infectivas e não infectivas indicou diferenças na expressão protéica entre as formas estudadas, revelando a ausência de expressão de algumas proteínas nas amostras não infectivas. A maior parte das proteínas identificadas neste estudo está envolvida em processos metabólicos relacionados à infectividade e virulência de Leishmania como as: de choque térmico - HSP83 e HSP70, enzimas nucleosídeos difosfato quinase, dissulfeto isomerase, enolase, tripanotiona redutase, triparedoxina peroxidase mitocondrial e ATPase, a triparedoxina citosólica e os fatores de alongamento α. Esses dados confirmam a exequibilidade de se fazer uma varredura do perfil protéico de um organismo relacionado à sua infectividade/virulência baseada nos perfis protéicos em 2-DE. Em vista dos resultados apresentados nos mapas 2-DE e na identificação das proteínas presentes nas formas estudadas podemos concluir que a infectividade e virulência de promastigotas de L. (L.) amazonensis esta relacionada a um conjunto de fatores e proteínas cuja expressão é de fundamental importância para a sobrevivência/multiplicação do parasito no seu hospedeiro

A floresta plantada de eucalipto representa a maior porcentagem entre as florestas plantadas no Brasil, principalmente para a producao de papel e celulose. Porem, durante todo o seu desenvolvimento, o eucalipto sofre o ataque de diferentes patogenos, e entre eles esta o fungo Puccinia psidii causador da ferrugem, principal doenca do eucalipto em regioes tropicais. Assim, com o intuito de estudar alguns mecanismos de defesa da planta contra a infeccao do fungo, este trabalho visou analisar a expressao genica de enzimas relacionadas ao estresse oxidativo e a atividade das mesmas; e o proteoma de clones de eucalipto resistentes e suscetiveis, ao longo do processo de infeccao, colonizacao e multiplicacao do fungo nas plantas. Foi possivel observar diferencas na expressao dos genes em todos os horarios estudados, principalmente as 24 horas apos inoculacao com o fungo. Alem disso, com a analise do proteoma pode-se observar algumas proteinas de grande relevancia para este trabalho, como algumas relacionadas a estresse oxidativo e a resposta de defesa da planta. / The eucalyptus planted forest represents the major percentage among all planted forests in Brazil, mainly for the production of paper and cellulose. However, during its development, the eucalyptus can be attacked by a large number of different pathogens, like the fungus Puccinia psidii, the causer of the eucalyptus rust, main disease that affects the eucalyptus in tropical regions. Thus, in order to study some plant defense mechanisms against the infection of the fungus, this study aimed to analyse the gene expression of some enzymes related to oxidative stress and their activities, and the proteome of resistant and susceptible eucalyptus clones, during the process of infection, colonization and multiplication of the fungus in the plant. We could observe differences in the gene expression at all times studied, mostly at 24 hours after inoculation with the fungus. Besides, with the proteome analysis we could find the very relevant proteins for this study, for instance some proteins related to the oxidative stress and to the plant defense response.

Orientadores: Adriana Zerlotti Mercadante, Fabio Marcio Squina / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-25T13:26:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mandelli_Fernanda_D.pdf: 50728289 bytes, checksum: 659e38d75c97749e6177d608199540ba (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Espécies reativas de oxigênio (ERO) e nitrogênio (ERN) são geradas dentro das células pela exposição a agentes endógenos e exógenos, estas espécies, quando em níveis normais, encontram-se envolvidas na produção de energia, regulação do crescimento celular, sinalização intercelular e síntese de substâncias biológicas importantes. Por outro lado, se produzidas em excesso, podem provocar oxidação lípidica, de proteínas ou do DNA causando o que conhecemos por estresse oxidativo. Para combater o excesso de espécies reativas, os organimos produzem moléculas antioxidantes tais como os carotenoides e enzimas como superóxido dismutase e catalase. No entanto, é difícil apontar as estratégias de adaptação dos micro-organismos em resposta a diferentes condições de estresse através do estudo individual de moléculas produzidas. Diante do exposto, esta pesquisa teve por objetivo elucidar o genoma, proteoma e transcriptoma bem como a produção de carotenoides da bactéria termófila Thermus filiformis quando submetida à algumas condições de cultivo: presença e ausência de H2O2 e temperatura de crescimento abaixo (63 ?C) e acima (77 ?C) do seu ótimo (70 ?C). Para tanto, o genoma e transcriptoma foram analisados com o emprego de tecnologias de sequenciamento de última geração e ferramentas computacionais, e a proteômica e os carotenoides foram caracterizados por cromatografia líquida e espectrometria de massas. Além disso, devido à conhecida capacidade antioxidante e alto potencial de aplicabilidade na indústria farmacêutica, cosmética e de formulação de alimentos, foi feita a clonagem, expressão e caracterização da enzima superóxido dismutase de Thermus filiformis (TfSOD). A TfSOD apresentou atividade enzimática utilizando como cofator tanto manganês quanto ferro e termoestabilidade a até 80 ?C. O sequenciamento de DNA produziu um total de 9.680.471 reads pareados e uma montagem com n50 = 85,2Kb, n90 = 17,1kb, contig de maior tamanho com 275,5kb e um tamanho total de 2,46MB. A predição genética resultou em 2.403 