Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2016. / Submitted by Camila Duarte (camiladias@bce.unb.br) on 2017-01-30T14:11:00Z No. of bitstreams: 1 2016_CristianeUrcinaJoannaOliveiraLima.pdf: 1643918 bytes, checksum: 5525da7babb7a34414f4d9eaf56084a3 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-02-13T18:43:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_CristianeUrcinaJoannaOliveiraLima.pdf: 1643918 bytes, checksum: 5525da7babb7a34414f4d9eaf56084a3 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-13T18:43:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_CristianeUrcinaJoannaOliveiraLima.pdf: 1643918 bytes, checksum: 5525da7babb7a34414f4d9eaf56084a3 (MD5) / Introdução: Evidências científicas veem demonstrando que Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) destaca-se dentre os demais patógenos por promover elevadas taxas de morbidade, mortalidade e aumento de custos hospitalares em âmbito mundial. Este microrganismo é intrinsicamente resistente à ampla diversidade de fármacos e capaz de se tornar resistente a diversos agentes antimicrobianos. Atualmente, verifica-se uma significativa limitação do arsenal terapêutico que pode ser empregado para o tratamento de infecções causadas por esta bactéria multirresistente. Estudos têm demonstrado que o cogumelo Agaricus blazei Murrill (AbM) apresenta atividade antimicrobiana. Objetivo: Avaliar a ação antimicrobiana dos extratos do Agaricus blazei Murrill sobre Pseudomonas aeruginosa multirresistente. Métodos: As cepas de Pseudomonas aeruginosa multirresistente foram obtidas de pacientes internados no Hospital Regional da Asa Norte do Distrito Federal. A multirresistência antimicrobiana foi determinada segundo os critérios do National Committee for Clinical Labocamundongory Standasrds. Os extratos, aquoso e metanólico, foram preparados a partir do basidiocarpo bruto do AbM e parte de sua composição química foi determinada, assim como os compostos fenólicos (polifenóis totais, polimerizados e não polimerizados; ésteres tartáricos e flavonóis) e ação antioxidante pelos métodos de DPPH e ABTS. Os testes in vitro contemplaram as avaliações da concentração inibitória mínima, do potencial hemolítico dos extratos, da viabilidade celular e quantificação de citocinas (TNF-α, IL-10, IL-12) em células RAW 264.7. No ensaio in vivo, os animais foram infectados com a Pseudomonas aeruginosa multirresistente para avaliação da ação antimicrobiana dos extratos do cogumelo na sobrevida de camundongos. Resultados: Os dados da composição química do AbM demonstraram uma elevada quantidade de carboidratos, proteínas e fibras, associado a baixo teor de gorduras. O extrato metanólico apresentou uma maior quantidade de compostos fenólicos em relação ao aquoso, e ambos os extratos evidenciaram elevada atividade antioxidante pelo método ABTS. Os demais estudos in vitro demostraram que o extrato metanólico apresentou atividade inibitória no crescimento de P. aeruginosa, ambos os extratos de AbM não promoveram atividade hemolítica e não estimularam a secreção de citocinas. Além disso, os extratos diminuíram a viabilidade celular. Nos experimentos in vivo, o extrato aquoso aumentou a sobrevida de camundongos com infecção em 60%, quando comparados com animais controle. Conclusão: Estes dados sugerem que o extrato aquoso do cogumelo AbM pode ser uma alternativa terapêutica para o tratamento de infecções bacterianas multirresistentes. / Introduction: Scientific evidence demonstrating see that Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) stands out among the other pathogens by promoting high rates of morbidity, mortality and increased hospital costs worldwide. This microorganism is intrinsically resistant to wide range of drugs and able to become resistant to many antimicrobial agents. Currently, there is a significant limitation in the therapeutic arsenal that can be used for the treatment of infections caused by multidrug this bacterium. Studies have shown that Agaricus blazei Murrill (AbM) has antimicrobial activity. Objective: To evaluate the antimicrobial action of Agaricus blazei Murrill extracts on multidrug resistant Pseudomonas aeruginosa. Methods: multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa strains were obtained from patients admitted to the Regional Hospital of the North Wing of the Federal District. The multidrug resistance was determined according to the criteria of the National Committee for Clinical Labocamundongory Standasrds. The extracts and aqueous methanol have been prepared from crude basidiocarp AbM and part of their chemical composition was determined, as