Orientador: Ricardo Velludo Soutello / Banca: Alessandro Francisco T. do Amarante / Banca: Wilma Aparecida Starke Buzetti / Resumo: Dentre todos os fatores que devem ser levados em consideração no quesito sanidade dos equinos, o parasitismo ocupa lugar de destaque devido aos prejuízos consequentes causados pelos parasitos gastrintestinais. O uso indiscriminado de drogas na tentativa do controle desses parasitos podem levar ao surgimento da resistência anti-helmíntica, o que representa um problema crescente para a saúde, bem-estar e produtividade dos equinos. Tendo em vista a carência de informações relacionadas aos tratamentos anti-helmínticos em rebanhos de equinos no estado de São Paulo, o presente estudo teve como objetivo avaliar a eficácia das principais classes dos anti-helmínticos utilizados no mercado: benzimidazois (Fenbendazole), avermectinas (ivermectina) e milbemicinas (moxidectina), determinar os gêneros e espécies de helmintos mais abundantes e investigar as medidas de controle parasitário praticadas em diferentes rebanhos de equinos na região oeste do estado de São Paulo / Brasil. As avaliações coprológicas foram realizadas em animais de 10 propriedades através do teste de redução na contagem de ovos por grama de fezes (R-OPG) e coproculturas para a identificação das larvas de terceiro estágio (L3) dos estrongilídeos. As medidas adotadas no controle parasitário foi investigada através de um inquérito aplicados aos criadores contendo perguntas sobre o manejo adotado na propriedade. Os resultados analisados por meio do teste de redução na contagem de ovos por grama de fezes (R-OPG) determinaram a presença da resistência anti-helmíntica ao fenbendazol e a alta eficácia da ivermectina e moxidectina na região oeste de estado de São Paulo. A identificação das larvas (L3) revelaram a prevalência dos ciatostomíneos entre as larvas de estrogilídeos encontradas e o maior aparecimento do Strongylus vulgaris em propriedades com intervalo de vermifugação longo. O questionário aplicado revela que a ivermectina é atualmente a ... / Abstract: Among all the factors that must be considered regarding health of horses, parasitism occupies a prominent place due to damage caused by gastrointestinal parasites. The indiscriminate use of drugs to control these parasites can lead to the development of anthelmintic resistance, which is increasing problem on the health, welfare and productivity of equines. Given the lack of research related to anthelmintic treatment in herds of horses in the São Paulo state, the objective of the present study was to evaluate the efficacy of major classes of anthelmintics used by the most farmers: benzimidazoles (Fenbendazole), avermectin (ivermectin) and milbemycin (moxidectin) then determine the genus and species of main abundant helminths and also investigate the parasite control measures practiced in different herds of horses in the western region of the Sao Paulo state/Brazil. The evaluations were performed using animals from 10 properties through the technique of fecal egg counts reduction test (FECRT) and stool cultures for third stage larvae identification (L3) of strongyles. Measures adopted in parasite control were investigated through a survey applied to breeders containing questions about the property management. The results of the fecal egg counts reduction test (FECR T) determined the presence of anthelmintics resistance when fenbendazole was used whereas the use of ivermectin and moxidectin showed high efficacy in the western region of the state of São Paulo. Regarding the larvae identification (L3), properties where the range of worming was greater showed that the most strongyles larvae found were cyathostomin and higher incidence of Strongylus vulgaris on farms with long-interval worming. However, the survey showed that currently ivermectin is the main drug used by the farmers and the application interval ranged in four times per year and once every two years. Thus, this study suggests that strategies of control more sustainable can ... / Mestre

Orientador: Alessandro Francisco Talamine do Amarante / Banca: Solange Maria Gennari / Banca: Cledson Augusto Garcia / Banca: Reinaldo José da Silva / Banca: Patrizia Ana Bricarello / Resumo: O experimento teve como objetivo avaliar a sobrevivência de larvas infectantes (L3) de Trichostrongylus colubriformis em três espécies forrageiras. Para tal, foram utilizados módulos experimentais constituídos por seis canteiros de 32,4 m2 cada, estabelecidos com as seguintes gramíneas forrageiras: Brachiaria decumbens cv. Australiana, Cynodon dactilon cv. Coast-cross e Panicum maximum cv. Aruana, perfazendo dois canteiros por espécie. Cada canteiro foi dividido em 36 parcelas, de 30 x 30 cm, de forma a permitir seis repetições por espécie e por altura em cada semana de colheita de material. A sobrevivência larval foi avaliada nas quatro estações do ano, sob o efeito de duas alturas de poda das forragens (baixa, 5 cm e alta, 30 cm). A poda foi realizada imediatamente antes da deposição das fezes. Ocorreram quatro deposições de