genes codificadores de proteínas. Na análise de transcriptoma, 97,1% dos genes codificadores de proteínas preditos apresentaram expressão com valores detectáveis de RSEM (RNA-Seq by Expectation-Maximization). Através da análise do transcriptoma foram identificados 37% e 5,86% dos genes diferencialmente expressos (p-valor<0,05) nos ensaios com diferentes temperaturas e com e sem adição de H2O2, respectivamente. Através da análise do proteoma, no ensaio com diferentes temperaturas, foi encontrado um total de 27,7% proteínas diferencialmente expressas com um FDR (False Discovery Rate) < 0,05%, sendo 20% significativamente diferentes (p-valor<0,05, teste T) e, no ensaio com e sem adição de H2O2, um total de 28,3% com um FDR < 0,05%, sendo 6% significativamente diferentes (p-valor<0,05, teste T). Algumas diferenças foram observadas na produção de carotenoides de acordo com cada condição de cultivo. Quanto ao perfil de carotenoides, nas condições a 70 ?C e a 77 ?C os carotenoides majoritários foram termozeaxantina-15 e termozeaxantina-13, enquanto que para condição a 63 ?C foram termozeaxantina-15 e zeaxantina livre. A amostra cultivada a 70 ?C sem adição de H2O2 apresentou a maior quantidade de carotenoides totais (1.516 ?g/g), por outro lado o extrato rico em carotenoides que apresentou maior capacidade de desativação do radical peroxila (50,5) foi o da amostra com adição de H2O2. Os resultados do presente estudo mostram que os principais processos afetados pela mudança de temperatura e adição de peróxido de hidrogênio foram: catabolismo, transcrição e tradução de proteínas. Observou-se também que a alteração na temperatura teve uma maior influencia na expressão diferencial de genes e proteinas do que a adição de peróxido. Através das análises do trancriptoma e do proteoma de T. filiformis foram identificadas enzimas termo-estáveis com potencial de aplicação industrial, como por exemplo alfa-amilases, alfa-galactosidases e esterases. Além disso, o extrato rico em carotenoides dessa bactéria apresentou capacidade de desativar o radical peroxila superior à capacidade de extratos de frutas e até mesmo de padrões de carotenoides / Abstract: Reactive oxygen (ROS) and nitrogen (RNS) species are produced in the cells by exposure to endogenous and exogenous agents, these species, when at normal levels, are involved in energy production, cell growth regulation, intercellular signaling and synthesis of important biological substances. On the other hand, if overproduced, can cause lipid, protein and DNA oxidation, leading to what is known as oxidative stress. To combat excessive reactive species, organisms produce antioxidant molecules such as carotenoids and enzymes such as superoxide dismutase and catalase. However, it is difficult to point out the adaptation strategies of microorganisms in response to different stress conditions through the study of individual molecules. Therefore the aim of this research was to elucidate the genome, proteome and transcriptome, as well as the carotenoid production of Thermus filiformis when submitted to the some cultivation conditions under stress: without and with hydrogen peroxide and temperature below (63 ?C) and above (77 ?C) the optimum (70 ?C). In order to achieve this aim, the genome and transcriptome were analyzed using next generation technology and computational tools, and proteome and carotenoids were characterized by liquid chromatography and mass spectrometry. Moreover, due to its known antioxidant capacity and potential application on pharmaceutical, cosmetics and food formulations, a superoxide dismutase from Thermus filiformis (TfSOD) was cloned, expressed and characterized. The TfSOD showed cambialistic characteristics, once it had enzymatic activity with either manganese or iron as cofactor and thermostability until 80 ?C. The DNA sequencing produced a total of 9,680,471 paired reads and the produced assembly had an n50 = 85.2Kb, n90 = 17.1kb, the largest contig size = 275.5kb and total size of 2.46MB. Gene prediction resulted in 2,403 protein coding genes. In the transcriptome analysis, 97.1% of predicted protein coding genes showed detectable expression with RSEM values (RNA-Seq by Expectation-Maximization). Through the computational analysis of T. filiformis transcriptome 37% and 5.86% of the genes significantly different (p-value < 0.05) in the assays with different temperatures and with and without H2O2 were identified, respectivelly. In the total proteome analysis a total of 27.7% proteins were differentially expressed with a FDR (False Discovery Rate) < 0.05%, being 20% significantly different (p-value < 0.05, T-test) in the temperature assay and 28.3% proteins with a FDR (False Discovery Rate) < 0.05%, being 6% significantly different (p-value < 0.05, T-test) in the H2O2 assay. Some changes were observed in the carotenoid production according to the cultivation condition. Regarding to the carotenoid profile, the major carotenoids under conditions at 70 ?C (without and with H2O2) and at 77 ?C were thermozeaxanthin-15 and thermozeaxanthin-13 while at 63 ?C were thermozeaxanthin-15 and free-zeaxanthin. The sample cultivated at 70 ?C without H2O2 showed the highest amount of total carotenoid (1516 ?g/g of dry mass), on the other hand the sample with the highest antioxidant capacity was the one cultivated at 70 ?C with H2O2. The carotenoid rich extract of all conditions studied showed a peroxyl scavenging capacity higher than those carotenoid rich extracts from some fruits and from some carotenoid standards, demonstrating the potential applicability of T. filiformis extracts in industry. The results of this study show that the main processes affected by temperature change and addition of H2O2 were: catabolism, transcription and protein translation. It was also observed that the change in temperature has greater influence on the differential expression of genes and proteins than the H2O2 addition. Through trancriptome and proteome analysis of T. filiformis thermostable enzymes have been identified with potential industrial applications, such as alpha-amylases, alpha-galactosidases and esterases. Moreover, the extract rich in carotenoids of this bacterium had a greater peroxyl radical scavenging capacity than the capacity of fruit extracts and even carotenoids standards / Doutorado / Ciência de Alimentos / Doutora em Ciência de Alimentos

