Orientadores: Beatriz Gomes Guimarães, Nilson Ivo Tonin Zanchin / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T19:49:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Giuseppe_PriscilaOliveirade_D.pdf: 13819393 bytes, checksum: 088685c4fb029e25a7f5c7b7f6e218cf (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Leptospira interrogans é uma bactéria espiroqueta que causa a leptospirose, uma zoonose de distribuição mundial que afeta mais de 500.000 pessoas anualmente. Pouco se sabe sobre a biologia de leptospiras, o que dificulta a elaboração de novas estratégias de prevenção e de tratamento contra a doença. Cerca de 60 % dos genes de L. interrogans codifica proteínas que não apresentam similaridade de sequência significativa com proteínas de função conhecida. Como a estrutura cristalográfica de uma proteína pode revelar vários indícios funcionais, este trabalho visou à determinação da estrutura cristalográfica das proteínas LIC10793, LIC12922 e LIC10494 de L. interrogans, que são potencialmente localizadas no envelope celular e não são funcionalmente caracterizadas. A estrutura do antígeno LIC10793 (Lp49) foi resolvida a 2 Å de resolução e revelou que essa provável lipoproteína apresenta dois domínios. O domínio N-terminal de Lp49 possui um enovelamento do tipo Imunoglobulina e sua topologia diverge das formas padrão do motivo estrutural "chave grega" (Greek key motif). O domínio C-terminal consiste em um ?- propeller formado por sete folhas ?. Comparações locais não identificaram nenhum sítio catalítico conhecido em Lp49, mas análises de sua superfície revelaram a presença deprováveis sítios de ligação a proteínas. Com base nesses indícios, na provável localização de Lp49 na membrana externa e em sua antigenicidade, postula-se que Lp49 tenha uma função de interação com outras proteínas podendo desempenhar um papel na interação entre leptospiras e seus hospedeiros. A estrutura cristalográfica de LIC12922, determinada a 3,1 Å de resolução, revelou a presença de dois domínios. O domínio NC é estruturalmente relacionado a domínios que apresentam atividade chaperona, encontrados nas proteínas SurA e trigger factor de E. coli. O domínio parvulina de LIC12922 não apresenta atividade de peptidil prolil isomerase, mas possui um provável sítio de interação a proteína que inclui o sítio de reconhecimento ao substrato proposto para o domínio parvulina P1 de SurA. Análises filogenéticas sugerem que LIC12922 e as chaperonas extracitoplasmáticas SurA, PpiD e PrsA apresentam um ancestral comum. Com base nesses indícios e na provável localização de LIC12922 no periplasma, propõe-se que LIC12922 seja uma chaperona periplasmática envolvida na biogênese de proteínas da membrana externa. LIC10494 foi expressa, purificada e cristalizada. Refinamentos das condições de cristalização não foram suficientes para se obter cristais adequados ao experimento de difração. Análises da sua sequência evidenciaram que LIC10494 apresenta uma extensa região central intrinsecamente desordenada rica em resíduos de treonina. Assim como proteínas que possuem domínios intrinsecamente desestruturados, LIC10494 apresenta mobilidade mais lenta do que o esperado em SDS-PAGE, um volume de eluição menor do que o esperado em ensaios de gel filtração e uma considerável contribuição de configurações randômicas em seu espectro de dicroísmo circular / Abstract: Leptospira interrogans is a spirochaetal bacterium which causes leptospirosis, a worldwide spread zoonosis that affects more than 500,000 people annually. Little is known about the biology of leptospires, which difficults the development of new preventive and treatment strategies for the disease. About 60 % of the genes from L. interrogans encode for proteins that did not show significative sequence similarity with proteins of known function. Since the tridimensional structure of a protein can contribute to the understanding of its function, this work aimed at the crystallographic structure determination of the proteins LIC10793, LIC12922 and LIC10494 from L. interrogans, which are potentially situated at the cell envelope and are not functionally characterized. The structure of the antigen LIC10793 (Lp49) was determined at 2 Å resolution and revealed that this probable lipoprotein possesses two domains. The Lp49 N-terminal domain presents an Immunoglobulin-like fold and its topology diverges from the standard patterns of the Greek key motif. The C-terminal domain is a 7-bladed ?-propeller. Local structural comparisons did not identify known catalytic sites at Lp49, but surface analyses evidenced potential protein binding sites. Based on these results, the putative localization of Lp49 at the outer membrane and its role as an antigen, we postulate that Lp49 has a protein binding function involved in Leptospira-host interaction. The LIC12922 crystal structure, determined at 3.1 Å resolution, revealed two domains. The NC domain is structurally related to the chaperone domains of E. coli SurA and trigger factor proteins. The LIC12922 parvulin domain is devoid of peptidyl prolyl isomerase activity, but presents a putative protein binding site which includes the substrate recognition site proposed to the first parvulin domain of SurA. Phylogenetic analyses suggest that LIC12922 and the extracytoplasmic chaperones SurA, PpiD and PrsA have a common ancestor. Based on the structural and phylogenetic analyses and taking into account its probable periplasmic localization we postulate that LIC12922 is a periplasmic chaperone involved at the biogenesis of outer membrane proteins. The protein LIC10494 was expressed, purified and crystallized. In spite of extensive refinement of crystallization conditions the crystals were not adequate for diffraction experiments. Sequence analyses evidenced that LIC10494 has an extensive central region intrinsically disordered which is rich in threonine residues. Similarly to proteins that possess intrinsically disordered domains, LIC10494 presents mobility slower than expected at SDSPAGE, elution volume smaller than expected in gel filtration assays and a considerable contribution of random coil structures in circular dichroism spectrum / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Paulo Mazzafera / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T23:52:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Purcino_RubiaPadilha_D.pdf: 1224493 bytes, checksum: 875e464b9ac37fd8cf61d27335a57537 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Xylella fastidiosa (Xf) é uma bactéria fitopatogênica que se desenvolve exclusivamente no xilema de uma grande variedade de plantas cultivadas. Na cultura do citros essa bactéria é conhecida como o agente causal da clorose variega do citros (CVC), doença responsável por prejuízos econômicos consideráveis, desde a década de 80. Embora muitos trabalhos tenham sido realizados com essa bactéria, pouco se conhece sobre o mecanismo de infecção, a composição do meio em que ela se desenvolve, o xilema e o desenvolvimento dos sintomas. Grande parte dos estudos sobre a nutrição