fezes, uma a cada estação do ano. A colheita das fezes e da forragem foi realizada uma, duas, quatro, oito, 12 e 16 semanas após cada deposição de fezes nos canteiros experimentais. A altura da forragem foi medida em cada uma das subdivisões imediatamente antes das colheitas. A forragem foi cortada com uma tesoura de poda, rente ao solo, de uma área delimitada com o auxílio de um círculo de 10 cm de raio. As fezes foram recolhidas manualmente dos canteiros. A recuperação de L3 das amostras fecais foi maior quando as fezes foram depositadas em meio ao capim alto (com 30 cm - P<0,05). Porém, a recuperação de L3 nas forragens foi similar em ambos os cortes. Em relação à concentração de L3, o corte baixo propiciou maior quantidade de L3 por quilo de matéria seca (P<0,05). As maiores recuperações de L3, nas fezes e nas forragens, ocorreram quando as fezes foram depositadas no outono e na primavera. Dentre as espécies forrageiras, o capim aruana foi o que no geral apresentou maiores concentrações de larvas infectantes de T. colubriformis. / Abstract: The purpose of the experiment was to evaluate infective Trichostrongylus colubriformis larvae (L3) survival in three forage species. Experimental modules formed by six 32.4-m2 plot, established with the following forage grass species, were used in the study: Australian Brachiaria decumbens cv., Cynodon dactilon cv. Coast-cross, and Panicum maximum cv. Aruana, totaling two plots for each species. Each plot was divided into 36 30 x 30 cm parts in order to allow six replicates per species and per height in each week of material collection. Larval survival was evaluated in the four seasons of the year under the effect of two forage paring heights (low, 5 cm, and high, 30 cm). The paring was carried out immediately before the feces were deposited. Four feces deposits were made, one in each season of the year. Feces and forage collection was performed one, two, four, eight, 12 and 16 weeks after each feces deposition in the experimental plots. Forage grass height was measured in each subdivision immediately before the collections. The forage was cut using pairing scissors, close to the soil, from an area delimited with a circle with a 10-cm radius. The feces were collected manually from the plots. L3 recovery rates from fecal samples were bigger when the feces were deposited in high grass (measuring 30 cm - P<0,05). However, L3 recovery in the forages was similar for both cuts. So far as the L3 concentration is concerned, the low cut resulted in a bigger number of L3 per kilogram of dry matter (P<0,05). The higher L3 recovery in the feces and in the forage grass occurred when the feces were deposited in the autumn and in the spring. Among the forage species, the aruana grass was the one that, in general, harbored the biggest concentrations of infecting T. colubriformis larvae. / Doutor

Orientador: Américo Garcia da Silva Sobrinho / Banca: Gilson Pereira de Oliveira / Banca: José Carlos Barbosa / Banca: Valdo Rodrigues Herling / Banca: Ângela Cristina Dias Ferreira / Resumo: As nematodioses se constituem no principal problema sanitário dos pequenos ruminantes. Com o objetivo de avaliar as nematodioses de ovinos e caprinos mantidos em pastagens dos capins andropógon, estrela-africana, Tanzânia e mombaça, foram conduzidos dois experimentos, nas Fazendas Santa Bárbara e Santo Ângelo, no município de Barreiras - Bahia. Os nematódeos gastrintestinais mais prevalentes nos ovinos, pastejando os capins Tanzânia, andropógon e estrela-africana, foram: Trichostrongylus spp., Haemonchus spp., Cooperia spp., Oesophagostomum spp. e Strongyloides sp., com infecção crescente na estação de pastejo. Os capins apresentaram concentrações semelhantes de larvas infectantes. O capim-andropógon apresentou utilização menos eficiente pelos animais, com alta quantidade de material morto, enquanto nos capins Tanzânia e estrela-africana a densidade de colmos, abaixo de 30 e 15 cm, respectivamente, foi elevada. Os nematódeos gastrintestinais mais prevalentes em ovinos e caprinos mantidos em pastagens de P. maximum, foram: Haemonchus spp., Trichostrongylus spp., Oesophagostomum spp. (caprinos), Cooperia spp. (ovinos). Os ovinos apresentaram menor infecção por nematódeos do que os caprinos, embora ao longo da estação de pastejo ambos tenham sido crescentemente infectados. Na produção de caprinos e ovinos em pastagens, devem ser considerados no controle integrado de nematódeos, a espécie de gramínea forrageira, a altura de manejo e a espécie animal. / Abstract: Nematodiosis is the major heath problem in small ruminants. There were designed two experiments to evaluate nematodioses in sheep and goats grazing gamba, star and Tanzania, and mombaça grasses, at Santa Bárbara and Santo Ângelo farms (Barreiras - Bahia), respectively. The gastrintestinal nematods identified in sheep grazing gamba, star, and Tanzania grasses were: Trichostrongylus spp., Haemonchus spp., Cooperia spp., Oesophagostomum spp., and Strongyloides sp., with increasing of infection level during grazing season. Grasses contained the same concentrations of infective larvae. Gamba grass was less used by the animals and accumulated high amount of dead material, while Tanzania and star grasses had higher stems densities, above 30 and 15 cm, respectively. The gastrintestinal nematods identified in goats and sheep grazing P. maximum were: Haemonchus spp., Trichostrongylus spp., Oesophagostomum spp. (goats), and Cooperia spp.(sheep). Sheep had small infection by nematods than goats, but along the grazing season both were strongly infected. For goats and sheep production on pastures, should be observed in integrated pest management the forage grass specie, the height of management, and the animal specie. / Doutor

