A 13C-Análise de Fluxos Metabólicos (13C-MFA) tornou-se uma técnica de alta precisão para estimar fluxos metabólicos e obter informações importantes sobre o metabolismo. Este método consiste em procedimentos experimentais, técnicas de medição e em cálculos para análise de dados. Neste contexto, os grupos de pesquisa de engenharia metabólica necessitam de ferramentas computacionais precisas e adequadas aos seus objetos de estudo. No presente trabalho, foi construída uma ferramenta computacional na plataforma MATLAB que executa cálculos de 13C-MFA, com balanços de metabólitos e cumômeros. Além disso, um módulo para estimar os fluxos metabólicos e um módulo para quantificar as incertezas das estimativas também foram implementados. O programa foi validado com dados presentes na literatura e aplicado a estudos de caso. Na estimação de fluxos de Pseudomonas sp. LFM046, identificou-se que esse micro-organismo possivelmente utiliza a Via das Pentoses em conjunto com a Via Entner-Doudoroff para a biossíntese de Polihidroxialcanoato (PHA). No design ótimo de experimentos para uma rede genérica de Pseudomonas, identificou-se a glicose marcada no átomo cinco como um substrato que permitirá determinar o fluxo na Via das Pentoses com menor incerteza. / 13C-Metabolic Flux Analysis (13C-MFA) has become a high-precision technique to estimate metabolic fluxes and get insights into metabolism. This method consists of experimental procedures, measurement techniques and data analysis calculations. In this context, metabolic engineering research groups demand accurate and suitable computational tools to perform the calculations. A computational tool was implemented in MATLAB platform that performs 13C-MFA calculation, using metabolite and cumomer balances, as well as a module to estimate the fluxes and a module to quantify their uncertainty. The program was validated with some classical cases from literature. From the flux estimates of Pseudomonas sp. LFM046, it was identified that the microorganism possibly uses the Pentose Phosphate Pathway along with the Entner-Doudoroff Pathway for Polyhydroxyalkanoate (PHA) biosynthesis. From the optimal experimental design for a generic Pseudomonas network, it was possible to conclude that glucose labeled at atom five is the best option to determine the flux in the Pentose Phosphate Pathway with smaller uncertainty.

Objetivos: Avaliar o perfil de suscetibilidade, a prevalência da produção de AmpC, β-lactamase de espectro estendido (ESBL) e Metalo-β-lactamase (M-βla) em Pseudomonas aeruginosa obtidas de dois hospitais universitários distintos (ISCMPA e HCPA) em Porto Alegre. Em adição, tipagem molecular por PFGE foi realizada entre os isolados produtores de M-βla para avaliar a relação clonal. Métodos: Foi determinada a suscetibilidade de 238 isolados de P. aeruginosa para 8 agentes antimicrobianos, através do teste de disco-difusão, usando agar Müller-Hinton (MH) de acordo com “National Committee for Clinical Laboratory Standards” (NCCLS) . Todos isolados foram avaliados para produção de AmpC com o disco de imipenem (indutor) próximo ao disco de cefepima/ceftazdima (substrato). Um achatamento no halo de cefepime/ceftazidima pela indução da enzima pelo imipenem, indicava resultado positivo para AmpC. Todos isolados forma avaliados para a presença de ESBL através do teste de aproximação de disco com ceftazidima, cefepima, cefotaxima, ceftriaxona e ticarcilina-clavulanato como inibidor de β-lactamase. A produção de M-βla foi determinada através do teste de aproximação de discos de CAZ a discos impregnados com ácido2-mercatopropiônico (2-MPA). As taxas de resistência foram comparadas através do Teste Exato de Fisher. Valor de P<0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Análise de macrorestrição com a enzima speI foi realizada em isolados produtores de M-βla. Resultados: As taxas de resistência para todos os agentes foram superiores entre os isolados obtidos na ISCMPA em relação aos do HCPA. A ceftazidima mostrou ser o antibiótico mais efetivo contra os isolados de ambos Hospitais (ISCMPA e HCPA) com taxa de resistência de 25,7% (ISCMPA) e 6,1% (HCPA). A expressão de AmpC foi observada em 190 isolados (83,7% HCPA e 77,1% ISCMPA). Não foi possível