Spiders and scorpions are efficient predators arachnid (PA) consuming preys larger than themselves. Few studies reported, molecularly, the digestion in PA. This work describes a biochemical, transcriptomic and proteomic analysis of the midgut and midgut glands (MMG) and digestive juice (DJ) from Nephilengys cruentata and Tityus serrulatus MMG. Cathepsin L, B, D and F, legumain, trypsin, astacin, carbohydrases and lipases were identified by these approaches. Peptide isomerase and ctenitoxins, which are venom proteins were identified, showing a correlation among digestive and venom enzymes. Summarily, PA relies in multi peptidase system mainly constituted of astacins for extracellular prey liquefaction and cathepsin L for intracellular digestion, describing a molecular model for digestion. Probably, during evolution, gene duplication led a diversification of astacins in the derived groups of Arachnida, like spiders, distinctly from what is observed in basal groups like scorpions. These data on Arachnida digestion will allow detailed multi disciplinary studies. / Aranhas e escorpiões são aracnídeos predadores eficientes (AP) consumindo presas maiores que eles mesmos. Poucos estudos descrevem molecularmente a digestão em AP. Neste trabalho caracterizamos bioquimicamente, por transcriptoma e proteoma o intestino e glândulas digestivas (IGD) e suco digestivo (SD) de Nephilengys cruentata e o IGD de Tityus serrulatus. Catepsinas L, B, D e F, legumaína, tripsinas, astacinas, carboidrases e lipases foram identificadas. Peptídeo isomerase e ctenitoxina foram identificadas no IGD. Estas proteínas podem indicar uma correlação entre enzimas digestivas e do veneno. Portanto, AP apresentam várias peptidases principalmente astacinas para liquefazer a presa extraoralmente e catepsinas L para digestão intracelular, descrevendo um modelo molecular para a digestão. Provavelmente, durante a evolução, eventos duplicação gênica levaram à diversificação das astacinas aracnídeos derivados, como as aranhas, diferentemente dos grupos basais, como os escorpiões. Estes dados sobre a digestão em Arachnida permitirão estudos multidisciplinares.

O mamão papaia (Carica papaya L.) é uma fruta tropical de grande relevância comercial uma vez que o Brasil é o maior produtor mundial e terceiro maior exportador da fruta. Contudo, por ser uma fruta climatérica, tem uma vida pós-colheita limitada, devido ao rápido Amaciamento da polpa. Neste trabalho foi realizada uma investigação proteômica comparativa de polpa do mamão verde e maduro. Várias centenas de componentes protéicos (spots) foram resolvidos em géis 2-DE (faixa de pH 4-7) utilizando a eletroforese diferencial em gel (DIGE) e posteriormente as imagens geradas foram analisadas pelo programa PDQuest. Os spots diferencialmente expressos foram retirados do gel, digeridos e sequenciados (ESI-Q-TOF-MS/MS). Em geral, as proteínas diferencialmente expressas foram associadas ao metabolismo do etileno, resposta ao estresse, metabolismo de carbono e outros importantes processos fisiológicos. Os papéis de algumas das proteínas identificadas foram discutidos em relação à qualidade dos frutos do mamão. Este estudo fornece a primeira caracterização das mudanças no proteoma da polpa do mamão durante o amadurecimento. Deste modo a identificação de proteínas envolvidas na instalação ou desenvolvimento do amadurecimento pode contribuir para o entendimento deste processo e, também, gerar subsídios para avanços tecnológicos visando à qualidade e diminuição das perdas pós-colheita. / Papaya (Carica papaya L.) fruit is a relevant tropical crop since Brazil is the world\'s largest producer and third largest exporter of fruit. However being a climacteric fruit, has a limited green life due to the rapid pulp softening. We report here a comparative proteomic investigation of fruit pulp from unripe and ripe papayas. Several hundreds of protein components were resolved on 2-DE gels (pH range 4-7) using the differential gel electrophoresis (DIGE) approach, and images were analyzed by PDQuest. The variable components were excised, in-gel digested and were analyzed by ESI-Q-TOF-MS/MS. In general, the differentially expressed proteins were associated to ethylene metabolism, stress response, carbon metabolism and other important physiological processes. The roles of some of the identified proteins were discussed in relation to papaya fruit quality. To the best of our knowledge, this investigation provides the first characterization of the changes in papaya fruit pulp proteome during ripening. Thus the identification of proteins involved in the installation or development of the ripening may contribute to the understanding of this process and also provide subsidies for technological advances aimed at quality and reduction of post harvest losses.