Orientador: Estevam Guilherme Lux Hoppe / Banca: Fabiana Pilarski / Banca: Wilson Gómez Manrique / Resumo: A facilidade para a obtenção de várias réplicas e a possibilidade de contagem da totalidade de integrantes das comunidades parasitárias permitem o desenvolvimento de numerosos estudos sobre a ecologia de populações e de comunidades, tornando os ictioparasitas bons modelos para estudos em ecologia parasitária. Em adição, com o desenvolvimento da aquicultura no Brasil e no mundo, houve aumento considerável da relevância de estudos relacionados com patógenos de organismos aquáticos. Portanto, o objetivo deste trabalho foi caracterizar e analisar as comunidades e infracomunidades de metazoários parasitos de corvinas capturadas no Reservatório de Promissão, Rio Tietê, no município de Borborema (21°39′58"S, 49°8′49"O), Estado de São Paulo. Foram examinados 50 espécimes, capturados por pescadores profissionais no mês de março de 2015. Os peixes foram necropsiados e os parasitas obtidos foram quantificados, preparados e montados para identificação taxonômica e análise das comunidades de parasitos. Os espécimes de peixe analisados no estudo apresentaram comprimento padrão médio de 25,21 ± 2,27 cm e peso médio de 328,82 ± 89,03 g. Foram coletados 5227 espécimes de parasitas metazoários, sendo 2880 (55,1%) Diplectanum piscinarius (Monogenoidea: Diplectanidae) e 2347 (44,9%) metacercárias de Austrodiplostomum compactum (Digenea, Diplostomidae), ambos com prevalência de 100% e abundância parasitária de 57,6 e 46,9, respectivamente. Foi encontrada baixa diversidade parasitária (riqueza de espécies=2), com índice de Simpson (D) igual a 0,505 e baixos valores dos índices de Shannon (H'=0,688) e de diversidade de Margalef (I=0,177). O índice de dominância de Berger-Parker (d=0,551) indicou uma leve dominância do monogenético D. piscinarius. Houve correlação positiva intermediária, avaliada pelo coeficiente de Pearson, entre a abundância parasitária de D. piscinarius e comprimento padrão (r=0,43) e... / Abstract: The objective of this study was to characterize and analyze the communities and infracommunities of metazoan parasites of Plagioscion squamosissimus caught in Promissão reservoir, Tiete river in Borborema city (21°39′58"S, 49°8′49"W), São Paulo State. Fish were caught by professional fishermen on March 2015 and 50 specimens were examined. The obtained parasites were quantified and mounted for taxonomic identification and analysis of parasite communities. The P. squamosissimus specimens analyzed in this study had an average standard length of 25.21 ± 2.27 cm and average weight of 328.82 ± 89.03 g. We obtained, in total, 5227 specimens of metazoan parasites, with 2880 (55.1%) Diplectanum piscinarius (Monogenoidea: Diplectanidae) and 2347 (44.9%) metacercarie Austrodiplostomum compactum (Digenea, Diplostomidae), both with prevalence of 100% and abundance of 57.6 and 46.9, respectively. Also, we observed low parasite diversity (species richness = 2), Simpson index (D) of 0.505 and low values of the indices of Shannon (H '= 0.688) and diversity of Margalef (I = 0.177). The Berger-Parker dominance index (p = 0.551) indicated a slight dominance of the monogenean D. piscinarius. There was a positive correlation assessed by Pearson coefficient between parasite abundance of D. piscinarius and standard length (r = 0.43) and weight (r = 0.51) of hosts / Mestre

Orientador: Helio Langoni / Banca: Antonio Carlos Paes / Banca: Márcio Garcia Ribeiro / Banca: Lisiane de Almeida Martins / Banca: Luiz Fernando Pita Gondim / Resumo: Toxoplasma gondii é um parasito de grande importância no contexto de produção animal e saúde pública, sendo importante patógeno oportunista em pacientes imunocomprometidos. Este estudo objetivou determinar a soroprevalência de toxoplasmose em ovinos de abatedouros do estado de São Paulo, e a variabilidade genotípica dos isolamentos obtidos. A presença de anticorpos para T. gondii foi pesquisada em 602 amostras de soro pela reação de imunofluorescência indireta (RIFI), aglutinação direta modificada (MAT), com antígeno fixado pelo metanol (AM) e formalina (AF). Bioensaio em camundongos e pesquisa do DNA do parasito pela reação em cadeia pela polimerase (PCR) do gene 529 pares de bases (pb), repetitivo 300 vezes no genoma do parasito, foi realizado com cérebro, pulmão e músculo ("pool" de diafragma e coração) dos ovinos soropositivos. Das amostras positivas à PCR realizou-se a genotipagem pelas técnicas de multilocus-, nested-PCR e polimorfismo de comprimento dos fragmentos de restrição (RFLP-PCR) em 12 loci (SAG1, 5'SAG2, 3'SAG2, alt-SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, c22-8, c29-2, L358, PK1, Apico, CS3), adicionado de ROP18Del e ROP18UPS, além da confirmação do parasito pelo locus 18S rRNA, diferenciando de Hammondia hammondi, Neospora caninum, Sarcocystis neurona, S. moulei, S. miescheriana, S. hominis, S. capracanis e S. tenella. 