da bactéria são realizados in vitro, o que pode não caracterizar a interação entre a bactéria e xilema. Este trabalho é resultado de um subprojeto do genoma funcional, cujo principal objetivo é a caracterização da constituição da seiva do xilema, na tentativa de melhor compreender a nutrição da bactéria e o desenvolvimento da doença. Ao longo da realização dos experimentos e análises dos resultados foram surgindo questões que levaram a necessidade do melhor entendimento do metabolismo do nitrogênio em plantas com CVC. Por isso os resultados gerados foram agrupados em dois capítulos, onde no primeiro são encontrados resultados da caracterização qualitativa e quantitativa das principais substâncias nitrogenadas presentes na seiva do xilema de plantas de citros com CVC, bem como atividade das principais enzimas envolvidas no metabolismo do nitrogênio. A atividade da Redutase do nitrato (RN) nas folhas não sofreu alteração em plantas doentes (PD), porém a atividade da Glutamina Sintetase (GS) foi significativamente maior nos extratos das folhas dessas plantas. Embora a concentração de aminoácidos tenha sido suavemente maior na seiva do xilema de PD, caiu drasticamente no extrato de folhas dessas plantas. O teor de proteínas solúveis também foi menor na seiva do xilema e no extrato de folhas de PD. PD e Planta Sadia (PS) apresentaram o mesmo perfil de aminoácidos em HPLC, contudo em proporções bem diferentes, principalmente dos aminoácidos ASN, GLN e ARG. A poliamina putrescina foi identificada em grande concentração somente em PD. Estes resultados demonstram que PD apresentam alterações no metabolismo de compostos nitrogenados provavelmente em resposta a mudanças na interação dos processos de absorção, assimilação e redistribuirão do nitrogênio. No segundo capítulo são agrupados os dados das análises do metabolismo de açúcares, ácidos orgânicos e investigação das alterações no metabolismo da parede celular. A seiva de PD apresenta menor concentração de glicose, acompanhada de frutose e glicose. Grande quantidade de ácido cítrico também foi determinada nessas plantas. Baseados nesses resultados cultivamos a bactéria em meios com diferentes fontes de carbono e verificamos que o meios que permitiram maior crescimento foram aqueles que a fonte de carbono utilizada foi glicose (I glL), sacarose combinada com citrato nas concentrações de 3g/L de cada fonte de cardono, e citrato na concentração de 3 g/L, o que demonstra que a composição química da seiva do xilema é importante tanto para o processo de agregação como para a formação do biofilme. A infecção com Xi também promoveu modificações nas paredes celulares dos pecíolos. Verificamos por imunocitoquímica em microscópio confocal utilizando os anticorpos 11M 5 e JIM 7, diferenças entre PD e PS nos padrões de esterificação da fração pectina, assim como encontramos no fracionamento da parede celular alterações na composição dos principais carboidratos que constituem a fração hemicelulose / Abstract: Xylellafastidiosa (Xj) is a fastidious bacterium which grows exclusively in the xylem of several plants. In citrus the disease caused by Xf is known as "clorose variegada do citros" (CVC), being responsible for marked loss of productivity since the 80s. Although a meaningful number of reports have been published in the literature about Xf, little is know about the mechanisms controlling infection, the biochemical composition of the xylem fluid where the bacteria develops and how the disease symptoms develop. Most of the studies on the nutritional requirements by the bacteria were carried out with artificial media in vitro, what may not be the exact situation in the xylem. The aim of this thesis was to characterize the xylem sap composition of citrus plants in order to better understand nutritional aspects of the bacteria and this can influence the disease development. During the experiments new questions arose and focus was given to the nitrogen metabolism of citrus plants infected with Cvc. Therefore, the thesis has two chapters. The first chapter contains results on the qualitative and quantitative characterization of the xylem sap of health and diseased plants as well as the activity of enzymes ofthe nitrogen metabolism in plants. The activity ofNitrate reductase (NR) in leaves did not change in diseased plant (PD), however, the activity of Glutamine synthethase (GS) was significantly higher in these leaves. Although amino acids concentration was slightly higher in the sap of diseased plants the leveI dropped drastically in the leaves. The protein contents were lower in the sap and in leaves of diseased plants. Diseased and health plants showed the same amino acid profile in HPLC, but different proportions were observed among amino acids, mainly for the amino acids ASN, GLN and ARG. The polyamine putrescine was found in high concentrations only in diseased plants. These results showed that significant changes take place in the nitrogen metabolism of diseased plants, probably as a response to the alterations in the absorption, assimilation and distribution of nitrogen in the plant. In the second chapter the data on carbohydrates, organic acids and cell wall are presented. The xylem sap of diseased plants showed lower concentration of glucose than health plants. High amounts of citric acid were also found in diseased plants. This information was used to design artificial media to grow the bacteria and study its nutritional need. Best growth was observed with media containing glucose (l g/L), sucrose plus citrate both at 3g/L, and citrate alone at 3 g/L, indicating that the composition of the sap might play a role both in the bacterial agregation as well as in the biofilm formation. Infection with XI also promoted changes in the cell wall of leaf peduncle of infected plants. Immunocytochemical analysis with confocal microscopy, using the antibodies 11M 5 and 11M 7, showed marked differences between diseased and health plants regarding the pectin esterification. Additionally the hemicelullose fraction was also affected. / Doutorado / Biologia Vegetal / Doutor em Biologia Vegetal

