Made available in DSpace on 2016-06-02T19:57:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissFCT.pdf: 1275381 bytes, checksum: 37915954a1c8462e3ded3fb6eff3f70b (MD5) Previous issue date: 2005-09-08 / Universidade Federal de Minas Gerais / In the present work it was studied the influence of operational conditions particularly dissolved oxygen concentration in the penicillin G acylase (PGA) production. The experiments were carried out in aerated and agitated bioreactor employing bacteria Bacillus megaterium. The production of PGA is sensitive to dissolved oxygen concentration during its cultivation. As much its lack as its excess can be reduces PGA production. As regarding dissolved oxygen concentration the experiments realized in 10% of its saturation showed the better results. The media composition was not significantly influence on enzyme production. The use of potassium acetate instead of phenyl acetic acid as well as the reduction of eighteen for seven amino acids did not have effect on the cells and enzyme concentrations obtained. It was proposed an hybrid model combining mass balance equation with artificial neural network to infer the cellular concentration during the process. The proposed model showed good results to modeling cellular concentration in both training and validate data sets. / Este trabalho teve por objetivo estudar a influência de condições operacionais, particularmente a concentração de oxigênio dissolvido, na produção da penicilina G acilase (PGA) em cultivos empregando bactéria Bacillus megaterium em biorreator tipo tanque agitado e aerado. A importância desta variável reside no fato que tanto sua falta como seu excesso pode prejudicar a produção da enzima. A análise dos dados experimentais permitiu identificar a melhor condição experimental: experimento realizado com controle de oxigênio dissolvido em 10% da saturação. Em relação à composição dos meios, esta não se mostrou significativa. A substituição do ácido fenilacético pelo acetato de potássio, bem como a redução de dezoito para sete aminoácidos não teve efeito sobre as concentrações de células e de enzima obtidas. A operação do cultivo em batelada alimentada e o controle de pH não se mostraram efetivos para melhorar a produção da enzima. Propôs-se modelo híbrido combinando equação de balanço com redes neurais artificiais para inferir a concentração celular ao longo do processo. O modelo proposto foi capaz de inferir com boa precisão a concentração celular nos ensaios de treinamento e obteve boas previsões nos ensaios de validação para alguns testes realizados.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseVRS.pdf: 5281242 bytes, checksum: 8ae3e0f5731bedd5705926ff0020de41 (MD5) Previous issue date: 2007-08-16 / Universidade Federal de Sao Carlos / Penicillin G acylase (PGA) is an important enzyme for industry, used to produce aminopenicillanic acid, a key intermediate in the synthesis of ampicillin, among other betalatam antibiotics. The production of this enzyme by Bacillus megaterium has been studied by the research group for several years. This work advances this research, aiming not only at the enhancement of the enzyme production, but also at a better understanding of B. megaterium regulatory expression mechanisms for PGA. A systematic study of the inoculum, including conservation strategies for the microorganism, was performed. Different cultivation media and operational conditions for the production of PGA were investigated, especially temperature and dissolved oxygen concentration. Enzyme recovery was also studied, including methodologies for minimizing protein contents in whey. Cheese whey is an important nutrient for enzyme production, but its use implies the presence of contaminant proteins in the culture broth. Finally, the enzyme was kinetically characterized. During the inoculum study, PGA yields of microorganisms conserved using different techniques were compared: endospores in 20%-glycerol, -50oC (cryotubes), endospores in solid medium, in refrigerator ( slants ) and vegetative cells in 5%-glycerol, -50oC ( eppendorffs ). It was observed that cryotubes (frozen spores) preserve the enzyme production levels for 12 months, 521 IU/L ±20 IU/L with great reproducibility. Conservation in slants shows a marked fall of production after one month, with a low reproducibility along months. Freezing vegetative cells leads to the highest patterns of enzyme production, up to 900 IU/L, but preservation is sustained for only five months. Maximum specific growth rates changed according to the conservation method, with µmax eppendofor > cryotube > slant . A study of the effect of the inoculum growth period on enzyme yield has shown that, for the three conservation methods, harvesting between 8 and 12 h leaded to similar cell mass and enzyme concentrations after 24 h of cultivation. The procedure of harvesting the inoculum after 12 h, with 10%-bioreactor inoculum volume, showed to be a good method for inoculum standardization. The effect of temperature on the cultivation of B. megaterium for production of PGA was assessed in the range 24-40oC. Maximum cell concentration and maximum enzyme yield were achieved at 30oC. The effect of the concentration of dissolved oxygen on the production of PGA was studied, using air to feed the bioreactor (culture medium volume: 1.2-2.0 L). A second B. megaterium strain showed a lower growth rate than the original one, demanding 24 h for germination/propagation, while the original one requires 12 h. Thus, different oxygen (air) feeding strategies were tested for both strains. Along the years, enzyme yields in agitated flasks have been higher than in bioreactor, for almost all assays. For the second strain, sustaining the dissolved oxygen at 10% of saturation leaded to the highest enzyme productivity among all tested conditions, with a bioreactor productivity similar to the agitated flasks. For the original strain a similar production was only achieved with an increasing stirring profile, implying a very low dissolved oxygen concentration, equal to zero during long periods of the cultivation. The two strains presented different dissolved oxygen requirements. Changes in the cultivation medium also implied different dissolved oxygen requirements for a maximum enzyme yield. Cheese whey has a still no-identified substance that is an essential nutrient for enzyme production. The use of enzymatically hydrolyzed cheese whey improves the downstream process. Assays in agitated flasks, with the original strain, using hydrolyzed whey, leaded to PGA levels similar to the ones obtained using integral whey. However, in bioreactor the yield of enzyme was always lower than in agitated flasks, no matter the aeration strategy that was used. Three possible explanations for this fact were investigated: 1) microorganism preservation method; 2) changes in the time necessary for attaining and sustaining the metabolic state where enzyme expression occurs, what could be related to the ratio between vegetative cells and spores along time, in flasks and in the bioreactor; 3) increase in the production of proteases in the bioreactor, compared to the flasks. The lower yield using hydrolyzed whey does not seem to be related to none of these hypotheses, and up to now it was not possible to generalize the study of the effect of this variable on the PGA production by B. megaterium. Enzyme purification and concentration, via ultra-diafiltration, in the presence of integral and hydrolyzed whey was another subject for research. The effect of pH and of the number of washing cycles on enzyme recovery was assessed. Results showed that this technique is efficient, provided it is run at low temperatures. Hydrolyzed whey indeed eases the purification of the enzyme using membranes, and great part of the contaminant whey proteins can be removed. However, an expressive loss of PGA occurs during the diafiltration stages, which must be minimized. pH did not influence enzyme recovery. The kinetic characterization of the produced enzyme, using the hydrolysis of penicillin G as standard reaction, has showed that maximum PGA activity is at pH 8 and 37oC. Estimated Michelis-Menten parameters were Vmax= 0.0344 mMPenG/min and Km=1.83 mM, with activation energy equal to 27.12 KJ/mol. / Penicilina G acilase (PGA) é uma importante enzima industrial usada para produção do ácido 6-aminopenicilânico, intermediário chave na produção de ampicilina e outros antibióticos β- lactâmicos semi-sintéticos. A produção dessa enzima por Bacillus megaterium vem sendo estudada no grupo há muitos anos. Esta tese dá continuidade a esse estudo visando