66/602 (11,0%) amostras de soro foram positivas para algum teste sorológico, com maior sensibilidade da MAT-AF, utilizado como teste de triagem. Amostras teciduais de 20/66 (30,3%) animais foram positivas ao isolamento, sendo detectados cistos em 12, taquizoítos em quatro e somente sorologia positiva em outras quatro. Detectouse o DNA do parasito em amostras de 22/66 (33,3%) animais. O genótipo completo foi obtido em somente 13/22 (59,1%). Dez genótipos diferentes foram identificados, sendo seis novos genótipos... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Toxoplasma gondii is a parasite with high importance to the animal production and public health, being important opportunistic pathogen in immunocompromised patients. This study was aimed to determine the seroprevalence of toxoplasmosis in ovines in slaughterhouses from State of de São Paulo, and the genotypic variability of the obtained isolates. T. gondii antibodies were researched in 602 serum samples by indirect fluorescent antibody test (IFAT) and modified agglutination test (MAT), with methanol- (AM) and formalin-fixed antigen (AF). Bioassay in mice and the research of DNA by polymerase chain reaction (PCR) of gene 529 base pairs (bp), 300 times repetitive in parasite genome, was assayed with brain, lung and muscle ("pool" of diaphragm and heart) from seropositive ovines. Genotyping of the PCR positive samples was performed by multilocus-, nested-PCR and restriction fragment lenght polymorphism (RFLP-PCR) in 12 loci (SAG1, 5'SAG2, 3'SAG2, alt-SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, c22-8, c29-2, L358, PK1, Apico and CS3), added of ROP18Del and ROP18UPS, beyond the confirmation by 18S rRNA locus, to differentiate Hammondia hammondi, Neospora caninum, Sarcocystis neurona, S. moulei, S. miescheriana, S. hominis, S. capracanis and S. tenella. 66/602 (11.0%) serum samples were positive to, at least, one serological test with high sensitivity to MAT-AF, used as screening test. Tissue samples of 20/66 (30.3%) animals were positive to the isolation, being detected cysts in 12, tachyzoites in four and in other four only positive result to the serology. DNA of the parasite was detected in samples of 22/66 (33.3%) animals. The complete genotype was detected in only 13/22 (59.1%). Ten different genotypes were identified, with six new genotypes. Two samples presented type II, isolated from Polwarth (Ideal) breed, bred extensively in Santana do Livramento and Uruguaiana, RS. Two other samples, from... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / As leishmanioses são um grupo de doenças causadas por protozoários do gênero Leishmania spp que afetam 98 países. No Brasil, no ano de 2013, foram relatados 3.253 casos de leishmaniose visceral e 18.226 casos de Leishmaniose Tegumentar Americana. O tratamento de primeira escolha continua sendo realizado com antimoniais pentavalentes, e em casos de insucessos os fármacos de segunda escolha são a pentamidina e a anfotericina B. Tais medicamentos causam intensos efeitos adversos e ultimamente têm surgido cepas resistentes aos mesmos. Em áreas endêmicas têm sido cada vez mais comum o surgimento da co-infecção Leishmania com Mycobacterium tuberculosis. O tratamento para a tuberculose com pirazinamida (PZA) e isoniazida (INZ), controla a leishmaniose. Esses dados sugerem atividade anti-leishmania da PZA e da INZ. O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade in vitro da INZ e da PZA e seus compostos derivados (série G e série R, respectivamente) sobre Leishmania (Viannia) braziliensis. As moléculas foram testadas em monocamadas de macrófagos peritoneais de camunongos infectados com L. (V) braziliensis durante 48h. Todas as moléculas testadas inibiram o índice de infecção de forma dose dependente em comparação aos controles. As moléculas da série R foram mais ativas do que a PZA, porém o resultado foi significativo somente para a R02 (p < 0,005). Apenas a molécula R05 (76,64M) foi relativamente tóxica para macrófagos. Os compostos mais ativos foram R02, G01 e G02, cujos índices de seletividade foram 14,31, 19 e 30, respectivamente. A dosagem de nitrito foi feita em sobrenadantes de monocamadas de macrófagos peritoniais infectados e tratados com as substâncias nas concentrações 10 e 100M. A G01 e a G02 estimularam a produção de NO2 nas duas concentrações, entretanto o resultado foi estatisticamente significativo para a G02 em 100M (p < 0,0001), a G05 só estimulou óxido nítrico na maior concentração. Todos os compostos da série R