Orientadores: Marcos Antonio Machado, Alexandre Morais do Amaral / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-07T05:44:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Baptista_JulianaCristina_M.pdf: 1606790 bytes, checksum: 2559d8ff6d67422a6685a6a8d5a31cd6 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O cancro cítrico, causado pela bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), e responsável por consideráveis prejuízos para a produção de laranja, no Brasil e no mundo. A doença e altamente agressiva para a planta de citros, provocando, entre outros, lesões em folhas e frutos, com redução tanto na qualidade de frutos quanto na produtividade. Devido a sua importância, recentemente a bactéria teve seu genoma completamente seqüenciado, onde foram identificados, por homologia de seqüência de proteínas, varias ORFs ("open reading frames") associadas ao processo de infecção. Dentre elas, varias seqüências que teoricamente codificam para proteínas envolvidas na degradação da parede celular vegetal, o que pode ser um indicativo de que a bactéria utiliza mecanismos relacionados a este evento durante o seu processo infeccioso e de adaptação. Entretanto, não ha ate o momento informação experimental a respeito da funcionalidade de seqüências em Xac que permitam a degradação da parede celular. O objetivo principal deste trabalho foi identificar funcionalmente, em Xac, através de ensaios in Vectra e in vitro, genes envolvidos na produção ou transporte de proteínas relacionadas a degradação de celulose e com isso analisar a sua relevância na capacidade infectiva ou adaptativa da bactéria. Para tal, foram produzidos mutantes a partir de inserções aleatórias de transposon e sitio-dirigidas, estabelecendo-se uma coleção de linhagens, cujo fenótipo e genótipo foram avaliados por ensaios biológicos e sequenciamento. Verificou-se que o operon xps do sistema de secreção do tipo II e funcional em Xac e que os genes XAC0028, XAC0029, XAC2374, XAC3516 e XAC4231 participam da degradação de celulose / Abstract: The citrus canker, caused by the bacterium Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), is responsible for considerable losses for the orange production, in Brazil and abroad. The disease is highly aggressive for citrus plants, resulting, among others, in injuries on leaves and fruits, with a reduction in the quality of fruits as much as in the productivity. Due to its importance, recently the bacterium had its genome completely sequenced and a number of open reading frames (ORFs) where identified by homology with protein sequences and annotated as associated to the infection process. Amongst them, some sequences that theoretically code for proteins involved in the degradation of the plant cell wall, which may indicate that the bacterium uses mechanisms related to this event during the process of adaptation and infection. However, there is no experimental data regarding such sequences to prove their real function during the pathogenesis of Xac. The main objective of this work was to identify functionally, in Xac, through in vitro and in vivo assays, genes involved in the production or transport of proteins related to the degradation of cellulose and, therefore, to analyze its relevance in the capacity of adaptation and infection of the bacterium. During the investigation, a collection of mutant strains of Xac was produced by random and site-directed mutagenesis, which were analyzed through the identification of leaf lesions and their action on degradation of artificial cellulose in plate as well as the growth in leaves. Through tests of mutagenesis and in vitro assays, this study shows that the xps operon that is present in Xac and encodes a type II secretion system machinery is functional and the genes XAC0028, XAC0029, XAC2374, XAC3516 and XAC4231 participate in cellulose degradation. In summary, for the first time it was experimentally demonstrated that Xac is capable in hydrolizing cellulose / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Marcos Silveira Buckeridge / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T07:05:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cavalari_AlineAndreia_D.pdf: 2066715 bytes, checksum: 503395a4dfdc3832fc20cbf4193ea790 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A parede celular é um componente particular dos tecidos vegetais e conhecer a composição dos polissacarídeos que a constituem e suas interações é essencial para compreender a textura dos alimentos e suas alterações pós-colheita, em especial em frutos climatérios, como é caso do mamão. A parede celular esta dividida por três domínios: o primeiro é formado por celulose e hemiceluloses, o segundo domínio é formado por pectinas e o terceiro um domínio composto por proteínas. As modificações dos polímeros e suas proporções nestes respectivos domínios são resultados de ações enzimáticas, que no caso dos frutos carnosos, leva ao amaciamento da polpa. Portanto, estudar as modificações nesses polímeros através da análise dos OXG obtidos por hidrolise com celulase, é um caminho importante para entender as alterações neste polissacarídeo ao longo do desenvolvimento de frutos. O presente trabalho teve como objetivo compreender as modificações da parede celular durante o desenvolvimento do fruto do mamoeiro. Foram utilizados frutos de Carica papaya L. cv. Sunrise solo, coletados diretamente do produtor (Caliman S/A- Unhares- ES). As amostras de frutos foram colhidas em intervalos de 30 dias, sendo os estádios analisados de 30 a 150 após a antese (dpa). Os resultados demonstram queda acentuada na proporção de parede celular em relação a outros compostos, como açúcares, por exemplo, o que é possivelmente uma indicação do processo de expansão celular e conseqüentemente uma alteração de textura da parede celular durante o desenvolvimento. Observou-se que o principal açúcar solúvel é a sacarose, sendo esta provavelmente a principal fonte energética para o desenvolvimento do fruto de mamão, uma vez que este não sintetiza amido. De maneira geral, a proporção de oligossacarídeos de xiloglucano menos ramificados diminuiu aos 120 dpa, enquanto que os de maior peso molecular e ou grau de ramificação (com fucose) aumentaram proporcionalmente. Estes resultados sugerem que xiloglucanos (ou parte das moléculas destes) pobremente ramificados com fucose, são retirados da parede celular, consequente enriquecimento de oligosasacarídeos fucosilados. Como estes últimos tornam o xiloglucano mais interativo com ele próprio e com a celulose, é possivel que estes sejam os principais efeitos que as transformações na parede promovam no fruto. As alterações na parede foram acompanhadas pelo aumento concomitante nas ativades de beta­galacosidase e beta-glucosidase, duas das principais hidrolases de xiloglucano. Concumitantemente, observou-se uma diminuição acentuada na proporção de celulose na parede. Com base nestas observações, sugere-se que as paredes celulares sofrem transformações importantes nos frutos do mamoeiro até os 120 dpa I sendo que a partir deste estádio a parede se torna mais acessível à hidrólise e denotando a preparação do fruto para o amadurecimento. / Abstract: The plant cell wall is a unique component of plant tissues and its polysaccharide composition essential to understand food texture and its changes during post-harvestingl especially of climateric fruits, as is the case of papaya. The plant cell wall is composed of three domains: the first is formed by cellulose and hemicelluloses, the second of pectins and the third of proteins. The changes in polymers and their proportions in these domains are a result of enzyme action, which in the case of fleshy fruits lead to the softening of the pulp. Hydrolysis of hemicelluloses such as xyloglucan can play important functions in cell expansion, cell growth and cell wall degradation. Therefore, studying the modifications in xyloglucan by looking at is fine structure (Le. oligosaccharide (OXG) pattern obtained after cellulase