O splicing alternativo é um processo no qual moléculas idênticas de pré-mRNA são processadas de diferentes formas. Ele é fundamental em organismos complexos, pois é responsável por criar uma ampla diversidade de proteínas a partir de um número relativamente pequeno de genes. Contudo, poucas proteínas advindas do splicing alternativo já foram identificadas, visto que a maioria dos espectros de espectrometria de massa em tandem (MS/MS) não encontra sequências correspondentes nos diversos bancos de dados de proteínas disponíveis. Entre diversos fatores, isso ocorre porque um número reduzido de eventos de splicing alternativo (ASEs) são conhecidos e devidamente estudados. Nesse trabalho, o espectro de eventos observáveis foi ampliado por meio da análise de eventos complexos de splicing alternativo (CASEs), que consideram múltiplos ASEs em um ou diferentes transcritos. Foi desenvolvido um novo método de análise utilizando expressões regulares (regexes) associada a uma sintaxe baseada em caracteres intuitivos. O método de análise e a sintaxe foram implementados em uma ferramenta web denominada de SPLOOCE (http://www.bioinformatics-brazil.org/splooce) que também apresenta ferramentas extras de análise. Adicionalmente, os subestimados eventos do tipo retenção de íntron (IR) foram explorados em busca de evidências funcionais por meio de análises de MS/MS. Como resultado, eventos bastante incomuns foram observados no proteoma humano, sugerindo que muito pouco ainda é conhecido sobre a complexidade transcriptômica e proteômica humana. Portanto, com base nesses dados, esse trabalho representa um grande avanço no estudo de fenômenos de splicing alternativo ainda pouco explorados. / Alternative splicing is defined, basically, as a process in which identical pre-mRNA molecules are processed in different ways in terms of usage of exon/introns borders. It is a fundamental process in complex organisms, and is responsible for creating a large diversity of proteins from a relatively small number of genes. However, just a few proteins resulted from alternative splicing were already identified, since only a small part of \\emph mass spectrometry (MS/MS) spetras match proteins in sequence databases. Among different factors, it occurs because a reduced number of alternative splicing events (ASEs) are known and properly studied. In this work, the landscape of observable events was amplified through the analysis of complex alternative splicing events (CASEs), which consider different ASEs within the same or different transcripts. A method of analysis was developed using regular expressions (regexes) associated with a syntax composed of intuitive characters. Those features were implemented in a web tool called SPLOOCE (http://www.bioinformatics-brazil.org/splooce) that also has extra analysis tools.Furthermore, the understudied events known as intron retention (IR) were explored using MS/MS analyses as a strategy to identify functional roles. As result, very uncommon events were observed in human proteome, suggesting that little is currently known about the complexity of the human proteome and transcriptome. Based on those data, it can be concluded that this work represents a significant advance in the study of uncommon and understudied alternative splicing events.

Lúpus eritematoso sistêmico (LES) é uma doença multisistêmica crônica e autoimune de etiologia desconhecida. O LES é considerado um fator de risco independente para eventos cardiovasculares em qualquer faixa etária. A coexistência de fatores de risco tradicionais e não tradicionais (alto nível plasmático de homocisteína) são as causas para o risco do desenvolvimento de doenças cardiovasculares (DCV) em portadores de LES. A hiperhomocisteinemia é considerada um fator de risco independente para DCV e cerebrovasculares e tem como causas fatores nutricionais, genéticos e fisiológicos. Proteína C reativa de alta sensibilidade (hs-PCR), fator de necrose tumoral-? (TNF- ?), interferon ?, MCP-1 (Monocyte Chemoattractant Protein- 1) e leptina tem sido descritos como importantes biomarcadores para DCV. Por outro lado, adiponectina e grelina tem sido retratadas como potentes protetores contra o desenvolvimento da aterosclerose. Parâmetros antropométricos aumentados também podem estar associados ao risco de DCV como aumento da espessura da camada íntima da carótida. O processo de inflamação crônica existente no LES está diretamente associado a alterações no perfil lipídico e no metabolismo de lipoproteínas. Análises em larga escala dos perfis de expressão de proteínas estão se tornando uma importante ferramenta na investigação de várias patologias associadas a resposta autoimune. Objetivos: Descrever e comparar medidas antropométricas, ingestão alimentar e proteoma plasmático em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico juvenil (LESJ) e controles saudáveis. Comparar metabólitos e antropometria entre dois clusters metabólicos de pacientes com LESJ (Lúpus Melhor Perfil Metabólico - LMPM e Lúpus Pior Perfil Metabólico - LPPM) e um cluster com controles saudáveis (Controle Melhor Perfil Metabólico) e, também, em dois clusters de pacientes com LESJ definidos pela dose diária de corticoide administrada. Métodos: Foram recrutadas 19 adolescentes portadoras de LESJ e 39 controles saudáveis. Foram mensurados índice de massa corporal (IMC), peso, estatura, circunferência da cintura (CC), ingestão alimentar (Recordatório de 24 horas), SLEDAI (Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index), SLICC (Systemic Lupus International Collaborating Clinics/American College of Rheumatology Damage Index), níveis plasmáticos de homocisteína, vitamina B12, 6 folato, TNF-?, hs-PCR, MCP-1, adiponectina, leptina, grelina, perfil lipídico e proteoma plasmático pela técnica Shotgun proteomics com Isobaric Tag for Relative and Absolute Quantitation. Os grupos foram comparados por ANCOVA. k-cluster foi usado para separar LESJ e controles em dois clusters extremos de melhor e pior perfil metabólico de acordo com os níveis plasmáticos de homocisteína, TNF-?, hsPCR e folato para a análise da