estimularam NO2, contudo, o resultado foi estatisticamente significativo para a R03 e R05 a 100M (p < 0,001). Adicionalmente, foi realizado uma análise preditiva in sílico de parâmetros farmacocinéticos das moléculas mais ativas in vitro, utilizando o software admetSAR. Os dados obtidos mostraram que de forma semelhante às suas moléculas originais a G01, G02 e R02 apresentaram alta capacidade de serem absorvidas pelo trato gastrointestinal, baixo potencial hepatotoxico e carcinogênico. Juntos, esses dados demonstram que essas moléculas são seletivamente tóxicas para o parasito com potencial para serem testadas pela via oral em estudos em modelo experimental de infecção. / Leishmaniasis are a group of diseases caused by protozoan of genus Leishmania spp affecting of 98 countries. In Brazil, in the year 2013 were 3.253 reported cases of visceral leishmaniasis and 18.226 cases of cutaneous leishmaniasis. The first choice of treatment is still performed with pentavalent antimonials and in cases of failures drugs of second line of treatment are pentamidine and anfotericin B. These drugs cause many adverse effects and has lately emerged resistant strains. In endemic areas it has been increasingly common the appearance of co-infection Leishmania and Mycobacterium tuberculosis. The treatment of tuberculosis with pyrazinamid and isoniazid control the leishmaniasis.The aim of this study was evaluate the anti-leishmania activity in vitro of INZ and PZA and yours derivatives compounds (serie G and serie R,respectively) on the Leishmania (Viannia) braziliensis. The molecules were tested on infected monolayers of peritoneal murine macrophages for 48h. All the molecules te inhibited the infection index in a dose-dependent manner in relation to controls. The molecules of the R series were more active than PZA, but the result was only significant for R02 (p < 0,005). Only R05 (CC50 = 76,64M) was relatively toxic to macrophages. The most active compounds were R02, G01 and G02 whose select index were 14,31, 19 and 30, respectively. Nitrite assay was performed in supernatants of infected monolayers of peritonial macrophages treated with the substancies at 10 and 100M. G01 and G02 stimulated NO2 prodution, however, the result was only statistically significant for G02 at 100M (p < 0,001). All the compounds of R serie stimulated NO2 production however the results were statistically significant for the R03 and R05 at 100M (p < 0,001). Additionally, a in silico preditive pharmacokinetic analysis was performed to active molecules using the admetSAR software the data showed that G01, G02 and R02 were similar to their original molecules as to high capacity to be absorbed by the gastrointestinal tract, low hepatotoxic and carcinogenic potencial. Together, these data demonstrate that these molecules are selectively toxic to the parasite with the potencial to be tested orally on studies in experimental infection.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A transsialidase é uma glicoproteína de membrana pertencente a uma família de genes de cópia múltipla, envolvida no processo de invasão celular do Trypanosoma cruzi no hospedeiro vertebrado. Esta dissertação foi concebida com um amplo componente analítico que dependia de dados publicamente disponíveis, ou seja, as sequências oriundas do projeto genoma de T. cruzi e cDNAs de trans-sialidase depositadas no Genbank-dbEST. Este componente analítico necessitou ser complementado e ampliado com a obtenção experimental de novas sequências, a partir da metodologia baseada na transcrição reversa acoplada a PCR. Os fragmentos obtidos de cepas de T. cruzi Dm28c (T. cruzi I), Y (T. cruzi II), CL-Brener (T. cruzi II, cepa híbrida), INPA4167 (zimodema III), 3663 (zimodema III) e Colombiana (zimodema III) foram clonados, sequenciados e analisados composicionalmente. Essas sequências foram editadas e alinhadas usando-se o software CLUSTAL X. Em uma seção específica do Genbank, denominada dbEST, buscamos os cDNAs homólogos a trans-sialidase. Esta busca por similaridade foi realizada individualmente com os números de acesso referentes às seqüências supracitadas contra o dbEST utilizando o BLAST a fim de obtermos informações funcionais e evolutivas. Em seguida, desenvolvemos metodologias experimentais que nos permitiu avaliar segmentos da 5 UTR, tais como os sítios de trans-splicing adicionais ou múltiplos em TS e seus respectivos sinais (região rica em polipirimidina), variação composicional e tamanho da região das sequências entre diferentes linhagens de T. cruzi. O resultado dessa averiguação também nos mostrou a quantidade de cDNAs relacionados com a transsialidase no dbEST bem como a relação desses cDNAs com o mini-exon. As cepas do zimodema III apresentaram tamanho médio dos fragmentos de 312 bases, enquanto T. cruzi I e T. cruzi II apresentaram, respectivamente 209 e 218. Trans splicing adicional ou duplicações gênicas com mutações no sítio primário de trans splicing não parece ser um fenômeno exclusivo de algum grupo populacional, embora seja mais evidente em T. cruzi zimodema III.