well as phenolic compounds (total polyphenols polymerized and unpolymerized; Tartaric acid esters, flavonoids) and antioxidant activity by DPPH methods and ABTS. In vitro testing contemplated reviews the minimum inhibitory concentration, hemolytic potential of the extracts, the cellular viability and quantification of cytokines (TNF-α, IL-10, IL-12) in RAW 264.7 cells. In the in vivo test, the animals were infected with Pseudomonas aeruginosa multiresistant to evaluate the antimicrobial activity of mushroom extracts on the survival of mice. Results: The data on the chemical composition AbM showed a high amount of carbohydrates, protein and fiber, associated with low fat content. The methanol extract showed a greater amount of phenolic compounds in relation to the aqueous, and both extracts showed high antioxidant activity by ABTS method. Other in vitro studies showed that the methanol extract showed inhibitory activity on the growth of P. aeruginosa, both AbM extracts did not promote hemolytic activity and did not stimulate the secretion of cytokines. Moreover, the extracts decreased cell viability. In in vivo experiments, the aqueous extract increased the survival of mice infected by 60% when compared to control animals. Conclusion: These data suggest that the aqueous extract of the mushroom AbM may be a therapeutic alternative for the treatment of multidrug-resistant bacterial infections.

Uma substância antimicrobiana produzida por Pseudomonas aeruginosa foi caracterizada. O microrganismo produtor foi isolado de um lago de tratamento de efluentes em um frigorífico localizado na região do vale do Rio Pardo, no Rio Grande do Sul. O isolado foi caracterizado por análise bioquímica e seqüenciamento do 16S rDNA. As condições de maior produção ocorreram a 30°C, sob agitação contínua, com o maior pico de produção a partir de 108 horas. A substância antimicrobiana foi parcialmente purificada através de precipitação com sulfato de amônio 70%, cromatografia de gel filtração (Sephadex G-100) e de troca iônica (DEAE Sepharose). A substância antimicrobiana foi caracterizada com as duas alíquotas coletadas a partir do eluato da coluna de gel filtração. Os dados da caracterização indicam que ambas as alíquotas são a mesma substância. A atividade antimicrobiana foi analisada sobre o gel de poliacrilamida. Uma banda majoritária no gel de poliacrilamida sugere que o peptídeo apresente uma massa molecular de aproximadamente 30 kDa. A substância apresentou uma ampla atividade antimicrobiana sobre cepas indicadoras, tais como S. aureus, L. monocytogenes, B. cereus e importantes bactérias patogênicas e deteriorantes. A atividade antimicrobiana foi constante na faixa de 10 a 100°C, por até 60 minutos, iniciando um declínio a 120°C. O peptídeo antimicrobiano resistiu a todas as proteases testadas e teve sua atividade diminuída com DMSO, Tween 20 e 80, TCA e uréia. A substância parcialmente purificada foi utilizada no combate de S. aureus artificialmente inoculados em hambúrgueres crus de carne bovina e não inibiu seu crescimento nas condições do experimento. / An antimicrobial substance produced by Pseudomonas aeruginosa was characterized. The producer microorganism was isolated from an effluents treatment lake from an abattoir localized in Rio Pardo valley area, Rio Grande do Sul, Brazil. The strain was characterized by chemical profiling and 16S sequencing. It has reached its maximum of production under the following conditions: 86ºF, continuous agitation and aeration, 108 h. The antimicrobial substance was partially purified by ammonium sulfate precipitation 70%, gel filtration (Sephadex G-100) and ion exchange chromatography (DEAE Sepharose). The antimicrobial substance was characterized into two fractions collected from gel filtration’s eluate. The characterization data indicates that both fractions are the same substance. Direct activity on sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was observed. A major band on SDS-PAGE suggested that the peptide had a molecular mass of about 30 kDa. The substance was inhibitory to a broad range of indicator strains such as S. aureus, L. monocytogenes B. cereus, and important pathogenic and spoilage bacterias. The activity was constant from 50 to 212ºF, for 60 minutes, beginning to decline at 248ºF. The antimicrobial peptide resisted to all proteolitic enzymes tested and only reduced its activity with dimethyl sulfoxide, polysorbate 20, polysorbate 80, trichloroacetic acid and urea. The partially purified substance was used to combat S. aureus in meat hamburgers and didn’t inhibit its growth at the experiment conditions.

