Nas secreções glandulares de anfíbios, muitos dos compostos isolados apresentam ação antifúngica e/ou antibacteriana, cuja função é protegê-los contra infecções, uma vez que estes animais habitam ambientes inóspitos. Os peptídeos têm-se destacado dentre os compostos com atividade antimicrobiana isolados de venenos de diversos animais. Além disso, compostos de natureza não proteica presentes nestas secreções têm demonstrado ação antimicrobiana. O objetivo deste estudo foi, primeiramente, isolar e caracterizar, estruturalmente, compostos com atividade antifúngica relevante. Em um segundo momento, foi realizar um estudo comparativo, através de técnicas ômicas, dos compostos presentes nas secreções das glândulas mucosas e parotoides. Os ensaios antimicrobianos, in vitro, foram realizados com fungos, leveduras e bactérias. O material de baixa massa molecular da água de diálise das secreções das glândulas parotoides apresentou atividade antimicrobiana sobre, principalmente, os fungos filamentosos. Este mesmo material foi submetido a uma filtração em gel, resultando em 11 frações as quais foram testadas contra Microsporum canis no ensaio de diluição seriada. A fração 9 mostrou atividade antifúngica e foi submetida a uma cromatografia de fase reversa, resultando em 9 frações, as quais foram testados contra M. canis. Destas frações, as frações 1 e 9 demonstraram, respectivamente, atividade fungicida e fungistática contra M. canis. No segundo momento, as secreções de ambas as glândulas foram analisadas por nanocromatografia líquida de ultra eficiência acoplada a um espectrômetro de massas de alta resolução. Desta análise, foram obtidos 11.034 compostos, distribuídos entre as secreções de ambas as glândulas. Todos os íons obtidos foram fragmentados (MS/MS) e submetidos à análise no programa PEAKS 6. Foram obtidas 511 sequências de peptídeos e/ou sequências parciais de proteínas das secreções das glândulas mucosas, enquanto que para as secreções das glândulas parotoides foram obtidas 110 sequências. Nas secreções das glândulas mucosas, a maior parte das sequências de aminoácidos são de compostos com massas moleculares entre 1 e 3 kDa, o que corresponde a 82% das sequências obtidas. Já para as secreções das glândulas parotoides, a maioria das sequências de aminoácidos são correspondentes aos peptídeos/proteínas com massas moleculares entre 1 e 2 kDa, o que representa 55% do total de sequências obtidas para esta secreção. As sequências foram analisadas pelo BLAST e revelou que um peptídeo presente nas secreções das glândulas parotoides apresenta 66,7% de identidade com o peptídeo antimicrobiano conhecido como ponericin-G2. Entre as sequências encontradas para as secreções das glândulas mucosas, o destaque foi para o precursor do peptídeo brevinin-1, com identidade de 31,2%. Todas as frações obtidas da filtração em gel das secreções das glândulas mucosas e parotoides foram direcionadas à análise por espectrometria de massas MALDI-TOF, o que resultou em maiores informações sobre a natureza dos compostos presentes nestas frações. A fração 8 das secreções das glândulas mucosas foi fracionada por cromatografia de fase reversa, resultando em 7 frações denominadas Pep1-Pep7. O composto denominado Pep7 teve sua massa molecular (6,012 kDa) determinada através da espectrometria de ressonância ciclotrônica de íons por transformada de Fourier com ionização por electrospray. Os peptídeos Pep4, Pep6 e Pep7 foram sequenciados pelo método de degradação de Edman. Estes peptídeos mostraram identidades com peptídeos antimicrobianos das famílias das tigerinin, shepherin e microcin e brevinins, respectivamente. Este estudo demonstrou que há compostos com atividade antimicrobiana significativa nestas secreções, principalmente para fungos filamentosos. Além disso, foi o primeiro a fazer uma análise comparativa dos compostos presentes nas secreções das glândulas mucosas e parotoides de R. schneideri, destacando a presença de peptídeos antimicrobianos / In amphibian glandular secretions, many of the isolated compounds have antifungal and/or antibacterial action, whose function is to protect the animal against infections, since they usually inhabit inhospitable environments. Peptides have been highlighted among antimicrobial compounds isolated from several venomous animals. In addition, non-proteic compounds present in these secretions have demonstrated antimicrobial action. The aim of this study was to isolate and structurally characterize antifungal compounds from Rhinella schneideri parotoid and mucous secretions. Moreover, in this study it was also performed a comparative study of the composition of mucous and parotid gland secretion by omics techniques. The low molecular weight material from parotoid gland secretion showed antimicrobial activity against filamentous fungi and bacteria. The low molecular weight material that showed antimicrobial activity was subjected to gel filtration, resulting in 11 fractions that were tested against Microsporum canis in serial dilution assay. The fraction 9 showed antifungal activity and it was subjected to a reversed phase chromatography, resulting in 9 fractions, which were tested against M. canis. Among them, fraction 1 and 9 showed fungicidal and fungistatic activity against M. canis, respectively. Gland secretion and the respective low molecular weight material were subjected to gel filtration and, each obtained fraction was analyzed by SDSTricine- PAGE. Secretion of the both glands were also quantitatively analyzed by nano ultraperformance liquid chromatography hyphenated to a high-resolution mass spectrometer. It was obtained 6,460 compounds distributed among secretions of both glands. All obtained ions were fragmented (MS/MS) and analyzed by PEAKS 6 program. 