As leishmanioses estão entre as mais importantes endemias brasileiras e encontram-se entre as doenças mais negligenciadas no mundo. O arsenal terapêutico disponível é restrito, tóxico, caro e em algumas situações ineficazes, devido ao surgimento de cepas resistentes do parasito. No Brasil são registrados anualmente mais de 20 mil casos de leishmaniose tegumentar e a Leishmania braziliensis é a principal espécie causadora das formas clínicas cutânea e mucosa. Portanto tornam-se importantes estudos que conduzam ao desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas. O objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade da pterocarpanoquinona denominada LQB118 sobre Leishmania braziliensis in vitro e in vivo usando hamsters como modelo experimental. O efeito antiparasitário foi avaliado sobre o crescimento in vitro das formas promastigotas e sobre amastigotas intracelulares em macrófagos peritoneais de camundongos. Para avaliar o modo ação in vitro foi investigada a indução de apoptose usando marcação por TUNEL e Anexina V-FITC. O efeito sobre a modulação da ativação de macrófagos murinos foi analisada pela dosagem de óxido nítrico (reagente de Griess) e de citocinas IL-12, TNF-alfa e IL-10 (por ELISA) nos sobrenadantes de macrófagos. In vivo a atividade terapêutica da LQB 118 foi estudada em grupos de hamsters infectados com L.braziliensis na pata, tratados com a LQB118 pelas vias intralesional (100M/3x/semana) ou oral (0,5mg/5x/semana) após 7 dias de infecção durante oito semanas. A ação terapêutica foi analisada através do tamanho da lesão. A resposta imune foi avaliada durante o tratamento, pela resposta de hipersensibilidade tardia (DTH) ao antígeno total de L. braziliensis. A ação da LQB118 in vitro foi dose-dependente tanto na forma promastigota inibindo 45%, 64,7% e 99,95%, quanto nas amastigotas intracelulares 22%, 72% e 81% nas concentrações de 5M, 10M e 20M, respectivamente para ambas as formas evolutivas. A LQB118 foi capaz de induzir a externalização de fosfatidilserina em promastigotas (18,57% das células incubadas por 24 h e em 25,79% de células tratadas por 48h) e também promoveu aumento da fluorescência nas duas formas evolutivas da Leishmania quando comparadas aos controles, demonstrando a indução de fragmentação do DNA do parasito. Esta substância também foi capaz de modular a resposta dos macrófagos infectados por 24 horas aumentando de forma dose-dependente a IL-12 e NO, mantendo constante TNF-&#945;. In vivo, na sétima semana de tratamento, observamos uma redução significativa do tamanho das lesões nos animais tratados com LQB 118 intralesional (p<0, 001) e no grupo tratado pela via oral (p<0,05) quando comparado com o controle. Estes resultados demonstram que a atividade anti-Leishmania da LQB118 é direta sobre o parasito pela indução de morte por apoptose, apresentando também uma ação moduladora da resposta dos macrófagos contribuindo para ação leishmanicida, sem alterar a morfologia da célula hospedeira e que a LQB 118 apresenta uma atividade terapêutica no modelo hamster e pode ser uma importante molécula para o desenvolvimento de um novo fármaco. / The leishmaniases are among the most important endemic diseases in Brazil and are among the most neglected diseases in the world. The therapeutic tools available is restricted, toxic, expensive and ineffective in some situations, due to the emergence of resistant strains of the parasite. Are reported annually in Brazil more than 20.000 cases of cutaneous leishmaniasis and Leishmania braziliensis is the main species causing clinical forms of skin and mucosa. Therefore become important studies that lead to the development of new therapies. The aim of this study was to evaluate the activity of pterocarpanoquinona LQB118 called on Leishmania braziliensis in vitro and in vivo using hamsters as an experimental model. The antiparasitic effect was evaluated on the in vitro growth of promastigotes and on intracellular amastigotes in mouse peritoneal macrophages. To assess the mode of action in vitro was investigated using the induction of apoptosis by TUNEL labeling and Annexin V-FITC. The effect on the modulation of murine macrophage activation was assessed by measuring levels of nitric oxide (Griess reagent) and IL-12, TNF-alpha and IL-10 (ELISA) in supernatants of macrophages. In vivo therapeutic activity of LQB 118 was studied in groups of hamsters infected with L.braziliensis the paw treated with intralesional routes by LQB118 (100M/3x/semana) or oral (0.5 mg/5x/semana) after 7 days after infection for eight weeks. The therapeutic action was analyzed using the size of the lesion. The immune response was evaluated during treatment, the response of delayed hypersensitivity (DTH) to the total antigen of L. braziliensis. The action of LQB118 in vitro was dose-dependent manner in both the promastigote inhibiting 45%, 64.7% and 99.95%, and intracellular amastigotes in 22%, 72% and 81% at concentrations of 5M, 10M and 20M, respectively for both forms evolving. The LQB118 was able to induce the externalization of phosphatidylserine in promastigotes (18.57% of the cells incubated for 24 h in 25.79% of cells treated for 48h) as well promoted the increase of fluorescence in the two evolutive forms of Leishmania compared to controls, demonstrating the induction of DNA fragmentation of the parasite. This substance was also able to modulate the response of macrophages infected for 24 h increased in a dose-dependent IL-12 and NO, TNF-&#945; was kept constant. In vivo, in the seventh week of treatment, we observed a significant reduction in lesion size in animals treated with intralesional LQB 118 (p <0, 001) and in those treated orally (p <0.05) compared with control. These results demonstrate that the activity of anti-Leishmania LQB118 is directly on the parasite by inducing apoptosis, also presenting to modulate the response of macrophages contributes to antileishmanial without changing the morphology of host cells and that the 118 has LQB therapeutic activity in a hamster model and could be an important molecule for the development of a new drug.