action) may be an important way to understand polysaccharide change during fruit development. The present work aimed at understanding the modifications in cell wall during the development of the papaya fruit. Fruits of Carica papaya L. Cv.Sunrise solol were collected directly by the producer (Calimanl SAI Unharesl Espirito Santol Brazil). Samples of fruits were harvested at intervals between 30 and 150 days after anthesis (daa). Our results showed that there were drastic changes in the cell wall of the mesocarp in relation to other compoundsl such as soluble sugars. This is probably an indication that cell expansion process is at least part of the cause of the changes in texture during development. We observed that the main soluble sugar found in fruits is sucrose, this being probably the principal source of energy for development of the organ, as no starch is synthesised in this fruit. In general, the proportion of less branched xyloglucan oligosaccharides decreased at 120 daa, whereas the OXG branched with fucose increased constantly during development up to the same stage. These results suggest that xyloglucans (or part of their molecules) that are poorely brached with fucose are retrieved from the cell wall. This seems to lead to enrichment of fucosylation of xyloglucan. As these OXG turn xyloglucan more interactive with itself and with cellulose, it is possible that these would be the principal effects that the cell walls provoke in the fruit. The changes in the wall were followed by a concomitant increase in activities of beta-galactosidase and betaglucosidase, both thought to be related to xyloglucan hydrolysis in vivo. At the same time, we observed a decrease in the proportion of cellulose in the walls during development. On the basis of these results, we suggest that the cell walls of papaya fruits undertake structural changes untill 120daa after which the wall becomes more accessible to hydrolases denoting the preparation of the papaya fruit for ripening. / Doutorado / Doutor em Biologia Vegetal

Fitoplasmas são organismos procarióticos desprovidos de parede celular, parasitas intracelulares obrigatórios de floema e patogênicos às plantas. Numerosas doenças associadas a este tipo de agentes patogênicos têm sido frequentemente relatadas em espécies cultivadas e plantas daninhas. No presente estudo, sintomas tipicamente induzidos por fitoplasmas, tais como clorose e avermelhamento foliar, redução no tamanho das folhas, diminuição dos órgãos florais, superbrotamento de ramos e declínio da planta, foram observados em pomares de fruteiras de caroço como pessegueiro e nectarineira. Além disto, em campos de couve-flor, plantas daninhas conhecidas como mostarda-do-campo também manifestaram sintomas que pareciam ter sido provocados por fitoplamas, expressados por superbrotamento de ramos finos e redução no tamanho de folhas e flores. Assim, o presente trabalho teve por objetivos detectar, identificar e classificar a nível molecular os possíveis fitoplasmas associados às plantas sintomáticas citadas anteriormente, utilizando as técnicas de PCR, análise de RFLP virtual e o método de classificação on-line denominado de iPhyclassifier. Para tanto, o DNA das amostras das fruteiras de caroço e da erva daninha foi extraído com o auxílio de um kit comercial ou através do protocolo 2X CTAB. A detecção dos fitoplasmas foi conduzida por duplo PCR com os primers universais R16mF2/mR1 e SN910601/SN011119 na primeira reação e com o par R16F2n/R2 na segunda reação. Para a mostarda, a identificação dos fitoplasmas também foi realizada através de duplo PCR com os primers e R16(III)F2/R16(III)R1 específicos para fitoplasmas do grupo 16SrIII. A aplicação de PCR com primers universais permitiu a detecção consistente desses agentes nos tecidos das plantas sintomáticas de pessegueiro, nectarineira e mostarda-do-campo pela amplificação de um fragmento genômico de 1250 pb, correspondente ao gene 16S rRNA. Para todos os hospedeiros analisados, os produtos amplificados por duplo PCR com os primers universais foram purificados, clonados em Escherichia coli e submetidos ao sequenciamento. A análise de RFLP virtual e iPhyclassifier permitiram classificar os fitoplasmas encontrados em mostarda nos grupos 16SrIII e 16SrVII. Os fitoplasmas detectados na mostarda-do-campo, foram definitivamente classificados como representantes dos subgrupos 16SrIII-B, 16SrIII-J e 16SrIII-U e 16SrVII-B. Em relação aos fitoplasmas encontrados no pessegueiro e nectarineira, foi possível classificar os fitoplasmas nos grupos 16SrI e 16SrIII, sendo definitivamente classificados como representantes dos subgrupos 16SrI-B em pessegueiro, e em nectarineira, classificados em 16SrI-B e 16SrIII-J. / Phytoplasmas are prokaryotic organisms devoid of cell wall, obligate intracellular phloem parasites and pathogenic to plants. Numerous diseases associated with this type of pathogen have been frequently reported in cultivated species of plants and weeds. In this present study, symptoms typically induced by phytoplasmas, such a yellowing an reddeling leaves, small leaves and flowers, \"witches\' broom\" appearance on terminal new bud growth, and death in plants, were observed in orchards of stone fruit trees such as peach and nectarines. In addition, in fields of cauliflower, weeds known as mustard-field also exhibited symptoms that appeared to have been caused by phytoplasmas, expressed by thin branches and reduced leaf and flower size. The objective of this present study was to detect, identify and classify at molecular level the phytoplasmas possibly associated with the symptomatic plants. PCR techniques, virtual RFLP analysis and the online method known as iPhyclassifier were used. Total DNA was extracted using a commercial kit or through the CTAB protocol. The detection of phytoplasmas was conducted by nested PCR with the universal primers R16mF2/mR1 and SN910601/SN011119 in the first reaction and R16F2n/R2 pair in the second reaction. For mustard-field, the identification of the phytoplasmas was also performed through nested PCR with the primers R16(III) F2/R16(III) R1, which are specific to detection of 16SrIII group phytoplasmas. The application of PCR with universal primers allowed the consistent detection of these agents in the tissues in symptomatic plants of peach, nectarine and mustard-field by the amplification of a 1250 bp genomic fragment, corresponding to the 16S rRNA gene. For all hosts analyzed, the products amplified by nested PCR with the universal primers were purified, cloned in Escherichia coli and sequenced. The analysis of virtual RFLP and iPhyclassifier allowed to classify the phytoplasmas found in mustard in the 16SrIII and 16SrVII groups. The phytoplasmas detected in mustard-field were definitively classified as representatives of the subgroups 16SrIII-B, 16SrIII-J and 16SrIII-U and 16SrVII-B. The phytoplasmas found in the peach and nectarine were classified within the 16SrI and 16SrIII groups, as representatives of the subgroups 16SrI-B for peach and 16SrI-B and 16SrIII-J for nectarine.