511 sequences were obtained from mucous gland secretion, against 110 sequences from parotoid gland secretion. In mucous gland secretion, most of the amino acid sequences (82%) are compounds with molecular masses between 1 and 3 kDa, while for parotoid gland secretion, most of sequences (55%) correspond to peptides/proteins with molecular masses between 1 and 2 kDa. Sequences were analyzed by BLAST, reveling a peptide in parotoid gland secretion that presents 66.7% of identify with an antimicrobial peptide known as ponericin-G2. Among sequences found in mucous gland secretion, the highlight was to one presenting 31.2% of identify with brevinin-1 precursor. All fractions obtained from gel filtration of the mucous and parotoid gland secretions were analyzed by MALDI-TOF mass spectrometry, which resulted in more informations about the nature of the compounds present in these secretions. Fraction 8 from mucous gland secretion was fractionated by reversed phase chromatography on C18 column, resulting in seven fractions denominated Pep1-Pep7. Pep7 presented a molecular mass of 6.012 kDa when analyzed by Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. In this analysis, six precursor ions were identified, but no sequence was obtained. Pep4, Pep6 and Pep7 were sequenced by Edman degradation method. These peptides showed identity with tigerinin, shepherin and microcin and brevinins, respectively. This study revealed compounds with significant antimicrobial activity in the analyzed secretions, especially to filamentous fungi. In addition, it was the first to perform a comparative analysis of compounds present in mucous and parotoid gland secretion from R. schneideri toad, highlighting the presence of antimicrobial peptides

As proteína quinases C (PKC) pertencem à família das serina/treonina quinases, que vem sendo apontadas como importantes enzimas para os processos de proliferação e diferenciação das células tronco embrionárias (CTE), todavia, a função exata de cada isoforma dessa família ainda não está clara. Dados anteriores do nosso laboratório indicam que dentre as PKCs expressas em CTE, formas cataliticamente ativas da PKCβI são altamente expressas no núcleo das CTE murinas. Estas ao se diferenciarem expressam essa quinase no seu citoplasma ou deixam de expressar a mesma, e que a maioria dos alvos da PKCβI em CTE indiferenciada estão envolvidos em processos de regulação da transcrição de proteínas envolvidas em processos de proliferação/ diferenciação. Dando continuidade aos resultados anteriores do laboratório, no presente trabalho, com técnicas de proteômica e fosfoproteômica identificamos outros alvos nucleares da PKCβI em CTE indiferenciadas. Vimos que de fato inibindo-se a PKCβI diminuiu-se a fostorilação de fatores envolvidos com a indiferenciação das CTE. Dentre os alvos da PKCβI encontramos a proteína adaptadora, TIF1 que recruta proteínas remodeladoras de cromatina. Essa proteína é essencial para a manutenção do estado indiferenciado das CTE. In vitro a PKCβI foi capaz de fosforilar a TIF1β e inibindo-se a PKCβI por RNAi vimos uma diminuição na expressão da TIF1β e no fator de indiferenciação Nanog cuja expressão já foi demonstrada ser regulada pela TIF1β. Além disso vimos que inibindo-se a PKCβI com o peptídeo inibidor da PKCβI aumentou a expressão de proteínas reguladas pelo c-Myc. E que o RNAi para a PKCβI aumentou a expressão de proteínas que regulam a expressão do c-Myc. Não vimos nenhum efeito na fosforilação ou expressão do c-Myc após a inibição da PKCβI o que sugere que a PKCβI ative proteínas repressoras do c-Myc. Nossos estudos sugerem que a PKCβI regula a manutenção do estado indiferenciado das CTE regulando a expressão e atividade da Tif1β um possível alvo direto da PKCβI. Levando a modificações da cromatina e regulação da expressão de genes que mantém as CTE indiferenciadas. Outro ponto de regulação da PKCβI parece ser a nibição da atividade de c-Myc o que seria importante para a manutenção do estado indiferenciado visto que o c-Myc é um amplificador das vias de sinalização que mantém as células proliferando. Desta forma a PKCβI parece ter um papel central na regulação da expressão gênica de CTE à nível de modificações epigenéticas e a nível transcricional mantendo as CTE indiferenciadas. / The Protein kinase C (PKC) family of serine/treonine kinases, are being described as important enzymes for proliferation and diferentiation of embryonic stem cells (ESC), however, the exact function of the different isoenzymes of this family still is unclear. Previous data from our laboratory indicates that amongst the PKCs expressed in ESC, catalytically active forms of PKCβI are highly expressed in nucleus of murine ESC. When these cells differentiate this kinase can be found in the cytoplasm or not expressed at all, and that the majority of PKCβI targets in undifferentiated ESC are involved in the regulation of proteins involved in transcription of proteins involved in proliferation/ diferentiation. Continuing our previous work herewith using proteomics and phosphoproteomics techniques we identified other nuclear PKCβI targets in undifferentiated ESC. We indeed saw that inhibiting PKCβI decreased the phosphorylation of factors involved with maintainance of the undifferentiated state of ESC. Amongst the targets of PKCβI we found the adaptor protein, TIF1βI, that recruits cromatin remodeling proteins. This protein is essential for the maintenance of the undifferentiated state of ESC. In vitro PKCβI phosphorylated TIF1β and inhibiting PKCβI with RNAi decreased the expression of TIF1β and of the undifferentiation factor Nanog whose expression has been shown to be regulated by TIF1β. We also saw that inhibiting PKCβI with a peptide inhibitor increased the expression of proteins regulated by c-Myc, and that RNAi for PKCβI increased the expression of proteins that regulate the expression of c-Myc. We did not see any effect on the phosphorylation or expression of c-Myc after inhibition of PKCβI suggesting that PKCβI activates c-Myc repressor proteins. Our studies sugest that PKCβI regulates the maintenance of the undiferentiated state of ESC regulating the expression and activity of Tif1β a possibly a direct target of PKCβI, leading to chromatin modifications and regulation of genes that maintain ESC undiferentiated. Another form of regulation of PKCβI seems to be by inhibiting the activity of c-Myc which is importante to maintain ESC undifferentiated since c-Myc is na an amplifyer of signaling patheways that maintain ESC proliferating. Together PKCβI has a central role in the regulation of the gene expression of ESC at the level of epigenetic modifications and transcriptional regulation