proteômica. Resultados: Pacientes com LESJ apresentaram maior IMC, CC, homocisteína, triglicérides, TNF-?, hsPCR e menor folato plasmático quando comparados ao grupo controle. Foram encontradas 10 proteínas com expressão significativamente diferente entre os clusters: Cluster Lúpus Melhor Perfil Metabólico (LMPM), Cluster Lúpus Pior Perfil Metabólico (LPPM) e Cluster Controle Melhor Perfil Metabólico (CMPM) (? -2-macroglobulina, ? -1-antitripsina, apoliproteína AI, apoliproteína E, ceruloplasmina, complemento C3, fibrinogênio de cadeia ?, haptoglobina, hemopexina e sorotransferrina). Oito proteínas foram mais expressas no LMPM e menos expressas no LPPM comparados com CMPM. As proteínas menos expressas no LPPM foram negativamente correlacionadas com maior risco para DCV. Conclusão: O presente estudo mostrou que as adolescentes com LESJ apresentaram maior IMC, circunferência da cintura, concentrações séricas de homocisteína, triglicérides, TNF-?, hs-PCR e, menor estatura e concentração de folato sérico quando comparadas com adolescentes saudáveis. Além disso, o cluster LPPM apresentou uma expressão diminuída das proteínas apolipoproteína AI, apolipoproteína E, alfa-2- macroglobulina, alfa-1-antitripsina, ceruloplasmina, complemento C3, hemopexina e sorotransferrina quando comparado aos clusters CMPM e LMPM. Sendo assim, é possível concluir que o presente estudo sinaliza possíveis complicações cardiovasculares futuras em pacientes com LESJ e, sugerem a necessidade de novos estudos, a fim de elucidar a interação do estado nutricional e das proteínas encontradas pela proteômica no contexto de sistemas biológicos em pacientes com LESJ. / Systemic lupus erythematosus (SLE) is a, autoimmune, chronic and inflammatory disease of unknown etiology. SLE is considered an independent risk factor for cardiovascular diseases at any age. Reasons for the increased risk of CVD in SLE include the co-existence of traditional cardiac risk factors and nontraditional risk factors such as high concentrations of homocysteine. Elevated homocysteine (Hcy) levels is considered an independent risk factor for CVD. Hiperhomocysteine can indicate undernourishment due to a lack of vitamins or genetic alterations. Inflammatory biomarkers have been consistently associated with the presence of CVD in multiple studies from different populations, including SLE, such as high-sensitivity C-reactive protein (hs-CRP), tumor necrosis factor - ? (TNF - ?), type I interferon (IFN), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) and leptin. On the other hand, some cytokines and hormones are related to atherosclerosis prevention, such as adiponectin and ghrelin. The existing chronic inflammation process in SLE is directly associated with changes in lipid and lipoprotein metabolism. Some comprehensive studies have been conducted at multiple biological levels including DNA (or genomics), mRNA (or transcriptomics), protein (or proteomics) and metabolites (or metabolomics). The \'omics\' platforms allow us to re-examine SLE at a greater degree of molecular resolution. Objectives: To describe and compare anthropometric measurements, food intake, metabolites and plasma proteomic analysis in child-hood onset systemic lupus erythematosus (c-SLE) and healthy controls. To compare metabolites and anthropometric parameters between two clusters with c-SLE (lupus cluster with the best - LCBMP and the worst metabolic profile - LCWMP) and one cluster with controls (healthy cluster with the best metabolic profile - HCBMP) and to compare metabolites and anthropometric parameters between two clusters of c-SLE patients defined by daily corticosteroid doses intake. Methods: 19 c-SLE and 39 healthy volunteers were recruited. We evaluated BMI, weight, height, waist circumference, food intake through a 24-hours recalls, SLEDAI (Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index), SLICC (Systemic Lupus International Collaborating Clinics/American College of Rheumatology Damage Index), SLICC, serum levels of homocysteine, vitamin B12, 8 folate, TNF-?, hs-C reactive protein, monocyte chemoattractant protein-1, adiponectin, leptin, ghrelin, lipid profile and plasma proteomic by Shotgun proteomics with Isobaric Tag for Relative and Absolute Quantitation. The groups were compared by ANCOVA. k-cluster were used to separate SLE and control groups into two different clusters with the best and the worst metabolic profile according to homocysteine, TNF-?, hsCRP and folate plasma levels for proteomic assessment. Results: SLE patients presented higher BMI, WC, homocysteine, triglycerides, TNF-?, hsCRP levels and lower plasma folate when compared to controls. We found 10 proteins with significantly different expression between healthy cluster with the best metabolic profile (HCBMP) and lupus cluster with the best (LCBMP) and the worst metabolic profile (LCWMP) (alpha-2- macroglobulin; alpha-1-antitripsin, apoliprotein AI, apoliprotein E, ceruloplasmin, complement C3, fibrinogen ? chain, haptoglobin, hemopexin and serum transferrin). Eight proteins were higher expressed in LCBMP and lower expressed in LCWMP compared with HCBMP. Proteins less expressed in LCWMP were negatively correlated with a higher risk for cardiovascular disease. Conclusion: Our results described some previously cardiovascular risk factors in c-SLE patients and possible associations between nutritional status and cardiovascular disease risk factors. Proteomic results showed acute phase proteins and pro-inflammatory proteins more expressed in c-SLE patients compared to controls. These results might allow us to treat c-SLE with personalized diets to avoid cardiovascular complications in future. The small sample size and the cross-sectional design were the limitations of the study, but it is a rare disease in the pediatric field and, despite this fact, the present study was able to characterize two distinct nutritional and metabolic groups with uncommon proteins expressed. These results deserve further investigations to better elucidate the whole of these proteins in the context of systems biology interactions in SLE pediatric patients.

