Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This work has as objective to investigate the production of biosurfactant employing strain of Pseudomonas aeruginosa using as source of carbon residual soybean oil from several foods frying. In the first assay the Pseudomonas aeruginosa were used ATCC 9027, isolated Pseudomonas aeruginosa from Landfarming REDUC (PALR) and a Pseudomonas aeruginosa PACL strain, isolated from a lagoon hydrocarbon-contaminated soil. To evaluate the results of the assay a two levels complete factorial experimental design was used, studying as variables the microorganism strain, the concentrations of residual soybean oil (OSR), the concentrations of nitrate of ammonium (AN) and brewery residual yeast (YRB). The experiments were performed in 500-mL Erlenmeyer flasks containing 50 mL of production medium, at 170 rpm and 30±1ºC, for a 48-hour fermentation period. Biosurfactant production has been monitored by measurements of rhamnose concentration (RM), surface tension (TS) and emulsifying activity (IE). The P. aeruginosa PALR, ATCC 9027 and the PALC were capable to reduce the superficial tension of the initial medium of 61± 1dynes/cm for 33,9; 28 e 26 dynes/cm, to produce g/L 0,25; 0,77 e 1,39 of rhamnose, with emulsification index of 60, 100 and 100%, respectively. The results obtained by experimental design proved that isolated Pseudomonas aeruginosa PALC presented potential greater to produce biossurfactante, being, therefore, selected for the other experiments carried out in at study. The optimization of OSR, AN, and RBY was accomplished by a central composite design (CCD) and their results analyzed by surface response analysis. The best planned results, was located on the central point, have corresponded to 22 g/L of RSO, 5.625 g/L of AN, and 11.5 g/L of RBY. The greater obtained concentration of rhamnose after 48 hours of fermentation, was 2,3 g/L with emulsifying activity of 100%. Employed the best result obtained in PCC, was determined, using a bioreactor, the best conditions of aeration rate (vvm) and agitation speed (rpm) using a complete factorial experimental design. In the optimized conditions, of 0,5 vvm (KLa of 10,2 h-1) and speed of agitation of 550 rpm, were obtained the superficial tension of 26,0 dyne/cm and synthesis of rhamnose of 3,26 g/L. Under the optimized conditions, the biosurfactant production from a mixture of waste frying soybean oil was compared with non used soybean oil (NUSO) and waste soybean oils used to fry in separate meats (MFSO), salty (SAFSO), and potatoes (POFSO). Finally was made a kinetic study, seeking to determine a model to represent the experimental data of rhamnose production and the nutrients consumption. After recovery and purification of the biosurfactant the rhamnose concentration increased in 80% in the final product, that is, 6,8 g/L. / Este trabalho tem como objetivo investigar a produção de biossurfactante empregando culturas de Pseudomonas aeruginosa utilizando como fonte de carbono óleos de soja residual proveniente da fritura de diversos alimentos. Nos primeiros ensaios foram empregados a Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Pseudomonas aeruginosa isolada do Landfarming REDUC (PALR) e a Pseudomonas aeruginosa PALC, isolada de solo de uma lagoa contaminada com hidrocarbonetos. Para selecionar a Pseudomonas e avaliar os resultados dos ensaios foi utilizado um planejamento fatorial a dois níveis, estudando como variáveis a linhagem de microrganismo, as concentrações de óleo de soja residual (OSR), de nitrato de amônio (NA) e de levedura cervejeira residual (LCR). Os experimentos foram realizados em Erlenmeyers de 500 mL de capacidade contendo 50 mL do meio de produção, a 170 rpm e temperatura de 30 ± 1ºC durante 48 h de fermentação. A produção de biossurfactante foi monitorada pelas determinações da tensão superficial (TS), da concentração de raminose (RM) produzida e da atividade emulsificante (IE). As P. aeruginosa PALR, ATCC 9027 e a PALC foram capazes de reduzir a tensão superficial do meio de 62 dina/cm ± 1 para 33,9; 28 e 26 dina/cm, produzir em g/L 0,25; 0,77 e 1,39 de raminose, com índice de emulsão de 60, 100 e 100%, respectivamente. Os resultados obtidos nestes planejamentos experimentais demonstraram que a Pseudomonas aeruginosa isolada PALC apresentou maior potencial para produzir biossurfactante, sendo, portanto, selecionada para os demais experimentos realizados neste estudo. A otimização das concentrações do OSR, NA e da LCR foram obtidas a partir de um planejamento de experimento composto central (PCC) e seus resultados analisados pelas superfícies de resposta. Os melhores resultados do planejamento foram encontrados no ponto central, correspondendo a 22 g/L de OSR, 5,625 g/L de NA e 11,5 g/L de LCR. A maior concentração obtida de raminose após 48 horas de fermentação, foi 2,3 g/L com índice de emulsão de 100%. A partir do melhor resultado obtido no PCC, determinou-se, utilizando um bioreator, as melhores condições de taxa de aeração (vvm) e velocidade de agitação (rpm) empregando um planejamento fatorial completo. Nas condições otimizadas, de 0,5 vvm (KLa de 10,2 h-1) e velocidade de agitação de 550 rpm, foram obtidos a tensão superficial de 26,0 dina/cm e síntese de raminose de 3,26 g/L. A partir das condições otimizadas, a produção de biossurfactante proveniente da mistura de óleo de soja residual foi comparada com óleo de soja in natura (OSN) e óleo de soja residual usado na fritura em separado de carnes (OSRC), salgados (OSRS) e batatas (OSRB). Finalmente foi feito um estudo cinético, visando determinar um modelo que representasse os dados experimentais de produção de raminose e de consumo de nutrientes. Após recuperação e purificação do biossurfactante a concentração de raminose aumentou em 80% no produto final, ou seja, 6,8 g/L. / Doutor em Engenharia Química