A falta de consenso na literatura acerca dos efeitos tóxicos do chumbo no sistema auditivo é notória, tanto em estudos clínicos quanto experimentais. Em adição, tem sido relatado que o ferro apresenta um efeito protetor na toxicidade cerebral causada pelo chumbo. Assim, estudos clínicos e bioquímicos têm sido realizados no intuito de compreender a relação entre o chumbo e o sistema auditivo, bem como identificar possíveis substâncias protetoras para a toxicidade deste metal. Neste sentido, no presente estudo verificou-se o processo maturacional do nervo auditivo e tronco encefálico, associado à análise proteômica da porção auditiva do tronco encefálico de ratos expostos a acetato de chumbo e suplementados com sulfato ferroso. O experimento foi realizado por seis semanas com 30 ratos (Rattus norvergicus, variedade Wistar) machos, recém-desmamados, divididos em seis grupos de cinco animais cada, sendo um controle, que recebeu água deionizada; dois grupos experimentais que receberam 100 mg/L de Pb(CH3COO)2 na água de beber, sendo administrado simultaneamente para um deles 20 mg/kg de FeSO4 a cada dois dias; dois grupos que receberam a dose de 400 mg/L de Pb (CH3COO)2 na água de beber, onde para um deles foi administrado simultaneamente 20 mg/kg de FeSO4 a cada dois dias e um grupo experimental que recebeu água deionizada e uma solução de 20 mg/kg de FeSO4 a cada dois dias. O processo maturacional do sistema auditivo foi verificado por meio da análise do Potencial Evocado Auditivo de Tronco Encefálico (PEATE) em dois momentos distintos, antes e depois da exposição ao chumbo. Os animais foram então sacrificados, coletado sangue e removido o tronco encefálico. A concentração de chumbo no sangue e tronco encefálico, apresentou um efeito dose-resposta, confirmado pela alta correlação entre a concentração nos dois compartimentos (r2=0,905, p<0,0001), tendo o sulfato ferroso reduzido a concentração de chumbo no sangue e no tecido, embora a diferença só tenha sido significativa para o sangue grupo que recebeu 100 mg/L de Pb(CH3COO)2). Com relação ao PEATE observou-se diferença estatisticamente significativa para o interpico I-II (p=0,049) nos grupos experimentais 100 mg/L Pb(CH3COO)2 e 400 mg/L Pb(CH3COO)2 e interpico I-IV, quando comparados os grupos 100 mg/L Pb(CH3COO)2 e 100 mg/L Pb(CH3COO)2 + FeSO4 (p=0,033). A análise proteômica apontou uma diminuição considerável no número de spots proteicos detectados em todos os grupos experimentais em relação ao controle, bem como uma redução na expressão do padrão proteico. Assim, o presente estudo reforça a hipótese do papel deletério do chumbo nas dosagens de 100 e 400 mg/L de Pb (CH3COO)2 na maturação do nervo auditivo e região do núcleo coclear, com possível efeito protetor do ferro. A análise proteômica do tronco encefálico de ratos demonstrou que o acetato de chumbo altera a expressão proteica desta estrutura, contudo o efeito protetor do sulfato ferroso não foi confirmado nas proteínas identificadas. / There is a lack of consensus in the literature about the toxic effects of lead in the auditory system, both in clinical and experimental studies. In addition to that, it has been reported that iron has a protective effect on brain toxicity caused by lead. Therefore, clinical and biochemical studies have been carried out to understand the relationship between Pb and the auditory function, as well as if the ferreous sulfate as an otoprotectant. In this study the maturational process of the auditory nerve and brainstem and the proteomic profile of the auditory portion of the brainstem of rats exposed to lead and supplemented with iron were evaluated. The experiment was carried out for six weeks with 30 wealing rats (Rattus norvegicus, Wistar), divided into six groups of five animals each: a control group that received deionized water; two experimental groups receiving 100 mg/L Pb(CH3COO)2 in drinking water, being given 20 mg/kg FeSO4 simultaneously to one of them every two days; two groups received 400 mg/LPb(CH3COO)2 in drinking water, where to one of them was given 20 mg/kg FeSO4 simultaneously every two days; and an experimental group that received deionized water and a solution of 20 mg/kg FeSO4 every two days. The maturational process of the auditory system was verified by analyzing the Brainstem Auditory-Evoked Potential (BAEP) at two different times, before and after lead exposure. The animals were sacrificed, their blood collected and brainstem removed. The concentration of lead in blood and brain stem showed a dose-response, confirmed by correlation between the concentration in the two compartments (rr2 = 0.905, p <0.0001). Ferreous sulfate reduced the levels of lead in blood and tissue, although the difference was only significant for blood (group receiving 100 mg/L Pb(CH3COO)2). Concerning to BEAP we observed a statistically significant difference for the interpeak I-II (p = 0.049) in the experimental groups 100 and 400 mg/L Pb(CH3COO)2 and for the interpeak I-IV, when groups 100 and 100 mg/L Pb(CH3COO)2 + FeSO4 were compared (p = 0.033). The proteomic analysis showed a considerable decrease in the number of protein spots detected in all experimental groups compared to control, as well as a reduction in the expression pattern of the proteins. Thus, the present study reinforces the hypothesis of deleterious role of Pb in dosages of 100 and 400 mg/L Pb(CH3COO)2 in the maturation of the auditory nerve and cochlear nucleus region, with a possible protective effect of ferreous sulfate. The proteomic analysis of the brainstem of rats showed that lead acetate alters protein expression of this structure. However, the protective effect of ferreous sulfate was not confirmed for the identified proteins.