Submitted by Etelvina Domingos (etelvina.domingos@ufpe.br) on 2015-03-12T16:57:48Z No. of bitstreams: 2 TESE_Agrinaldo Jacinto do Nascimento Júnior.pdf: 6927683 bytes, checksum: bf123d71858e87a718a988da950251f3 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-12T16:57:48Z (GMT). No. of bitstreams: 2 TESE_Agrinaldo Jacinto do Nascimento Júnior.pdf: 6927683 bytes, checksum: bf123d71858e87a718a988da950251f3 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013-12-19 / FACEPE CAPES INAMI / A membrana externa de bactérias Gram- negativas é constituida majoritariamente de lipopolissacárideo (LPS) e fosfolipídeo. Cada unidade de LPS é constituida por até três partes, o lipídeo A, o Core e outra nem sempre presente chamada antígeno-O. O lípideo A tem um maior carater apolar, embora possua grupos fosfatos. Já o core é a região mais carregada do LPS e possui não apenas açucares fosforilados, mas também carboxilados. Desta maneira, a superfície da membrana de LPS é negativa e a interação com os cátions necessária para neutralizar a carga da membrana. Por isso, estas membranas possuem alta capacidade em adsorver cátions e assim são candidatas a serem utilizadas como agente biorremediadores, na captura por exemplo de radionuclídeos. Numa perspectiva de saúde, o LPS atua como um antigeno para o sistema imunológico de mamíferos e a sua ação pode auxiliar a causar não apenas febre, mas até levar a morte individuos imunocomprometidos. A bactéria Gram-negativa Pseudomonas aeruginosa é um destes patógenos nosocomiais oportunistas e tem sido apontada como uma das principais responsáveis por provocar a morte de pacientes portadores de fibroce cística. A estrutura supramolecular das membranas de LPS afetam não apenas a sua permeabilidade, mas ainda a ativação do sistema imunológico do hospedeiro no momento da infecção. Para uma descrição a nível molecular da influência dos cátions, Na+ , K+, Ca2+, Mg2+ , Zn2+ e Ba2+ na membrana de LPS utilizamos uma abordagem teórica baseada na dinâmica molecular clássica atomística. O modelo da membrana foi uma bicamada constituida de 72 unidades de LPS de Pseudomonas aeruginosa do quimiotipo PAO1 ancorados em 180 moléculas de 1,2-dipalmitoil-3-fosfatidil-etanolamina (DPPE) considerando o pH = 7 e temperatura de 300K. Os resultados das análises das simulações indicaram que as membranas de LPS suportam um nível de hidratação maior do que as bicamadas de fosfolipídeos e além disso os cátions tendem a provocar a ligação cruzada entre as unidades de LPS. Ainda, o aumento do raio de hidratação dos cátions, bem como a diminuição da ligação cruzada entre as unidades de LPS tendem a promover a transição da membrana de um estado lamelar para não lamelar. Deste modo, os resultados sugerem que a escolha combinada da valência do cátion e sua capacidade relativa de coordenar os grupos fosfatos e moléculas de água podem servir como regra para modular propriedades das membranas de LPS como estrutura supramolecular, fluidez e hidratação.