Base teórica: Devido à diminuição do desenvolvimento de novos antimicrobianos nas últimas décadas, terapias combinadas têm sido empregadas contra bactérias multirresistentes como opção à monoterapia no tratamento de infecções graves. Para tratar infecções causadas por Peusdomonas aeruginosa resistente a carbapenêmicos, amicacina e polimixina B têm sido utilizadas em associações com imipenem, pois possuem diferentes mecanismos de ação, o que, teoricamente, indicaria a possibilidade de efeito sinérgico. Objetivo: O objetivo deste trabalho foi verificar a interação, in vitro, de amicacina e polimixina B em associação com imipenem frente a diferentes isolados de P. aeruginosa resistentes a carbapenêmico. Métodos: Foram selecionados isolados de P. aeruginosa resistentes a carbapenêmico oriundos do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, coletados no período de janeiro a março de 2015. Foi realizada eletroforese em gel de campo pulsado e detecção do gene blaSPM-1 para selecionar diferentes clones. Seis isolados (três SPM-1 positivos e três negativos para a carbapenemase) foram selecionados para realização da técnica de time-kill, a fim de avaliar a atividade antimicrobiana das combinações de imipenem com amicacina e imipenem com polimixina B. Resultados: Sinergismo ocorreu para combinações de imipenem com amicacina em 3 isolados, dos quais um era SPM-1 positivo e dois eram SPM-1 negativos e todos apresentaram CIMs relativamente baixas a intermediárias. Quanto às combinações de imipenem com polimixina B, houve sinergismo somente para dois isolados, um SPM-1 positivo e um SPM-1 negativo, contudo houve antagonismo em 5 isolados, dois SPM-1 positivos e três SPM-1 negativos. Para 4 isolados, as combinações de imipenem com amicacina tiveram atividade bactericida, enquanto, para todos os isolados, as combinações de imipenem com polimixina B, bem como polimixina B isoladamente, 1x e 2x a CIM apresentaram atividade bactericida. Conclusão: Sinergismo pode ocorrer, para combinações de imipenem mais amicacina, quando os isolados apresentam CIMs relativamente baixas ou intermediárias para imipenem (≤16 μg/mL a 128 μg/mL) e amicacina (≤32 μg/mL). Entretanto, antagonismo aconteceu independentemente de valores altos ou baixos de concentrações inibitórias mínimas para imipenem e polimixina B. Além disso, a presença ou ausência do gene blaSPM-1 não pareceu influenciar nos resultados. / Background: Due to a decrease on new antibiotic development over the last decades, combined therapies have been employed against multigrug-resistant bacteria as an option to monotherapy in severe infection treatment. In order to treat infections caused by carbapenem resistant Pseudomonas aeruginosa, amikacin and polymyxin B have been used in associations with imipenem, because they possess different mechanisms of action, which could, theoretically, indicate the possibility of synergistic effect. Objective: The aim of this study was to verify the interaction, in vitro, of amikacin and polymyxin B in association with imipenem against various carbapenem resistant P. aeruginosa isolates. Methods: Carbapenem resistant P. aeruginosa isolates have been selected from Hospital de Clínicas de Porto Alegre, collected from January to March 2015. Pulsed field gel electrophoresis and detection of blaSPM-1 gene has been performed to select different clones. Six isolates (three SPM-1 positive and three negative for the carbapenemase) were selected for time-kill assay, in order to assess antimicrobial activity of imipenem plus amikacin and imipenem plus polymyxin B combinations. Results: Synergism occurred for combinations of imipenem plus amikacin in three isolates, from which one was SPM-1 positive and two were SPM-1 negative, and all presented relatively low to intermediate minimum inhibitory concentrations. About imipenem plus polymyxin B combinations, synergism occurred in only two isolates, one SPM-1 positive and one SPM-1 negative, however antagonism occurred in five isolates, two SPM-1 positive and three SPM-1 negative. For 4 isolates, imipenem plus amikacin combinations had bactericidal effect, while, for all isolates, combinations of imipenem plus 1x and 2x the MIC of polymyxin B presented bactericidal activity. Conclusions: Synergism can occur, for imipenem plus amikacin combinations, when isolates present relatively low or intermediate MIC of imipenem (≤16 μg/mL to 128 μg/mL) and amikacin (≤32 μg/mL). However, antagonism happened regardless high or low minimum inhibitory concentrations for imipenem and polymyxin B. Also, the presence or absence of blaSPM-1 gene did not seem to influence the results.

Opções terapêuticas para tratar infecções por Pseudomonas aeruginosa são limitadas por seus diversos mecanismos de resistência, que podem ou não ser detectados no laboratório clínico. Um fenótipo observado na rotina laboratorial é o surgimento de subpopulações resistentes a partir de uma população sensível aos antimicrobianos – heteroresistência. Em P. aeruginosa esse fenômeno já foi investigado para carbapenêmicos, porém, em relação à polimixina B, não há dados literários. Objetivamos avaliar a heteroresistência à polimixina B em dois grupos de P. aeruginosa, um sensível e outro resistente aos carbapenêmicos. Cento e vinte e quatro isolados de P. aeruginosa foram obtidos, aleatoriamente, no Hospital de Clínicas de Porto Alegre em 2011. O perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos, disco difusão e microdiluição em caldo – CIM (determinação da concentração inibitória mínima) para polimixina B, foi realizada conforme o Clinical Laboratory Standard Institute (CLSI) 2011. Isolados resistentes aos carbapenêmicos foram avaliados para CIM dos carbapenêmicos e cefalosporinas, e para pesquisa fenotípica e genotípica de metalo-β-lactamase (MβL). Um total de 24/124 isolados foi separado em dois grupos, um sensível (grupo S) e outro resistente (grupo R) aos carbapenêmicos (imipenem e/ou meropenem) para investigação da heteroresistência a polimixina B. Realizou-se ensaio de heteroresistência em duplicata através de diluições seriadas, partindo de uma suspensão de 0,5 de MacFarland e inoculadas em Agar Mueller Hinton com concentrações crescentes de polimixina B (0; 0,5; 1; 2; 4 e 8μg/mL). Após 5 dias de passagem em meio sem antibiótico, foi determinada a CIM dos isolados que cresceram na concentração mais