não só aumento da produção da enzima, mas também um melhor entendimento dos mecanismos regulatórios da expressão de PGA por B. megaterium. Neste trabalho foi realizado um estudo sistemático do inóculo, incluindo estratégias para conservação do microrganismo. Foram investigados diferentes meios de cultura e condições operacionais de cultivo na produção de PGA, em especial temperatura e concentração de oxigênio dissolvido. A recuperação da enzima foi também estudada, incluindo metodologias para minimização do conteúdo de proteínas presentes no soro de queijo, um nutriente importante na produção da enzima, mas cujo uso implica também a presença de proteínas contaminantes no meio de cultivo. Finalmente, a enzima foi caracterizada cineticamente. No estudo do inóculo foram comparados, ao longo do tempo, os desempenhos na produção de PGA de microrganismos conservados como endósporos em glicerol 20% v/v, a -70°C (criotubos), como endósporos conservados em meio sólido a 4ºC ( slants ) e como células vegetativas em glicerol 8% v/v, a -70°C ( eppendorfs ). Verificou-se que sob a forma de esporos congelados (criotubos) há preservação dos níveis de produção da enzima até 12 meses, 521 UI/L ± 20 UI/L, com grande reprodutibilidade. Conservação como slants além de mostrar variabilidade ao longo dos meses, apresenta queda acentuada desde o primeiro mês de conservação. Congelamento de células vegetativas conduz a níveis mais altos de produção da enzima, 900 UI/L, mas preserva atividade apenas durante cinco meses. Velocidades específicas máximas de crescimento dos microrganismos variaram com a forma de conservação, com µmáx eppendorf > criotubo > slant . Estudo do efeito do tempo de crescimento do inóculo na produção da enzima mostrou que, para as três formas de conservação estudada, a colheita do microrganismo entre 8 e 12 horas de cultivo conduzia a produções de enzima e concentração do microrganismo similares após 24 horas de produção. O procedimento de colheita após 12 horas de cultivo, com inoculação de 10% do volume de biorreator, mostrou-se, assim, um bom critério para padronização do inóculo. Foi estudada a influência da temperatura no cultivo de B. megaterium para produção de PGA na faixa entre 25-40°C. Os resultados mostraram que a máxima concentração celular e a máxima produção da enzima ocorrem no cultivo a 30°C. O efeito da concentração de oxigênio dissolvido na produção de PGA foi extensamente estudado, sendo o biorreator (volume de meio: 1,2-2,0 L) alimentado com ar. Uma segunda linhagem de B. megaterium mostrou crescimento mais lento que a original, requerendo 24 horas para a fase de germinação/propagação, enquanto que a original requer 12 horas. Foi, assim, efetuado estudo em biorreator com diferentes estratégias de fornecimento de oxigênio (ar) para as duas linhagens. Ao longo dos anos, a produção de enzima em frascos agitados vem se mostrando maior que a obtida em biorreator em quase todos os ensaios realizados. A segunda linhagem mostrou de forma clara que a manutenção da concentração de oxigênio dissolvido em 10% da saturação conduzia à maior produção da enzima dentre todas as condições testadas, com produção em biorreator similar à obtida em frasco agitado, 450 UI/L. Entretanto, produção em biorreator similar à obtida em frasco agitado, 550-600UI/L, só foi obtida com a linhagem original usando-se um perfil crescente de agitação, que implicava concentração de oxigênio dissolvido muito baixa, permanecendo em zero por vários períodos ao longo do cultivo. As duas linhagens apresentaram, portanto, requerimentos diferenciados para o oxigênio dissolvido. Alterações no meio de cultivo também alteram o requerimento de oxigênio dissolvido para obtenção da máxima produção da enzima. Soro de queijo possui um fator que ainda não foi possível identificar que é nutriente essencial para a produção da enzima. O uso de soro hidrolisado permite melhor recuperação da enzima. Ensaios em frascos agitados, com a linhagem original, na presença de soro hidrolisado, conduziram a níveis de PGA similares aos obtidos com soro integral. Contudo, em biorreator, para todas as condições de oxigênio dissolvido testadas a produção da enzima era inferior à obtida em frascos agitados, qualquer que fosse a estratégia de aeração usada. Foram investigadas três possíveis explicações para esse fato: 1) forma de preservação do microrganismo; 2) alteração no tempo para se atingir e/ou manter o estágio metabólico onde ocorre expressão da enzima, o que poderia estar relacionado com a proporção entre células vegetativas/esporos ao longo do tempo em frascos agitados e biorreator; 3) aumento na produção de proteases no ensaio em biorreator em relação ao ensaio em frasco agitado. A menor produção com soro hidrolisado não parece estar relacionada com nenhuma dessas hipóteses, não tendo sido possível, portanto, até o momento, generalizar o estudo do efeito dessa variável na produção de PGA por B. megaterium. Foi efetuado estudo da concentração e purificação da enzima produzida na presença de soro integral e hidrolisado, através de ultra-diafiltração. Foi estudado o efeito do pH e do número de lavagens na recuperação da enzima. Resultados obtidos mostraram eficiência da técnica para concentração da enzima, se realizada a baixa temperatura. Mostraram também que soro hidrolisado realmente facilita a purificação da enzima através da filtração em membrana, permitindo remoção de grande parte das proteínas contaminantes introduzidas no meio com o soro de queijo. Contudo, ocorre expressiva perda de PGA durante as etapas de diafiltração, que devem ser minimizadas. O pH não influenciou na recuperação da enzima. Caracterização cinética da enzima produzida para a hidrólise de penicilina G mostrou que a máxima atividade de PGA ocorre a pH 8 e temperatura de 37°C. Os valores estimados para os parâmetros cinéticos de Michaelis-Menten foram de Vmáx e Km de 0,0344 mMPenG/min e 1,83 mM, respectivamente, com energia de ativação de 27,12 KJ/mol.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2414.pdf: 14993428 bytes, checksum: da8b438d6672bb118531117cfa66edcb (MD5) Previous issue date: 2008-12-12 / Universidade Federal de Sao Carlos / Penicillin G acylase (PGA), EC 3.5.1.1.11, is an enzyme employed in the hydrolysis reactions of penicillin G to produce 6-amino penicillanic acid (6-APA), but it can also used in the synthesis of semi-synthetic antibiotics. This work investigated the influence of different biocatalysts conceptions and of different acyl donors on the ampicillin synthesis with immobilized PGA, determining experimentally yield data (antibiotic produced / consumed acyl donor), selectivity (antibiotic produced/D(-)-phenylglycine generated) and productivity (produced antibiotic (mmol)/UI/time). First of all, ampicilina synthesis were carried out in homogeneous solution (with substrates and products solubles), using industrial catalyst Recordatti, in order to verify the influence of the different acyl donors, D(-)- phenylgycine methyl (PGEM), ethyl (PGEE) and isopropyl (PGEI) esters on the synthesis of ampicillin. The results showed that the use of EEPG, besides not reducing the ampicillin synthesis rate, also it reduces the ester hydrolysis rate, showing great potential to increase the selectivity of the enzymatic route. The multipoint covalent attachment of PGA was carried out in agar-agarose support with medium diameter of 1.3 ± 7 × 10-2 mm. That biocatalyst was tested in the ampicillin synthesis at 25ºC with the methyl and ethyl esters, with the objective of evaluating its acting in two pH values (6.2 and 6.5). The ethyl ester presented the yield and selectivity (71 ± 4 and 2.2 ± 4 × 10-1) better than the phenylglycine methyl ester (67 ± 1 and 2.0 ± 1 × 10-1) being the pH 6,2 more favorable. Two different biocatalysts for use in the ampicillin synthesis with simultaneous crystallization of the products were tested: PGA immobilized within agarose particles with average diameter of 95.2 ± 3 × 10-1 μm and, soon after, wrapped by alginate gel, resulting in particles with average diameter of 2.1 ± 6 × 10-2 mm; and PGA immobilized in agarose ME particles (10% wt) with average diameter of 1.4 ± 8 × 10-2 mm. So much the envolvement of the immobilized enzyme by a secondary support (agarose-alginate catalyst) as the use of particles gel of millimetric dimensions (agarose 1.4 mm) caused modifications in the microambient of that enzyme, mainly in reason of the profiles of íons intra-particle generated with the progress of the reaction. In view of the above exposed, ampicillin synthesis were carried out in three different pHs (6.0; 6.2 and 6.5), at 25- °C, using