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2015-05-26T17:40:43Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação_de_mestrado FERNANDA correção após apresentação FINALIZADA DIGITAL.pdf: 1967282 bytes, checksum: 8e1bd13e2a7cb2f2b493bb443c3db0f9 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-26T17:40:43Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação_de_mestrado FERNANDA correção após apresentação FINALIZADA DIGITAL.pdf: 1967282 bytes, checksum: 8e1bd13e2a7cb2f2b493bb443c3db0f9 (MD5) Previous issue date: 2015-02-23 / Pseudomonas aeruginosa é uma importante causa de infecções apresentando, no Brasil, altas taxas de morbidade e mortalidade. Os principais mecanismos de resistência utilizados por P. aeruginosa são a produção de β-lactamases e a expressão de bombas de efluxo. O uso de IgG e antibióticos para tratamento destas infecções tem apresentado resultados bem sucedidos, o que motiva a realização de estudos quanto a atividade in vitro da IgG humana com antibióticos frente a isolados de P. aeruginosa. O objetivo deste estudo foi detectar a presença dos genes de resistência, a relação clonal, o tempo de morte em isolados de P. aeruginosa provenientes de Infecções relacionadas à saúde (IrAS) de hospitais públicos do Recife-PE, em 2014, e verificar in vitro a taxa de fagocitose e a produção de oxido nítrico (NO) por monócitos humanos quando infectados por P. aeruginosa tratada com IgG humana em associação a Meropenem e Polimixina E. Foram avaliados 32 isolados para a detecção de genes de resistência por PCR, e para a avaliação de similaridade genética por ERIC-PCR. Destes, foram selecionados os 5 isolados apresentando maior número de genes de resistência e menor similaridade genética. Esses cinco isolados foram submetidos às associações dos sub-CIMs destes antibióticos com a IgG humana, para a determinação do tempo de morte, da taxa de fagocitose de células bacterianas e para a dosagem de NO por monócitos humanos. Foi detectado a presença do gene blaKPC em dois isolados de P. aeruginosa. Todos os isolados possuem os genes mexR, mexB, mexE e rpsL, apenas um isolado foi negativo para os genes mexA e mexF. Foram detectados 30 perfis genéticos distintos entre os isolados bacterianos. O tempo de morte dos isolados revelou que os tratamentos combinados com antibióticos, principalmente Polimixina E, são mais letais para as células bacterianas. A taxa de fagocitose por monócitos humanos revelou que quando infectados com bactéria tratada com IgG mais antibiótico, os monócitos ficam mais ativos à fagocitose e reduz drasticamente a quantidade de células bacterianas. Houve diferença significativa na produção de NO naqueles tratados com Meropenem e IgG. Com o presente estudo concluiu-se que a combinação de IgG mais antibiótico pode ser uma alternativa para o tratamento dessas infecções, pois a bactéria estará em número reduzido facilitando a fagocitose.