alta de polimixina B. O perfil de análise populacional (PAP) foi definido pela razão do número de unidades formadoras de colônia (UFC) da placa com maior concentração de polimixina B onde houve crescimento bacteriano, pelo número de UFC da placa sem antibiótico. Foram consideradas heteroresistentes amostras que apresentaram subpopulações com crescimento em concentração de polimixina B ≥ 2 μg/mL. Amostras com subpopulações com crescimento em concentração de polimixina B superiores duas vezes ao CIM original, mas < 2 μg/mL, foram classificadas como heterogêneas. O resultado do disco difusão indicou heterogeneidade de suscetibilidade, sendo que gentamicina e imipenem foram os antibióticos com maior percentual de resistência e aztreonam e ciprofloxacino apresentaram os maiores perfis de sensibilidade. Todos os isolados foram sensíveis à polimixina B, com CIM50 e CIM90 de 1μg/mL e 2μg/mL, respectivamente. Trinta e sete isolados (30%; 37/124) apresentaram resistência aos carbapenêmicos. Quatro amostras foram positivas para MβL no teste fenotípico, sendo que o gene blaIMP foi idenficado nestas amostras. O grupo S não apresentou subpopulação heteroresistente, porém 3 isolados apresentaram subpopulação heterogênea. A freqüência do PAP no grupo S variou entre 2,1x10-4 a 4,0x10-7. O grupo R apresentou uma amostra heteroresistente e 6 isolados apresentaram subpopulação heterogênea, a freqüência do PAP variou entre 2,6x10-4 a 2,0x10-7. Os resultados deste estudo indicam baixa ocorrência de heteroresistência à polimixina B em amostras de P. aeruginosa tanto resistentes quanto sensíveis aos carbapenêmicos. No entanto, diversas amostras apresentaram subpopulações heterogêneas (CIM aumentada para a polimixina B), o que poderia explicar eventuais falhas terapêuticas durante o tratamento. / Therapeutic options to treat infections caused by Pseudomonas aeruginosa are limited because of their different resistance mechanisms that can be or don't be detected in the clinical laboratory. A phenotype that has been observed in our laboratory is the emergence of resistant subpopulations from a population sensitive to antibiotics - a phenomenon named heteroresistance. In P. aeruginosa this phenomenon has been investigated for carbapenems, however, in relation to the polymyxin B no data in the literature. We investigate the heteroresistance and polymyxin B into two groups P. aeruginosa, one sensitive and second resistant to carbapenems. One hundred twenty-four strains of P. aeruginosa were obtained randomly at the Hospital de Clinicas de Porto Alegre in 2011. The Antimicrobial Susceptibility Testing (Disk-difusion and the microdiluition broth, with determination of minimum inhibitory concentration (MIC) for polymyxin B, was performed according the Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI), 2011. Isolates resistant to carbapenems were evaluated for MIC of carbapenems and cephalosporins, also for phenotypic and genotypic metallo-β-lactamase (MβL). A total of 24/124 strains were separated in two groups, one sensitive (S group) and other resistant (R group) to carbapenems (imipenem and / or meropenem) for investigation of heteroresistance polymyxin B. The assay was performed in duplicate heteroresistance through serial dilutions, starting from a 0.5 MacFarland suspension and inoculated into Mueller Hinton Agar with increasing concentrations of polymyxin B (0; 0,5; 1; 2; 4 e 8μg/mL). After 5 days of passage in medium without antibiotics, was determined the MIC of the isolates that grew at the highest concentration of polymyxin B. The population analysis profile (PAP) was defined as the ratio of the number of colony forming units (CFU) on the card with the highest concentration of polymyxin B in which bacterial growth, the number of CFU plate without antibiotic. We considered heteroresistant samples that showed subpopulations with growth in concentration of polymyxin B ≥ 2 mg / mL. Samples with subpopulations growing at higher concentration of polymyxin B twice CIM original, but <2 mg / mL were classified as heterogeneous. The result of AST indicated heterogeneity of susceptibility, and gentamicin and imipenem were the highest percentage with antibiotic resistance and aztreonam and norfloxacin showed the highest sensitivity profiles. All isolates were susceptible to polymyxin B, with CIM50 and CIM90 of 1μg/mL and 2μg/mL, respectively. Thirty-seven isolates (30%; 37/124) were resistant to carbapenems. Four samples were positive for the phenotypic test to MβL and the blaIMP gene was indentificated in this samples. The S group showed no subpopulation heteroresistente, but 3 isolates showed heterogeneous subpopulation. The frequency of PAP in group S varied between 2,0x10-4 to 4,0x10-7. The group R provided a sample heteroresistant and 6 isolates showed heterogeneous subpopulation, the frequency of PAP varied between 2,6x10- 4 a 2,0x10-7. The results of this study indicate a low occurrence of heteroresistance to polymyxin B in samples of P. aeruginosa so resistant assensitive to carbapenems. However, several samples showed heterogeneous subpopulations (MIC increased to polymyxin B) which could explain possible treatment failure during treatment.

Os microrganismos podem apresentar-se tanto em forma de vida livre como aderidos a uma superfície ou interface ar-líquido, formando comunidades complexas e dinâmicas conhecidas como biofilmes. Nos últimos anos, com o avanço das pesquisas em nível molecular, foi identificado que a maioria das bactérias utilizam guanosina monofosfato (3´-5´)-cíclica dimérica (c-di-GMP) como um segundo mensageiro. De forma geral, essa molécula controla a sinalização celular, virulência, comunicação entre células e a expressão de proteínas relacionadas com o fenótipo de biofilmes, em resposta à sua concentração intracelular. Sua síntese e degradação são controladas respectivamente por diguanilto ciclases (DGCs) contendo domínio GGDEF e fosfodiesterases (PDEs) que possuem os domínios EAL ou HD-GYP. Em Pseudomonas aeruginosa (PA14) foi identificada uma nova classe de receptor específico para c-di-GMP, a proteína transmembranar