Controlar a proliferação celular de tumores é um objetivo que vem sendo perseguido há décadas, com moderado sucesso na maioria dos casos. Dentre os diversos tipos de tumores que atingem a humanidade, alguns gliomas são considerados os mais fatais, por haver pouca ou nenhuma alternativa de tratamento efetivo. Agentes que apresentam propriedades anti-tumorais, como glicocorticóides (GC) e a forma all-trans do ácido retinóico (ATRA) são utilizados como adjuvantes no tratamento de alguns tipos de glioma. Entretanto, apesar de serem moléculas bastante conhecidas, pouco se sabe sobre seu mecanismo de ação como anti-tumoral. Para endereçar este problema, nosso laboratório se propôs a isolar e caracterizar genes regulados por estes agentes, utilizando modelos celulares, como as linhagens C6 e ST1 de glioma de rato, e as linhagens T98G e A172 de glioma humano. A linhagem C6 apresenta características de células transformadas e tumorais em cultura, e responde a GC, ou ATRA, com inibição de crescimento e achatamento celular. A linhagem ST1, variante derivado da C6, é hiper-responsiva ao tratamento com GC e, aparentemente, mais responsiva ao tratamento com ATRA, passando por um processo de completa reversão fenotípica tumoral-normal, devido ao expressivo aumento do tempo de dobramento, diminuição da densidade de saturação, recuperação da dependência de fatores de crescimento presentes no soro fetal bovino e da dependência de ancoragem para proliferação e perda do potencial tumorigênico, além de sofrer alterações morfológicas, como um maior achatamento celular e reorganização em feixes paralelos, que a aproximam do fenótipo normal. No presente trabalho buscou-se alterações moleculares induzidas por ATRA em células ST1, para melhor compreender a cascata de eventos desencadeada por ação deste fármaco. Em paralelo foram realizados estudos da ação de ATRA sobre as células T98G, buscando-se correlacionar os dados obtidos em modelo celular murino com modelos humanos. Para tanto, duas metodologias de estudo foram aplicadas: a) análise proteômica através de eletroforese bidimensional de proteínas (2D-PAGE), acoplada à espectrometria de massa (MALDI-TOF), para gerar perfis de expressão protéica na ausência e na presença de ATRA, permitindo comparação e identificação de proteínas moduladas no processo; b) construção de vetores plasmideais e retrovirais para super-expressar ou bloquear a expressão de um inibidor de serina protease de rato (serpinb6), descrito previamente no laboratório como estando potencialmente envolvido no processo de reversão fenotípica de ST1 induzido por ATRA. A abordagem proteômica permitiu a identificação de sete proteínas potencialmente reguladas por ATRA no modelo celular ST1, como as proteínas envolvidas em proliferação celular (c-Fos e SCGF), as proteínas de citoesqueleto (actina e tubulina), as proteínas envolvidas em estresse celular (GRP78 e Hsc70) e a proteína TCTP, classicamente reprimida em processos de reversão do fenótipo tumoral. O uso de construções plasmideais e retrovirais permitiu a obtenção de populações celulares que super-expressam serpinb6 e a análise de fenótipo destas células indicou que serpinb6 também pode ter função citoprotetora em células ST1, o que a coloca junto com as proteínas GRP78 e Hsc70 identificadas, evidenciando a importância desta classe de proteínas no processo estudado. / Control of tumor cell proliferation is an objective that has been pursued for decades, with modest or no success in the majority of the cases. Among the several kinds of tumors that develop in humans, some gliomas are considered the most fatal, due to the lack of alternatives for effective treatment. Anti-tumor agents, such as glucocorticoids (GC) or all-trans retinoic acid (ATRA) are used in combination with other drugs in some glioma cases. However, besides being very known molecules, their anti-tumor mechanism is not completely understood. In order to address this problem, our laboratory decided to isolate and characterize genes regulated by these agents, using cellular models, such as the C6 and ST1 rat glioma cell lines and the T98G and A172 human glioma models. The C6 cell line is fully transformed and tumoral in culture and responds to GC or ATRA treatment, showing growth inhibition and cell flattening. The ST1 variant is hyper-responsive to the treatment with GC and, apparently, more responsive to the treatment with ATRA, when compared to C6. Upon treatment with these agents, it undergoes a complete tumoral to normal phenotypic reversion, characterized by an increase in doubling time, decrease of saturation density in culture, recovery of dependence of serum factors for proliferation and anchorage for colony formation, besides inhability to form tumors in nude mice and morphological changes. Here we present the efforts undertaken towards better understanding of the molecular changes induced by ATRA in ST1 cells. Aiming at the correlation of the data obtained from a rat model with human models, all the studies were performed in parallel with the T98G human glioma cell model. To this end, two study methodologies were applied: a) proteomic analysis through bidimensional electrophoresis coupled to MALDI-TOF identification, to generate protein expression profiles in the presence and absence of ATRA, allowing comparison and identification of proteins modulated in the process; b) construction of plasmid and retroviral vectors to overexpress or block the expression of a serine protease inhibitor (serpinb6), previously described in the laboratory as being potentially involved in the process of tumoral to normal phenotypic reversion promoted by ATRA in ST1. The proteomics approach allowed the identification of seven proteins potentially regulated by ATRA in ST1, such as the proteins involved in cell proliferation (c-Fos and SCGF), cytoskeleton organization (actin and tubulin), cellular stress (GRP78 and Hsc70) and the tumor related protein TCTP, classically repressed in tumoral to normal reversions, and related to the three groups of proteins mentioned above. By using plasmid and retroviral vectors it was possible to obtain recombinant cell populations over-expressing serpinb6. The phenotype analysis of these populations indicated that serpinb6 can also have cell protection effects in ST1, which would classify it together with GRP78 and Hsc70 as an anti-stress protein highlighting the importance of this protein class in the process studied.