detectar a presença de ESBL entre todos as P. aeruginosa avaliadas em ambos hospitais. Foi observada a presença de M-βla em 28 isolados (20,0%) da ISCMPA. Mas não foi detectada M-βla em nenhuma P. aeruginosa do HCPA. A análise de macrorestrição mostrou que 14 de 16 P. aeruginosa Mβla positivas pertenciam a um clone (denominado clone A), e seus subclones. Apenas dois outros clones (B e C) foram identificados em um isolado cada. / Objectives: To evaluate susceptibility profile, the prevalence of extendedspectrum β-lactamases (ESBL) production, AmpC and Metallo-β-lactamases (M-βla) in Pseudomonas aeruginosa obtained from two distinct hospitals (ISCMPA and HCPA) in Porto Alegre, Brazil. In addiction, molecular typing by PFGE was perfomed among isolates producing M-βla in order to evaluate probably clonal relatedness. Methods: The susceptibility of 238 P. aeruginosa to 8 antimicrobial agents was determined by the disk diffusion method, using Müller-Hinton agar (MH) in accordance with “National Committee for Clinical Laboratory Standards” guidelines. All isolates were evaluated for AmpC production with the imipenem disk (strong inducer) near of the cefepime/ceftazidime disk (substrate). A blunting of the cefepime/ceftazidime zone by imipenem-induced enzyme, indicated positive result for AmpC. All isolates were evaluated for ESBL production by disk approximation test with ceftazdime, cefepime, cefotaxime, ceftriaxone plus ticarcillin-clavulanate as inhibitor. M-βla production was determined by disk approximation test with disks containing CAZ and 2-mercatopropionic acid (2-MPA). The results were compared by the Fisher’s Exact Test. Macrorestriction analysis by SpeI, followed by PFGE, was perfomed in isolates M-βla positive. The resistance rates were compared by The Fisher’s Exact Test. P values < 0.05 were considered to be statistically significant. Results: The resistance rates to all antimicrobial agents were higher among isolates obtained from ISCMPA than those obtained from HCPA. The ceftazidime was the more active antibiotic against the isolates in both hospitals with resistance rates of 25,7% (ISCMPA) and 6,1% (HCPA). The derepression of AmpC was observed in 190 isolates (83,7% HCPA and 77,1% ISCMPA). It was not possible to detect the presence of ESBL among all P. aeruginosa evaluated in both hospitals. Positive results for M-βla production were observed in 28 isolates (20,0%) from ISCMPA. But none M-βla production was identified in P. aeruginosa from HCPA. The macrorestriction analysis by PFGE, showed that 14 of 16 M-βla positive P. aeruginosa beloneed to one clone (named clone A) and its subclones.Only two others clones (B and C) were identified in one isolate each.

Le norovirus murin (MNV) est un agent pathogène de la souris récemment découvert et représente le contaminant le plus courant dans les animaleries de Recherche. Néanmoins, les effets de l'infection au MNV sur la recherche biomédicale ne sont pas encore clairs. Nous avons testé l'hypothèse que l'infection au MNV pourrait modifier la réponse immunitaire chez les souris atteintes d'une infection pulmonaire aiguë. Nous rapportons ici que la co-infection avec MNV augmente la survie des souris ayant une infection pulmonaire aiguë à Pseudomonas aeruginosa et diminue la production in vivo et in vitro de cytokines pro-inflammatoires. Nos résultats suggèrent que l'infection au MNV peut profondément modifier les paramètres étudiés dans les modèles classiques d'infection et mener à de fausses conclusions dans ces modèles expérimentaux. / The murine norovirus (MNV) is a recently discovered mouse pathogen, this virus represents the most common contaminant in laboratory mouse colonies. Nevertheless, the effects of MNV infection on biomedical research are still unclear. We tested the hypothesis that MNV infection could alter immune response in mice with acute lung infection. Here we report that co-infection with MNV increases survival of mice with Pseudomonas aeruginosa acute lung injury and decreases in vivo and in vitro production of pro-inflammatory cytokines. Our results suggest that MNV infection can deeply modify the parameters studied in conventional models of in-fection and lead to false conclusions in experimental models.