PelD, cuja porção citoplasmática contém os domínios GAF e GGDEF degenerado. Sua modulação através desse dinucleotídeo controla a produção de exopolissacarídeos pelos componentes do conservado operon pel e influencia diretamente na capacidade de formação de biofilmes. Devido à escassez de dados a respeito dos eventos moleculares do mecanismo de sinalização mediado por c-di-GMP, este trabalho teve como objetivo principal a caracterização biofísica/estrutural da proteína PelD, bem como o reconhecimento de interação entre este ligante e a porção citoplasmática da proteína. Diversas construções solúveis de PelD foram clonadas e expressas, sendo que a construção compreendendo os resíduos 176-455 (PelD176-455) foi cristalizada com sucesso e teve sua estrutura determinada por iodo-SAD. O modelo final apresentou os dois domínios com enovelamentos característicos das famílias GAF e GGDEF, sendo a interface inter-domínios composta majoritariamente por resíduos hidrofóbicos. Visando uma compreensão das bases moleculares de reconhecimento e ativação de PelD por c-di-GMP, uma estrutura em complexo com o ligante foi resolvida. Como esperado, o dinucleotídeo foi encontrado no sítio inibitório do domínio GGDEF, onde o motivo R367xxD370 e o resíduo R402 são responsáveis pela maior parte das interações com c-di-GMP. No entanto, nenhuma grande mudança estrutural foi observada entre as formas apo e holo de PelD, ao contrário de outros sistemas efetores tal como LapD e domínios PilZ. Curiosamente, apenas uma molécula de c-di-GMP foi encontrada no sítio, contrastando com a forma dimérica intercalada normalmente ligada aos sítios inibitórios de domínios GGDEF, tais como em PleD e WspR. Estudos de ITC confirmaram a estequiometria 1:1 em solução. Isso mostra a versatilidade dos diversos receptores já identificados até o momento, frente à ligação desse dinucleotídeo. Estudos de bioinformática identificaram uma potencial região de coiled-coil na hélice juxtamembrana de PelD, resíduos 115-160, provavelmente responsável pela homodimerização. Visando uma comprovação experimental dessa hipótese, uma construção contendo toda a porção citoplasmática, PelD111-455, foi expressa e purificada. Estudos comparativos de dicroísmo circular e ultracentrifugação analítica entre as construções PelD176-455 e PelD111-455 realmente demonstraram que os resíduos extras presentes em PelD111-455 formam uma hélice-&alpha; e são responsáveis pela dimerização da porção citoplasmática da proteína. De modo geral, os resultados aqui apresentados não só contribuirão para o entendimento dos mecanismos de regulação das vias de sinalização mediadas por c-di-GMP como, em longo prazo, poderão levar ao desenvolvimento de agentes contra infecções bacterianas. / Microorganisms may be presented either in planktonic free-swimming life-style or adhered to surfaces, forming a complex and dynamic community known as biofilm. In recent years, with the progress of research at the molecular level, it was identified that the majority of bacteria use guanosine monophosphate (3\'-5 \')-cyclic dimeric (c-di-GMP) as a second messenger. Generally, this molecule controls the cell signaling, virulence, communication between cells and expression of proteins related to the phenotype of biofilms in response to its intracellular concentration. Its synthesis and degradation are controlled respectively by diguanylate cyclases (DGC) containing the GGDEF domain and phosphodiesterases (PDE) with the domains EAL or HD-GYP. In Pseudomonas aeruginosa (PA14) a novel class of receptor specific for c-di-GMP has been identified, the transmembrane protein PelD, which contains a GAF and degenerate GGDEF domains in the cytoplasmic portion. Its modulation through this dinucleotide controls the production of exopolysaccharides by the components of the conserved operon pel and directly influences the ability of biofilm formation. Due to the paucity of data about the molecular events of the signaling mechanism mediated by c-di-GMP, this study aimed to characterize biophysically and structurally the protein PelD. Various soluble constructions of PelD were cloned and expressed, and the construction comprising the residues 176-455 (PelD176-455) was successfully crystallized and its structure was determined by iodine-SAD. The final model showed the two characteristic domains of families GAF and GGDEF, and the inter-domain interface composed primarily of hydrophobic residues. Seeking an understanding of the molecular basis of recognition and activation of PelD by c-di-GMP, a structure in complex with the ligand was solved. As expected, the dinucleotide was found at the inhibitory site of the GGDEF domain, where the motif R367xxD370 and the residue R402 are responsible for most of the interactions with c-di-GMP. However, no major structural change was observed between the apo and holo forms of PelD, unlike other effector systems such as LapD and domains PilZ. Interestingly, only one molecule of c-di-GMP was present on the site, in contrast to the dimeric intercalated form normally found at I-sites GGDEF domains, such as PleD and in WspR. ITC studies confirmed the 1:1 stoichiometry in solution. This shows the versatility of the various receptors identified so far, compared to the binding of dinucleotide. Bioinformatics studies have identified a potential coiled-coil region in the juxtamembrane helix of PelD, residues 115-160, probably responsible for homodimerization. Aiming at an experimental confirmation of this hypothesis, a construct containing the full cytoplasmic portion, PelD111-455 was expressed and purified. Comparative studies of circular dichroism and analytical ultracentrifugation between constructs PelD176-455 and PelD111-455 indeed demonstrated that the extra residues present in PelD111-455 form an &alpha;-helix and are responsible for dimerization of the cytoplasmic portion of the protein. Overall, the results presented here not only contribute to the understanding of the mechanisms of regulation of signaling pathways mediated by c-di-GMP as in the long run, may lead to the development of agents against bacterial infections.