Made available in DSpace on 2014-06-12T23:13:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O paclobutrazol ([2RS,3RS]-1-(4-Clorofenil)-4,4-dimetil-2-(1H-1,2,4tiazolil1) pentanol3) é um regulador de crescimento vegetal, cujo modo de ação inclui a inibição da giberelina. Quando adicionado ao solo, sua mobilidade é relativamente baixa e, por isso, este composto se acumula ao solo. O objetivo deste trabalho foi investigar a degradação de paclobutrazol (PBZ) por uma cultura mista de Pseudomonas spp., isolada de um solo proveniente do vale do São Francisco, localizado no Nordeste do Brasil. Os experimentos de biodegradação foram realizados em batelada, sob condições estéreis e não-estéreis. O paclobutrazol na sua forma pura (Sigma) e na sua formulação comercial Cultar 250 SC (Syngenta), foi utilizado como única fonte de carbono e também adicionado de glicerol. Dois solos (Argissolo-Amarelo e Vertissolo) provenientes da região do Vale do São Francisco foram utilizados. Foi utilizada uma cultura mista de bactérias do gênero Pseudomonas, isoladas previamente por enriquecimento. O paclobutrazol foi utilizado nas concentrações de 10 e 25 mg/L e a concentração de paclobutrazol foi determinada por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Três modelos matemáticos foram utilizados para avaliar a cinética de biodegradação do paclobutrazol obtida experimentalmente. Segundo a análise estatística (ANOVA), os resultados de biodegradação obtidos foram semelhantes, tanto para o Argissolo-Amarelo quanto para o Vertissolo bem como para os experimentos em condições estéreis e não-estéreis, e para o PBZ puro e o PBZ comercial. A biodegradação alcançou valor máximo de 43%, quando foi utilizado apenas PBZ como única fonte de carbono. Entretanto, quando o glicerol foi utilizado como fonte adicional de carbono, a biodegradação chegou a 70%, aproximadamente. Foram obtidos ótimos ajustes utilizando os modelos de dupla cinética e logístico, pois a biodegradação do paclobutrazol segue visivelmente duas fases bem distintas, uma rápida e outra mais lenta. O tempo de meia-vida do PBZ obtido por meio da equação de dupla cinética foi de aproximadamente 55 dias quando ele foi utilizado na concentração de 10 mg/L, e de 170 dias quando foi utilizado na concentração de 20 mg/L. Em ambos os casos, o PBZ foi utilizado como única fonte de carbono. Quando o PBZ foi utilizado juntamente com o glicerol, o tempo de meia-vida caiu para aproximadamente 10 dias nas duas concentrações utilizadas

It has been well-established that Pseudomonas species possess extremely versatile metabolic systems allowing them to utilise a wide range of nutrient sources and, furthermore, that the regulation of these enzyme systems involves highly evolved and sophisticated regulatory machinery. This study examined the complexity of metabolic regulation in Pseudomonas using the hydantoin-hydrolysing system of the environmental isolate, Pseudomonas putida RU-KM3s. In this system, the genes encoding dihydropyrimidinase and β-ureidopropionase (dhp and bup) are arranged divergently on the chromosome, separated by a 616 bp intergenic region involved in the transcriptional regulation of these genes. The focus was on the transcriptional regulation of dhp expression. DHP activity was found to be sensitive to several environmental signals including growth phase, carbon catabolite repression (CCR), substrate induction and quorum sensing (QS). Bioinformatic analysis of the intergenic region upstream of dhp revealed a number of putative binding sites for transcriptional regulators, including recognition sequences for the alternate sigma factors σ54 and σ38, as well as for the global regulators Anr (for anaerobic regulator) and Vfr (for virulence factor regulator). The targeted disruption of the genes encoding the transcriptional regulators, Vfr and the major CCR protein, Crc, resulted in a partial relief from repression for the vfr- mutant under quorum sensing conditions and a general decrease in activity in the crc- mutant. This data suggested that both Vfr and Crc were involved in regulating DHP activity. Mutational analysis of the dhp promoter revealed that at least two sites were involved in regulating transcriptional activity, one which mediated activation and the other repression. These sites were designated as a putative Anr box, situated 232 bp from the start codon of dhp, and a CRP-like binding site, at a position 213 bp upstream of dhp. Taken together, this data shows the involvement of several global regulatory factors in controlling the expression of dhp. A complex synergistic model was proposed for the transcriptional regulation of dhp, involving alternate sigma factors in addition to both global and specific regulators and responding to a number of environmental signals associated with growth phase, including nutrient availability, cell density and oxygen status.