Um total de 1.520 bactérias isoladas a partir de amostras de lodo de esgoto doméstico e de solo de área preservada foi avaliado para a produção de polihidroxialcanoatos (PHA) com os corantes lipofílicos Nile Red A e Sudan Black B, permitindo a detecção de 261 isolados. Ensaios de produção de PHA revelaram isolados produtores de P3HB apresentando valores superiores à linhagem Burkholderia sacchari LFM101 e valores de produção de PHAMCL superiores à linhagem Pseudomonas sp. LFM046, além de 6 isolados produtores da mistura de P3HB e PHAMCL. Os primers RECF1/RECR permitiram a detecção específica do gene phaC do tipo I de três bactérias produtoras de P3HB, e os primers P613F/P613R detectaram genes phaC do tipo I em bactérias produtoras da mistura de polímeros. Um fragmento de DNA de 4 kpb de uma biblioteca genômica do isolado RMP1058BII, produtor da mistura de P3HB e PHAMCL, foi detectado utilizando os primers P613F/P613R, e a expressão desse fragmento de DNA uma linhagem de Pseudomonas mutada no gene phaC levou à produção de pequena quantidade de P3HB. / A total of 1520 isolates from domestic sewage sludge or soil of preserved area were evaluated in regards of PHA production using the lipophilic Nile Red A or Sudan Black B dyes, allowing the detection of 261 isolates. PHA production experiments revealed P3HB producing isolates at higher amounts than the strain Burkholderia sacchari LFM101 and PHAMCL production rates higher than those presented by the strain Pseudomonas sp. LFM046, besides 6 isolates producing P3HB and PHAMCL mixtures. The RECF1/RECR primers allowed the specific type I phaC genes detection in three P3HB producing bacteria and the P613F/P613R primers detected type I phaC genes in the polymer mixture producing isolates. A 4 kbp DNA fragment from a genomic library of the isolate RMP1058BII was detected using the P613F/P613R primers. This DNA fragment expression in a Pseudomonas strain mutated in phaC gene leaded to the production of small amounts of P3HB.

Para avaliar a sensibilidade da colistina e polimixina B de isolados de P. aeruginosa multirresistentes foram utilizadas diferentes metodologias, como microdiluição, Etest e disco-difusão, cujos resultados evidenciaram que a microdiluição continua sendo o método de referência. Do total de 109 isolados, não houve resistência para colistina e apenas um isolado mostrou-se resistente para a polimixina B. Para determinar a linhagem clonal destes isolados foi empregada a técnica de eletroforese em campo pulsado, a qual evidenciou a existência de um padrão molecular predominante durante o período de estudo e a presença de 7 grupos de isolados de P. aeruginosa multirresistentes em 2003 / -

A resistência aos carbapenêmicos em amostras de Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter spp aumentou na última década. Vários surtos causados por esses agentes já foram descritos no Brasil. O presente estudo comparou métodos fenotípicos de triagem de carbapenemase em P. aeruginosa e Acinetobacter spp. isolados de hemoculturas de pacientes internados no HC-FMUSP. Foram estudados 108 isolados de P. aeruginosa identificados por sistema automatizado Vitek® e 50 isolados Acinetobacter spp. identificados pelo método miniaturizado API20NE. A determinação inibitória mínima dos carbapenêmicos foi realizada pela técnica de microdiluição em caldo e a tipagem molecular pela técnica de eletroforese em campo pulsado (PFGE). Os genes codificadores de carbapenemase foram identificados por meio da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) e foi avaliada a hidrólise de imipenem de todos os isolados positivos para esses genes. Sensibilidade, especificidade, valor preditivo negativo e positivo dos testes fenotípicos foram calculados usando como padrão-ouro a detecção dos genes codificadores das carbapenemases por PCR. Nos isolados de Acinetobacter spp, foram pesquisados os genes das oxacilinases, dos quais quarenta e nove (98%) apresentaram pela técnica de PCR genes codificadores da enzima Oxa-51-like, sendo que um isolado não apresentou essa enzima e após sequenciamento do gene codificador da porção 16S do RNA ribossomal, foi considerado da espécie A. calcoaceticus. Em trinta e oito (76%) dos isolados foi detectado o gene blaOXA-143, em nove (18%) foi detectado o gene blaOXA-23, sendo que sete desses isolados pertenciam ao mesmo clone. Apenas cinco (10%) isolados de Acinetobacter