As leucemias cromossomo Ph-positivas estão intimamente associadas à expressão da tirosina-quinase Bcr-Abl. Esta oncoproteína promove independência de fatores de crescimento, alterações na adesão e inibição da apoptose por mecanismos ainda não totalmente elucidados. O objetivo desse estudo foi avaliar a contribuição da atividade quinase de Bcr-Abl para seu potencial anti-apoptótico e identificar alterações moleculares envolvidas na transformação celular induzida por essa proteína. Nossos resultados sugerem que a resistência à apoptose não depende da manutenção constante da atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl, tampouco da presença de proteínas fosforiladas em tirosina. A comparação do proteoma de células HL-60.vetor e HL-60.Bcr-Abl revelou que a presença de Bcr-Abl causa alterações profundas no padrão de expressão protéica. As proteínas afetadas estão associadas a diversos processos celulares, como adesão, transdução de sinais, proliferação e morte celular. Esses achados devem contribuir para a identificação de novos marcadores de prognóstico e alvos terapêuticos. / Ph chromosome-positive leukemias are closely associated with the expression of Bcr-Abl tyrosine kinase. This oncoprotein promotes growth factor independence, alters cell adhesion and confers resistance to apoptosis by mechanisms that are not fully understood. The aim of this study was to evaluate the contribution of Bcr-Abl kinase activity for its antiapoptotic potential and identify molecular alterations involved in Bcr-Abl-induced cell malignant transformation. Our results suggest that Bcr-Abl is not required to be constantly active to maintain the resistance to apoptosis and pY-containing proteins may not be responsible for the antiapoptotic effect of Bcr-Abl. The comparison between the proteome of HL-60.vector and HL-60.Bcr-Abl cells revealed that the presence of Bcr-Abl alters the expression of a great variety of proteins. The affected molecules are associated with several cellular processes, including cell adhesion, signal transduction, proliferation and cell death. Our findings might help the identification of new prognostic markers and therapeutic targets.

O complexo salivar da sanguessuga H. depressa é composto pelas glândulas salivares e probóscide. Análises bidimensionais (2D) mostraram que a maioria das proteínas apresentam pI entre 3.5 à 9.5 e MM entre 10 à 105 kDa. O mapa 2D do complexo salivar apresentou 352 spots totais, sendo 249 exclusivos da saliva (corado por nitrato de prata) e 219 spots totais (corado por Coomassie Blue). As proteínas foram identificadas após sequenciamento tandem MS (proteoma) pela complementariedade às sequências traduzidas do cDNA (transcriptoma). As proteínas mais abundantes foram: antiagregante plaquetário; miohemeritrina e anidrase carbônica. Estas proteínas devem exercer um papel na digestão ou anticoagulação do sangue durante a alimentação. A zimografia também identificou uma protease gelatinolítica (45 kDa). Porém, lefaxin (inibidor de FXa) e hementerina (fibrinogenolítico e inibidor de agregação plaquetária) não foram identificados por estas técnicas biotecnológicas, o que mostra a necessidade de técnicas adicionais para a completa elucidação da constituição desta amostra. / The salivary complex from H. depressa leech is composed of salivary gland and proboscis. Two-dimensional (2D) analysis showed that majority of proteins have pI from 3.5 to 9.5 and MW from 10 to 105 kDa. The 2D gel of salivary complex showed 352 total spots, 249 of them were from saliva (silver stained) and 219 total spots (Coomassie Blue stained). Proteins were identified after tandem MS sequencing (proteome) and complementar analysis of translated sequences from cDNA (transcriptome). The most abundant proteins were: antiplatelet protein; myohemerytrin; carbonic anhydrase. These proteins may have a role in digestion or antihemostatic system during blood feeding. The zymographic assay identified a gelatinolytic protein (45 kDa). But, lefaxin (inhibitor of Fxa) and hementerin (fibrinogenolytic and antiplatelet function) were not identified by these biotechonolgical techniques, showing that additional techniques are necessary for complete knowledge about the composition of this sample.

A alimentação é um dos custos mais relevantes da produção de bovinos de corte e melhorar a eficiência na utilização de nutrientes é essencial para a viabilidade da produção, dado o atual cenário de crescente demanda por proteína animal e mercado altamente competitivo. Nesse contexto, a proteômica surge como uma importante ferramenta na busca por alternativas que aumentem a eficiência alimentar (EA) de bovinos de corte. Assim, o objetivo deste trabalho é caracterizar o proteoma hepático de bovinos Nelore classificados quanto à EA. Noventa e oito animais foram avaliados em projeto anterior e seis indivíduos de baixa (BEA) e alta eficiência (AEA) tiveram amostras de fígado coletadas no abate, congeladas em Nitrogênio líquido e armazenadas em freezer à -80 ºC. Após a extração e precipitação das proteínas, as amostras foram processadas por duas abordagens distintas: digeridas com tripsina em solução e analisadas em cromatógrafo líquido de alta eficiência acoplado ao espectrômetro de massas (LC-MS/MS); e previamente separadas em gel para posterior digestão e análise (GeLC-MS/MS). Os dados adquiridos por LC-MS/MS foram analisados com o programa MaxQuant contra os bancos de Bos taurus e Bos indicus do Uniprot para identificação das proteínas, e os resultados analisados com o programa Perseus. Os dados obtidos por GeLC-MS/MS foram analisados com os programas Mascot Distiller e X! Tandem e validados no Scaffold Q+ contra o banco Bos taurus do Uniprot e os resultados analisados com os programas Scaffold Q+ e Perseus. Para abordagem LC-MS/MS, 376 proteínas foram quantificadas e submetidas à análise de abundância diferencial e construção de redes de co-expressão pelo WGCNA, identificando 42 proteínas diferencialmente abundantes (PDAs, p &lt; 0,05) e três módulos significativamente associados à EA. Pela abordagem GeLC-MS/MS foram quantificadas 102 proteínas, das quais cinco foram PDAs (p-valor &lt; 0,05). Três PDAs foram comuns às duas abordagens proteômicas. As proteínas associadas negativamente à EA foram principalmente relacionadas à síntese lipídica, degradação de ácidos graxos, enzimas do sistema do citocromo P450 e processos oxidativos. Por outro lado, as proteínas positivamente relacionadas à EA, foram principalmente envolvidas em processamento e enovelamento de proteínas, além de proteínas atuantes na manutenção da integridade e restauração do citoesqueleto celular. Em ambos os grupos também foram identificadas proteínas que atuam no sistema imunológico e resposta inflamatória. Estes resultados comprovam experimentos anteriores do grupo e demonstram a existência de diferença entre os proteomas do fígado de animais eficientes e ineficientes. / Feeding is one of the most relevant cost of beef cattle production and improving nutrient utilization efficiency is essential for the viability of production, given the current scenario of increasing demand for animal protein and highly competitive market. In this context, proteomics appears as an important tool in the search for alternatives that increase the feed efficiency (FE) of beef cattle. Thus, the aim of this work is to characterize the hepatic proteome of beef cattle selected for divergent FE. Ninety-eight animals were evaluated in a previous project, and six individuals with low feed efficiency (LFE) and six with high feed efficiency (HFE) had liver samples collected at slaughter, frozen in liquid Nitrogen and stored in a freezer at -80 °C. After protein extraction and precipitation, the samples were processed by two different approaches: digested with trypsin in solution and analyzed in a high efficiency liquid chromatograph coupled to the mass spectrometer (LC-MS/MS); and previously separated in gel for further digestion and analysis (GeLC-MS/MS). Data acquired by LC-MS/MS were analyzed with MaxQuant software against the Bos taurus and Bos indicus Uniprot databases for proteins identification and the results analyzed with Perseus software. The data obtained by GeLC-MS/MS were analyzed with the softwares Mascot Distiller and X! Tandem and validated in the Scaffold Q+, against Bos taurus Uniprot database and results analyzed with the softwares Scaffold Q+ and Perseus. For the LC-MS/MS approach, 376 proteins were quantified and submitted to differential abundance analysis and co-expression networks by WGCNA, identifying 42 differentially abundant proteins (DAPs, p &lt; 0.05) and three modules significantly associated with FE. For the GeLC-MS/MS approach, 102 proteins were quantified, of which five were DAPs (p-value &lt; 0.05). Three DAPs were common to both proteomics approaches. Proteins negatively associated with FE were mainly related to lipid synthesis, degradation of fatty acids, cytochrome P450 system enzymes and oxidative processes. On the other hand, proteins positively related to FE were mainly involved in protein processing and folding, maintenance of the integrity and restoration of the cellular cytoskeleton. In both groups were also identified proteins that play a role on the immune system and inflammatory response. These results prove previous experiments of the group and demonstrate the existence of difference between liver proteomes of efficient and inefficient animals.

As proteína quinases C (PKC) pertencem à família das serina/treonina quinases, que vem sendo apontadas como importantes enzimas para os processos de proliferação e diferenciação das células tronco embrionárias (CTE), todavia, a função exata de cada isoforma dessa família ainda não está clara. Dados anteriores do nosso laboratório indicam que dentre as PKCs expressas em CTE, formas cataliticamente ativas da PKC&#946;I são altamente expressas no núcleo das CTE murinas. Estas ao se diferenciarem expressam essa quinase no seu citoplasma ou deixam de expressar a mesma, e que a maioria dos alvos da PKC&#946;I em CTE indiferenciada estão envolvidos em processos de regulação da transcrição de proteínas envolvidas em processos de proliferação/ diferenciação. Dando continuidade aos resultados anteriores do laboratório, no presente trabalho, com técnicas de proteômica e fosfoproteômica identificamos outros alvos nucleares da PKC&#946;I em CTE indiferenciadas. Vimos que de fato inibindo-se a PKC&#946;I diminuiu-se a fostorilação de fatores envolvidos com a indiferenciação das CTE. Dentre os alvos da PKC&#946;I encontramos a proteína adaptadora, TIF1 que recruta proteínas remodeladoras de cromatina. Essa proteína é essencial para a manutenção do estado indiferenciado das CTE. In vitro a PKC&#946;I foi capaz de fosforilar a TIF1&#946; e inibindo-se a PKC&#946;I por RNAi vimos uma diminuição na expressão da TIF1&#946; e no fator de indiferenciação Nanog cuja expressão já foi demonstrada ser regulada pela TIF1&#946;. Além disso vimos que inibindo-se a PKC&#946;I com o peptídeo inibidor da PKC&#946;I aumentou a expressão de proteínas reguladas pelo c-Myc. E que o RNAi para a PKC&#946;I aumentou a expressão de proteínas que regulam a expressão do c-Myc. Não vimos nenhum efeito na fosforilação ou expressão do c-Myc após a inibição da PKC&#946;I o que sugere que a PKC&#946;I ative proteínas repressoras do c-Myc. Nossos estudos sugerem que a PKC&#946;I regula a manutenção do estado indiferenciado das CTE regulando a expressão e atividade da Tif1&#946; um possível alvo direto da PKC&#946;I. Levando a modificações da cromatina e regulação da expressão de genes que mantém as CTE indiferenciadas. Outro ponto de regulação da PKC&#946;I parece ser a nibição da atividade de c-Myc o que seria importante para a manutenção do estado indiferenciado visto que o c-Myc é um amplificador das vias de sinalização que mantém as células proliferando. Desta forma a PKC&#946;I parece ter um papel central na regulação da expressão gênica de CTE à nível de modificações epigenéticas e a nível transcricional mantendo as CTE indiferenciadas. / The Protein kinase C (PKC) family of serine/treonine kinases, are being described as important enzymes for proliferation and diferentiation of embryonic stem cells (ESC), however, the exact function of the