the methyl, ethyl and isopropyl esters with excess of 6-APA. To reduce the hydrolyis of the produced antibiotic, making possible its industrial production, was necessary that it precipitates inside of the synthesis reactor. When we evaluated of global form the selectivity, yield and productivity we concluded that a promising strategy would be to carry out the synthesis using ethyl ester, alginate-PGA-agarose 6BCL catalyst in pH 6.2. By this condition was obtained productivity of 8.0 × 10-5 ± 8 × 10-6, selectivity 2.0 ± 2 × 10-1 and yield 62%. The reactions were also carried out with ester excess, however the selectivity was drastically reduced getting at 1.1 ± 6 × 10-2. The last stage of this work was the kinetic study of the ampicillin synthesis. Synthesis were carried out in several initial conditions of substrate concentration (6-APA and PGEE) in pH 6.0 and 6.2 with the alginate-PGA-agarose 6BCL catalyst. In some cases, ampicilin and D(-) -FG crystals were sowed in the reaction start to check possible inhibitory effects of the products. Largests yields and selectivities were obtained when the concentration of 6-APA was increased by the ester concentration. Inhibitory effect in the antibiotic hydrolysis was verified when a high concentration of both substrates was used. In general, the experiments carried out in heterogeneous medium favored the yield, selectivity and productivity. In all of the experiments the lowest pH (pH 6.0) favored the improvement of the yield and selectivity while the productivity was favored the pH 6.2. The synthesis in fed-batch reactor, with high concentration of substrates, favored the selectivity of the reaction, it passed from 2.5 to 3.5. / Penicilina G Acilase (PGA), EC 3.5.1.1.11, é uma enzima empregada nas reações de hidrólise da penicilina G para produção do ácido 6-amino penicilânico (6-APA), sendo também utilizada na síntese de antibióticos semi-sintéticos. Este trabalho levantou a influência de diferentes concepções de biocatalisador e de diferentes doadores acil sobre a síntese de ampicilina com PGA imobilizada, determinando experimentalmente dados de rendimento (antibiótico produzido/doador acil consumido), seletividade (antibiótico produzido/fenilglicina gerada) e produtividade (antibiótico produzido (mmol)/UI/tempo). Primeiramente foram realizadas sínteses de ampicilina em meio homogêneo (com substratos e produtos solúveis), utilizando catalisador industrial Recordatti, a fim de verificar a influência dos diferentes doadores acil, os ésteres metílico (EMFG), etílico (EEFG) e isopropílico (EIFG) de D-fenilglicina na síntese de ampicilina. Os resultados obtidos mostraram que a utilização de EEFG, além de não reduzir a velocidade de síntese de ampicilina, também diminuiu a velocidade de hidrólise do éster, mostrando grande potencial para aumentar a seletividade da rota enzimática. Em seguida, PGA foi imobilizada covalentemente em matriz agar-agarose com diâmetro médio de 1,3 ± 7 × 10-2 mm. Esse biocatalisador foi testado na síntese de ampicilina, a 25oC com os ésteres metílico e etílico, com o objetivo de avaliar seu desempenho em dois valores de pH (6,2 e 6,5). O éster etílico apresentou rendimentos e seletividades (71,0 ± 4 e 2,2 ± 4 × 10-1) melhores que o éster metílico de fenilglicina (67,0 ± 1 e 2,0 ± 1 × 10-1) sendo o pH 6,2 mais favorável. Dois diferentes biocatalisadores para uso na síntese de ampicilina com cristalização simultânea dos produtos foram testados: PGA imobilizada em partículas de agarose com diâmetro médio de 95,2 ± 3 × 10-1 μm e, em seguida, envolvida em gel de alginato, resultando em partículas com 2,1 ± 6 × 10-2 mm de diâmetro; e PGA imobilizada em partículas de agarose ME 10% ((m/m)) com 1,4 ± 8 × 10-2 mm de diâmetro. Tanto o envolvimento da enzima imobilizada por uma matriz secundária (caso do catalisador agarose-alginato) como o uso de partículas de gel de dimensões milimétricas (agarose 1,4 mm) causaram modificações no microambiente da enzima, principalmente em razão dos perfis intra-partícula de íons gerados com o avanço da reação. Em vista do exposto acima, sínteses de ampicilina foram realizadas em três diferentes pHs (6,0; 6,2 e 6,5), a 25oC, utilizando os ésteres metílico, etílico e isopropílico com excesso de 6- APA. Para reduzir a hidrólise do antibiótico produzido, viabilizando sua produção industrial, foi necessário que ele precipitasse dentro do próprio reator de síntese. Avaliando de forma global seletividade, rendimento e produtividade se concluiu que uma estratégia promissora seria realizar a síntese utilizando éster etílico, catalisador alginato-PGA-agarose 6BCL em pH 6,2. Condição em que se obteve produtividade de 8,0 × 10-5 ± 8 × 10-6, com seletividade 2,0 ± 2 × 10-1 e rendimento 62%. As reações também foram realizadas com excesso de éster, porém a seletividade foi drasticamente reduzida chegando a 1,1 ± 6 × 10-2. A última etapa do trabalho foi o estudo cinético da síntese de ampicilina. Sínteses foram realizadas em várias condições iniciais de concentração de substrato (6-APA e EEFG) em pH 6,0 e 6,2 com o catalisador alginato-PGA-agarose 6BCL. Em alguns casos cristais de ampicilina e D(-)-FG foram semeados no início da reação para verificar possíveis efeitos inibitórios dos produtos. Maiores rendimentos e seletividades foram alcançados quando se aumentava a concentração de 6-APA frente à concentração de éster. Efeito inibitório na hidrólise do antibiótico foi verificado quando se utilizou alta concentração de ambos os substratos. Em geral, os experimentos realizados em meio heterogêneo favoreceram rendimento, seletividade e produtividade. Em todos os experimentos o pH mais baixo (pH 6,0) favoreceu a melhora do rendimento e seletividade enquanto que a produtividade foi favorecida a pH 6,2. A síntese em reator batelada alimentada, com alta concentração dos substratos, favoreceu a seletividade da reação, que passou de 2,5 para 3,5.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DoutRGS.pdf: 2966707 bytes, checksum: 76003e0d6d999794b955bb26e523ff71 (MD5) Previous issue date: 2003-07-27 / Universidade Federal de Minas Gerais / The enzyme penicillin G acylase (E.C.3.5.1.11) is used in the production of 6-aminopenicillanic acid (6-APA) and 7-aminocephalosporinic acid (7-ACA), which are key intermediates for the production of β-lactam antibiotics. Its industrial importance was one of the motivations for this thesis. On-line measurement and monitoring of cultivations of Bacillus megaterium ATCC 14945 in a agitated and aerated bioreactor allowed the acquisition of variables such as mol fraction of CO2 and O2 in the exhaust gases, pH, dissolved oxygen. Batch and fed-batch runs, using either enzymatically hydrolyzed casein or a pool of free amino acids provided information concerning the extend of the cultivation, preservation of the microorganism and addition/exclusion of nutrients. Usual carbon sources as glucose, fructose and glycerol increased the cellular mass, but did not improve the productivity of PGA. The use of amino acids resulted in a 2.5-fold increase of productivity. Adding phenyl acetic acid at the beginning of the experiments did not inhibit cell growth. Three non-structured models of microbial growth were put forth, assuming one, two and three limiting substrates. However, these models were too simple for our purposes. Another approach was then followed, using neural networks (NN) as softsensors. Before implementing the inference algorithm, the blank noise of the instrumentation had to be reduced. A non-conventional filter was developed, combining a recursive NN, a moving average and a second recursive NN. The smoothed variables were the input for a second NN, for pattern recognition, which classified the run in one of the main growth phases: lag, exponential and stationary. The main purpose of this NN was to identify the exponential phase, which would be the domain of the next NN, a multilayer perceptron (MLP) for inference of the cellular mass. Several NN, with different topologies, were tested for this purpose. Finally, the product concentration (PGA activity in the medium) was estimated through a hybrid approach, using the growth rate inferred by the MLP NN, coupled to the cell-product yield, obtained from the fitting of the non-structured models. Another important information for this last algorithm was the knowledge that production of PGA was growth-associated, but with a 2hr-delay. The algorithm for inference was robust and accurate. / A grande importância da enzima penicilina G acilase (E.C.3.5.1.11), usada para a produção dos ácidos 6-aminopenicilânico (6-APA) e 7-aminocefalosporânico (7-ACA), compostos-chave na produção industrial de antibióticos β-lactâmicos, foi a principal motivação deste trabalho. Através de realização de experimentos de produção de PGA por Bacillus megaterium ATCC 14945 em reator convencional, utilizando sistema de aquisição de dados, foi possível monitorar em tempo real variáveis como, por exemplo, fração molar de oxigênio e dióxido de carbono nos gases de saída, pH, oxigênio dissolvido. Foram realizados cultivos em batelada e batelada alimentada tendo como substratos limitantes tanto caseína hidrolisada enzimaticamente como aminoácidos livres. Obtiveram-se informações relacionadas ao tempo de cultivo, à estocagem do microrganismo e à adição e exclusão de nutrientes. Fontes usuais de carbono, como glicose, lactose e glicerol, quando utilizadas, promoviam o crescimento da massa celular sem, no entanto, aumentar a produção de PGA. O uso de aminoácidos como principal substrato elevou em 2,5 vezes a produtividade. Observou-se, ainda, que a adição de ácido fenilacético (AFA) desde o início do cultivo não inibiu o crescimento do microrganismo. As informações experimentais permitiram a proposição e validação de três modelos cinéticos não-estruturados deste processo, com um ou mais substrato(s) limitante(s). Como essas propostas se mostraram demasiadamente simplificadas, optouse pelo uso de redes neurais como sensores baseados em software , já que não se chegou a um modelo fenomenológico satisfatório. Para implementação do algoritmo de inferência baseado em rede neural, mostrou-se necessário filtrar os ruídos das medidas provenientes do sistema de aquisição de forma a minimizar erros aleatórios da instrumentação. Propõe-se para isso filtro que utiliza redes recorrentes, combinadas a média móvel. As variáveis filtradas foram utilizadas numa segunda rede de identificação de padrões, que dividia o cultivo nas três principais fases do crescimento microbiano. O principal objetivo desta foi identificar a fase de crescimento exponencial, que seria a enfocada pelo algoritmo de inferência. Para essa inferência, com base nas variáveis medidas em tempo real, treinaram-se redes com várias topologias e entradas, de modo a escolher as variáveis que possibilitassem o aprendizado dos aspectos essenciais da dinâmica do processo. Por fim, a concentração de produto (atividade de PGA no meio de cultura) foi estimada através de enfoque híbrido, usando a velocidade de crescimento inferida por rede feedforward , acoplada ao fator de rendimento célula-produto estimado no ajuste dos modelos não-estruturados. Outra informação importante utilizada neste último algoritmo foi o fato da produção ser associada ao crescimento, mas com atraso de 2h. Novamente, os resultados quantitativos do algoritmo de inferência do produto foram muito satisfatórios.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissRTO.pdf: 1502599 bytes, checksum: 74b4b7145b86c0fed8e0b1327b8aaea1 (MD5) Previous issue date: 2006-12-20 / Universidade Federal de Sao Carlos / Penicillin G acylase (PGA) is an enzyme of major impact in human health for catalyzing the deacilation of the penicillin G, to yield 6-aminopenicillanic acid (6- APA), key intermediate in the semi-synthetic antibiotics production. Several microorganisms produce PGA, but Bacillus megaterium is capable of secreting it to the medium. PGA from B. megaterium has been studied in DEQ-UFSCar. Xanthomonas campestris presents in your DNA the genetic sequence that codify acylase penicillin and tests with a strain of this microorganism from Departamento de Genética e Evolução da UFSCar showed PGA extracellular production. Studies in PGA production were initiated with the microorganism stored in DEQ-UFSCar. At the same time, strains of X. campestris from Coleção de Culturas Tropical (CCT) and Instituto Agronômico do Paraná (IAPAR) were tested. However, assays with these strains showed little cellular growth and no enzymatic activity. The microorganism reactivated was send to Fundação André Toselo for identification. The result showed that the microorganism was Bacillus megaterium. Therefore, at the same time that realized adaptations tries with the new strain of X. campestris, studies of production operational conditions of PGA were performed with strain of Bacillus megaterium, in shaking flasks and bioreactor, as well the enzyme characterization Germination/ propagation of B. megaterium experiments, at 30°C, carried out in shaking flasks showed that the growth time of microorganism in the inoculum step was 24 hours and maximum specific growth rate was µmáx = 0.33h-1. Assays in shaking flasks were carried out in shaker at 30ºC and 300 rpm intend to determine the most adequate pH for the enzyme production in both, microorganism propagation phase and enzyme production phase The results showed that the best pHs among the tested ones were pH 8.0 and 7.0, for the propagation and production phases, respectively, with 355 IU/L. The culture medium with preferentially consumed amino acids 20,0 g/L, potassium phenylacetate 3,5 g/L, solution with differents salts 0,22 g/L and cheese whey 20,0 g/L was the more efficient in PGA production, carried out maximum cellular growth and enzymatic activity, 4,59 g/L and 592UI/L, respectively, in 36 hours. Assays in a 2-L bioreactor, with production medium in the presence of amino acids preferably consumed 10.0 g/L, cheese whey 20.0 g/L, solution of salts 0.22 g/L and inducer potassium phenylacetate 3.5 g/L, indicated that the addition of nutrients during the fermentation is a efficient strategy, providing enzyme production increase. In the study of the influence of oxygen dissolved, carried out in bioreactor too, maximum enzymatic activity was 451 IU/L with 10% of saturation. Moreover, the maximum enzyme production was observed in the bioreactor and not in shaking flasks, like in all experiments until this. In the stage of characterization of the penicillin G acylase from Bacillus megaterium, optimum values of temperature and pH were, 47°C and 8.0, respectively. The Michaelis Menten model fitted resulting in estimated Km and Vmáx parameters values of 1.51 mM and 1.1*10-3 mmol/min*IU, respectively. The activation energy estimated was 27.12 KJ/mol.The results showed that PGA from Bacillus megaterium deactivate completely after 45 minutes of incubation at 60°C and 90 minutes in pH 11.0. / Penicilina G acilase (PGA) é das enzimas de maior impacto na saúde humana, pois catalisa a desacilação de penicilinas naturais, principalmente a penicilina G, para a obtenção do ácido 6-aminopenicilânico (6-APA), composto chave na produção de antibióticos β-lactâmicos. Ela é produzida por diferentes microrganismos, dentre os quais Bacillus megaterium, um dos poucos que secreta a enzima. A produção de PGA por esse microrganismo vem sendo estudada há tempos no DEQ-UFSCar. Xanthomonas campestris possui em seu DNA a seqüência genética que codifica PGA e teste preliminar de cultivo de linhagem desse microrganismo doada pelo Departamento de Genética e Evolução da UFSCar mostrou produção extracelular de PGA. Foi iniciado, por isso, meses depois, estudos de produção de PGA por X.campestris, reativando-se cultura do microrganismo que estava armazenada no DEQ-UFSCar. Em paralelo, foram obtidas e testadas outras linhagens desse microrganismo, procedentes da Coleção de Culturas Tropical (CCT) e do Instituto Agronômico do Paraná (IAPAR). Cultivos dessas novas linhagens de X. campestris mostraram crescimento celular pequeno, sem produção de PGA. Comparando-se essas novas linhagens com o microrganismo que se vinha trabalhando pode-se verificar então que este não era X. campestris. O microrganismo foi a seguir enviado para identificação na Fundação André Toselo. O laudo dessa Instituição mostrou que o microrganismo que vinha sendo cultivado era Bacillus megaterium de Bary 1884AL (ATCC 35985). Esse resultado já era esperado, pois havia muitas semelhanças entre as duas culturas. Contudo, havia também algumas diferenças, que motivaram o envio para identificação criteriosa do microrganismo produtor de PGA. Assim, ao mesmo tempo em que foram realizadas tentativas de adaptação das novas linhagens de X. campestris visando produção de PGA, foram investigadas diferentes condições operacionais de produção da enzima com o microrganismo identificado como B. megaterium, tanto em câmara rotativa shaker como em biorreator, bem como a caracterização da enzima produzida. Ensaios de germinação/propagação de Bacillus megaterium, a 30oC, realizados em shaker , mostraram que o microrganismo atinge fase estacionária em 24 horas, com velocidade máxima específica de crescimento µmáx = 0,33h-1. O pH inicial