spp apresentaram o gene blaIMP-1. Para os isolados de P. aeruginosa o gene blaSPM-1 foi o mais frequente sendo identificado em vinte e um (19,4%) dos isolados e quatro (3,7%) foi identificado com o gene blaVIM-2. Nove dos vinte e um isolados positivo para gene blaSPM-1, apresentaram a mesma clonalidade. O gene codificador blaGES-5 foi encontrado em quatro (3,7%) dos isolados de P. aeruginosa. Dos vinte quatro isolados P. aeruginosa que apresentaram gene codificador da M?L, apenas um isolado não hidrolisou IMI entre os Acinetobacter spp e apenas dois dos cincos isolados positivos para o gene codificador de M?L, hidrolisaram o IMI e apresentaram inibição com o EDTA. Dos vários testes fenotípicos realizados, os melhores resultados foram observados com Etest® M?L para ambos microrganismos com sensibilidade de 100%, mas esse teste foi pouco específico. Para os isolados de Acinetobacter spp o melhor resultado foi observado com o teste de aproximação de disco de IMI com disco de ABM, que apresentou sensibilidade de 100% e especificidade de 71% e para P. aeruginosa foi a aproximação de disco de CAZ com um disco de EDTA, que apresentou sensibilidade de 48% e especificidade de 93%. O presente estudo verificou que não existe um único teste fenotípico que consiga identificar carbapenemases nesses isolados e que a performace dos testes varia de acordo com as carbapenemases encontradas / Carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter spp increased in the last decade. Several outbreaks caused by these agents resistant to carbapenems have been reported in Brazil. This study compared several phenotypic methods for screening of carbapenemase in P. aeruginosa and Acinetobacter spp isolated from blood cultures of hospitalized patients in HCFMUSP. One hundred and eight isolates were studied of P. aeruginosa identified by the automated system Vitek® and fifty isolates Acinetobacter spp identified by the API20NE method miniaturized. The determination of cabapenem minimum inhibitory was performed by the microdilution broth. Molecular typing was performed using the technique of pulsed field gel electrophoresis (PFGE). Genes encoding carbapenemase were identified by the technique of polymerase chain reaction (PCR) and was evaluated by hydrolysis of imipenem of all the positives isolates. Sensitivity, specificity, positive and negative predictive value of phenotypic tests were calculated using as the gold standard the detection of genes encoding carbapenemases by PCR. Oxacilinases genes were evaluated in isolates of Acinetobacter spp, of which forty-nine (98%) exhibited by PCR enzyme- encoding gene OXA-51-like, and the one isolate that did not show this enzyme, after gene sequencing encoding portion 16S ribosomal RNA was considered the species A. calcoaceticus. In thirty-eight (76%) isolates the gene OXA-143- like was detected and seven belonged to the same clone. Only five (10%) isolates of Acinetobacter spp showed the gene blaIMP-1. For the isolates of P. aeruginosa, gene blaSPM-1 was the most frequent being present in twenty-one (19,4%) isolates and four (3,7%) was identified with the gene blaVIM-2. Nine of the twenty-one isolates positive for gene blaSPM-1, showed the same clonality. The gene encoding blaGES-5 was found in four (3,7%) isolates of P. aeruginosa. Among the twenty-four isolates P. aeruginosa harboring M?L, not only one isolated hydrolyzed IMI, between Acinetobacter spp two of five isolates harboring M?L hydrolyzed IMI that was inhibited by EDTA. Of the various phenotypic tests conducted, the best results were observed for Etest® for both micro-organisms with sensitivity 100%, but this test was not specific. For the isolates of Acinetobacter spp best result was observed in the nearest IMI disk a disk of ABM, which had a sensitivity of 100% and specificity of 71% and for P. aeruginosa was approaching CAZ disk with a disk EDTA which had a sensitivity of 48% and specificity of 93%. This study verified that there is no single phenotypic test which can identify those isolates carbapenemases and that the performance of the tests various according to carbapenemases found