Carrapatos da espécie Rhipicephalus (Boophilus) microplus causam enormes prejuízos à saúde e à produção animal. Sendo um ectoparasita hematófago, o carrapato espolia seu hospedeiro e transmite doenças. Seu parasitismo é mediado por sua saliva, que inibe as reações homeostáticas do hospedeiro à injúria local causada por sua picada. Seus hospedeiros montam respostas imunes contra esse parasita, incluindo a resposta imune mediada por anticorpos, indicando que o controle imunobiológico é possível. Contudo, o complexo farmacológico da saliva do parasita é composto por proteínas solúveis que são sabidamente pouco ou nada imunogênicos se não forem introduzidos no hospedeiro com adjuvante ou na foram agregada. Assim, dificilmente induziriam imunidade nos hospedeiros. Bovinos apresentam fenótipos contrastantes e herdáveis quanto à intensidade de infestações com carrapatos. Carrapatos alimentados em bovinos resistentes não completam a refeição de sangue, apresentando menor eficiência reprodutiva. É possível que esse desfecho seja devido à capacidade do hospedeiro resistente, mas não do suscetível, de produzir anticorpos que neutralizam componentes salivares do carrapato cruciais para realize a hematofagia. É necessário, portanto, examinar essa possibilidade. Os resultados obtidos também podem ajudar a identificar antígenos úteis para formular uma vacina anti-carrapato. Para estabelecer quais componentes salivares são reconhecidos pelos dois fenótipos de hospedeiros empregamos uma soroteca composta por soros obtidos de bovinos resistentes e suscetíveis ao carrapato em diferentes estágios do ciclo do parasito (larva, ninfa e adulto) e após uma, duas ou três ciclos de infestações. Os soros foram empregados individualmente e em forma de pools para imunodetecção por western blot de proteínas presentes em extrato de larvas não-alimentadas, saliva e glândulas salivares de fêmeas de R. microplus e separadas em uma e duas dimensões. Os resultados obtidos nos western blots 1D de saliva e de extrato de larvas não alimentadas mostraram que houve um reconhecimento diferencial dos antígenos parasitários pelos soros dos animais resistentes e suscetíveis. Os soros dos animais resistentes quando ainda eram livres de infestações (i.e., naïve) ou quando infestados com a forma larval reconheceram com maior freqüência e/ou exclusivamente certas bandas de proteínas. Resultados semelhantes foram vistos nos western blots de géis 2D de saliva e glândulas salivares de fêmeas, onde os soros dos animais resistentes ainda não infestados (i.e., naïve) reconheceram vários spots presentes nessas amostras e soros de animais resistentes infestados reconhecerem spots de forma exclusiva. Também foi observado que, apesar dos hospedeiros suscetíveis estarem expostos a grande quantidade de saliva, os soros desses animais não reconhecem um número maior de spots que os hospedeiros infestados resistentes. Por outro lado, a maioria das proteínas salivares não é reconhecida pelos hospedeiros infestados, sejam resistentes ou suscetíveis. Esses resultados indicam que os hospedeiros bovinos resistentes reconhecem de forma mais precoce que os bovinos suscetíveis certos componentes parasitários. Essa capacidade pode estar relacionada ao fenótipo de resistência ao carrapato / The cattle tick, Rhipicephalus (Boophilus) microplus, causes enormous losses to animal health and production. Since it is a hematophagous parasite the tick expoliates its hosts and transmits diseases. Parasitism by the tick is mediated by its saliva, which inhibits the hosts local homeostatic reactions to its bite. Hosts mount immune responses against this parasite, including antibody-mediated responses, indicating that the immunobiological control of ticks is possible. However, the pharmacological complex of saliva is composed of soluble proteins, which are known to be incapable of eliciting antibody responses if they are not introduced into the host with adjuvant or in aggregated form. Thus, salivary proteins may not be able to induce immunity in hosts. Bovines present contrasting, heritable phenotypes for tick infestations. Ticks fed on resistant hosts are unable to complete a blood meal and present a decrease in reproductive immunity. It is possible that this outcome is caused by an ability of the resistant host to produce antibodies that neutralize salivary components that are crucial to blood feeding. It is necessary, therefore, to examine this possibility. The results will also assist in the identification of protective antigens to formulate an anti-tick vaccine. In order to establish which salivary components are recognized by the two types of host phenotypes, a collection of sera derived from resistant and susceptible bovines infested one, two and three times with different developmental stages of the parasite (larvae, nymphs and adults) was employed to detect which proteins were recognized in western blots of saliva and extracts of salivary glands and unfed larvae. Western blots of tick proteins (saliva and extracts of unfed larvae) separated in one dimension showed that antigens were differentially recognized by resistant and susceptible bovines. Sera from resistant bovines still naïve or infested with larvae recognized certain protein bands exclusively or more frequently than similar sera from susceptible bovines. Similar results were seen in western blots of proteins from saliva and extracts of salivary glands separated in two dimensions, where sera from naïve, resistant bovines recognized several spots and sera from infested, resistant bovines recognized several spots exclusively. In spite of the fac that susceptible hosts are exposed to greater amounts of tick saliva, sera from these animals did not recognize a greater amount of spots than those from resistant bovines. On the other hand, the great majority of spots is not recognized by any of the different sera, be they from resistant or susceptible hosts. These results indicate that resistant bovines are able to recognize parasitic proteins earlier than susceptible bovines. This ability may, in turn, affect expression of salivary components that are crucial for the tick and may explain the phenotypes of tick infestations in bovines.