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A doença de Chagas é endêmica na América Latina sendo considerada uma doença negligenciada com grande impacto socioeconômico. A infecção é causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi que é transmitido pela forma vetorial, entre outros mecanismos. O tratamento consiste basicamente no uso de dois fármacos, o benznidazol e o Nifurtimox que apresentam uma série de efeitos colaterais e atuam muito pouco nas formas amastigotas intracelulares o que faz com que o tratamento atual seja restrito e insatisfatório.Várias atividades farmacológicas foram atribuídas ao lapachol e a pterocarpanos, tais como atividade antitumoral e antiparasitária. Devido a esse potencial foi sintetizado uma molécula híbrida, a pterocarpanoquinona LQB-118, e algumas moléculas derivadas. A LQB-118 mostrou anteriormente atividade antitumoral e anti-Leishmania. O objetivo do presente trabalho foi investigar a atividade in vitro da LQB-118 e suas moléculas derivadas sobre o Trypanosoma cruzi clone Dm28c. Para avaliação inicial do efeito anti-parasitário das moléculas, amastigotas intracelulares, tripomastigotas metacíclicos e epimastigotas foram incubados com 20 M das LQBs 118, 168, 187, 182 e 236. A LQB-118 demonstrou atividade antiparasitária nas três formas evolutivas (90% na forma amastigota, 44% na forma tripomastigota e 70% na forma epimastigota) do parasito, enquanto as moléculas derivadas não mostraram atividade significativa. Sendo assim os estudos foram continuados com a molécula LQB-118. A ação da LQB-118 sobre as amastigotas intracelulares foi dose dependente, com redução do índice de infecção em 81% e 88% nas concentrações de 20 e 30 M respectivamente. Já sobre tripomastigotas, a LQB-118 foi menos ativa reduzindo a mobilidade dessas formas em até 45% a 30 M. Sobre a forma epimastigota a ação foi dose-dependente chegando a inibir 96% o crescimento dos parasitos a 20 M, com alterações da morfologia tais como arrendondamento do corpo celular e perda do flagelo. A dose capaz de inibir 50% foi de 4,2 M para amastigota intracelular e 38,1 M para tripomastigotas. Para macrófagos, a LC50 ficou em 40 M, uma concentração quase dez vezes maior que a IC50 para amastigotas. A capacidade das formas amastigotas intracelulares se diferenciarem em tripomatigotas e lisar os macrófagos foi avaliada após o tratamento com a LQB-118 por 72h. Observou-se um atraso do ciclo intracelular do parasito de modo dose-dependente, onde na concentração de 30 M o surgimento de tripomastigota foi no 9 dia enquanto nos controles foi no 5 dia de cultura. Para delinear o mecanismo de ação, foi avaliado o efeito direto sobre o parasito como a indução da fragmentação de DNA. A análise de indução da fragmentação do DNA feita pela marcação pelo TUNEL mostrou que o tratamento com a LQB-118 induziu seletivamente a fragmentação do núcleo das amastigotas enquanto o núcleo dos macrófagos se mantiveram íntegros. Macrófagos peritoneais pré-tratados com LQB-118 por 24 horas foram capazes de reduzir o número de amastigotas após 72h de cultivo na ausência da molécula, mas sem alteração na produção de óxido nítrico. Esses resultados mostram que a LQB-118 é ativa contra o T. cruzi, principalmente sobre a forma amastigota intracelular, que é a forma presente na fase crônica da infecção. O mecanismo de ação sugere que a LQB-118 é capaz de ser seletivamente tóxica para o parasito e também ativar os mecanismos microbicidas dos macrófagos de modo independente da produção de óxido nítrico. / Chagas disease is endemic in Latin America being considered a neglected disease with high socioeconomic impact. The infection is caused by the protozoan Trypanosoma cruzi, which is transmitted by the vector form, among other mechanisms. The treatment basically consists of using two drugs, benznidazole and nifurtimox which presenting several side effects and acts very little on intracellular amastigotes what makes the current treatment is restricted and unsatisfactory. Several pharmacological activities have been attributed to lapachol and pterocarpans, such as antitumor and antiparasitic activity. Because of this therapeutic potential an hybrid molecule was synthesized, a pterocarpanquinone LQB-118, and some derived molecules. The LQB-118 previously showed antitumor and anti-Leishmania activity. The objective of this study was to investigate the in vitro activity of LQB-118 and its derived molecules on Trypanosoma cruzi Dm28c clone. For initial evaluation of the antiparasitic effect of the molecules, intracellular amastigotes, epimastigotes and metacyclic trypomastigotes were incubated with 20 M of LQBs 118, 168, 187, 182 and 236. The LQB-118 showed antiparasitic activity on the three evolutionary forms (90% on amastigote form, 44% on trypomastigote form and 70% on epimastigote form) of the parasite, while derived molecules showed no significant activity. Thus, studies were continued with the molecule LQB-118. The action of LQB-118 on intracellular amastigotes was dose dependent, with reduction of infection index into 81 and 88% at concentrations of 20 and 30 M respectively. In trypomastigotes, LQB-118 was less active reducing the mobility of these forms up to 45% at 30 M. In epimastigote form, the action was dose dependent reaching 96% to inhibit the growth of parasites at 20 M, with morphological changes such as rounding of the cell body and loss of the flagellum. The dose able to inhibit 50% was 4,2 M to intracellular amastigote and 38,1 M to trypomastigote. To macrophages, LC50 was 40 M, a concentration about ten times higher than the IC50 to amastigotes.The ability of intracellular amastigotes differentiate on trypomastigotes and break macrophages was evaluated after the treatment with LQB-118 for 72 hours. There was a delay on intracellular cycle of the parasite in a dose dependent way, where in the concentration of 30 M the trypomastigote emergence was on the 9th day while in controls was on the 5th day of culture. To delineate the mechanism of action, it was evaluated the direct effect on the parasite such as the induction of DNA fragmentation. Analysis of the induction of DNA fragmentation by TUNEL labeling showed that the treatment with LQB-118 induced selectively fragmentation of amastigotess nuclei while macrophagess nuclei remained without fragmentation. Peritoneal macrophages pretreated with LQB-118 for 24 hours were able to reduce the number of amastigotes after 72 hours of culture in absence of the molecule, but without alteration in nitric oxide production. These results show that LQB-118 is active against T. cruzi, mainly on intracellular amastigote form, which is present in the chronic phase of infection. The mechanism of action suggests that LQB-118 can be selectively toxic to parasite and also activate the microbicidal mechanisms of macrophages independently of nitric oxide production.