Opções terapêuticas para tratar infecções por Pseudomonas aeruginosa são limitadas por seus diversos mecanismos de resistência, que podem ou não ser detectados no laboratório clínico. Um fenótipo observado na rotina laboratorial é o surgimento de subpopulações resistentes a partir de uma população sensível aos antimicrobianos – heteroresistência. Em P. aeruginosa esse fenômeno já foi investigado para carbapenêmicos, porém, em relação à polimixina B, não há dados literários. Objetivamos avaliar a heteroresistência à polimixina B em dois grupos de P. aeruginosa, um sensível e outro resistente aos carbapenêmicos. Cento e vinte e quatro isolados de P. aeruginosa foram obtidos, aleatoriamente, no Hospital de Clínicas de Porto Alegre em 2011. O perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos, disco difusão e microdiluição em caldo – CIM (determinação da concentração inibitória mínima) para polimixina B, foi realizada conforme o Clinical Laboratory Standard Institute (CLSI) 2011. Isolados resistentes aos carbapenêmicos foram avaliados para CIM dos carbapenêmicos e cefalosporinas, e para pesquisa fenotípica e genotípica de metalo-β-lactamase (MβL). Um total de 24/124 isolados foi separado em dois grupos, um sensível (grupo S) e outro resistente (grupo R) aos carbapenêmicos (imipenem e/ou meropenem) para investigação da heteroresistência a polimixina B. Realizou-se ensaio de heteroresistência em duplicata através de diluições seriadas, partindo de uma suspensão de 0,5 de MacFarland e inoculadas em Agar Mueller Hinton com concentrações crescentes de polimixina B (0; 0,5; 1; 2; 4 e 8μg/mL). Após 5 dias de passagem em meio sem antibiótico, foi determinada a CIM dos isolados que cresceram na concentração mais alta de polimixina B. O perfil de análise populacional (PAP) foi definido pela razão do número de unidades formadoras de colônia (UFC) da placa com maior concentração de polimixina B onde houve crescimento bacteriano, pelo número de UFC da placa sem antibiótico. Foram consideradas heteroresistentes amostras que apresentaram subpopulações com crescimento em concentração de polimixina B ≥ 2 μg/mL. Amostras com subpopulações com crescimento em concentração de polimixina B superiores duas vezes ao CIM original, mas < 2 μg/mL, foram classificadas como heterogêneas. O resultado do disco difusão indicou heterogeneidade de suscetibilidade, sendo que gentamicina e imipenem foram os antibióticos com maior percentual de resistência e aztreonam e ciprofloxacino apresentaram os maiores perfis de sensibilidade. Todos os isolados foram sensíveis à polimixina B, com CIM50 e CIM90 de 1μg/mL e 2μg/mL, respectivamente. Trinta e sete isolados (30%; 37/124) apresentaram resistência aos carbapenêmicos. Quatro amostras foram positivas para MβL no teste fenotípico, sendo que o gene blaIMP foi idenficado nestas amostras. O grupo S não apresentou subpopulação heteroresistente, porém 3 isolados apresentaram subpopulação heterogênea. A freqüência do PAP no grupo S variou entre 2,1x10-4 a 4,0x10-7. O grupo R apresentou uma amostra heteroresistente e 6 isolados apresentaram subpopulação heterogênea, a freqüência do PAP variou entre 2,6x10-4 a 2,0x10-7. Os resultados deste estudo indicam baixa ocorrência de heteroresistência à polimixina B em amostras de P. aeruginosa tanto resistentes quanto sensíveis aos carbapenêmicos. No entanto, diversas amostras apresentaram subpopulações heterogêneas (CIM aumentada para a polimixina B), o que poderia explicar eventuais falhas terapêuticas durante o tratamento. / Therapeutic options to treat infections caused by Pseudomonas aeruginosa are limited because of their different resistance mechanisms that can be or don't be detected in the clinical laboratory. A phenotype that has been observed in our laboratory is the emergence of resistant subpopulations from a population sensitive to antibiotics - a phenomenon named heteroresistance. In P. aeruginosa this phenomenon has been investigated for carbapenems, however, in relation to the polymyxin B no data in the literature. We investigate the heteroresistance and polymyxin B into two groups P. aeruginosa, one sensitive and second resistant to carbapenems. One hundred twenty-four strains of P. aeruginosa were obtained randomly at the Hospital de Clinicas de Porto Alegre in 2011. The Antimicrobial Susceptibility Testing (Disk-difusion and the microdiluition broth, with determination of minimum inhibitory concentration (MIC) for polymyxin B, was performed according the Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI), 2011. Isolates resistant to carbapenems were evaluated for MIC of carbapenems and cephalosporins, also for phenotypic and