Os surfactantes são poderosos agentes anfipáticos com aplicação em vários segmentos industriais, como as indústrias petrolífera, alimentícia, e farmacêutica, entre outras. Muitos biossurfactantes têm sido produzidos, embora poucos sejam comercializados em virtude do alto custo de produção e principalmente no que se refere à utilização de substratos e aos processos de purificação. Neste sentido, a utilização dos resíduos industriais, milhocina e óleo de canola residual de fritura, como substratos alternativos para a produção de um biossurfactante por Pseudomonas cepacia CCT6659 foi avaliada com vistas à aplicação na área ambiental, As concentrações dos constituintes do meio foram estudadas utilizando um Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR) como ferramenta estatística na redução da tensão superficial. O biossurfactante produzido no meio constituído por milhocina 3%, óleo de fritura (canola) 2% e NaNO3 0,2% reduziu a tensão superficial para 26 mN/m após 60 horas sob agitação de 250 rpm. No estudo da cinética observou-se que a produção do biossurfactante estava associada ao crescimento celular. O rendimento em biossurfactante isolado foi de 8,0 g/L. As propriedades do biossurfactante isolado foram investigadas e sua CMC calculada. A caracterização bioquímica preliminar revelou a natureza glicolipídica e aniônica do biossurfactante. O biossurfactante foi capaz de emulsificar 90% do óleo de motor e demonstrou estabilidade durante exposição a altas temperaturas (120C por 15 minutos), altas concentrações salinas (12% NaCl) e em ampla faixa de pH (2-12). Testes realizados com o biossurfactante bruto demonstraram ausência de toxicidade frente ao microcrustáceo Artemia salina e a duas espécies de repolho Brassica oleracea. O biossurfactante bruto também foi eficiente na remoção de 75% do óleo de motor adsorvido em amostras de areia e na dispersão do óleo 65%, além de ser capaz de remover 90% do óleo aderido à superfície sólida. Os resultados obtidos demonstram o potencial do biossurfactante para aplicação na indústria de petróleo, recuperação de óleo, limpeza de tanques de estocagem e na remediação de derramamentos de óleos em solos e água. / Surfactants are amphipathic powerful agents with application in various industries like oil industries, food, and pharmaceutical industries, among others. Several biosurfactants have been produced, but few are marketed due to the high cost of production and especially in relation to use of substrates and purification processes. In this sense, the use of industrial waste, corn steep liquor and residual canola oil frying, as alternative substrates for the production of a Pseudomonas cepacia CCT6659 biosurfactant was assessed in order to apply the environmental area, concentrations of constituents in the medium were studied using one central composite rotational design (DCCR) as a statistical tool to reduce surface tension. The biosurfactant produced in medium consisting of 3% corn steep liquor, cooking oil (canola) 2% NaNO3, and 0.2% reduced the surface tension to 26 mN / m after 60 hours under agitation of 250 rpm. In the study of the kinetics observed that the production of the biosurfactant was associated with cellular growth. The isolated biosurfactant yield was 8.0 g / L. The properties of the isolated biosurfactant were investigated and their CMC calculated. A preliminary biochemical characterization revealed the nature of the anion and glicolipídica biosurfactant. The biosurfactant was able to emulsify 90% engine oil and demonstrated stability during exposure to high temperatures (120 C for 15 minutes), high salt concentrations (12% NaCl) and in a wide pH range (2-12). Tests performed with crude biosurfactant showed no toxicity against the brine shrimp Artemia salina and two species of cabbage Brassica oleracea. The crude biosurfactant was also efficient in the removal of 75% of motor oil adsorbed on samples of sand and 65% oil dispersion, besides being able to remove 90% of the oil adhered to the solid surface. The results demonstrate the potential of biosurfactant for application in the oil industry, oil recovery, cleaning storage tanks and remediation of oil spills on land and water.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Os biossurfactantes são compostos anfipáticos capazes de exibir uma variedade de propriedades tensoativas que, entre outras funções, auxiliam os micro-organismos a solubilizar e degradar substratos hidrofóbicos. Nos últimos anos, os biossurfactantes têm sido investigados como possíveis substitutos para os surfactantes sintéticos, especialmente por possuírem vastas aplicações ambientais. Nesse sentido, o objetivo desse trabalho foi caracterizar o biossurfactante produzido pela bactéria Pseudomonas cepacia CCT6659 cultivada em 2% de óleo de soja residual e 2% de milhocina e aplicar a biomolécula na remediação de solo contaminado por derivados de petróleo. O biossurfactante foi inicialmente produzido, isolado e submetido à técnica de Cromatografia