This study provides information to support the use of plant cell wall, from sugarcane bagasse, to produce cellulosic ethanol. Therewith, cell wall proteins from sugarcane cells cultures, leaves and culms were identified. To do so, different protocols were used. Using two-month-old leaves and culms, the extractions were performed using a destructive method, based on griding the tissues, submitting them to a growing gradient of succrose and centrifugation, being the cell wall extract later isolated by washing on a nylon net. After that, the cell wall proteins were extracted using two salts, 0,2 M CaCl2 and 2 M LiCl. Using cultured cells, a similar protocol was used, but it had a previous step of separation of the cell wall through grinding and precipitation in glycerol 15%. Using culms of the same age, a nondestructive protocol was tested based on vacuum infiltration of the tissues in the same salts already described, 0,2 M CaCl2 and 2 M LiCl, and posterior centrifugation. Two replicates were used from two-month-old plants and three in the case of suspension cells. The complex samples were digested, fractionated and sequenced through mass spectrometry, using SYNAPT G2HDMS coupled to nanoACQUITY, both from Waters. Peptides were processed using ProteinLynx 2.5 Global Server against sugarcane translated-EST database. Using bioinformatic programs, such as Blast2GO, it was possible to find the annotation and classification of similar proteins. Only proteins equally found in all repetitions were considered in the main analysis. SignalP, WolfPSORT, TargetP, TMHMM and Predotar were used to predict the subcellular location, both from ESTs and blasted proteins, and only the proteins predicted to be secreted in two or more programs were considered as cell wall proteins. Altogether, 157 different SAS related to sugarcane cell wall were found. Among these, 101 different cell wall proteins were characterized from eight functional classes. The method based on vacuum infiltration seems to be the most efficient one, since it had almost half, 48,84% of the proteins predicted to be secreted, which is a good percentage when comparing to other studies. From secreted proteins most of them were related to lipid metabolism, as lipid-transfer proteins, oxido-reductases, such as peroxidases, cell wall modifying enzymes, like glycoside-hydrolases, proteases, proteins with interacting domains, signaling proteins and several others. Results are in agreement with the expected role of the extracellular matrix in polysaccharide metabolism and signaling phenomena. Therefore, this work provided valuable information about sugarcane cell wall that can lead to future studies to enhance cellulosic ethanol production. / Este estudo fornece informação para auxiliar o uso da parede celular vegetal, a partir do bagaço de cana, para a produção de etanol celulósico. Com isso, as proteínas da parede celular de folhas, colmos e células em suspensão foram identificadas. Para isso, foram utilizados diferentes protocolos. Utilizando folhas e colmos de cana-de-açúcar de dois meses de idade, as extracções foram realizadas por meio de método destrutivo, com base na trituração dos tecidos, submetendo-os a gradiente crescente de sacarose e centrifugação, sendo a parede da célula extraída e depois isolada por lavagem sobre uma rede de nylon. Depois disso, as proteínas de parede celular foram extraídas utilizando dois sais, 0,2 M de CaCl2 e 2 M de LiCl. Para células em suspensão, um protocolo semelhante foi utilizado, contendo, no entanto, um passo anterior de separação da parede celular por meio de maceração e precipitação em glicerol 15%. Usando colmos da mesma idade, dois meses, um protocolo não destrutivo foi testado com base na infiltração a vácuo dos tecidos nos mesmos sais já descritos, 0,2 M de CaCl2 e 2 M de LiCl, e posterior centrifugação. Duas repetições foram usadas nos experimentos com plantas de dois meses de idade, e três, no caso de células em suspensão. As amostras complexas foram digeridas, fracionadas e seqüenciadas por espectrometria de massas, utilizando o equipamento SYNAPT G2HDMS acoplado ao cromatógrafo nanoACQUITY, ambos da Waters. Os peptídeos foram processadas utilizando ProteinLynx 2,5 comparando com a base de dados de ESTs traduzidos da cana. Utilizando programas de bioinformática, como Blast2GO, foi possível encontrar a anotação e classificação de proteínas semelhantes. Apenas proteínas igualmente encontradas em todas as repetições foram consideradas na análise principal. SignalP, WolfPSORT, TargetP, TMHMM e Predotar foram softwares utilizados para prever a localização subcelular, tanto para ESTs como proteínas, e apenas as proteínas preditas para serem secretadas por dois ou mais programas foram consideradas como proteínas de parede celular. Ao todo, 157 SAS diferentes relacionados à parede celular da cana foram encontrados. Dentre eles, 101 diferentes proteínas de parede foram caracterizadas em oito classes funcionais. O método baseado na infiltração a vácuo mostrou-se o mais eficiente, uma vez que apresentou quase metade, 48,84%, das proteínas preditas para serem secretadas, o que é um bom valor quando comparado com outros estudos. A maioria das proteínas secretadas estava relacionada com o metabolismo lipídico, como proteínas de transporte de lípidos, oxido-redutases, tais como peroxidases, enzimas modificadoras da parede, como as glicosil-hidrolases, proteases, proteínas com domínios de interação, proteínas sinalizadoras, entre outras. Os resultados estão de acordo com o papel que se espera da matriz extracelular no metabolismo de polissacarídeos e fenômenos de sinalização. Portanto, este trabalho forneceu informações valiosas sobre a parede celular da cana, tornando possível a utilização desses dados em futuros estudos para otimizar a produção de etanol celulósico.