Há muito tempo os venenos de abelhas se tornaram objeto de interesse de muitos cientistas, principalmente os venenos daquelas linhagens do gênero Apis, chamadas abelhas europeias e as conhecidas abelhas africanizadas. O foco no desenvolvimento de terapias eficazes que pudessem prevenir ou frear as reações desencadeadas pelas toxinas dos venenos desses insetos foi o principal estimulador do surgimento dessa grande área da pesquisa, uma vez que esses animais causam um grande número de acidentes em animais e seres humanos e os acidentes podem desencadear graves consequências, inclusive óbito. Sendo assim, desenvolvemos o presente trabalho baseado na caracterização da composição proteica dos venenos de abelhas europeias e africanizadas, na análise quantitativa diferencial entre os venenos e, na investigação de fosforilações e a possível relação das mesmas com as funções biológicas. Reunindo todos os elementos que estavam ao nosso alcance para compor o melhor conjunto de etapas para a realização do estudo proteômico de venenos de abelhas, nós atingimos todos os objetivos propostos. Utilizando uma abordagem baseada em espectrometria de massas, consistindo de análise shotgun seguida de LC-MS/MS realizada em um dos mais modernos espectrômetros de massas, nós fomos capazes de obter resultados extremamente confiáveis e interessantes. Comparando-se o efeito da extensão do gradiente de separação na cromatografia líquida, nós fomos capazes de atingir uma maior cobertura da amostra, uma vez que identificamos um maior número de proteínas após a utilização do gradiente mais longo. A identificação de fosforilações foi favorecida pela combinação de fragmentação por \"Colisão Induzida por Dissociação\" e medidas de massa de alta acurácia realizadas no instrumento LTQ-Orbitrap-Velos. Enquanto apenas 29 proteínas foram identificadas após 120 minutos de separação cromatográfica, um total de 51 proteínas foram identificadas aplicando-se gradiente mais longo. Dentre as 51 proteínas totais, 42 são comuns aos venenos das três abelhas. A comparação em pares mostrou que os venenos das abelhas europeias compartilham 44 proteínas e os venenos das abelhas africanizadas compartilham 43 proteínas tanto com o veneno de A. m. carnica quanto com o de A. m. ligustica. Além disso, nós revelamos que existem diferenças quantitativas entre algumas das proteínas dos venenos, sendo muitas dessas proteínas diferenciais toxinas com funções conhecidamente relevantes. A investigação de fosforilação mostrou que duas toxinas apresentam-se na forma fosforilada: melitina e icarapina. Melitina é considerada a principal toxina de venenos de abelhas, sendo bem conhecida por sua ação altamente tóxica e alergenicidade. Este peptídeo foi identificado com fosforilação ocorrendo no sítio Ser18 em todas as amostras de venenos, enquanto somente no veneno da abelha africanizada foi também identificado com sítio de fosforilação no resíduo de Thr10. Icarapina, também já descrita como um alérgeno do veneno, apresentou sítio de fosforilação no resíduo Ser205. Por fim, nós demonstramos o efeito da fosforilação presente em melitina (Ser18) realizando ensaios de atividade biológica do peptídeo fosforilado e nativo, como: hemólise, lise celular e desgranulação de mastócitos e atividade quimiotáctica. Foi observado que a toxicidade do peptídeo fosforilado é reduzida em comparação ao do peptídeo nativo. Sendo assim, nós podemos concluir que a combinação de metodologias eficientes e a utilização de moderna instrumentação nos levou a resultados surpreendentes, os quais se somam a todo o conhecimento já existente acerca de venenos de abelhas / Honeybee venom toxins disturb the activity of critical cellular processes, triggering immunological, physiological, and neurological responses within victims. Studies on venom toxins have provided invaluable knowledge towards elucidating the molecular and functional details of their biological targets, yet there has been no report of a full proteome/phosphoproteome profile of honeybee venom. In this study, we focused on Apis mellifera honeybee venom characterization, including proteins identification, label-free quantitative analysis and phosphorylation identification. Making use of a MS-based proteomic approach, consisting on in-solution digestion followed by LC-MS/MS analysis, we were able to compare the effect of the liquid chromatography gradient length on the sample coverage, consequently, to identify a higher number of proteins using longer separation gradient of the tryptic peptides. Favorable identification of phosphorylations was achieved by the application of a long separation gradient combined with CID fragmentation and high accuracy mass measurement using an LTQ Orbitrap Velos. Here we report on the comparative shotgun proteomics study of the venoms of two Apis mellifera subspecies, A. m. carnica and A. m. ligustica, and the hybrid known as Africanized honey bee (AHB). We identified 51 proteins in total, with 42 of them being common among the three venoms, including many previously unidentified entries. Performing label-free quantification, we observed that few proteins were found with different relative amounts. Additionally, we revealed the phosphorylation of two proteins in all the samples, with two of them being HBV toxins/allergens: melittin and icarapin. Icarapin was identified as phosphorylated at 205Ser. Melittin was identified as phosphorylated at the 18Ser and 10Thr positions in all venoms, as well. Given these novel findings, we then chose to compare the toxicity of the phosphorylated/unphosphorylated forms of the major venom toxin, melittin, considering the most prominent phosphorylation event, the phosphorylated 18Ser position. We showed that the toxicity is in fact decreased when the peptide is phosphorylated. Based on a combination of efficient methodology and state-of-the-art instrumentation, delineated by our Shotgun-NanoESI-Long Gradient-LTQ Orbitrap Velos analysis, we achieved proteomic coverage far surpassing any previous report. Together, these discoveries pave the way for future phosphovenomic studies