em Camada Delgada, sendo classificado como uma biomolécula predominantemente hidrofóbica e aniônica contendo lipídeos e carboidratos nas proporções de 75 e 25%, respectivamente. A caracterização por Ressonância Magnética Nuclear (1H e 13C NMR) revelou a presença de grupos carbonílicos, olefínicos e alifáticos, tipicamente observados em espectros de lipídeos. Experimentos de biodegradação foram posteriormente conduzidos em solo contaminado com compostos orgânicos hidrofóbicos coletado de uma antiga região portuária na presença de um consórcio autóctone. As amostras de solo, enriquecidas inicialmente com melaço de cana, foram submetidas aos seguintes tratamentos: condição 1 solo + células bacterianas, condição 2 solo + biossurfactante, condição 3 solo + células bacterianas + biossurfactante, condição 4 solo sem adição de células e biossurfactante (controle). Os resultados obtidos demonstraram 83% de degradação dos contaminantes na presença de ambos surfactante e micro-organismo produtor (condição 3) após os primeiros dez dias de experimento, enquanto que percentuais de degradação acima de 95% foram observados nas condições 1, 2 e 3 entre 35 e 60 dias. Os resultados obtidos demonstram o potencial do biosssurfactante e de seu micro-organismo produtor como coadjuvantes dos processos de remediação em solos contaminados com derivados de petróleo. / Biosurfactants are amphipathic compounds capable of displaying a variety of surface-active properties that, among other functions, assist microorganisms that degrade and solubilize hydrophobic substrates. In recent years, the biosurfactants have been investigated as possible replacements for synthetic surfactants, especially because they have large environmental applications. In this sense, the bacterium Pseudomonas cepacia CCT6659 cultured with 2% soybean waste frying oil and 2% corn steep liquor as substrates produced a biosurfactant with potential to be applied in bioremediation of soils. Firstly, the biosurfactant was produced, isolated and submitted to Thin Layer Chromatography, being classified as an anionic biomolecule with lipid and carbohydrate combination of 75 and 25% respectively. The characterization by proton nuclear magnetic resonance (1H and 13C NMR) revealed the presence of carbonyl, olefinic and aliphatic groups, being observed typical spectra of lipids. Four sets of biodegradation experiments were carried out with a soil contaminated by hydrophobic organic compounds amended with sugar cane molasses in the presence of indigenous consortium as follows: set 1 soil + bacterial cells, set 2 soil + biosurfactant, set 3 soil + bacterial cells + biosurfactant, set 4 soil without bacterial cells and biosurfactant (control). Interestingly, when biosurfactant and bacterial cells were used (set 3), significant oil biodegradation activity occurred (83%) in the first ten days of experiments, while maximum degradation of the organic compounds (above 95%) was observed in sets 1 , 2 and 3 between 35 and 60 days. It is evident from the results that the biosurfactant alone or its producer specie is capable of promoting biodegradation to a large extent.

Foram avaliados 528 isolados clínicos de Pseudomonas aeruginosa de 131 pacientes fibrocísticos atendidos em um centro de referência em fibrose cística (FC) durante o período de 2005 a 2008. 135 isolados clínicos (25,6%) apresentaram subpopulação hipermutante (isolados com altas taxas de mutações) utilizando teste modificado de suscetibilidade aos antimicrobianos. Destes, 9 isolados (6,7%) de 7 pacientes foram classificados como hipermutantes (HPM) segundo estimativa da freqüência de mutação. Após seqüenciamento do gene mutS e análise de mutações relacionadas à inativação do sistema de reparo de erros no pareamento do DNA (Mismatch Repair System - MRS), foi possível observar este tipo de mutação em 5 isolados HPM de 4 pacientes. Avaliamos a formação de biofilme em 45 isolados NHPM, 9 HPM e suas respectivas subpopulações por duas metodologias. Segundo o primeiro método, 24 (53,3%) e 3 (21,4%) isolados NHPM e HPM, respectivamente, foram classificados como não-formadores de biofilme. Pelo segundo método, apenas 4 (8,9%) isolados NHPM e nenhum isolado HPM foram classificados nessa categoria. Os percentuais de resistência aos antibióticos ceftazidima, ciprofloxacino e tobramicina em condições de biofilme foram mais elevados que aqueles obtidos em crescimento plantônico e, em ambas as condições, foi possível evidenciar forte associação entre hipermutabilidade e aumento de resistência antibiótica. A associação dos macrolídeos azitromicina e claritromicina, em concentrações sub-inibidoras, com os antibióticos anti-pseudomonas, demonstrou ação inibitória sobre isolados clínicos de P. aeruginosa em condições de biofilme, o que sugere sua indicação no tratamento de infecções por P. aeruginosa pela sua ação anti-biofilme. / We evaluated 528 clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in 131 CF patients attended at a referral center for cystic fibrosis (CF) during the period of 2005 to 2008. 