genotypic metallo-β-lactamase (MβL). A total of 24/124 strains were separated in two groups, one sensitive (S group) and other resistant (R group) to carbapenems (imipenem and / or meropenem) for investigation of heteroresistance polymyxin B. The assay was performed in duplicate heteroresistance through serial dilutions, starting from a 0.5 MacFarland suspension and inoculated into Mueller Hinton Agar with increasing concentrations of polymyxin B (0; 0,5; 1; 2; 4 e 8μg/mL). After 5 days of passage in medium without antibiotics, was determined the MIC of the isolates that grew at the highest concentration of polymyxin B. The population analysis profile (PAP) was defined as the ratio of the number of colony forming units (CFU) on the card with the highest concentration of polymyxin B in which bacterial growth, the number of CFU plate without antibiotic. We considered heteroresistant samples that showed subpopulations with growth in concentration of polymyxin B ≥ 2 mg / mL. Samples with subpopulations growing at higher concentration of polymyxin B twice CIM original, but <2 mg / mL were classified as heterogeneous. The result of AST indicated heterogeneity of susceptibility, and gentamicin and imipenem were the highest percentage with antibiotic resistance and aztreonam and norfloxacin showed the highest sensitivity profiles. All isolates were susceptible to polymyxin B, with CIM50 and CIM90 of 1μg/mL and 2μg/mL, respectively. Thirty-seven isolates (30%; 37/124) were resistant to carbapenems. Four samples were positive for the phenotypic test to MβL and the blaIMP gene was indentificated in this samples. The S group showed no subpopulation heteroresistente, but 3 isolates showed heterogeneous subpopulation. The frequency of PAP in group S varied between 2,0x10-4 to 4,0x10-7. The group R provided a sample heteroresistant and 6 isolates showed heterogeneous subpopulation, the frequency of PAP varied between 2,6x10- 4 a 2,0x10-7. The results of this study indicate a low occurrence of heteroresistance to polymyxin B in samples of P. aeruginosa so resistant assensitive to carbapenems. However, several samples showed heterogeneous subpopulations (MIC increased to polymyxin B) which could explain possible treatment failure during treatment.

Os polihidroxialcanoatos (PHA) são poliésteres bacterianos. Na sua biossíntese, a PHA sintase incorpora monômeros 3HA à cadeia polimérica. O objetivo deste trabalho foi estudar o potencial da PHA sintase de 2 isolados do gênero Burkholderia sp. na produção de copolímeros. Construiram-se linhagens recombinantes que abrigavam os genes da PHA sintase classe I, em mutantes de Pseudomonas sp. e Burkholderia sacchari, que não acumulam PHA. Foram realizados ensaios de acúmulo de PHA usando glicose como fonte de carbono, apresentando a produção de unidades de 3HB, 3HO e 3HD nas linhagens recombinantes de Pseudomonas sp. As linhagens recombinantes de B. sacchari incorporaram como único constituinte P(3HB). Ensaios de acúmulo de PHA foram realizados nas linhagens recombinantes de B. sacchari, usando como co-substratos diferentes ácidos graxos, sendo detectada a incorporação de unidades de 3HV e 3HHx além do 3HB, quando foram fornecidos acido hexanóico e valérico. Estes resultados indicam que as PHA sintases classe I são capazes de incorporar diferentes unidades monoméricas. / The polyhydroxyalkanoates (PHA) are bacterial polyester. In their biosynthesis, the PHA synthase incorporates monomers 3HA to the polymer chain. The objective of this work was to study the potential of PHA synthase of 2 isolates of the genus Burkholderia sp. in the production of copolymers. Were constructed recombinant strains that housed the genes of PHA synthase class I mutants of Pseudomonas sp. and Burkholderia sacchari, which do not accumulate PHA. PHA accumulation assays were performed using glucose as carbon source, showing the production of units of 3HB, 3HO and 3HD in recombinant strains of Pseudomonas sp. The recombinant strains of B. sacchari incorporated as single constituent P(3HB). PHA accumulation assays were performed on the recombinant strains of B. sacchari, Using as co-substrates different fatty acids, being detected the incorporation of units of 3HV and 3HHx beyond the 3HB, when were supplied hexanoic acid and valerico. These results indicate that the PHA synthases class I are able to incorporate different monomer units.