As peçonhas ofídicas apresentam uma grande diversidade de componentes proteicos e estes podem variar dependendo de diversos fatores, como espécie, hábitos alimentares e comportamentais, ontogenia e até mudanças sazonais. Este alto grau de variabilidade pode levar a mudanças na fisiopatologia do envenenamento ofídico. No Brasil, as serpentes da espécie Crotalus durissus são capazes de habitar várias regiões do país e sua peçonha está sujeita a variabilidade, levando a uma grande dificuldade no tratamento do envenenamento, que é realizado por infusão do soro antiofídico. O estudo proteômico permite conhecer os componentes expressos pela glândula de peçonha. Sendo assim, este trabalho teve como objetivos realizar uma análise comparativa das diferenças intraespecíficas na composição proteica das peçonhas de 22 espécimes de Crotalus durissus collilineatus através de técnicas ômicas, avaliar a capacidade neutralizante do soro antiofídico produzido pelo Instituto Butantan contra essas peçonhas, avaliar a atividade hialuronidásica de cada peçonha e comparar as alterações bioquímicas e imunológicas de camundongos após o envenenamento crotálico experimental. Para isto, as peçonhas de 22 serpentes da espécie C. d. collilineatus, da região de Catalão - GO, foram fracionadas em uma coluna de fase reversa C-18 acoplada a um sistema de cromatografia líquida rápida de proteínas e analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida e métodos de espectrometria de massas. Inicialmente, foi observado que as peçonhas destas 22 serpentes variaram entre as cores branca e amarela. Os perfis cromatográficos foram semelhantes, entretanto, apresentaram diferenças qualitativas e quantitativas significativas de alguns componentes, por exemplo, apenas duas das peçonhas apresentaram a proteína crotamina. Outros componentes previamente relatados em outros estudos também foram identificados, como, o complexo da crotoxina, serinoproteases, metaloproteases e convulxina. Pela primeira vez foi possível evidenciar por técnicas proteômicas alguns componentes para a subespécie C. d. collilineatus, como: fator de crescimento neural, enzima conversora de angiotensina, fosfodiesterase, 5\'-nucleotidase, carboxipeptidase, glutaminil ciclase, glutationa peroxidase, NADH desidrogenase e fosfolipase B. Através do método de ELISA, constatou-se que o soro anticrotálico produzido pelo Instituto Butantan foi capaz de reconhecer todas as peçonhas utilizadas, embora algumas frações isoladas não tenham sido reconhecidas com tanta eficácia. A atividade hialuronidásica também foi avaliada, evidenciando que as peçonhas de algumas serpentes não apresentaram atividade detectável desta enzima. Por fim, o envenenamento crotálico experimental em camundongos Balb/c revelou que peçonhas diferentes são capazes de produzir alterações bioquímicas e imunológicas distintas. Assim, as vítimas do envenenamento podem necessitar de tratamentos diferenciados. Este trabalho mostrou que existem variações intraespecíficas importantes nas peçonhas de C. d. collilineatus, sendo que algumas podem ser mais miotóxicas que outras, evidenciadas por induzirem grandes aumentos dos níveis de creatina quinase. Além disso, este estudo proteômico revelou a presença de novos componentes proteicos na peçonha de C. d. collilineatus, contribuindo significativamente para o conhecimento de sua composição. Adicionalmente, estes dados indicam que quanto mais diversificado for o pool de peçonhas utilizado para a imunização de cavalos, melhor será o soro anticrotálico produzido, de forma que o único tratamento para este acidente seja ainda mais eficaz. / Snake venoms present a wide variety of protein components and these can vary depending on several factors such as species, eating and behavioral habits, ontogeny and even seasonal changes. This high degree of variability can lead to changes in the pathophysiology of snake bite envenoming. In Brazil, snakes of the species Crotalus durissus are capable of inhabiting various regions of the country and its venom is subject to variability, leading to a high difficulty in treating envenoming, which is performed by the infusion of an antivenom. Proteomic studies allow the knowledge of the components expressed by the venom gland. Thus, this study aimed to perform a comparative analysis of intraspecific differences in the protein composition of the venoms of 22 specimens of Crotalus durissus collilineatus through omics techniques, to evaluate the neutralizing capacity of antivenom produced by Instituto Butantan against these venoms, to evaluate the hyaluronidase activity of each venom and to compare the biochemical and immunological changes of mice after experimental crotalic envenoming. In this way, the snake venoms of the 22 species of C. d. collilineatus, from Catalão - GO region, were fractionated on a reverse phase column C-18 coupled to a fast protein liquid chromatography system and analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis and mass spectrometry methods. Initially, it was observed that the venoms of these 22 snakes varied between white and yellow colors. The chromatographic profiles were similar, however, presenting significant qualitative and quantitative differences of some components, for example, only two venoms showed the protein crotamine. Other components previously reported in other studies were also identified, such as crotoxin, serine proteases, metalloproteases and convulxin. For the first time, it was possible to demonstrate, by proteomic techniques, some components not found thus far in the subspecies C. d. collilineatus, such as nerve growth factor, angiotensin converting enzyme, phosphodiesterase, 5\'-nucleotidase, carboxypeptidase, glutaminyl cyclase, glutathione peroxidase, NADH dehydrogenase, and phospholipase B. By ELISA method, it was found that the crotalic serum produced by the Instituto Butantan was able to recognize all the venoms used, although some isolated fractions have not been recognized effectively. The hyaluronidase activity was also evaluated, showing that the venom of some snakes do not presented detectable activity of this enzyme. The experimental crotalic envenoming in Balb/c mice revealed that different venoms are able to produce different biochemical and immunological changes. Thus, the victims of envenoming may need different treatments. This study demonstrated that there are significant intraspecific variations in the venom of C. d. collilineatus, and some of them may be more myotoxic than others, evidenced by an increasing of creatine kinase levels. Furthermore, the proteomic study revealed the presence of new protein components in the venom of C. d. collilineatus, significantly contributing to the knowledge of its composition. In addition, these data indicate that the more diverse the pool of the venoms used for the immunization of horses, better will be the anticrotalic serum produced, so that the only treatment for this accident will be even more effective