Atualmente há o reconhecimento de que critérios de seleção que favorecem a produção de grãos podem ser indesejáveis para o valor nutricional de silagens de milho. Híbridos de milho para silagem devem maturar mais lentamente com declínio gradual da umidade da planta, ter grãos macios e colmo com alta digestibilidade da fibra. Assim, objetivou-se avaliar o efeito da idade de corte sobre a qualidade nutricional do colmo de genótipos de milho, permitindo a seleção de materiais de melhor qualidade, com o intuito de definir critérios de seleção em programas de melhoramento de híbridos de milho para ensilagem que visem o aumento da digestibilidade da fibra do colmo. Objetivou-se ainda a classificação dos genótipos em grupos de acordo com suas características produtivas e de qualidade nutricional. Foram avaliados 15 híbridos de milho do programa de melhoramento do Instituto Agronômico de Campinas, em ensaio sob delineamento de blocos ao acaso, com três repetições, colhidos com 90, 120 e 150 dias após a germinação. O 4º e 5º internódios do colmo, acima do solo, foram retirados para determinação da composição bromatológica e digestibilidade in vitro. Houve queda no teor de fibra e aumento na concentração de lignina com avanço da maturidade, em ambos os internódios. Houve aumento na digestibilidade da MS do 5º internódio com o avanço da maturidade, enquanto que não houve efeito sobre o 4º internódio. Ocorreu redução na digestibilidade da fibra do 4º internódio com o avanço da maturidade, enquanto que não houve efeito sobre o 5º internódio. A digestibilidade da fibra do 4º internódio foi negativamente correlacionada com a lignificação, enquanto que esta correlação foi inexistente no 5º internódio, indicando que o 4º internódio do colmo pode ser utilizado como indicador da queda de digestibilidade da fibra da haste de híbridos de milho que ocorre com o avanço da maturidade. Verificou-se entre os 15 genótipos nas três idades de corte, grande variabilidade genética para os parâmetros de qualidade, o que realça a necessidade de seleção criteriosa do material a ser utilizado para silagem e a possibilidade de implantação de programas de melhoramento genético voltados para qualidade nutricional de híbridos de milho para silagem. / Nowadays there is the recognition that selection criteria that favors grain production can be undesirable for nutritional value of corn silages. Corn hybrids for silage should mature slower with gradual decline of plant moisture, have softer grains and stalk with high fiber digestibility. Therefore, it was our objective to evaluate the effect of age of harvest on the stalk nutritional quality of corn hybrids, aiming to define selection criteria in breeding programs focused on improving the stalk fiber digestibility. It was still our objective the classification of genotypes in groups according to their production and nutritional qualities. Fifteen hybrids from the Instituto Agronômico de Campinas breeding program were evaluated in a random block design with three repetitions, harvested with 90, 120 and 150 days after germination. The 4th and 5th above soil stalk internodes were removed to determination of chemical composition and in vitro digestibility. The fiber content decreased and lignin content increased with advanced maturity, in both internodes. The DM digestibility of the 5th internode increased with maturity, while there was no change in the 4th internode. The fiber digestibility of the 4th internode was reduced with advanced maturity while there was no effect on the 5th internode. Fiber digestibility of the 4th internode was negatively correlated with lignifications, while this correlation was inexistent for the 5th internode, indicating that the 4th internode could be used as an indicator of the decrease in stalk fiber digestibility that occurs with advanced maturity of corn hybrids. There was great genetic variability among the 15 genotypes in the three stages of maturity for the quality parameters, highlighting the necessity of careful selection of the material to be used for silage production and the possibility of implementing breeding programs focused on improving the nutritional quality of corn hybrids for silage.

Este estudo trata das proteínas relacionadas ao desenvolvimento e à formação da parede celular vegetal de cana-de-açúcar, com o objetivo de auxiliar no desenvolvimento de novas tecnologias para a produção de etanol celulósico a partir do bagaço de cana. Com isso, as proteínas de parede celular de entrenós e folhas de plantas com 4 meses de idade em dois estádios de desenvolvimento, juvenil e maduro, foram identificadas. Para extração foi utilizado o método não destrutivo por infiltração a vácuo utilizando dois sais, 0,2 M de CaCl2 e 2 M de LiCl seguido de centrifugação. As amostras complexas foram digeridas, fracionadas, sequenciadas por LC-MSE . Os peptídeos foram processados utilizando o ProteinLynx 2.5 e comparados com a base de dados de ESTs traduzidos de cana e sorgo. A anotação das proteínas foi realizada com base no programa PFAM e dividas em classes funcionais. Apenas as proteínas que apareceram em pelo menos duas das três repetições biológicas foram utilizadas na análise principal. Para prever a localização subcelular das proteínas selecionadas utilizaram-se os softwares: SignalP, TargetP, Predotar e TMHMM. Apenas aquelas proteínas que foram preditas para serem secretadas por dois ou mais programas foram consideradas como proteínas de parede celular (PPC). Ao todo, 543 proteínas foram consideradas como PPC: 205 em entrenós jovens, 143 em entrenós maduros, 124 em folhas jovens e 71 em folhas maduras. Dentre essas proteínas, 365 foram consideradas diferentes, e caracterizadas em dez classes funcionais. A análise estatística compreendeu a análise de PCA e PLS-DA, havendo diferença estatística entre os tratamentos analisados. Neste trabalho, foram encontradas 66 glicosil-hidrolases e 39 peroxidases, sendo 14 e 11 exclusivas de tecidos juvenis, respectivamente. Essas proteínas são conhecidas por terem funções relacionadas à quebra e ao remodelamento dos polissacarídeos da parede celular vegetal, e, portanto, foram indicadas neste estudo como alvo de pesquisas futuras que utilizem as próprias enzimas da planta para otimização da produção do etanol celulósico.Individualmente, este estudo foi o que mais identificou PPCs dentre a literatura existente, além de ter sido pioneiro na utilização da análise quantitativa para PPC. / This study provides information about the proteins of the cell wall of sugarcane at diferente stages of development and formation. The aim of this study is to assist in the development of new technologies for the production of cellulosic ethanol from sugarcane bagasse. Cell wall proteins from 4-month-old internodes and leaves of sugarcane in two developmental stages, juvenile and mature, have been identified. Protein extraction was performed with a non-destructive method by using vacuum infiltration with two salts, 0.2 M CaCl2 and 2 M LiCl, followed by centrifugation. Complex samples were digested, fractionated and sequenced by LC-MSE. Peptides were processed by ProteinLynx 2.5 and compared to the translated sugarcane and sorghum ESTs database. The annotation of the proteins was performed using PFAM and the functional classification was according the one used in other related studies. Only the proteins that appeared in at least two of the three biological replicates were used in the main analysis. In order to predict the subcellular localization of these proteins, SignalP, TargetP, TMHMM and Predotar softwares were used. Only those proteins that were predicted to be secreted by two or more programs were considered as cell wall proteins (PPS). Altogether, 543 proteins were classified as PPC: 205 inimmature internodes, 143 in mature internodes, 124 in young leaves and 71 in matured leaves. Among these proteins, 365 were considered different, and divided into ten functional classes. Statistical analysis was made with PCA and PLSDA, confirming that there were statistical differences among the treatments. In this work, 66 glycoside hydrolases and 39 peroxidases c identified, being 14 and 11 unique to young tissues, respectively. These proteins have their function related to plant cell wall polysaccharides breakdown and remodeling, and, therewith, the glycoside hydrolases and peroxidases found in this study were indicated to be the target of future research using the plant\'s own enzymes to optimize the cellulosic ethanol production. Individually, this study was the one that most identified PPC among the existing literature, and is a pioneer in the use of quantitative analysis for PPCs.