onde se obtém a maior atividade de PGA é 8,0 para o meio de crescimento (propagação) e pH 7,0 para o meio de produção. Cultivos a diferentes temperaturas mostraram que 30ºC é a temperatura ótima tanto para o crescimento do microrganismo quanto para produção da enzima. O meio de cultivo composto por aminoácidos consumidos preferencialmente pelo microrganismo - 20 g/L, fenilacetato de potássio - 3,5 g/L, solução com diferentes sais 0,22 g/L, e soro de queijo-20,0 g/L mostrou ser o mais eficiente na produção da PGA, atingindo máxima concentração celular e atividade enzimática, 4,59 g/L e 592 UI/L, respectivamente, em 36 horas de cultivo, com pHs para os meios de crescimento e produção iguais a 8,0 e 7,0, respectivamente, e temperatura controlada em 30°C. Cultivos do microrganismo em biorreator de 2 L mostraram que a adição de nutrientes na forma de pulsos é estratégia eficiente, proporcionando aumento nos níveis de produção da enzima. Estudo da influência de oxigênio dissolvido na produção de PGA mostrou que manutenção de 10% de saturação durante todo o cultivo conduz à máxima atividade enzimática, 451 UI/L. Essa deve ser realmente a condição ótima para oxigênio, pois pela primeira vez se obteve maior atividade enzimática no biorreator e não no ensaio em shaker , sempre realizado em paralelo para padronização do estudo. Resultados obtidos na caracterização da enzima confirmaram os valores já obtidos anteriormente para PGA de B. megaterium: temperatura e pH ótimos foram 47°C e 8,0, respectivamente; parâmetros cinéticos obtidos por ajuste do modelo de Michaelis-Menten a dados de velocidades iniciais de hidrólise de penicilina G catalisada por PGA, a 370C, foram: Vmáx 1,1*10-3 mmol/min*UI e Km 1,51 mM; meia-vida da enzima a 60°C é de 10 minutos, com inativação completa após 45 minutos de exposição. Quanto à estabilidade alcalina, verificou-se a completa desnaturação de PGA após 90 minutos de incubação a pH 11,0, com tempo de meia vida de 1 minuto.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissERN.pdf: 1095577 bytes, checksum: db0cd04a8651aaa02aaf07151f39e8e4 (MD5) Previous issue date: 2003-07-28 / Universidade Federal de Sao Carlos / Penicillin G acylase (PGA) is an important enzyme for the pharmaceutical industry. This enzyme has industrial use in the hydrolysis of penicillin G to obtain 6-aminocephalosporanic acid (6-APA), essential intermediate for the production of beta-lactam antibiotics. Many microorganisms produce PGA, but Bacillus megaterium is one of the few that excretes the enzyme to the extra cellular medium, facilitating downstream operations. Another recently enzyme application refers to enzymatic synthesis of semi-synthetics antibiotics as amoxilin and amphicilin via green route. This work studied the pH influence on the production of the enzyme. An algorithm based on the Fuzzy logic theory was implemented aiming to determine the maximum enzyme concentration during Bacillus megaterium cultivations. Experiments were carried out in a bioreactor (5 liter working volume) coupled to a data acquisition system using a Programmable Logic Controller and Supervisory System. Experiments carried out under pH control showed a decreasing in enzyme concentration compared to standard experiments. This result could be related to production of proteases by microorganism or enzyme deactivation caused by local acid addition. Two algorithms were implemented. The first was programmed in Fortran and linked as dynamic link library in a Visual Basic program to exchange on-line information with data acquisition system. The second one was implemented in MatLab (Mathworks, 5.2) software. On-line variables as cultivation time, carbon dioxide concentration and time carbon dioxide concentration derivate were used as information to Fuzzy algorithm. Both algorithms were able to accurately identify the time for which the enzyme reached its maximum. The first algorithm was tested in real time in two experiments. / Penicilina G acilase (PGA) é uma enzima de grande interesse na produção industrial de antibióticos beta-lactâmicos. Sua principal aplicação é como catalisador na hidrólise da penicilina G em ácido 6-aminopenicilânico (6-APA), composto-chave na produção industrial de antibióticos semi-sintéticos. PGA é produzida por vários microrganismos, apresentando diferentes características e propriedades. Dentre aqueles, Bacillus megaterium é um dos poucos que a produz extracelularmente, simplificando etapas para sua separação e purificação. Outra importante aplicação refere-se à sua utilização na síntese enzimática de antibióticos como amoxilina e ampicilina via rota verde. Neste trabalho estudouse a influência do pH na produção da enzima e implementou-se algoritmo baseado na teoria da lógica nebulosa ( Fuzzy ) com o objetivo de identificar o momento de máxima concentração da enzima. Experimentos foram realizados em biorreator de bancada (5 litros de volume útil) com aquisição de dados e controle do processo via controlador lógico programável e sistema supervisório.A utilização de controle de pH nos experimentos não resultou em bons resultados havendo uma diminuição na concentração da enzima em comparação com experimentos realizado sem controle. Este fato poderia estar relacionado com a produção de proteases pelo microrganismo ou pela desativação da enzima causada pela adição pontual de ácido. Dois algoritmos foram implementados. O primeiro foi programado em Fortran e utilizado como biblioteca dinâmica em plataforma de comunicação desenvolvida em Visual Basic para troca de informações em tempo real com sistema de aquisição de dados. O segundo algoritmo foi implementado no programa MatLab (Mathworks, 5.2). Os algoritmos empregaram como variáveis o tempo de cultivo, a fração molar de dióxido de carbono e sua derivada em relação ao tempo. Ambos algoritmos foram capazes de identificar com boa precisão o momento de parar o cultivo. O primeiro foi validado através de sua implementação no sistema em dois experimentos.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3185.pdf: 3522652 bytes, checksum: 063df10d4f80507d55f3980b84be9243 (MD5) Previous issue date: 2010-03-31 / Universidade Federal de Sao Carlos / Penicillin Acylases are enzymes of great industrial importance, being used mainly for production of 6-aminopenicillanic acid, 6-APA from penicillin G. In the late 90's, its use for synthesis of β-lactam semisynthetic antibiotics began on an industrial scale, an alternative in the context of "green chemistry" to the chemical synthesis of high environmental impact. The aiming thesis was to evaluate the influence of the growth media on the strains of Bacillus megaterium that will be used in the cloning of the gene pac in own B. megaterium, aiming at a larger number of copies of the gene, thus increasing the levels of expression of the enzyme penicillin G Acylase (PGA). It was determined the main metabolites produced by strains ATCC 14945 QB 1551 and PV 361 (the latter given by Professor Patricia Vary, corresponding to the wild QB 1551 with all megaplasmids deleted, which will be cloned with enzyme PGA). Evaluated medium has some influence on the metabolism of the organism, in order to optimize the production of the enzyme in cultures of high cell concentrations. The analysis of experimental data showed the strain PV 361 reached the highest cell concentration 16,6 g / L (dry weight), in fed-batch cultivation with the SNB medium with cheese whey (10,0 g / L), compared with 12,5 g / L without the presence of whey and 9,6 g / L in the LB-B medium. In cultures in SNB medium with whey the concentration of lactic acid reached 22,1 g/L, compared with 13,2 g/L in the absence of whey. However for the LB-B medium, the main product was acetic acid with a concentration of 6,7 g /L. Kinetic parameters were calculated as μmax, Yx/s, during the fed-batch cultivations in a bioreactor in stirred tank and aerated in a bench scale (5 L and 2L). The kinetic model for growth and production of metabolites was defined from the test phase in bioreactor batch. The operation of fed-batch culture and pH control were not effective for improving the production of biomass, because it had a high lactic acid production (up to 8 g / L in phase with the batch means SNB) and acetic acid (above 6 g / L at the end of the batch with LB medium-B), concentrations that led to the inhibition of growth of the microorganism and induced its sporulation, biological phenomenon that once started is difficult to reverse and that hinders the production in high cell density (HCDC). / Penicilinas acilases são enzimas de grande importância industrial, sendo utilizadas