Na propriedade rural, onde o leite cru refrigerado fica armazenado até a captação pelo caminhão tanque em coleta a granel, o mesmo é mantido a temperatura de refrigeração entre 1 a 4ºC por longos períodos (até 96 horas), os microrganismos psicrotróficos encontram condições favoráveis para sua multiplicação, produzindo enzimas proteolíticas e lipolíticas termotolerantes, podendo provocar alterações indesejáveis no leite e nos seus derivados. Quando estes microrganismos estão presentes em elevadas populações, pode ser indicativo de baixa qualidade do leite e insatisfatória condições sanitárias para o processamento. Devido a necessidade da melhora da qualidade dos produtos lácteos, objetivou-se a execução desta pesquisa realizando levantamentos sobre o cumprimento dos padrões microbiológicos exigidos pela atual legislação brasileira IN 62 (BRASIL, 2011), pesquisas sobre os microrganismos psicrotróficos, Pseudomonas spp. e produção de enzimas proteolítica e lipolítica por Pseudomonas spp. As coletas foram realizadas em 10 propriedades do Estado de São Paulo na Regional Agrícola do Escritório de Desenvolvimento Rural - EDR Limeira - SP, sendo, 5 propriedades com ordenha manual e 5 propriedades com ordenha mecânica, nos períodos de chuva e seca e em vários pontos durante a obtenção do leite cru refrigerado e também do leite com intervalo de 24 horas até a captação deste leite pelo caminhão. As médias das populações dos microrganismos mesófilos na ordenha manual, foi diferente estatisticamente significativo no leite recém ordenhado (1,52×106 UFC.mL-1) para o leite com 24 horas de armazenamento (2,67×107 UFC.mL-1) no período chuvoso, e na ordenha mecânica, o encontrado foi uma diferença estatisticamente significativa no leite recém ordenhado (3,87×106 UFC.mL-1) para o leite com 24 horas de armazenamento (9,82×108 UFC.mL-1) também no período chuvoso. Nas populações dos microrganismos psicrotróficos, suas médias diferiram estatisticamente na ordenha manual no período da chuva no leite recém ordenhado (1,48×104 UFC.mL-1) para o leite com 48 horas de armazenamento (1,49×105 UFC.mL-1) e na ordenha mecânica, o leite recém ordenhado (8,74×103 UFC.mL-1), com 24 horas de armazenamento (4,33×104 UFC.mL-1) não diferiram entre si e foram diferentes estatisticamente do leite com 48 horas de armazenamento (3,46×105 UFC.mL-1) apresentaram valor elevado, principalmente quando o leite cru refrigerado permanece por longos períodos de armazenamento na propriedade rural, que pode ser um sério fator de comprometimento pela produção de lipases ou proteases principalmente pelas Pseudomonas spp. onde em todos os pontos amostrados foram isolados este microrganismo produzindo enzimas (lipase e/ou protease). A maior porcentagem de atividade lipolítica foi verificada no período seco, já a maior porcentagem de atividade proteolítica foi verificada no período chuvoso. Contudo, deve-se intensificar as medidas de autocontrole para minimizar os efeitos dos microrganismos mesófilos e psicrotróficos sobre a qualidade do leite cru refrigerado e, consequentemente, de seus derivados. / On the farm, where the cold raw milk is stored until the tank truck collects it in bulk, it is kept at refrigeration temperature between 1 and 4°C for extended periods (96 hours), the psychrotrophic microorganisms find favorable conditions for their multiplication, producing proteolytic and lipolytic thermotolerant enzymes, it may cause undesirable changes in milk and its derivatives. When these microorganisms are present in a large population, it can be an indicative of low quality milk and unsatisfactory sanitary conditions for its processing. Due to the need of improving the quality of dairy products, this research was carried out with surveys about fullfilment of microbiological standards required by current Brazilian law IN 62 (BRAZIL, 2011), researches on psychrotrophic microorganisms, Pseudomonas spp. and production of proteolytic and lipolytic enzymes by Pseudomonas spp. Samples were collected