Cathelicidins are antimicrobial peptides (AMPs) that were first discovered to have microbicidal properties but more recently to be multifunctional immunomodulators and thus important in influencing host defence against infectious disease. Whilst roles in various organs have been demonstrated, their expression patterns in health and disease in other organs are less clear and their key immunomodulatory functions remain undefined, particularly with regard to the balance of immunomodulatory properties and microbicidal activity in their ability to promote defence against infection. I therefore set out to describe LL-37 expression (human cathelicidin) in the female reproductive tract (across the menstrual cycle) and in the lung (during specific lung diseases), to define the effects on the function of airway epithelial cells during bacterial infection and to evaluate the key in vivo roles of endogenous cathelicidin (using a knockout mouse model) as well as the effect of therapeutic administration of LL-37 in a pulmonary Pseudomonas aeruginosa infection model. I demonstrated that cathelicidin protein and transcription shows a cyclical pattern of expression in female reproductive tissues which is maintained at high levels in decidua. LL- 37 protein was also detected in hTERT endometrial epithelial cells but despite the suggestion that cathelicidin may be regulated by steroid hormones there was no direct effect of progesterone on transcription. LL-37 is barely detected in healthy airways however is well known to increase during infection or inflammation. I observed that sputum from patients with bronchiectasis showed a correlation between the level of LL-37, TNF, MPO and chronic colonisation of Pseudomonas aeruginosa. Patients with lung cancer expressed much less LL- 37 than the bronchiectasis patients but there was a trend towards increased production postsurgery compared to pre-surgery. LL-37 was previously shown by our lab to selectively promote BAX and caspase-dependant death of infected epithelial cells. I went on to show that this appears to be a partially caspase- 1 dependent mechanism and that human bronchial epithelial (HBE) cells and A549 cell lines both express several of the components required to form inflammasomes, a caspase-1 dependant form of inflammatory cell death. Finally, I showed using murine models that cathelicidin enhances bacterial clearance during pulmonary infection in vivo, a response which is defective in mice lacking endogenous cathelicidin and that administration of exogenous, synthetic LL-37 at the time of infection can promote an early protective neutrophil influx in the absence of endogenous cathelicidin production.

A 5.1 kbEcoR I fragment from Pseudomonas putida TOL plsmid pDKR1, carrying the xylE and xylL genes, was inserted into pBR 325 and transformed into E. coli. The xylE region, coding for catechol 2,3-dioxygenase, was subjected to Maxam-Gilbert sequencing reactions.

Purified macrophage cationic proteins were used in functional assays to determine their interactions with the outer membrane and lipopolysaccharide of Pseudomonas aeruginosa. A fluorescent derivative of polymyxin B (dansyl-polymyxin) was found to bind to saturation to purified lipopolysaocharide, with similar affinity for the aminoglycoside supersensitive strain H215 and wild type strain H103 lipopolysaocharide. MCP-1 could displace more dansyl-polymyxin bound to the lipopolysaocharide of both strains, and bound with greater affinity than MCP-2. When whole cells were used, MCPs also displaced bound dansyl-polymyxin. Effects on the outer membrane of whole cells were examined by determining the initial rate of uptake of the hydrophobic fluorescent probe 1-N-phenylnaphthylamine. Uptake was enhanced in the presence of MCPs, indicating permeabilization of the outer membrane. MCP-1 caused maximal uptake of the probe at 40 µg/ml, MCP-2 at 70 µg/ml, and crude extract at only 20 µg/ml. Uptake of the probe was found to be enhanced at add pH, with maximal uptake occurring with only 7.5 µg/ml MCP-1 at pH 6.5. The data suggested that MCPs act to permeabilize the outer membranes of P. aeruginosa in a manner analagous to that defined for other polycationic agents. / Science, Faculty of / Microbiology and Immunology, Department of / Graduate

The problem of finding an efficient antibiotic against Pseudomonas aeruginosa which can be used in the clinical treatment of genito-urinary tract infections resistant to treatment by streptomycin has not yet been solved. Therefore, this problem has consisted of first, the acquisition of possible inhibitors of the streptomycin resistant strain of Pseudomonas aeruginosa; second, the selection and identification of those which show a marked antagonism toward this organism; third, the determination of the antibiotic spectra of the inhibitors; fourth, the determination of whether the streptomycin resistant strain could also acquire a resistance to the antibiotic produced by its inhibitors; and last, an attempt to evaluate the therapeutic possibilities of the antibiotics demonstrated.