principalmente para produção de ácido 6 - aminopenicilânico, 6-APA, a partir de penicilina G. Em fins da década de 90, seu uso para síntese de antibióticos β- lactâmicos semi-sintéticos teve início em nível industrial, como uma alternativa no âmbito da química verde , aos processos químicos de síntese, de alto impacto ambiental. Este mestrado teve por objetivo avaliar meios de crescimento celular para linhagens de Bacillus megaterium que foram usadas na clonagem de seu gene pac no próprio B. megaterium, visando a um maior número de cópias do gene, aumentando assim os níveis de expressão da enzima penicilina G acilase (PGA). Foram determinados os principais metabólitos produzidos pelas linhagens ATCC 14945, QB 1551 e PV 361 (este último cedido pela Profa. Patrícia Vary, correspondendo à linhagem selvagem QB 1551 com todos os megaplasmídeos deletados, na qual será clonada a enzima PGA). Avaliou-se a influência do meio sobre o metabolismo do microrganismo, com o objetivo de otimizar a produção da enzima em cultivos de altas concentrações celulares. A análise dos dados experimentais permitiu identificar que o meio no qual a linhagem PV 361 atingiu a maior concentração celular em cultivos em batelada alimentada foi o SNB com soro de queijo (10,0 g/L ), alcançando concentração celular de 16,6 g/L (massa seca), comparado com os 12,5 g/L sem a presença do soro e 9,60 g/L no meio LB-B. Em cultivos no meio SNB com soro, a concentração de ácido lático atingiu de 22,1 g/L, comparado com 13,2 g/L na ausência do soro. Já para o meio LB-B o produto principal foi o ácido acético com uma concentração de 6,7 g/L. Os parâmetros cinéticos ajustados foram: μmax = 0,285 h-1 e 0,106 h-1 com e sem o soro respectivamente, obtidos utilizando o algoritmo simulated annealing (SA) junto com o algoritmo de Levenberg-Marquardt (LM). Foram calculados parâmetros cinéticos como μmax, Yx/s, na fase de batelada alimentada em cultivos em biorreator tipo tanque agitado e aerado, em escala de bancada (2L e 5 L). O modelo cinético de crescimento e de produção de metabólitos foi definido a partir de ensaios em biorreator na fase batelada. A operação do cultivo em batelada alimentada e o controle de pH não se mostraram efetivos para melhorar a produção da biomassa, pois se teve uma alta produção de ácido lático (acima de 8 g/L na fase batelada com o meio SNB) e acético (acima de 6 g/L ao final da batelada com meio LB-B), concentrações que levaram à inibição do crescimento do microrganismo e induziram sua esporulação, fenômeno biológico que uma vez inciado é de difícil reversão, e que dificulta ainda mas a produção em alta densidade.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6022.pdf: 1662458 bytes, checksum: 4e6f5f48dc72f84e96a68be96f5ddf02 (MD5) Previous issue date: 2014-03-28 / Financiadora de Estudos e Projetos / Penicillin G acylase (PGA) is the key enzyme for the industrial production of β-lactam antibiotics. Major current PGA demand is attended for producer organisms as Escherichia coli and Bacillus megaterium genetically modified. The enzyme produced by Escherichia coli accumulates in the periplasmic space of the bacteria and it requires cell disruption for recovery, whereas the enzyme from Bacillus megaterium is secreted into the production medium. This study aimed to evaluate the adsorption of PGA expressed by these two recombinant microorganisms in cationic and anionic resins for recovery and purification of the enzyme. For E. coli PGA was evaluated ionic adsorption of the enzyme in Streamline SP XL® cation exchanger resin after cell disruption by sonication. In this step, we assessed the influence of pH and buffer, to reduce the loss of enzyme inactivation and adjust the pH to a value suitable for a subsequent selective adsorption of the enzyme. The buffers evaluated were acetate, citrate, phosphate and carbonate, and the values of pH were adjusted between 4,5 and 11,0. No denaturation of the enzyme was observed in buffers and pHs evaluated. However, it was observed enzyme adsorption in cellular debris at pH values equal or smaller than 5,4, this debris adsorption was more apparent in the presence of acetate buffer. Thus, cell disruption was defined at pH 6.0 to prevent loss PGA in the adsorption of debris and adjustment of pH and salt molarity by dilution in the appropriate buffer to prevent denaturation of the enzyme by local reduction of the pH when uses concentrated acid. The STREAMLINE SP XL® resin showed higher adsorption capacity of PGA at pH 5,0 and the temperature range (4 and 25°C) did not influence it. The Langmuir isotherm represented adequately the experimental data of the enzyme adsorption resin at 4 and 25°C (pH 5,0) with similar values of qm and KL 25,4 U/g 185,2 U/g, respectively. Purification of PGA in a fixed-bed column showed overall recovery of activity around 50% and purification factor of about 9 times. The adsorption capacity of cationic resin in this mode of operation was 10,9 UNIPAB/mlresin. The PGA purification secreted by Bacillus megaterium recombinant, produced in a synthetic medium, was studied by ion adsorption resins and the following pH values: Streamline SP XL ® and IMMOBEAD IB-C435 (cation-exchanger resins, pH 5,0, 5,5 and 6,0); manae-agarose activated with 40 and 80mmoles/g amino groups (cation exchanger resin, pH 6,0, 7,0 and 7,5); STREAMLINE DEAE XL® and STREAMLINE Q XL® (anionic exchange resins, pH 7,5 and 8,5). Equilibrium experiments in cationic resins Streamline SP XL ® (4°C, pH 5,0) and IB-C435 IMMOBEAD (4°C, pH 5,5) allowed estimation of the parameters of the Langmuir model qm = 76,6 and 91,5 U/g KL = 294,7 and 412,3 U/g, respectively. Despite the high adsorptive capacity of these resins, they were not suited to purification of PGA, because their adsorbes PGA and the contaminants. Manae-agarose resins (40 and 80 μmoles/g) were not effective in PGA adsorption. The STREAMLINE anionic exchangers resins not adsorbed significant amount of PGA in pH evaluated, however, this resin performed a adsorption of almost of 50% proteins present in the medium, demonstrating selective for removal contaminating proteins. Adsorption assays in fixed-bed column Streamline Q XL ® (22°C, pH 8,0) showed that the resin is effective in adsorption of contaminating proteins, it is possible to recover approximately 70 % PGA with a purification factor of 4 times and high specific activity of about 25 U/mg. Already on STREAMLINE SP XL® (22ºC, pH 5,0) resin, the total enzyme recovery was 70 %, but with a purification factor of only 1,61 times and specific activity of around 11 U/mg. It was concluded that adsorption in anionic mode is more advantageous, because presents a better performance and avoid the enzyme dilution. The cultivation of recombinant B. megaterium in a high cell density bioreactor using complex medium, allowed to reach PGA volumetric activity of 50 U/mL. After concentration of the enzyme extract by ultrafiltration to 100 U/mL, was evaluated purification of the enzyme on gel filtration resin column using Superdex 200 Prep Grad (22 °C, pH 7,5). This technique allowed high enzyme recovery (>93%), however with a purification factor of 3 times and specific activity of 13 U/mg. / Penicilina G acilase (PGA) é a enzima chave para a produção industrial de antibióticos β-lactâmicos. Grande parte da demanda atual pela enzima é atendida pela sua produção por Escherichia coli e Bacillus megaterium geneticamente modificados. A enzima produzida por Escherichia coli acumula-se no espaço periplasmático da bactéria, requerendo rompimento celular para sua recuperação, enquanto que a enzima produzida por Bacillus megaterium é secretada para o meio de produção. Este trabalho teve como objetivo avaliar a adsorção de PGA produzida por esses dois microrganismos recombinantes em resinas catiônicas e aniônicas para recuperação e purificação da enzima. Para PGA de E. coli avaliou-se a adsorção iônica da enzima na resina de troca catiônica STREAMLINE SP XL® após rompimento celular por sonicação. Nesta etapa, avaliou-se a influência do tampão e do pH, visando reduzir a perda de enzima por inativação e ajustar o pH a um valor apropriado para uma posterior adsorção seletiva da enzima. Os tampões avaliados foram acetato, citrato, fosfato e carbonato, ajustados para valores de pH entre 4,5 e 11,0. Não se observou desnaturação da enzima nos tampões e pHs avaliados. Contudo, observou-se adsorção da enzima nos debris celulares a valores de pH iguais ou menores que 5,4, sendo mais acentuada essa adsorção na presença de tampão acetato. Definiu-se, assim, rompimento celular em pH 6,0 para evitar perda de PGA por adsorção nos