Herein we describe the study biocatalytic potential of the whole cell of microorganisms isolated from a plant belonging to Cactacea family, Nopalea cochenillifera (L.) Salm- Dyck, popularly known as âpalma doceâ or âpalma forrageiraâ. The microorganisms were isolated by induction technique using as acetophenone susbtrate. Among the microorganisms strains (I-1, I-2, I-3, I-4) only I-2, (Pseudomonas sp), was effective as biocatalyst in reducing the acetophenone. The best conditions for carrying out the bioreduction of acetophenone were as follows: 1g of resting cells of Pseudomonas sp, resuspended in buffer solution pH 7, at 28 Â C and rotation of 175 r.p.m for 4 days, obtaining the (S)-1-phenylethanol with conversion of 77% e.e. and 89%. The bioreduction study, using the Pseudomonas sp strain, was extended to the following derivatives of acetophenone, 4-methoxy-acetophenone (2a), 4-methyl acetophenone (3a), 4-nitro-acetophenone (4a), 4 -bromo-acetophenone (5a), 4-chloro-acetophenone (6a), 4-fluoro-acetophenone (7a), 3-methoxy-acetophenone (8a), 3-methyl acetophenone (9a), 3-nitro-acetophenone (10a) 2-methoxy-acetophenone (11a), 2-methyl acetophenone (12a), 2-nitro-acetophenone (13a), 2-bromo-acetophenone (14a), 2-chloro-acetophenone (15a), 2 - fluoro-acetophenone (16a). It is not worthy that all the alcohols were obtained with Prelog selectivity (S configuration). In general, the best results were obtained for the derivatives of acetophenone with substituent methoxyl, methyl, nitro and bromine in position - ortho (e.e. of 94 to > 99% conversion and 23-80%). With respect to the chlorine and fluorine substituents, the best results of selectivity and enzymatic activity were obtained for the â para substituted derivatives (e.e. 93% and 73% conversion, 83% e.e. and conversion of 51%, respectively). / Neste trabalho descrevemos o estudo do potencial biocatalÃtico de cÃlulas Ãntegras de micro-organismos isolados de um vegetal da famÃlia das Cactaceas, Nopalea cochenillifera (L.) Salm-Dyck, popularmente conhecido como âpalma doceâ ou âpalma forrageiraâ. Os micro-organismos foram isolados pela tÃcnica de induÃÃo utilizando o substrato acetofenona. Dos quatro micro-organismo isolados (I-1, I-2, I-3, I-4) apenas o I-2, identificado como Pseudomonas sp, foi eficiente como biocatalisador na reduÃÃo do substrato padrÃo acetofenona. As melhores condiÃÃes para a realizaÃÃo da biorreduÃÃo da acetofenona foram as seguintes: 1g de cÃlulas em repouso de Pseudomonas sp, ressuspendidas em soluÃÃo tampÃo de pH 7, temperatura de 28 ÂC e rotaÃÃo de 175 r.p.m por 4 dias, com obtenÃÃo do (S)-1-feniletanol com conversÃo de 77% e e.e. de 89%. O estudo da biorreduÃÃo, utilizando a cepa isolada de Pseudomonas sp, foi estendido para os seguintes derivados da acetofenona: 4-metÃxi-acetofenona (2a), 4-metil-acetofenona (3a), 4-nitro-acetofenona (4a), 4-bromo-acetofenona (5a), 4-cloro-acetofenona (6a), 4-fluoro-acetofenona (7a), 3-metÃxi-acetofenona (8a), 3-metil-acetofenona (9a), 3-nitro-acetofenona (10a), 2-metÃxi-acetofenona (11a), 2-metil-acetofenona (12a), 2-nitro-acetofenona (13a), 2-bromo-acetofenona (14a), 2-cloro-acetofenona (15a), 2-fluoro-acetofenona (16a). Cabe ressaltar que todos os Ãlcoois foram obtidos com seletividade Prelog (configuraÃÃo S). Em geral, os melhores resultados foram obtidos para os derivados da acetofenona com substituintes metoxila, metila, nitro e bromo na posiÃÃo â orto (e.e. de 94 a > 99% e conversÃo de 23 a 80%). Com relaÃÃo aos substituintes cloro e flÃor, os melhores resultados de seletividade e atividade enzimÃtica foram obtidos para os derivados âpara substituÃdos (e.e. 93% e conversÃo 73%; e.e. 83% e conversÃo de 51%, respectivamente).

A 13C-Análise de Fluxos Metabólicos (13C-MFA) tornou-se uma técnica de alta precisão para estimar fluxos metabólicos e obter informações importantes sobre o metabolismo. Este método consiste em procedimentos experimentais, técnicas de medição e em cálculos para análise de dados. Neste contexto, os grupos de pesquisa de engenharia metabólica necessitam de ferramentas computacionais precisas e adequadas aos seus objetos de estudo. No presente trabalho, foi construída uma ferramenta computacional na plataforma MATLAB que executa cálculos de 13C-MFA, com balanços de metabólitos e cumômeros. Além disso, um módulo para estimar os fluxos metabólicos e um módulo para quantificar as incertezas das estimativas também foram implementados. O programa foi validado com dados presentes na literatura e aplicado a estudos de caso. Na estimação de fluxos de Pseudomonas sp. LFM046, identificou-se que esse micro-organismo possivelmente utiliza a Via das Pentoses em conjunto com a Via Entner-Doudoroff para a biossíntese de Polihidroxialcanoato (PHA). No design ótimo de experimentos para uma rede genérica de Pseudomonas, identificou-se a glicose marcada no átomo cinco como um substrato que permitirá determinar o fluxo na Via das Pentoses com menor incerteza. / 13C-Metabolic Flux Analysis (13C-MFA) has become a high-precision technique to estimate metabolic fluxes and get insights into metabolism. This method consists of experimental procedures, measurement techniques and data analysis calculations. In this context, metabolic engineering research groups demand accurate and suitable computational tools to perform the calculations. A computational tool was implemented in MATLAB platform that performs 13C-MFA calculation, using metabolite and cumomer balances, as well as a module to estimate the fluxes and a module to quantify their uncertainty. The program was validated with some classical cases from literature. From the flux estimates of Pseudomonas sp. LFM046, it was identified that the microorganism possibly uses the Pentose Phosphate Pathway along with the Entner-Doudoroff Pathway for Polyhydroxyalkanoate (PHA) biosynthesis. From the optimal experimental design for a generic Pseudomonas network, it was possible to conclude that glucose labeled at atom five is the best option to determine the flux in the Pentose Phosphate Pathway with smaller uncertainty.