different isoenzymes of this family still is unclear. Previous data from our laboratory indicates that amongst the PKCs expressed in ESC, catalytically active forms of PKC&#946;I are highly expressed in nucleus of murine ESC. When these cells differentiate this kinase can be found in the cytoplasm or not expressed at all, and that the majority of PKC&#946;I targets in undifferentiated ESC are involved in the regulation of proteins involved in transcription of proteins involved in proliferation/ diferentiation. Continuing our previous work herewith using proteomics and phosphoproteomics techniques we identified other nuclear PKC&#946;I targets in undifferentiated ESC. We indeed saw that inhibiting PKC&#946;I decreased the phosphorylation of factors involved with maintainance of the undifferentiated state of ESC. Amongst the targets of PKC&#946;I we found the adaptor protein, TIF1&#946;I, that recruits cromatin remodeling proteins. This protein is essential for the maintenance of the undifferentiated state of ESC. In vitro PKC&#946;I phosphorylated TIF1&#946; and inhibiting PKC&#946;I with RNAi decreased the expression of TIF1&#946; and of the undifferentiation factor Nanog whose expression has been shown to be regulated by TIF1&#946;. We also saw that inhibiting PKC&#946;I with a peptide inhibitor increased the expression of proteins regulated by c-Myc, and that RNAi for PKC&#946;I increased the expression of proteins that regulate the expression of c-Myc. We did not see any effect on the phosphorylation or expression of c-Myc after inhibition of PKC&#946;I suggesting that PKC&#946;I activates c-Myc repressor proteins. Our studies sugest that PKC&#946;I regulates the maintenance of the undiferentiated state of ESC regulating the expression and activity of Tif1&#946; a possibly a direct target of PKC&#946;I, leading to chromatin modifications and regulation of genes that maintain ESC undiferentiated. Another form of regulation of PKC&#946;I seems to be by inhibiting the activity of c-Myc which is importante to maintain ESC undifferentiated since c-Myc is na an amplifyer of signaling patheways that maintain ESC proliferating. Together PKC&#946;I has a central role in the regulation of the gene expression of ESC at the level of epigenetic modifications and transcriptional regulation

A restrição calórica (RC) é uma intervenção dietética capaz de estender a longevidade de vários organismos. O modelo para RC em Saccharomyces cerevisiae consiste da diminuição da concentração de glicose no meio de cultura e mostra um aumentado tanto do tempo de vida cronológico quanto replicativo. Nosso objetivo foi investigar experimentalmente a ação da RC, focando principalmente nas causas e consequências das modificações de geração de EROs mitocondriais e como estas estão associadas ao processo de envelhecimento. Em um primeiro período de estudos, verificamos quais as fontes mitocondriais de EROs, e comprovamos que uma quantidade significativa se origina de proteínas da matriz mitocondrial, e não da cadeia de transporte de elétrons. Nós estudamos a participação de glicose e de outras fontes de carbono sobre o tempo de vida cronológico em leveduras e mostramos que o aumento da longevidade promovida pela RC está associado à uma mudança de metabolismo fermentativo para respiratório, com participação da via de sinalização de glicose. No estágio realizado no laboratório do Professor Francis Sluse na Université de Liegè, Bélgica, estudamos a ação da RC em leveduras focando nas consequências das modificações no proteoma mitocondrial. Em nosso estudo proteômico, encontramos grandes modificações em proteínas envolvidas com o metabolismo de aminoácidos. Monitoramos a atividade de enzimas relacionadas ao metabolismo de aminoácidos e o tempo de vida cronológico de S. cerevisiae e as mutantes nulas bat2&#916;, gdh1&#916;, gdh2&#916; e gdh3&#916;, que codificam a aminotransferase de aminoácidos de cadeia ramificada citosólica, NADP glutamato desidrogenase citosólica, a NAD glutamato desidrogenase mitocondrial, e a NADP glutamato desidrogenase mitocondrial, respectivamente. A atividade da NAD glutamato desidrogenase é aumentada em RC, mas a de NADP glutamato desidrogenase decresce em células controle. Aumentos do tempo de vida cronológico foram observados nas mutantes bat2&#916; e gdh1&#916; devido a RC, mas nenhuma diferença significativa foi encontrada nas mutantes nulas para Gdh2p e Gdh3p em fase estacionária, indicando que essas proteínas são essenciais para os efeitos benéficos da RC. Nessas células WT crescidas em condições normais e as mutantes nulas apresentam iguais longevidades. Juntos, nossos resultados indicam que o aumento da longevidade em S. cerevisiae promovida pela RC depende da interação entre o sinal de glicose e o metabolismo de aminoácidos. / Calorie restriction (CR) is a dietary intervention capable of extending lifespans in a wide range of organisms. A yeast model of CR has been developed in which limiting the concentration of glucose in growth media of Saccharomyces cerevisiae leads to enhanced chronological and replicative life spans. Our aim was to experimentally investigate the effects of CR, focusing mainly on the causes and consequences of changes in mitochondrial reactive oxygen species (ROS) generation and how these are associated with the aging process. Initially, we looked for sources of mitochondrial ROS, and found that a significant amount of ROS comes from mitochondrial matrix enzymes and not from the electron transport chain. We studied the participation of glucose and other carbon sources in chronological lifespan and show that increased longevity promoted by CR is associated with a metabolism change from fermentation to respiration, with participation of glucose repression pathway. During studies performed in the laboratory of Professor Francis Sluse at the Université de Liège, Belgium, we studied the effect of CR in yeast with focus on the consequences of changes in the mitochondrial proteome. We found large proteomic changes in proteins involved in amino acid metabolism. We monitored the activity of enzymes related to amino acid metabolism and