Trichomonas vaginalis é o protozoário flagelado que parasita o trato urogenital humano causando a tricomonose, doença sexualmente transmissível (DST) de origem não viral mais comum no mundo. Durante a infecção a aquisição de nutrientes, como nucleotídeos púricos, pirimidínicos e ferro é essencial à sobrevivência do parasito. T. vaginalis não sintetiza de novo purinas e pirimidinas, dependendo de vias de salvação para aquisição destas moléculas. O ferro desempenha um papel crucial na patogenicidade da tricomonose, influenciando a expressão de múltiplos genes envolvidos na virulência. Nucleotídeos extracelulares, especialmente o ATP, são liberados em situações de estresse, anoxia ou injúria, atuando como sinalizadores pró-inflamatórios ao sistema imune. As enzimas NTPDase e ecto-5'-nucleotidase degradam ATP à adenosina, esta com ação anti-inflamatória. A enzima adenosina deaminase (ADA) degrada adenosina à inosina. A presença desta cadeia enzimática em T. vaginalis sugere a modulação das concentrações nucleotídeos/nucleosídeos durante a inflamação. A atividade da ADA foi caracterizada em T. vaginalis, porém há poucos relatos sobre a participação desta enzima na sobrevivência do parasito, bem como, a localização celular e o efeito de nutrientes essenciais na atividade enzimática e na expressão gênica. O estudo da localização da ADA em T. vaginalis foi realizado, indicando a presença da enzima na membrana celular e no citoplasma do trofozoíto. Avaliando-se o perfil da ADA de diferentes isolados de T. vaginalis em uma condição de limitação de soro bovino, o qual representa a fonte de adenosina aos trofozoítos, não se observou diferenças significativas na deaminação da adenosina à inosina. Na avaliação do efeito de diferentes fontes de ferro ou a privação deste cátion na atividade e na expressão gênica da ADA foi possível verificar uma diminuição da atividade e um aumento na expressão gênica após a privação do ferro, reforçando a hipótese que este elemento pode modular a atividade das enzimas envolvidas na sinalização purinérgica. Os resultados obtidos nesta dissertação permitem a avaliação de importantes aspectos da ADA, contribuindo para o melhor entendimento do sistema purinérgico em T. vaginalis e seu papel no estabelecimento e manutenção da infecção e consequente sobrevivência do parasito. / Trichomonas vaginalis is a flagellate protozoan that parasitizes the urogenital human tract causing trichomonosis, the non-viral sexually transmitted disease (STD) most common in the world. During infection the acquisition of nutrients such as purine and pyrimidine nucleotides, and iron is essential to the parasite survival. T. vaginalis lacks de novo purines and pyrimidines synthesis depending on the salvation pathway for the acquisition of these molecules. Iron plays a crucial role in trichomonosis pathogenesis, influencing the expression of multiple genes involved in virulence. Extracellular nucleotides, especially ATP, are released during stress, injury or anoxia, acting as a pro-inflammatory signaling to the immune system. The enzymes NTPDase and ecto-5'-nucleotidase degrade ATP to adenosine with anti-inflammatory action. The adenosine deaminase (ADA) enzyme degrades adenosine to inosine. The presence of this enzymatic chain in T. vaginalis suggests the modulation of nucleotides/nucleosides concentrations during inflammation. The ADA activity was characterized in T. vaginalis, but there are few reports on the participation of this enzyme in the parasite survival, as well as the cellular localization and the effect of essential nutrients on enzyme activity and gene expression. The study of ADA localization in T. vaginalis was performed, indicating the presence of the enzyme on trophozoite cell membrane and cytoplasm. Evaluating the ADA profile in different T. vaginalis isolates in bovine serum limitation condition, which is the source of adenosine for the trophozoites, no significant differences were observed in the deamination of adenosine to inosine. Regarding the effect of different iron sources or iron deprivation in activity and gene expression of ADA, it was observed a decrease in activity and an increase in gene expression after iron deprivation, reinforcing the hypothesis that this element can modulate the activity of enzymes involved in the purinergic signaling. The results obtained in this study allow the assessment of important aspects of ADA, contributing to a better understanding of the purinergic system in T. vaginalis and its role in the establishment and maintenance of infection and consequent survival of the parasite.