135 clinical isolates (25.6%) presented hypermutable subpopulation (isolates with high mutation rates) using a modified antimicrobial susceptibility method. Of these, 9 isolates (6.7%) of 7 patients were classified as hypermutable (HPM) according to the estimate of mutation frequency. After gene sequencing and analysis of mutS mutations related to inactivation of the repair system errors in DNA pairing (Mismatch Repair System - MRS), we observed this type of mutation in 5 HPM isolates of 4 patients. We evaluated the biofilm formation in 45 isolates NHPM, 9 HPM and their subpopulations by two methods. According the first method, 24 (53.3%) and 3 (21.4%) isolates NHPM and HPM, respectively, were classified as non-biofilm formers. According the second method, only 4 (8.9%) isolates NHPM and none HPM were classified in this category. The percentages of resistance to antibiotics ceftazidime, ciprofloxacin and tobramycin in conditions of biofilm were higher than those obtained in planktonic growth, and in both conditions, it was observed a strong association between hypermutability and increased antibiotic resistance. The association of macrolides azithromycin and clarithromycin, in sub-inhibitory concentrations, with anti-pseudomonas antibiotics, has shown inhibitory activity on clinical isolates of P. aeruginosa in biofilm conditions, which should be recommended for treatment of CF P. aeruginosa infections due to its anti-biofilm action.

Resumo não disponível.

P. aeruginosa est une bactérie pathogène de l'homme, responsable d'infections nosocomiales chez les patients immunodéprimés. Bien que son évolution au sein d'un patient soit bien décrite, son évolution génomique globale au cours de sa propagation dans un hôpital est très mal connue. Le clone à haut-risque ST395 multirésistant aux antibiotiques a diffusé dans le Centre Hospitalier Regional Universitaire de Besançon entre 1997 et 2008 en infectant ou colonisant plus de 300 patients. Une approche WGS a été utilisée afin d'identifier l'origine de l'épidémie, les caractéristiques ayant aidé à son installation à l'hôpital ainsi que celles à l'origine de sa disparition. Les génomes de 54 isolats représentatifs de l'épidémie ont été séquencés. L’arbre phylogénétique a mis en évidence deux clusters distincts indiquant la présence de deux épidémies parallèles. La datation d'un ancêtre commun en 1979, date de début de la construction de l'hôpital, indiquerait une contamination précoce du réseau d'eau de l'hôpital. Cette hypothèse est soutenue par la présence d'un îlot génomique spécifique de ST395 portant les gènes codant 6 transporteurs du cuivre et associée à une résistance phénotypique à ce métal constituant les tuyaux du réseaux de distribution d'eau potable. Les isolats tardifs présentaient des signatures génomiques d'adaptation à l’infection chronique (altération du lipopolysaccharide et de la porine OprD – objectivées phénotypiquement, et extinction de la surproduction de la pompe d’efflux MexAB-OprM – contrôlée par RT-qPCR) suite à des mutations indépendantes. Certaines de ces mutations ont été associées à une perte de fitness bactérien. Nous émettons l’hypothèse que l’émergence indépendante d’isolats adaptés à l’infection chronique, et ainsi l’accumulation de culs-de-sac épidémiologiques, a participé à l’épuisement de l’épidémie hospitalière de P. aeruginosa ST395. / P. aeruginosa is an opportunistic pathogen responsible of hospital-acquired infections in immunocompromised patients. Although in-host evolution of P. aeruginosa is well documented, little is known about this pathogen evolution during its spread on a hospital scale. The high-risk multidrug resistant clone ST395 spread among more than 300 patients in the University Hospital of Besançon between 1997 and 2008. We used a WGS approach to identify the origin of the outbreak, the features that could have helped its implantation in our hospital and those associated with the end of the epidemics. The genomes of 54 representative isolates were fully sequenced. The phylogenetic tree indicated two distinct clusters corresponding to two parallel outbreaks. The ancestor of the ST395 clone possibly contaminated our hospital water network during its construction in 1979. This hypothesis is supported by the fact that the ST395 strain had a specific genomic island carrying 6 copper transporter genes implicated in copper resistance, correlated with the resistance to this metal which water supply network is made of. The late isolates displayed independent genomic signatures of chronic adaptation in patients (altered LPS and porin OprD, and extinction of MexAB-oprM efflux pump overproduction). Some of these mutations were associated with a decreased in vitro fitness. We hypothesize that the independent emergence of isolates adapted to chronic infection, and thus the accumulation of epidemiological dead-ends, participated to the end of the hospital outbreak of P. aeruginosa ST395.