in 10 farms in the state of São Paulo in the Regional Agrícola do Escritório de Desenvolvimento Rural - EDR in Limeira - SP, 5 farms with manual milking and 5 farms with mechanical milking; during the rainy and dry periods and in several points during the obtaining of refrigerated raw milk and also milk with a 24-hour-interval before the collection of this milk by the truck. The averages of the mesophilic population in the manual milking were different, statistically significant between the newly expressed milk (1,52×106 UFC.mL-1) and 24 hour-storage milk (2,67×107 UFC.mL-1) in the rainy season, and during mechanical milking, what was found was a statistically significant difference between the newly expressed milk (3,87×106 UFC.mL-1) and 24-hour-storage milk (9,82×108 UFC.mL-1, also in the rainy season. In the populations of psychrotropic microorganisms, the averages statistically differed in manual milking during the period of rain between the newly expressed milk (1,48×104 UFC.mL-1) and 48-hour-storage milk (1,49×105 UFC.mL-1); and during the mechanical milking, newly expressed milk (8,74×103 UFC.mL-1) and 24-hour-storage (4,33×104 UFC.mL-1); were not different and were statistically different from 48-hour-storage milk (3,46×105 UFC.mL-1), they present high value, especially when refrigerated raw milk remains for long storage periods on the farm, which can be a serious impairment factor for the production of lipases and proteases mainly by Pseudomonas spp. where in all the sampling sites these microorganisms were isolated producing enzymes (lipase and/or protease). The highest percentage of lipolytic activity was observed in the dry season; the highest percentage of proteolytic activity was observed during the rainy season. However, the self-control measurementsshould be intensified to minimize the effects of mesophilic and psychrotrophic microorganisms on the quality of refrigerated raw milk and, consequently, its derivatives.

L'utilisation de virus de bactéries ou bactériophages pourrait être un complément efficace à l’antibiothérapie. Mon travail a porté sur la caractérisation de bactériophages dirigés contre l’espèce Pseudomonas aeruginosa, pathogène opportuniste responsable d'infections des voies respiratoires des patients atteints de mucoviscidose.J'ai tout d'abord déterminé la sensibilité des souches mucoviscidosiques au Pyophage (un cocktail de phages thérapeutiques Géorgien) et identifié six phages lytiques de quatre genres différents. Environ 15% des souches sont résistantes au Pyophage. Ensuite, en utilisant les souches cliniques multi-résistantes aux phages comme bactérie d’enrichissement, 32 phages ont été obtenus à partir des eaux usées de France et Côte d’Ivoire. Tous les phages analysés sont caudés et distribués au sein de dix genres parmi lesquels six exclusivement lytiques. J'ai identifié des souches bactériennes qui demeurent insensibles à tous les phages. J'ai montré que le système CRISPRs-Cas n'est pas associé à la résistance des souches aux phages lytiques. / The use of viruses of bacteria commonly called bacteriophages could constitute an efficient complement to antibiotics. During my PhD, I have characterized phages infecting the opportunistic pathogen Pseudomonas. aeruginosa, responsible for lung infections in cystic fribrosis patients. Firstly, I investigated the efficiency of Pyophage (a cocktail of phages therapeutic Georgian) on clinical P. aeruginosa strains and recovered six lytic phages from four different genus. The Pyophage appears to be unactive on approximately 15% of clinical strains. Secondly, and using multi-phages resistant strains as enrichment bacteria, 32 phages were isolated from waste water of France and Côte d’Ivoire. All phages are tailed and distributed within ten different genus including six exclusively lytic. I identified bacterial strains which remain insensitive to all phages. I also demonstrated that the CRISPRs-cas system plays no role in the resistance of strains to lytic phages.