De todas as adaptações que as plantas sofreram durante a evolução, a aquisição do sistema vascular à 400 milhões de anos atrás, foi sem dúvida um evento decisivo para sua bem sucedida existência na terra. A madeira é considerada o mais importante recurso natural de energia renovável e o setor econômico baseado na produção florestal cresce a cada ano. Inúmeros fatores como rápida taxa de crescimento, grande produção de biomassa, adaptabilidade a diversos ambientes e solos, boa qualidade de madeira para produção de uma ampla gama de produtos e presença de celulose de fibra curta, ideal para a produção de papel e celulose, contribuíram para o grande sucesso das espécies de Eucalyptus e tornaram o Brasil o maior produtor mundial de celulose de fibra curta utilizando o eucalipto como matéria prima. Devido à reconhecida importância econômica e também ambiental das árvores, o desenvolvimento do sistema vascular se tornou um importante e fascinante processo biológico para se estudar. No entanto, existe ainda pouco conhecimento sobre os processos celulares, moleculares e bioquímicos envolvidos na formação da madeira. Dessa forma, no presente trabalho foi utilizada a técnica de SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) para caracterizar o perfil transcricional do caule de plantas de E. grandis com 6 meses de idade. A partir do sequenciamento de 826 clones, foi possível analisar 2.274 tags/genes, sendo que 989 (43,5%) genes puderam ser identificados e ter uma possível função atribuída. Genes que codificam enzimas e proteínas muito importantes durante o processo de formação da madeira, como aqueles relacionados à biossíntese e deposição da parede celular e organização do citoesqueleto, apresentaram elevada expressão, sendo possível ainda sugerir a ocorrência de possíveis mecanismos comuns de controle transcricional para grupos de genes funcionalmente relacionados. A posterior comparação com as proteínas identificadas por espectrometria de massas através do sistema LC-MS/MS a partir do mesmo material biológico mostrou que muitos desses genes representam também as proteínas mais abundantes. Juntamente com outros projetos que vêm sendo desenvolvidos no laboratório, o presente trabalho contribuiu para a construção de um banco de dados local com informações do transcritoma e do proteoma de diferentes idades e tecidos, fornecendo uma visão global sobre os genes envolvidos no processo de formação da madeira e possivelmente responsáveis pelo rápido crescimento nas espécies de Eucalyptus, indicando importantes alvos para futuros programas de melhoramento. / From the numerous adaptations that plants have developed during evolution, the acquisition of the vascular system some 400 million years ago was been a decisive event for their successful existence on earth. Wood is considered the most important natural resource of renewable energy and the Forest-based economical sector grows every year. Several factors like the fast growth rate, large biomass production, adaptability to a wide range of environments and soils, good wood quality for the production of a wide range of products and the presence of short cellulose fiber, suitable for pulp and paper production, have contributed to the great success of Eucalyptus species making Brazil the main producer of short cellulose fiber using eucalypt as raw material. Due to the recognized economical and also environmental importance of trees, the development of the vascular system became an important and fascinating biological process to study. However, little is known about the cellular, molecular and biochemical processes involved in wood formation. In this way, in the current work SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) technique was used to characterize the transcriptional profile in stems of 6 months old Eucalyptus grandis. From the sequencing of 826 clones, it was possible to analyse 2,274 tags/genes, and 989 (43,5%) genes could be identified and to have a possible function attributed. Genes that code for enzymes and proteins important for wood formation process, like those related to cell wall biosynthesis and deposition, and cytoskeleton organization had high expression, making it possible to suggest the occurrence of a common transcriptional control for a few functionally related genes. The posterior comparison with the set of proteins identified by LC ESI-MS/MS from the same biological material showed that some of these genes also represent the most abundant proteins. Taken together with other projects that are being developed in the laboratory, the present work contributed for the construction of a local data-base with transcriptome and proteome information from different ages and tissues, giving a global vision of the genes involved in the wood formation process and potentially responsible for the fast growth in the Eucalyptus species, indicating important targets for future breedings programs.