Pseudomonas aeruginosa (PA) est une bactérie présentant des résistances aux antibiotiques toute particulière. Elle est aujourd’hui largement impliquée dans de nombreuses maladies nosocomiales et dans l’infection de patients immunodéprimés. Les lectines sont des glycoprotéines formant des interactions faibles et réversibles avec les saccharides, et elles sont impliquées dans les mécanismes de protection et de virulence de la bactérie. Afin d’augmenter l’affinité des sucres pour celle-ci nous utilisons la multivalence conduisant à des leurres moléculaires ciblant les lectines I et II de PA. Notre stratégie consiste à synthétiser des glycoclusters conjugués à une étiquette ADN permettant leur criblage par des puces à ADN. Nous décrivons le design, la synthèse et l’assemblage des différents blocs de construction composant les glyco-oligonucléotides en s’appuyant sur la chimie "Click" (CuAAc) et la chimie oligonucléotidique. Le criblage des glyco-oligonucléotides est complété par des études de modélisation moléculaire et par RMN STD. Les meilleurs composés issus du criblage sont synthétisés sans leur étiquette ADN afin d’évaluer leur capacité inhibitrice de la formation du biofilm par PA. / Pseudomonas aeruginosa (PA) is a bacteria with a strong resistance to antibiotics.It’s an opportunistic germ involved in nosocomial infections and the infection of immunocompromised patients. Lectins are glycoproteins that bind saccharides reversibly with a low affinity. They are involved in bacteria protection mechanisms and virulence. In order to increase the affinity of saccharides to PA lectins I and II, we used multivalence and synthesized molecular decoys. Our strategy involves the synthesis of glycoclusters conjugated with a DNA tag in order to easily screen them on DNA arrays. We described here the design, the synthesis and the assembly of different building blocks allowing the synthesis of glyco-oligonucleotides,based on "Click" chemistry (CuAAc) and oligonucleotide chemistry. The screening of theglyco-oligonucleotides was completed by studies of molecular modelisation and by STD NMR.The best compounds from the screening were synthesized without the DNA tag in order to evaluate their abilities of inhibiting the biofilm formation of PA.

Made available in DSpace on 2016-12-08T15:50:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGMS12DA008.pdf: 1237418 bytes, checksum: f369aa1152db6b98aced7001e1799850 (MD5) Previous issue date: 2012-03-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Currently the common bean (Phaseolus vulgaris L.) occupies an area of over 4 million ha in Brazil, being cultivated in various management systems and technological level. The state of Santa Catarina has to feature family farms into small holdings, where the bean crop is conducted in small plots for subsistence and low technology. Under these conditions it is normal to use Creole bean genotypes, where the reproduction of seeds is carried by the producer and the use of technologies such as rhizobial inoculation and fertilizer application is rarely performed in order to achieve maximum crop yield potential. The characterization of landraces of common bean associated with the efficient use of nitrogen-fixing microorganisms (N) and mycorrhizal associations can be of great value, since most likely to contain alleles for local adaptation, disease resistance and tolerance to major climatic adversities. The objectives of this study were to evaluate the occurrence and diversity of rhizobacteria on roots of bean plants grown on small farms in West and Mid-western state of Santa Catarina and evaluate the response in nutrition and gene expression of bean genotypes submitted to inoculation with divergent strains of rhizobacteria and AMF (Glomus clarum nicol. & Schenck). The analysis of occurrence and genetic and physiological characterization of rhizobacteria in bean roots showed a high density of rhizobacteria and the isolation and physiological characterization of strains was observed in the potential auxin production and biological nitrogen fixation. The identification of the strains showed the presence of the rhizobacteria Pseudomonas sp. Rhizobium sp. Pseudomonas moraviensis and Stenotrophomonas maltophilia. The sequencing of the strains allowed us to observe that there is a predominance of Pseudomonas sp.: 13 out of 15 strains identified. In assessing the effect of bean genotypes, phosphorus and inoculation with Glomus clarum nutrition and gene expression, the results show that the dose effect of P provided in shoot dry weight, the maximum value of dry mass observed with 400 mg P kg-1. The effect of genotype was observed in P and P accumulated in the harvest at 28 days after sowing, and the genotype BAF55 was superior to genotype commercial BAF115. The P present effect on mycorrhizal colonization in two harvests. In the harvest at 28 days after sowing, the genotype inoculated with commercial BAF115 G. clarum and 100 mg P kg-1 was 123% increase in root colonization in comparison with the treatment without application of P. In genotype BAF55 conditions of inoculation with G. clarum and indigenous AMF was observed that the treatment without P application showed the lowest