Introdução e objetivos: A produção de beta-lactamases de espectro ampliado (ESBLs) tem sido restrita a espécies do gênero Klebsiella spp. e E. coli, sendo associada a altos índices de resistência, morbidade e mortalidade. Uma vez que os determinantes genéticos para ESBLs (genes blaESBL) são mediados por plasmídios, a sua disseminação para outras espécies de importância médica é considerada uma urgência epidemiológica. Os genes que codificam para ESBLs são mais comumente encontrados em membros da família Enterobacteriaceae, porém, plasmídeos, integrons, e sequências de inserção têm contribuído para o aumento da incidência de genes blaESBL entre outras bactérias Gramnegativas, incluindo Pseudomonas aeruginosa. Infelizmente, uma das maiores dificuldades associada à identificação precoce da produção de ESBL em agentes de infecção hospitalar como Pseudomonas aeruginosa tem sido a padronização de métodos fenotípicos, os quais são afetados por resultados falso-negativos, decorrentes de mecanismos intrínsecos que mascaram a presença destas enzimas (i.e., produção de beta-lactamase AmpC de origem cromossômica). O presente estudo teve como objetivo caracterizar feno e genotipicamente a produção de ESBLs em isolados clínicos de P. aeruginosa recuperados de diferentes hospitais do Estado de São Paulo durante o período de 2004-2008. Materiais e métodos: 35 amostras de P. aeruginosa provenientes de 4 diferentes centros médicos de São Paulo, com perfil de resitência às cefalosporinas de terceira geração, foram submetidas à triagem fenotípica para a produção de ESBL na presença e ausência de inibidores específicos (ácido clavulânico e cloxacilina). A confirmação genotípica foi realizada por PCR e sequenciamento, usando iniciadores para pesquisa dos genes blaCTX-M, blaTEM, blaSHV, blaOXA, blaPER e blaGES, e para o mapeamento de integron Classe 1. A diversidade genética das amostras foi realizada com auxílio do método de ERIC PCR e o índice de similaridade calculado empregando-se o coeficiente de Dice. Resultados e conclusão: Os métodos fenotípicos identificaram 3 cepas produtoras de ESBL, porém, a presença dos genes blaCTX-M e blaOXA-10 foi confirmada em 9 (33%) e 2 (7%) cepas de P. aeruginosa, respectivamente, recuperadas em 3 centros. O mapeamento e seqüenciamento do integron classe 1 encontrado revelou que duas cepas carregam 2 diferentes integrons classe 1 com genes blaCTX-M-2, aac6, e aadA6 de resistência para as cefalosporinas de terceira geração e para aminoglicosídeos. A transferência horizontal dos genes blaESBL não foi confirmada por transformação. Este estudo descreve que o aparecimento e disseminação de genes blaCTX-M em isolados clínicos de P. aeruginosa no Brasil teve sua origem a partir de 2005. Uma vez que ESBLs do tipo CTX-M têm sido amplamente descritas em Enterobactérias, a identificação destes genes em isolados de P. aeruginosa é alarmante e mostra que a mobilização horizontal do gene blaCTX-M entre diferentes gêneros e espécies é uma realidade no Brasil. Os genes que conferem resistência às metilases 16s RNAr não estavam relacionados a cepa de Pseudomonas aeruginosa produtores da enzima ESBL isoladas nas amostras de São Paulo. As cepas de Pseudomonas aeruginosa do presente estudo mostraram vários elementos de mobilização genéticos, como integrons e sequências de inserção, que podem estar participando na disseminação de resistência aos antibióticos beta- lactâmicos de amplo espectro. / Introduction and aim: The production of extended-spectrum beta-lactamases (ESBLs) has been restricted to Klebsiella spp. and Escherichia coli, being associated with high rates of resistance, morbidity and mortality. Since genetic determinants for ESBLs (blaESBL genes) are mediated by plasmids, the spread to other medical important species is considered an epidemiological urgency. These genes encoding ESBLs are commonly found in members of the Enterobacteriaceae however, plasmids, integrons, and insertion sequences have contributed to the increase in the incidence of blaESBL genes among other gram-negative bacteria, including Pseudomonas aeruginosa. Unfortunately, one of the biggest difficulties associated with the early identification of the production of ESBL in nosocomial agents as Pseudomonas aeruginosa has been the standardization of phenotypic methods, which are affected by false-negative results stemming from intrinsic mechanisms which can mask the presence of these enzymes (i.e., production of chromosomal beta-lactamase AmpC). The aim of this study is to characterize phenotypical and genotypical ESBL production in clinical isolates of P. aeruginosa recovered in different hospitals in São Paulo during the period of 2004 to 2008. Materials and methods: 35 P .aeruginosa isolates intermediately resistant or resistant to third generation cephalosporin were phenotypically analyzed for the presence of ESBL with and without inhibitors (clavulanic acid and cloxacilin).Genotipic confirmation with specific primers for blaCTX-M, blaTEM, blaSHV, blaOXA, blaPER and blaGES and the characterization of the genetic environment of blaCTX-M was performed by PCR and DNA sequencing.The random amplified polymorphism DNA technique with primer ERIC-2 was carried out for the isolates genotyping and the similarity index calculated with coefficient of Dice. Results and conclusion: the phenotypic methods identified 3 ESBL producing strains, however, the presence of genes blaCTX-M and blaOXA-10 has been confirmed in 9 (33%) and 2 (7%) strains of P. aeruginosa, respectively, from 3 medical centers. The mapping and sequencing of integron class 1 revealed that two strains harbored two different class 1 integrons with aadA6-like , aac6 gene and blaCTX-M-2-like genes conferring resistance to aminoglicosydes and third generation cephalosporins. The blaESBL horizontal transferation has not been confirmed by transformation. This study describes that the emergence and spread of genes blaCTX-M in clinical isolates of P. aeruginosa in Brazil had its origin from 2005. Since CTX-M type ESBLs have been widely described in Enterobacteriaceae, the identification of these genes in P. aeruginosa is alarming and shows that the blaCTX-M horizontal mobilization among different genus and species is a reality in Brazil. The genes that confer resistance to 16s RNAr methylases are not related to ESBL positive Pseudomonas aeruginosa strains in samples of São Paulo. The Pseudomonas aeruginosa strains of this study showed several genetic mobilization elements, such as integrons and insertion sequences, which may be participating in the spread of resistance to broad spectrum betalactams.

CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A maioria dos micro-organismos encontra-se integrados em comunidades denominadas âbiofilmeâ. Dentre estes se destaca a Pseudomonas aeruginosa, um patÃgeno oportunista de vegetais, animais e humanos, frequentemente associado à infecÃÃes nosocomiais difÃceis de serem erradicadas devido à presenÃa de biofilme. Os antibiÃticos fluoroquinolonas, tais como a ciprofloxacina (CIP), sÃo utilizados contra esta bactÃria, entretanto, mecanismos de resistÃncia vem sendo desenvolvidos por este micro-organismo. Assim, novas formas de controle microbiano tÃm sido alvo de inÃmeras pesquisas a fim de substituir ou potencializar os mÃtodos convencionais. Para esse fim, peptÃdeos antimicrobianos (AMPs) obtidos de diversos seres vivos representam uma alternativa para o desenvolvimento de novas drogas. Formas sintÃticas anÃlogas ao AMP Hilina a1 (Hy-a1), isolado da espÃcie Hypsiboas albopunctatus, tem demonstrado excelente eficÃcia antimicrobiana, dentre os quais se destacam o peptÃdeo Lys-[Trp6]hy-a1 (Lys-a1). Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi verificar a influÃncia do peptÃdeo Lys-a1 na atividade antimicrobiana de CIP contra o micro-organismo patogÃnico Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027. A concentraÃÃo inibitÃria mÃnima (CIM), a concentraÃÃo bactericida mÃnima (CBM) e a curva de morte foram determinadas para a CIP e a Lys-a1, separadamente. A influÃncia da Lys-a1 na atividade antimicrobiana da CIP foi verificada pela metodologia checkerboard com quantificaÃÃo da biomassa e do nÃmero de cÃlulas viÃveis do biofilme atravÃs da coloraÃÃo pelo cristal violeta e contagem de unidades formadoras de colÃnia (UFC), respectivamente. Os valores de CIM e CBM da Lys-a1 foi de 125 &#956;g.mL-1, e para a CIP foi de 0,24 e 0,48 &#956;g.mL-1, respectivamente. Os dados mostraram que tanto a CIP quanto a Lys-a1 sÃo potentes antimicrobianos contra P. aeruginosa, sendo capazes de inibir tanto o crescimento planctÃnico como o desenvolvimento do biofilme. A interaÃÃo das substÃncias foi interpretada pelo Ãndice de concentraÃÃo inibitÃria fracional (ICIF) e mostrou um efeito aditivo, estabelecendo uma diminuiÃÃo de 16 vezes da CIM e da CBM da CIP, quando combinada com a Lys-a1. Esta influÃncia foi observada tambÃm na cinÃtica de morte e na atividade antibiofilme. Em conclusÃo, o efeito aditivo entre a Lys-a1 e a CIP na atividade antimicrobiana sugere que o peptÃdeo tem potencial como um agente terapÃutico e adjuvante para o tratamento de doenÃas infecciosas causadas por P. aeruginosa, podendo habilitar o uso de concentraÃÃes menores do antibiÃtico. / Most microorganism lies embedded in communities called "biofilms". Among these stand out Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic pathogen of plants, animals and humans, frequently associated with nosocomial infections difficult to be eradicated due to the presence of biofilm. The fluoroquinolone antibiotics such as ciprofloxacin (CIP) against this bacterium are used, however, the mechanism of resistance has been developed for this microorganism. Thus, new forms of microbial control have been the subject of numerous studies in order to replace or enhance conventional methods. For this purpose, antimicrobial peptides (AMPs) obtained from various living beings represent an alternative to the development of new drugs. Synthetic forms analogous to Hylin a1 AMP (Hy-a1), isolated from species Hypsiboas albopunctatus, has shown excellent antimicrobial efficacy, among which stand out the peptide Lys-[Trp6]hy-a1 (Lys-a1). Thus, the aim of this work was to verify the influence of the peptide Lys-a1 in antimicrobial activity of CIP against pathogenic microorganism Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027. Minimum inhibitory concentration (MIC), minimum bactericidal concentration (MBC) and the curve death were determined to CIP and Lys-a1 separately. The influence of Lys-a1 in the antimicrobial activity of the CIP has been verified by the checkerboard method to quantify the biomass and the number of viable cells in biofilms by crystal violet staining and counting of colony forming units (CFU), respectively. The MIC and MBC values of Lys-a1 was 125 &#956;g.mL-1 and the CIP was 0.24 and 0.48 &#956;g.mL-1, respectively. The data showed that both the CIP as Lys-a1 are potent antibiotics against P. aeruginosa is able to inhibit both the planktonic growth and biofilm development. The interaction of substances interpreted by the fractional inhibitory concentration index (FICI) and showed an additive effect, establishing a decrease of 16 times the MIC and MBC of the CIP, when combined with the Lys-a1. This effect was also observed in the kinetics of death and antibiofilm activity. In conclusion, the additive effect of the Lys-a1 and CIP in antimicrobial activity suggests that the peptide has potential as a therapeutic agent and an adjuvant for the treatment of infectious diseases caused by P. aeruginosa can enable the use of lower concentrations of the antibiotic.

As bactérias são reconhecidas pelos macrófagos através dos receptores do tipo Toll (TLR), que ativam as vias do NF-&#954;B e das MAPKs, resultando em respostas como a fagocitose e a produção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (ROS/RNS), que causam a morte do microrganismo. P. aeruginosa, uma causa comum de pneumonia associada à ventilação mecânica, é uma bactéria que utiliza diversas estratégias de virulência e defesa, incluindo mecanismos antioxidantes. O objetivo deste trabalho foi verificar a relação entre o papel da 1-Cys peroxirredoxina LsfA está envolvida na virulência de P. aeruginosa. Linhagens mutantes com deleção em lsfA ou com uma mutação pontual neste gene (troca da Cys45 por Ala, RB302) foram construídas, sendo mais sensíveis a peróxido de hidrogênio que a linhagem selvagem PA14, como verificado pelo halo de inibição de crescimento. A atividade peroxidásica de LsfA foi medida in vitro pelo ensaio de tiocianato férrico e apenas a proteína com a sequência selvagem foi ativa, enquanto uma mutação na Cys45 aboliu completamente a sua atividade. Infecção de macrófagos J774 com as linhagens &#916;lsfA ou C45A resultaram em uma diminuição da morte dos macrófagos, aumento do clearance bacteriano e aumento da secreção de TNF-&#945; em comparação aos macrófagos infectados com a linhagem PA14, sugerindo uma maior ativação das vias do NF-&#954;B e das MAPKs nos macrófagos infectados com as linhagens mutantes. Para verificar se LsfA poderia alterar o estado oxidativo dos macrófagos, eles foram infectados com as linhagens PA14 ou RB302 (C45A) e incubadas com carbóxi-H2DCFDA, um indicador que se torna fluorescente quando oxidado. Macrófagos infectados com a linhagem mutante demonstraram um maior estado oxidativo em comparação aos macrófagos infectados com a linhagem selvagem, confirmando que LsfA limita a ativação dos macrófagos, resultando numa menor produção de TNF-&#945; e diminuição da citotoxicidade. A via das MAPKs e do NF-&#954;B são requeridos