debris e ajuste do pH e da molaridade do sal por diluição no próprio tampão da adsorção, para evitar desnaturação da enzima por redução local do pH quando se utiliza ácido concentrado. A resina STREAMLINE SP XL® mostrou maior capacidade de adsorção de PGA em pH 5,0, não sendo influenciada nas temperaturas avaliadas (4 e 25ºC). A isoterma de Langmuir representou adequadamente os dados experimentais de adsorção da enzima nessa resina a 4 e 25ºC (pH 5,0), com valores similares de qm e KL, 25,4 U/g e 185,2 U/g, respectivamente. A purificação de PGA em coluna de leito fixo apresentou recuperação global de atividade em torno de 50% e fator de purificação de aproximadamente 9 vezes. A capacidade de adsorção da resina de troca catiônica nesse modo de operação foi de 10,9 UNIPAB/mLresina. A purificação de PGA secretada por Bacillus megaterium recombinante, produzida em meio sintético, foi estudada por adsorção iônica da enzima nas seguintes resinas e valores de pH: STREAMLINE SP XL® e IMMOBEAD IB-C435 (resinas de troca catiônica, pHs 5,0, 5,5 e 6,0); MANAE-agarose ativada com 40 e 80 μmoles de grupos amino/g (resina de troca catiônica, pHs 6,0, 7,0 e 7,5); STREAMLINE DEAE XL® e STREAMLINE Q XL® (resinas de troca aniônica, pHs 7,5 e 8,5). Ensaios de equilíbrio para as resinas de troca catiônica STREAMLINE SP XL® (4ºC, pH 5,0) e IMMOBEAD IB-C435 (4ºC, pH 5,5) permitiram a estimativa dos parâmetros do modelo de Langmuir: qm = 76,6 e 91,5 U/g e KL= 294,7 e 412,3 U/g, respectivamente. Apesar da alta capacidade adsortiva dessas resinas, as mesmas não foram adequadas à purificação de PGA, pois adsorveram tanto PGA quanto proteínas contaminantes. As resinas MANAE-AGAROSE (40 e 80 μmoles/g) não foram eficazes na adsorção de PGA. As resinas STREAMLINE de troca aniônica não adsorveram quantidade significativa de PGA nos valores de pH avaliados, entretanto, adsorveram quase 50% de proteínas presentes no meio, mostrando-se assim seletiva para retirada das proteínas contaminantes. Ensaios de adsorção em coluna de leito fixo com STREAMLINE Q XL® (22ºC, pH 8,0) mostraram que a resina é eficaz na adsorção de proteínas contaminantes, sendo possível a recuperação de aproximadamente 70% de PGA com um fator de purificação de 4 vezes e alta atividade específica, em torno de 25 U/mg. Já na resina STREAMLINE SP XL® (22ºC, pH 5,0) a recuperação total da enzima foi de 70%, mas com um fator de purificação de apenas 1,61 vezes e atividade específica em torno de 11 U/mg. Assim, conclui-se que a adsorção no modo aniônico é mais vantajosa, pois além de maior purificação, não dilui a enzima. O cultivo de B. megaterium recombinante em biorreator com alta densidade celular, utilizando meio complexo, permitiu atingir atividade volumétrica de PGA de 50 U/mL. Após concentração do extrato enzimático por ultrafiltração até 100 U/mL, avaliou-se a purificação da enzima em coluna de gel de filtração utilizando a resina Superdex 200 prep grad (22ºC, pH 7,5). Essa técnica permitiu alta recuperação da enzima (>93%), entretanto com um fator de purificação de 3 vezes e atividade específica de 13 U/mg.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4561.pdf: 2229870 bytes, checksum: e51008e96773b0184eb28a316cf86d57 (MD5) Previous issue date: 2012-04-27 / Financiadora de Estudos e Projetos / Penicillin G acylase (PGA, E.C.3.5.1.11) from Escherichia coli is an enzyme of great industrial importance, widely used for the hydrolysis of penicillin G, producing the 6-aminopenicillanic acid (6-APA), which is a key molecule for the synthesis of semi-synthetic penicillins. Among them, amoxicillin has a broad spectrum of activity against a variety of bacteriological infections. Industrially, amoxicillin is produced by chemical processes, which require drastic reaction conditions, several steps of protection and deprotection of reactive groups in order to prevent non-selective hydrolytic reactions, use of organochloride solvents with non-recyclable waste generation, which are toxic and harmful to the environment. The enzymatic synthesis is a more attractive alternative from the environmental point of view and economic. The tendency of the pharmaceutical industry is the development of enzymatic methods to produce these β-lactam semi-synthetic antibiotics, including amoxicillin. Nevertheless, a major obstacle to its industrial implementation is the limited yield, as a consequence of undesirable hydrolytic side-reactions, which lead to the formation of the by-product (p-hydroxyphenylglycine, POHPG) throughout the course of the reaction. This drawback can be partially avoided by reducing the water activity (aw) in the medium. For this purpose, ionic liquids (ILs) have emerged as an alternative to conventional organic media due to their high thermal and chemical stability, non-flammability, easy recycling, and negligible vapor pressure. Within this context, this work researched the development of an integrated green process for the recovery, reuse and recycle of the by-product (POHPG) of the kinetically controlled enzymatic synthesis of amoxicillin, employing PGA immobilized on Sepabeads® in a totally aqueous medium reaction (sodium phosphate buffer 100 mM, pH 6.5), and assessed the catalytic activity of this biocatalyst in the presence of different ILs as cosolvents for these synthetic reactions, in terms of selectivity (synthesis/hydrolysis, S/H ratio) and conversion of the substrate 6-aminopenicillanic acid (6-APA). The recovery of the by-product (POHPG) of the kinetically controlled enzymatic synthesis of amoxicillin in a totally aqueous reaction medium was done efficiently, achieving a final purity of 99% for the POHPG, which was successfully reused for the production of the substrate p-hydroxyphenylglycine ethyl ester (POHPGEE), achieving a conversion of 93%. Then, POHPGEE was recycled to the reactor (without any further purification) for another batch of enzymatic synthesis of amoxicillin, following the characteristic profile that is expected for these synthetic reactions. This integrated green process generated sodium chloride (NaCl) as waste, which is an inert and harmless salt. Moreover, the assessment of the use of ILs as cosolvents for the reactions of kinetically controlled enzymatic synthesis of amoxicillin presented promising results. An increase of 400% in the selectivity was observed for the reactions carried out in the presence of 1-butyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate (BMI.PF6), as cosolvent at a concentration of 75% (VIL/VWATER) in relation to the standard reaction performed in totally aqueous medium. Similarly, this figure reached more than 350% for reactions conducted in 1-butyl-3-methylimidazolium bis(trifluoromethylsulfonyl)imide (BMI.NTf2) at the same volume fraction, while for 1-butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate (BMI.BF4) there was only a slight increase in selectivity (about 57%). The highest conversion of 6-APA was achieved using BMI.NTf2 as cosolvent at a concentration of 71% (VIL/VWATER), representing an increase of more than 36% compared to standard aqueous reaction. No deactivation of the enzyme was observed after the reactions in any of the ILs, and the physical integrity of the biocatalyst particles was entirely maintained. The results of this work collaborated for the advance in the study of the enzymatic synthesis of semi-synthetic penicillins through the use of technologies more green . / Penicilina G acilase (PGA, E.C.3.5.1.11) de Escherichia coli é uma enzima de grande importância industrial, amplamente utilizada para a hidrólise de penicilina G, produzindo o ácido 6-aminopenicilânico (6-APA), que é uma molécula chave para a síntese de penicilinas semi-sintéticas, dentre elas, a amoxicilina, que possui um amplo espectro de ação contra uma variedade de infecções bacteriológicas. Industrialmente, a amoxicilina é produzida por meio de processos químicos, os quais requerem condições drásticas de reação, diversos passos de proteção e desproteção de grupos reativos para impedir reações hidrolíticas não seletivas, utilização de solventes organoclorados com geração de resíduos não recicláveis, que são tóxicos e nocivos ao meio ambiente. A síntese enzimática é uma alternativa mais interessante do ponto de vista ambiental e econômico. A tendência da indústria farmacêutica é o desenvolvimento de métodos enzimáticos para a produção destes antibióticos β-lactâmicos semi-sintéticos, incluindo a amoxicilina. Entretanto, um dos principais impedimentos para a sua implementação industrial é o rendimento limitado, em decorrência de reações laterais de hidrólise indesejáveis, que levam à formação do