values of mycorrhizal colonization. At the time of harvest to 48 days after sowing, the genotype BAF55 inoculation with G. clarum increased colonization in relation to the status of indigenous AMF. The analysis of gene expression PVPT gene demonstrated that there is an effect of the genotypes studied, rates of P and inoculation with G. clarum. Was observed in gene expression of the gene PVPT that genotype BAF55 responded with both inoculation with G. clarum as with the native AMF population, while the genotype trade BAF115 (Valente) answered only in the AMF treatment with native soil. In both genotypes was possible to observe the response of gene expression occurred in a dose of 100 mg P kg-1, and this response is associated with the native soil and mycorrhizal inoculation with non G. clarum. In the study with co-inoculation observed positive effect of inoculation with rhizobacteria and G. clarum dry matter yield, P and N uptake of shoots in bean plants. The best treatment was observed co-inoculation G. clarum and strain of Pseudomonas moraviensis Fe55, which obtained the highest values of dry matter, N and P accumulated in shoots and dry weight of nodules. A strain Fe55 of Pseudomonas moraviensis performed better than strain Ai27 the parameters analyzed in this trial / Atualmente a cultura do feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) ocupa uma área de mais de 4 milhões de ha no Brasil, sendo cultivada em diversos sistemas de manejo e grau tecnológico. O estado de Santa Catarina tem com característica a agricultura familiar em pequenas propriedades, onde a cultura do feijoeiro é conduzida em pequenas áreas para subsistência e com baixa tecnologia. Nestas condições é normal o uso de genótipos crioulos de feijoeiro, onde a reprodução das sementes é realizada pelo próprio produtor e o uso de tecnologias como a inoculação com rizóbios e a aplicação de fertilizantes é raramente realizada de forma a obter o máximo potencial produtivo da cultura. A caracterização de acessos crioulos de feijoeiro associada ao uso eficiente de microrganismos fixadores de nitrogênio (N) e associações com FMAs pode ser de grande valor, já que apresentam maior probabilidade de conter alelos para adaptação local, resistência a doenças e tolerância as principais adversidades edafoclimáticas. Os objetivos deste estudo foram avaliar a ocorrência e a diversidade de rizobactérias em raízes de feijoeiro cultivados em pequenas propriedades, no Oeste e Meio-oeste do estado de Santa Catarina e avaliar a resposta na nutrição e expressão gênica de genótipos crioulos de feijoeiro submetidos à inoculação com estirpes divergentes de rizobactérias e FMA (Glomus clarum nicol. & schenck). A análise de ocorrência e caracterização fisiológica e genética de rizobactérias em raízes de feijoeiro mostrou uma alta densidade de rizobactérias, com o isolamento e caracterização fisiológica das estirpes foi observado o potencial de produção de auxina e fixação biológica de nitrogênio. A identificação das estirpes demonstrou a presença de rizobactérias do gênero Pseudomonas sp.; Rhizobium sp.; Pseudomonas moraviensis e Stenotrophomonas maltophilia. O seqüenciamento das estirpes permitiu contatar um predomínio do gênero Pseudomonas sp.: 13 de um total de 15 estirpes identificadas. Na avaliação do efeito dos genótipos de feijoeiro, doses de fósforo e inoculação com Glomus clarum na nutrição e expressão gênica, os resultados demonstram que a dose de P proporcionou efeito na massa seca da parte aérea, sendo o valor máximo de massa seca observado com a dose de 400 mg de P kg-1. O efeito do genótipo foi observado no teor de P e P acumulado, sendo que o genótipo crioulo BAF55 foi superior ao genótipo comercial BAF115. As doses de P proporcionaram efeito na colonização micorrízica nas duas épocas de coleta (28 e 48 dias após a semeadura). Na coleta aos 28 dias, no genótipo comercial BAF115 com inoculação de G. clarum e dose de 100 mg P kg-1 houve elevação de 123% na colonização micorrízica em comparação com o tratamento sem aplicação de P. No genótipo crioulo BAF55 nas condições de inoculação com G. clarum e FMAs nativos foi possível observar que o tratamento sem aplicação de P apresentou os menores valores de colonização micorrízica. Na época de coleta aos 48 dias, no genótipo BAF55 a inoculação com G. clarum aumentou a colonização em relação à condição de FMAs nativos. A análise da expressão genética demonstrou que existe efeito dos genótipos analisados, doses de P e inoculação com G. clarum no gene PVPT. Foi observado na expressão gênica do gene PVPT que o genótipo crioulo BAF55 respondeu tanto com a inoculação com G. clarum quanto com a população de FMAs nativas, enquanto que o genótipo comercial BAF115 (Valente) respondeu somente no tratamento com FMAs nativos do solo. Em ambos os genótipos foi possível observar a resposta da expressão genética ocorreu na dose de 100 mg de P kg-1, sendo que esta resposta está associada aos FMAs nativos do solo e não inoculação com G. clarum. No estudo com coinoculação foi observado efeito positivo da inoculação com rizobactérias e G. clarum na massa seca, P e N acumulado da parte aérea em plantas de feijoeiro. O melhor tratamento observado foi a coinoculação de G. clarum e a estirpe Fe55 de Pseudomonas moraviensis, que obteve os maiores valores de massa seca, P e N acumulado na parte aérea e na massa seca dos nódulos. A estirpe Fe55 de Pseudomonas moraviensis apresentou melhor desempenho que a estirpe Ai27 nos parâmetros analisados neste ensaio