Orientadores: Beatriz Appezzato da Glória, Fernando Batista da Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T23:31:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lusa_MakeliGaribotti_D.pdf: 111212555 bytes, checksum: dcca67728c1e6b3b3529dd3542283773 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Asteraceae é uma das maiores famílias entre as angiospermas, possuindo de 24.000 a 30.000 espécies, o que representa, aproximadamente, 10% da flora mundial. Atualmente são reconhecidas 21 subtribos pertencentes à Vernonieae. Entre elas, Lychnophorinae tem uma distribuição quase restrita ao Brasil, ocorrendo nos campos rupestres e cerrados do Planalto Central. A subtribo apresenta 18 gêneros e 104 espécies, distribuídos entre os mais variados hábitos: ervas perenes, arbustos, subarbustos, arvoretas, árvores e caulirosuletum. Estudos filogenéticos recentes indicam que a subtribo é monofilética. As linhagens mais basais e mais derivadas são bem sustentadas, contudo, as relações entre os demais clados persistem apenas parcialmente resolvidas. Por esse motivo, nesse estudo são investigadas espécies da subtribo em relação à morfoanatomia e à química dos principais metabólitos de caules aéreos e folhas, buscando-se novos caracteres que possam ser úteis para um melhor entendimento evolutivo do grupo, inclusive possíveis sinapomorfias. Para tanto, foram eleitas espécies chaves dentro de Lychnophorinae, representantes das principais linhagens. Para as análises estruturais e histoquímicas, amostras de caules e de folhas foram processadas de acordo com as técnicas usuais em anatomia vegetal. Para as análises fitoquímicas, os extratos foram analisados por cromatografia liquida e espectrometria de massas. As reconstruções dos estados ancestrais dos caracteres foram efetuadas em uma filogenia baseada em dados morfológicos e moleculares. Em Lychnophorinae, os principais locais de síntese dos metabólitos secundários são: tricomas glandulares, idioblastos epidérmicos e tecidos parenquimáticos das folhas e dos caules. As análises fitoquímicas evidenciaram a presença de flavonoides, derivados do ácido trans-cinâmico, lactonas sesquiterpênicas e poliacetilenos. A reconstrução dos estados ancestrais dessas substâncias na filogenia da subtribo indicam possíveis sinapomorfias químicas. No decorrer das análises morfoanatômicas foram observadas duas importantes novidades em Lychnophorinae. A primeira relata a ocorrência de fitomelanina em caules aéreos e folhas de Lychnophorinae. As reconstruções dos estados ancestrais dos caracteres sugerem que o ancestral comum mais recente das Lychnophorinae já apresentava fitomelanina no caule espessado. A segunda novidade morfoanatômica diz respeito a um modo não usual de retenção de água sobre ápices caulinares, onde uma substância hialina é resultado da degradação parietal de tricomas não glandulares, tendo natureza hidrofílica. Essa substância possivelmente apresenta a função de proteger os órgãos jovens contra dessecação. Durante as investigações anatômicas de caules e folhas de Lychnophorinae, nós observamos características peculiares, frequentemente relatadas como xéricas, e procuramos entender se tais características mostravam algum padrão que agrupava as espécies. Nós realizamos análises multivariadas levando em consideração tais características. Os resultados indicaram quatro grupos funcionais em Lychnophorinae e sinalizaram que as espécies agrupadas, ocupavam os mesmos nichos, os quais refletiam condições específicas nos diferentes ambientes. Finalmente, após a conclusão das análises anatômicas, as características foram mapeadas na filogenia de Lychnophorinae e geraram importantes informações, como a identificação de oito possíveis sinapomorfias. As informações geradas nesse estudo sugerem que a evolução da diversidade morfológica e anatômica em Lychnophorinae pode ter sido direcionada por pressões adaptativas, derivadas de fatores ecofisiológicos dos ambientes restritos em que habitam a maioria das espécies / Abstract: Asteraceae is one of the largest flowering plants families, with 24,000-30,000 species, representing approximately 10% of the world's flora. Currently, 21 subtribes are recognized in Vernonieae. Among them, Lychnophorinae is nearly endemic to Brazil, occurring in campos rupestres areas and savannas of Central Plateau. The subtribe has 18 genera and 104 species distributed among the various habits: perennial herbs, shrubs, subshrubs, treelets, trees and caulirosuletum. Recent phylogenetic studies show that the subtribe is monophyletic. The most "basal" and more "derived" strains are well supported, however, relationships between the remaining clades persist partially unresolved. Therefore, in this study, species of the subtribe are investigated in relation to morphoanatomy and chemistry of the main metabolites of aerial stems and leaves, searching for new characters that might be useful for a better understanding of the group evolution, including possible synapomorphies. To this aim, key species were chosen in Lychnophorinae, representing the principal lineages. For structural and histochemical analyzes, samples of leaves and stems were processed according to usual plant anatomy techniques. For phytochemical analysis, the extracts were analyzed by liquid chromatography and mass spectrometry. Reconstructions of ancestral states of the characters was performed using parsimony in a phylogeny based on morphological and molecular data. In Lychnophorinae, the major sites of synthesis of secondary metabolites are: glandular trichomes, epidermal idioblasts and parenchyma of the leaves and stems. The phytochemical analysis revealed the presence of flavonoids, derivatives of trans-cinnamic acid, sesquiterpene lactones and polyacetylenes. The reconstruction of ancestral states of these substances in the phylogeny of the subtribe indicate possible chemical synapomorphies. During the morphoanatomic analyzes two important events in Lychnophorinae were observed. The first reports the occurrence of phytomelanin aerial stems and leaves of Lychnophorinae. Reconstructions of ancestral states of the characters suggest that the most recent common ancestral of Lychnophorinae presented phytomelanin in thickened stem. The second morphoanatomical novelty relates to a method of unusual water retention of apexes, where a substance hyaline is a result of parietal degradation of non glandular trichomes, and it has hydrophilic nature. This substance probably has the function to protect young organs from desiccation. During the anatomical investigations of stems and leaves of Lychnophorinae, we observed frequently reported as xeric peculiar characteristics, and seek to understand whether these characteristics showed some pattern that grouped species. We performed multivariate analysis taking into account the peculiar characteristics. The results indicated four functional groups Lychnophorinae and signaled that grouped species occupy the same niche, which reflect specific conditions in different environments. Finally, after completing the anatomical analyzes, the features were mapped on the phylogeny of Lychnophorinae and generated important information such as the identification of eight possible synapomorphies. The information generated in this study suggest that the evolution of morphological and anatomical diversity in Lychnophorinae may have been driven by adaptive pressures, derived from ecophysiological factors of restricted environments in which most species inhabit / Doutorado / Biologia Vegetal / Doutora em Biologia Vegetal