para a produção máxima de TNF-&#945; nos macrófagos infectados com a linhagem RB302, o que foi demonstrado utilizando-se de inibidores farmacológicos para essas vias. Como esperado, quando os macrófagos foram infectados com a linhagem RB302 na presença do antioxidante N-acetil-cisteína, houve uma redução da produção de TNF-&#945; a níveis semelhantes dos macrófagos infectados com a linhagem selvagem. Em modelo de pneumonia aguda, todos os camundongos infectados com a linhagem PA14 morreram 48h pós-infecção, enquanto os camundongos infectados com a linhagem RB302 sobreviveram por mais de 60 dias após a infecção. Houve uma redução do número de bactérias nos pulmões, baço e fígado nos camundongos infectados com a linhagem RB302 em comparação aos camundongos infectados com a linhagem PA14. Também foi observado um aumento na produção de citocinas pró-inflamatórias nos camundongos infectados com a linhagem RB302 em comparação aos camundongos infectados com PA14. Com isso, foi demonstrado pela primeira vez o envolvimento de uma 1-Cys peroxirredoxina de bactérias na virulência, com a modulação da resposta imune do hospedeiro in vitro e in vivo. / Bacteria are recognized by macrophages via Toll-Like Receptors (TLR), leading to a signaling pathway that activates NF-&#954;B and MAPKs. Killing in phagossomes is achieved by reactive oxygen and nitrogen species (ROS/RNS) generation. P. aeruginosa is a common cause of ventilator associated pneumonia and it uses several strategies for virulence and defense, including antioxidant mechanisms. In this work, we show for the first time that the 1-Cys peroxiredoxin LsfA is implicated in P. aeruginosa virulence. Mutant strains with a deletion in lsfA or with a mutation (Cys45 to Ala, RB302) were constructed and they were more sensitive to H2O2 than the wild type strain PA14, as verified by a growth inhibition assay. In vitro peroxidasic activity of LsfA was measured by ferric-thiocyanate assay, and while the wild-type protein was active, the mutation in Cys45 abolished its activity. Infection of J774 macrophages with &#916;lsfA or C45A strains resulted in lower cell death, increased bacterial clearance and higher TNF-&#945; production in comparison to PA14-infected macrophages, suggesting a higher level of MAPKs and NF-&#954;B activation due to the mutant strains. To verify whether LsfA could modify the oxidative state of infected macrophages, they were infected with PA14 or RB302 strains and incubated with carboxy-H2DCFDA, an indicator that emits fluorescence when oxidized. Macrophages infected with mutant strains showed a higher oxidative state in comparison to PA14-infected cells, thus confirming that LsfA limits macrophages activation that leads to TNF-&#945; production and cytotoxic activity. MAPKs and NF-&#954;B pathways are required to full production of TNF-&#945; in macrophages infected with RB302, as shown using pharmacological inhibitors for those pathways. When macrophages were infected with RB302 in the presence of the antioxidant N-acetyl-cysteine, there was a reduction in TNF-&#945; production as compared to PA14, as expected. In an acute pneumonia model, all PA14-infected mice died at 48h post-infection, while C45A-infected mice survived as long as 60 days. There was also reduction in bacterial counts in the lungs, spleen and liver of mice infected with RB302, in comparison to PA14-infected mice. A greater pro-inflammatory cytokine production was observed in mice infected with mutant strain in comparison to mice infected with PA14. Altogether, this work shows for the first time the role of a bacterial 1-Cys Prx that modulates host immune response in vitro and in vivo.

Foram avaliados 528 isolados clínicos de Pseudomonas aeruginosa de 131 pacientes fibrocísticos atendidos em um centro de referência em fibrose cística (FC) durante o período de 2005 a 2008. 135 isolados clínicos (25,6%) apresentaram subpopulação hipermutante (isolados com altas taxas de mutações) utilizando teste modificado de suscetibilidade aos antimicrobianos. Destes, 9 isolados (6,7%) de 7 pacientes foram classificados como hipermutantes (HPM) segundo estimativa da freqüência de mutação. Após seqüenciamento do gene mutS e análise de mutações relacionadas à inativação do sistema de reparo de erros no pareamento do DNA (Mismatch Repair System - MRS), foi possível observar este tipo de mutação em 5 isolados HPM de 4 pacientes. Avaliamos a formação de biofilme em 45 isolados NHPM, 9 HPM e suas respectivas subpopulações por duas metodologias. Segundo o primeiro método, 24 (53,3%) e 3 (21,4%) isolados NHPM e HPM, respectivamente, foram classificados como não-formadores de biofilme. Pelo segundo método, apenas 4 (8,9%) isolados NHPM e nenhum isolado HPM foram classificados nessa categoria. Os percentuais de resistência aos antibióticos ceftazidima, ciprofloxacino e tobramicina em condições de biofilme foram mais elevados que aqueles obtidos em crescimento plantônico e, em ambas as condições, foi possível evidenciar forte associação entre hipermutabilidade e aumento de resistência antibiótica. A associação dos macrolídeos azitromicina e claritromicina, em concentrações sub-inibidoras, com os antibióticos anti-pseudomonas, demonstrou ação inibitória sobre isolados clínicos de P. aeruginosa em condições de biofilme, o que sugere sua indicação no tratamento de infecções por P. aeruginosa pela sua ação anti-biofilme. / We evaluated 528 clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in 131 CF patients attended at a referral center for cystic fibrosis (CF) during the period of 2005 to 2008. 135 clinical isolates (25.6%) presented hypermutable subpopulation (isolates with high mutation rates) using a modified antimicrobial susceptibility method. Of these, 9 isolates (6.7%) of 7 patients were classified as hypermutable (HPM) according to the estimate of mutation frequency. After gene sequencing and analysis of mutS mutations related to inactivation of the repair system errors in DNA pairing (Mismatch Repair System - MRS), we observed this type of mutation in 5 HPM isolates of 4 patients. We evaluated the biofilm formation in 45 isolates NHPM, 9 HPM and their subpopulations by two methods. According the first method, 24 (53.3%) and 3 (21.4%) isolates NHPM and HPM, respectively, were classified as non-biofilm formers. According the second method, only 4 (8.9%) isolates NHPM and none HPM were classified in this category. The percentages of resistance to antibiotics ceftazidime, ciprofloxacin and tobramycin in conditions of biofilm were higher than those obtained in planktonic growth, and in both conditions, it was observed a strong association between hypermutability and increased antibiotic resistance. The association of macrolides azithromycin and clarithromycin, in sub-inhibitory concentrations, with anti-pseudomonas antibiotics, has shown inhibitory activity on clinical isolates of P. aeruginosa in biofilm conditions, which should be recommended for treatment of CF P. aeruginosa infections due to its anti-biofilm action.