Uma característica associada à capacidade de Pseudomonas aeruginosa sobreviver e disseminar-se frente a situações adversas encontradas no ambiente e no organismo de hospedeiros é a regulação de genes de resposta a condições de estresse celular, que incluem o evento de choque térmico. A exposição do microrganismo a um ambiente de alta temperatura resulta na indução da síntese de proteínas específicas, representadas por chaperonas e proteases, que conferem um aumento da viabilidade celular microbiana em condições consideradas letais. Presume- se que o gene PA 0657 de P. aeruginosa O1 possa estar associado à indução ou supressão do processo transcricional de genes envolvidos na resposta ao choque térmico. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi caracterizar a função do gene PA0657 de P. aeruginosa O1. Para isso, análises bioinformáticas foram realizadas e o gene foi clonado e expresso em sistema bacteriano, produzindo uma proteína recombinante que foi purificada e caracterizada enzimaticamente. Além disso, uma linhagem de P. aeruginosa O1 com o gene PA0657 rompido por recombinação homóloga foi construída, sendo submetida, juntamente com a linhagem selvagem, a uma condição de estresse térmico, permitindo que a expressão de diversos genes associados ao evento de choque térmico pudessem ser avaliadas por qRT-PCR. Os resultados mostraram que a proteína recombinante PA0657 foi capaz de degradar adenosina trifosfato (ATP), dependente do íon Zn2+. Foi possível verificar também que a linhagem rompida perdeu a capacidade de produzir o pigmento piocianina quando crescida em meio cetrimida e não apresentou seu fenótipo mucóide. Em análise in silico observou-se que a região promotora do gene PA0657 é dependente de σ32 e a análise de expressão gênica evidenciou uma diminuição de expressão do gene rpoH na linhagem selvagem de PAO1 após choque térmico, sendo este gene significativamente expresso na linhagem rompida. Observou-se também um acentuado aumento na expressão do gene algU, nestas mesmas condições, na linhagem selvagem PAO1, com ausência de expressão na linhagem rompida. É possível concluir, dessa forma, que o gene PA0657 exerce participação importante no processo de regulação de resposta ao choque térmico e está relacionado com a conversão do fenótipo mucóide. / Submitted by Ana Guimarães Pereira (agpereir@ucs.br) on 2015-02-12T16:39:42Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Franciele Maria Zanol.pdf: 2049257 bytes, checksum: 659cf19a6ee79184c9f91b239ba09a19 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-12T16:39:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Franciele Maria Zanol.pdf: 2049257 bytes, checksum: 659cf19a6ee79184c9f91b239ba09a19 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES / A feature associated with the ability of Pseudomonas aeruginosa survive and dissemination in adverse conditions found in the environment and in hosts‘ organisms is a specific genes regulation of stress response, including heat shock event. The exposure of microorganisms to a high temperature environment results in the induction of synthesis os specific proteins, represent by chaperones and proteases, conferring an increase og the microbial cell viability under conditions considered lethal. . It is presumed that the PA0657 gene of P. aeruginosa O1 can be related to the induction or suppression of transcriptional process of genes that are involved in a response to heat shock. In this context, the aim of this work was to characterize the function of the PA0657 gene of P. aeruginosa O1. In this way, bioinformatic analyzes were performed and the gene was cloned and expressed in bacterial system, producing recombinant protein which was purified and enzymatically characterized. Moreover, the PA0657 gene of P. aeruginosa O1 strain was disrupted by homologous recombination. The wild type strain and the disrupted strain were submitted to a thermal stress and the expression of various genes associated with heat shock event could be evaluated by qRT -PCR. The results showed that the PA0657 recombinant protein was capable of degrading adenosine triphosphate (ATP) of Zn2+ dependent manner. It was also verified that the ruptured strain lost its ability to produce pyocyanin pigment when grown on cetrimide means and its mucoid phenotype. It was possible to find in computational analysis that the promoter region of the PA0657 gene is dependent on σ32. The gene expression analysis showed a decrease in expression of the rpoH gene in the wild type strain after heat shock, this gene is significantly expressed in the disrupted strain. A significant increase in expression of the algU gene was observed, on the wild type strain with absence of expression in the disrupted strain. Therefore, it was possible to conclude that the PA0657 gene cts in the regulatory process of thermal shock response and is related to the conversion of the mucoid phenotype.