chronological life span of S. cerevisiae null mutants bat2&#916;, gdh1&#916;, gdh2&#916;, and gdh3&#916;, which encode for the cytosolic branched-chain amino acid aminotransferase, cytosolic NADP glutamate dehydrogenase, mitochondrial NAD glutamate dehydrogenase and mitochondrial NADP glutamate dehydrogenase, respectively. The activity of NAD glutamate dehydrogenase is increased in CR, but NADP glutamate dehydrogenase decreases in control cells. Increases in chronological life span due to RC were observed in bat2&#916; and gdh1&#916; mutants, but no significant difference was found in Gdh2p and Gdh3p null mutants in the stationary phase, indicating that these proteins are essential for the beneficial effects of CR. In rich medium, WT cells and null mutants have similar life spans. Together, our results indicate that longevity enhancement by CR in S. cerevisiae depends on the interaction between glucose signals and amino acid metabolism

A alimentação é um dos custos mais relevantes da produção de bovinos de corte e melhorar a eficiência na utilização de nutrientes é essencial para a viabilidade da produção, dado o atual cenário de crescente demanda por proteína animal e mercado altamente competitivo. Nesse contexto, a proteômica surge como uma importante ferramenta na busca por alternativas que aumentem a eficiência alimentar (EA) de bovinos de corte. Assim, o objetivo deste trabalho é caracterizar o proteoma hepático de bovinos Nelore classificados quanto à EA. Noventa e oito animais foram avaliados em projeto anterior e seis indivíduos de baixa (BEA) e alta eficiência (AEA) tiveram amostras de fígado coletadas no abate, congeladas em Nitrogênio líquido e armazenadas em freezer à -80 ºC. Após a extração e precipitação das proteínas, as amostras foram processadas por duas abordagens distintas: digeridas com tripsina em solução e analisadas em cromatógrafo líquido de alta eficiência acoplado ao espectrômetro de massas (LC-MS/MS); e previamente separadas em gel para posterior digestão e análise (GeLC-MS/MS). Os dados adquiridos por LC-MS/MS foram analisados com o programa MaxQuant contra os bancos de Bos taurus e Bos indicus do Uniprot para identificação das proteínas, e os resultados analisados com o programa Perseus. Os dados obtidos por GeLC-MS/MS foram analisados com os programas Mascot Distiller e X! Tandem e validados no Scaffold Q+ contra o banco Bos taurus do Uniprot e os resultados analisados com os programas Scaffold Q+ e Perseus. Para abordagem LC-MS/MS, 376 proteínas foram quantificadas e submetidas à análise de abundância diferencial e construção de redes de co-expressão pelo WGCNA, identificando 42 proteínas diferencialmente abundantes (PDAs, p &lt; 0,05) e três módulos significativamente associados à EA. Pela abordagem GeLC-MS/MS foram quantificadas 102 proteínas, das quais cinco foram PDAs (p-valor &lt; 0,05). Três PDAs foram comuns às duas abordagens proteômicas. As proteínas associadas negativamente à EA foram principalmente relacionadas à síntese lipídica, degradação de ácidos graxos, enzimas do sistema do citocromo P450 e processos oxidativos. Por outro lado, as proteínas positivamente relacionadas à EA, foram principalmente envolvidas em processamento e enovelamento de proteínas, além de proteínas atuantes na manutenção da integridade e restauração do citoesqueleto celular. Em ambos os grupos também foram identificadas proteínas que atuam no sistema imunológico e resposta inflamatória. Estes resultados comprovam experimentos anteriores do grupo e demonstram a existência de diferença entre os proteomas do fígado de animais eficientes e ineficientes. / Feeding is one of the most relevant cost of beef cattle production and improving nutrient utilization efficiency is essential for the viability of production, given the current scenario of increasing demand for animal protein and highly competitive market. In this context, proteomics appears as an important tool in the search for alternatives that increase the feed efficiency (FE) of beef cattle. Thus, the aim of this work is to characterize the hepatic proteome of beef cattle selected for divergent FE. Ninety-eight animals were evaluated in a previous project, and six individuals with low feed efficiency (LFE) and six with high feed efficiency (HFE) had liver samples collected at slaughter, frozen in liquid Nitrogen and stored in a freezer at -80 °C. After protein extraction and precipitation, the samples were processed by two different approaches: digested with trypsin in solution and analyzed in a high efficiency liquid chromatograph coupled to the mass spectrometer (LC-MS/MS); and previously separated in gel for further digestion and analysis (GeLC-MS/MS). Data acquired by LC-MS/MS were analyzed with MaxQuant software against the Bos taurus and Bos indicus Uniprot databases for proteins identification and the results analyzed with Perseus software. The data obtained by GeLC-MS/MS were analyzed with the softwares Mascot Distiller and X! Tandem and validated in the Scaffold Q+, against Bos taurus Uniprot database and results analyzed with the softwares Scaffold Q+ and Perseus. For the LC-MS/MS approach, 376 proteins were quantified and submitted to differential abundance analysis and co-expression networks by WGCNA, identifying 42 differentially abundant proteins (DAPs, p &lt; 0.05) and three modules significantly associated with FE. For the GeLC-MS/MS approach, 102 proteins were quantified, of which five were DAPs (p-value &lt; 0.05). Three DAPs were common to both proteomics approaches. Proteins negatively associated with FE were mainly related to lipid synthesis, degradation of fatty acids, cytochrome P450 system enzymes and oxidative processes. On the other hand, proteins positively related to FE were mainly involved in protein processing and folding, maintenance of the integrity and restoration of the cellular cytoskeleton. In both groups were also identified proteins that play a role on the immune system and inflammatory response. These results prove previous experiments of the group and demonstrate the existence of difference between liver proteomes of efficient and inefficient animals.