Orientador: José Raimundo de Souza Passos / Coorientador: Edson Luiz Furtado / Banca: Magali Ribeiro da Silva / Banca: Lidia Raque de Carvalho / Resumo: A avaliação da severidade - porcentagem da área lesionada em relação à área total - pode ser feita com auxílio de escalas diagramáticas, que são elaboradas com base na Lei WeberFechner e utilizam regressão linear simples em seu processo de validação, porém apresentam erros na metodologia estatística. O objetivo desta pesquisa foi propor um método de elaboração e validação de escalas de bacteriose em um híbrido Eucalyptus urophylla x Eucalyptus grandis, avaliar a da influência de concentrações de diferentes espécies de bactérias na validação de escalas, verificar a possibilidade de avaliações utilizando tons de cinza, e a influência da dispersão de lesões nas estimativas dos avaliadores no uso desta ferramenta. Foram conduzidos quatro experimentos com amostras das cidades de Bofete-SP e Botucatu-SP. No primeiro experimento, foram utilizadas 100 folhas de três clones (H13, I144 e AEC 1528) de Eucalyptus urophylla x Eucalyptus grandis infectadas naturalmente com bacteriose, que tiveram sua severidade medida para elaboração, por quartis e Weber-Fechner, e validação das seis escalas diagramáticas. No segundo, mudas de eucalipto com três concentrações diferentes (105, 107 e 109 indivíduos/mL) de inóculo de três bactérias (Pseudomonas sp., Xanthomonas sp. e mix) tiveram folhas coletadas para construção de três escalas diagramáticas. No terceiro, imagens digitais das amostras de folhas dos três clones de eucalipto infectados com bacteriose foram analisadas em tons de cinza. Houve ... / Abstract: The severity evaluation - percentage of the injured leaf area relative to its total - could be done with the assistance of diagrammatic scales, which are elaborated based on the WeberFechner law and uses simple linear regression for its validation process. However, errors can be found in statistical methodology. The objective of this research was to propose methods of elaboration and validation for diagrammatic scales of bacterial leaf blight on the hybrid Eucalyptus urophylla x Eucalyptus grandis, evaluate the influence of concentrations and different species of bacteria on scales validation, verify the possibilities of evaluations using gray scale, and the influence of leaf injuries dispersion on the estimates done by evaluators using this tool. Four experiments were conducted with samples from Bofete-SP and Botucatu-SP. In the first experiment, 100 leaves were used from three different clones (H13, I144 e AEC 1528) of Eucalyptus urophylla x Eucalyptus grandis naturally infected with bacterial leaf blight, which had the severity measured for the elaboration, by quartiles and Weber-Fechner law, and the validation of the six resultant diagrammatic scales. In the second one, eucalypt leaves with three different concentrations (105, 107 e 109 individuals/mL) of three bacterial inoculums (Pseudomonas sp., Xanthomonas sp. and mix), had their leaves collected for the construction of three diagrammatic scales. In the third, the digital images of the sampled leaves of the three eucalypt clones were analyzed using gray scale values. There was made a correlation among the variables considering the three clones as one single group and separately. In the fourth, the diagrammatic scale built for the clone AEC 1528 was replicated into different levels of dispersion with the same severity of the levels present in the scale, followed by evaluation. In the first experiment, the quartiles method presented reading ... / Mestre

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / A infecção pulmonar é uma das principais causas de morbidade e mortalidade em pacientes com Fibrose Cística (FC). O prognóstico destes pacientes é influenciado pelo número de exacerbações anuais e a carga microbiana nas secreções respiratórias. Pseudomonas aeruginosa é o principal patógeno, tanto em importância quanto em prevalência. Recentemente, foi demonstrada a ocorrência de cepas de P. aeruginosa altamente transmissíveis em centros de atendimento a pacientes com FC. A persistência de P. aeruginosa no pulmão de pacientes com FC está associada, em parte, à presença de cepas com hipermutabilidade (HPM), um fenômeno decorrente, principalmente, de defeitos em genes envolvidos no sistema de reparo do DNA. Tivemos como objetivo investigar a ocorrência de cepas HPM em P. aeruginosa, associadas às infecções pulmonares crônicas em pacientes com FC, bem como, avaliar a associação entre HPM, resistência a antimicrobianos e expressão de fatores de virulência. Das 179 amostras bacterianas estudadas, isoladas de 17 (85%) dos 20 pacientes incluídos no estudo, 43 (24%) apresentaram HPM seguindo os critérios estabelecidos por Maciá e colaboradores. Essas subpopulações apresentaram maiores taxas de resistência a antimicrobianos. As amostras estudadas apresentaram grande variabilidade genética (49 perfis definidos com a utilização da técnica de RADP), embora tenha sido observada, também, a incidência de clones compartilhados por diferentes pacientes. Não encontramos similaridade entre os clones estudados e as cepas epidêmicas circulantes em outros países. Das amostras classificadas como HPM pelos critérios de Macia e colaboradores, apenas 3 delas apresentaram frequência de mutação que permitisse sua classificação como HPM. Com o sequenciamento do DNA encontramos mutações que levaram a mudança de aminoácidos nas proteínas codificadas pelos genes mutS, mutD e urvD. Não observamos mutações nos genes mutM, mutT e mutY que pudessem alterar os aminoácidos sintetizados. Como são escassos estudos sobre a influência da HPM em alterações fenotípicas outras que a resistência a antimicrobianos, comparamos a expressão de atributos de virulência nas populações selvagens e subpopulações. Não observamos alterações nos estados nutricionais, mobilidade e capacidade de formação de biofilme dos microrganismos estudados. Ao contrário, as subpopulaçãoes apresentaram uma menor atividade de LasA e um aumento na produção de piocianina, o que reforça nossa hipótese de que células mutantes teriam uma vantagem no ambiente pulmonar de pacientes com FC. Devido à diferença nos testes propostos para caracterização de HPM, sugerimos que o teste de difusão em agar modificado seja adotado como uma metodologia de triagem a ser utilizada em laboratório de microbiologia clinica. / Pulmonary infection is a major cause of morbidity and mortality in patients with Cystic Fibrosis (CF). The prognosis of these patients is influenced by the number of annual exacerbations of the infectious processes and the microbial load in their respiratory secretions. Pseudomonas aeruginosa is the main CF pathogen, both in importance and predominance. Recently, highly transmissible P. aeruginosa strains were reported among CF patients from different CF Health Care centers. The persistence of P. aeruginosa in the lung of CF patients is associated, at leat in part, with the presence of strains with hipermutability (HPM), a phenomenon caused mainly by defects in genes involved in the DNA repair system. In this report, 43 (24%) out of 179 P. aeruginosa isolates recovered from 17 (85%) out of 20 CF patients included in the study were characterized as HPM, according to the criteria established by Maciá and collegues. The HPM subpopulations exhibited higher rates of antimicrobial resistance. By using the RAPD technique, bacteria included in our study were shown to exhibit high genetic variability and could be grouped in 49 different clones. However, a few clones were shared by different patients. No similarity was detected among these clones and epidemic strains from others countries. Of the 43 isolates classified as HPM by Maciás criteria, only 3 exhibited mutation frequencies allowing their inclusion in the HPM group. By sequencing the DNA from these bacteria we found mutations in the genes mutS, mutD and urvD that resulted in changes in the aminoacids sequences. We did not observe mutations in the genes mutM, mutt and mutY that could have altered the aminoacid sequence from synthesized protein. Since there are only a few report in the literature on the influence of HPM on bacterial phenotypic alterations other than antimicrobial resistance, we also compared 81 bacterial isolates from the wild populations and HPM subpopulations in their virulence properties No difference among the microorganisms were detected considering their nutricional variations, mobility and ability of biofilm formation. In contrast, HPM subpopulations exhibited decreased LasA activity and increased production of pyocianyn. These results reinforced our hypothesis that bacterial mutants may have some advantage in the pulmonary environment of CF patients. Due to the difference in the results of the two sorts of test used to identify HPM, we propose the test of diffusion in modified agar as a trial test to be included in laboratories of clinical microbiology.