subproduto (p-hidroxifenilglicina, POHFG) durante todo o andamento da reação. Este inconveniente pode ser parcialmente evitado reduzindo a atividade da água (aw) no meio. Para esta finalidade, os líquidos iônicos (LIs) surgiram como uma alternativa aos meios orgânicos convencionais, devido à sua elevada estabilidade térmica e química, não inflamabilidade, fácil reciclagem e pressão de vapor desprezível. Neste contexto, este trabalho pesquisou o desenvolvimento de um processo integrado verde para a recuperação, reutilização e reciclo do subproduto (POHFG) da síntese enzimática cineticamente controlada de amoxicilina, empregando PGA imobilizada em Sepabeads® em um meio de reação totalmente aquoso (tampão fosfato de sódio 100 mM, pH 6,5), e avaliou a atividade catalítica deste biocatalisador na presença de diferentes LIs como cossolventes para estas reações sintéticas, em termos de seletividade (síntese/hidrólise, relação S/H) e conversão do substrato ácido 6-aminopenicilânico (6-APA). A recuperação do subproduto (POHFG) da síntese enzimática cineticamente controlada de amoxicilina em meio totalmente aquoso foi realizada eficientemente, atingindo uma pureza final de 99% para a POHFG, a qual foi reutilizada com sucesso para a produção do substrato éster etílico da p-hidroxifenilglicina (EEPOHFG), atingindo uma conversão de 93%. Em seguida, o EEPOHFG foi reciclado ao reator (sem qualquer purificação adicional) para outra batelada de síntese enzimática de amoxicilina, seguindo o perfil característico que é esperado para estas reações sintéticas. Este processo integrado verde gerou como resíduo o sal cloreto de sódio (NaCl) que é inerte e inofensivo. Além disso, a avaliação da utilização de LIs como cossolventes para as reações de síntese enzimática cineticamente controlada de amoxicilina apresentou resultados promissores. Um acréscimo de 400% na seletividade foi observado para as reações realizadas na presença de hexafluorfosfato de 1-butil-3-metilimidazólio (BMI.PF6), como cossolvente na concentração de 75% (VLI/VÁGUA) em relação à reação padrão realizada em meio totalmente aquoso. De maneira similar, este número alcançou mais do que 350% para as reações conduzidas em bis(trifluormetilsulfonil)imida de 1-butil-3-metilimidazólio (BMI.NTf2) na mesma fração volumétrica, enquanto que para tetrafluorborato de 1-butil-3-metilimidazólio (BMI.BF4) houve apenas um ligeiro aumento na seletividade (cerca de 57%). A mais elevada conversão de 6-APA foi obtida empregando BMI.NTf2 como cossolvente na concentração de 71% (VLI/VÁGUA), representando um aumento de mais do que 36% em comparação à reação padrão aquosa. Nenhuma desativação da enzima foi observada após as reações em qualquer um dos LIs, e a integridade física das partículas do biocatalisador foi integralmente mantida. Os resultados deste trabalho colaboraram para o avanço no estudo da síntese enzimática de penicilinas semi-sintéticas através do emprego de tecnologias mais verdes .

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:02:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5706.pdf: 7869131 bytes, checksum: 3a35e736b3418ca357ef4fc2e657c0af (MD5) Previous issue date: 2013-10-16 / Universidade Federal de Minas Gerais / Enzymes are potent catalysts, but operationally fragile, expensive and soluble. Industrial applications of enzymes, often, are possible only using immobilized enzyme. Nowadays, various studies have been performed aiming to immobilize enzymes onto magnetic carriers, which allow the selective recovery of the derivative by applying an external magnetic field even in complex reaction media containing other suspended solids. There are many studies using magnetic carriers in enzymes immobilization procedures, however there are no commercially available enzymes immobilized onto magnetic materials. In these studies usually are used carriers with not ideal characteristics for applications in industrial processes. The present study aimed to develop new magnetic carriers and methods for immobilization of enzymes in these carriers, penicillin G acylase (PGA) and cellulases have been used as model enzymes. The thesis was divided into five parts, in the first part (Chapter 1) the state-of-art is presented. The second part (Chapter 2) describes the synthesis of magnetic carriers robust, cheap and with good characteristics for applications in bioprocesses. For this purpose were tested the synthesis of silica magnetic microparticles (SMMps) in water-in-oil micro-emulsion using sodium silicate as silica source and superparamagnetic iron oxide nanoparticles as magnetic core. Materials with good magnetic properties, high surface area and mesoporous structure were obtained. SMMps structure was characterized, it was possible to control the final structure of the material according to the synthesis conditions. In the third part of this study (Chapter 3) was evaluated a new concept in enzymes immobilization using magnetic materials. Magnetic tags were co-aggregated with PGA and cross-linked with glutaraldehyde, producing magnetic cross-linked enzymes aggregates (M-CLEAs). Several reaction conditions were tested producing M-CLEAs with different characteristics and strong response to external magnetic fields. Derivatives with good recovered activity and increased thermal and methanol 50% (v/v) stabilities were obtained. M-CLEAs presented superior performance, in comparison with the free enzyme, in penicillin G hydrolysis experiments, being reused for three reaction cycles without loss of activity. In the fourth part of this study (Chapter 4) the immobilization of the Trichoderma reesei cellulolytic complex onto 17 carriers using 60 different immobilization conditions was evaluated. Covalent methods to cellulases immobilization resulted in total loss of the enzymatic activity. The immobilization by adsorption allowed preserving a portion of the enzymatic activity, however, the enzyme was desorbed from the carrier with the increase in the ionic strength. The best results were achieved for adsorption in MANAE-agarose followed by cross-linking with glutaraldehyde. Hydrolysis experiments using insoluble substrates showed that it is possible to hydrolyze such substrates even using immobilized enzyme onto porous carriers. The derivative was reused for ten reaction cycles (hydrolysis of filter paper) saving more than 90% of its activity. Finally, in Chapter 5, the T. reesei cellulolytic complex was immobilized by adsorption onto SMMp activated with amino groups followed by glutaraldehyde cross-linking achieving good results in terms of recovered activity. / Enzimas são potentes catalisadores, porém frágeis operacionalmente, caras e solúveis. Aplicações industriais desses catalisadores, muitas vezes, são possíveis apenas com o uso de enzima imobilizada. Estudos indicam que o uso de suportes magnéticos para imobilizar enzimas pode permitir a recuperação seletiva do derivado através da aplicação de um campo magnético externo mesmo em meios complexos contendo outros sólidos em suspensão. Apesar de existirem muitos estudos empregando suportes magnéticos para imobilização de enzimas, não existem enzimas imobilizadas em materiais magnéticos disponíveis comercialmente. Nestes estudos geralmente são utilizados suportes magnéticos com características não ideais para aplicações em bioprocessos. O presente estudo teve como principal objetivo o desenvolvimento de novos suportes magnéticos e métodos para imobilização de enzimas nestes suportes, a enzima penicilina G acilase (PGA) e celulases foram utilizadas como modelo. O estudo foi dividido em cinco partes, no Capítulo 1 é apresentada uma introdução indicando o estado da arte. O Capítulo 2 apresenta o preparo de novos suportes magnéticos robustos, baratos e com características ótimas para aplicações em bioprocessos. Nesta etapa foi testada a síntese de micro-partículas magnéticas de sílica (SMMps) em micro-emulsão água-em-óleo, empregando silicato de sódio como fonte de sílica e nanopartículas superparamagnéticas de óxido de ferro como núcleo magnético. Os materiais obtidos apresentaram excelentes propriedades magnéticas, alta área de superfície e estrutura mesoporosa. A partir da caracterização físico-química e morfológica das SMMps foi possível controlar a estrutura final do material de acordo com as condições de síntese. No Capítulo 3 foi avaliado um novo conceito em imobilização de enzimas empregando materiais magnéticos. Neste estudo etiquetas magnéticas foram co-agregadas com PGA e entrecruzadas com glutaraldeído, gerando agregados enzimáticos entrecruzados com propriedades magnéticas (M-CLEAs). Várias condições reacionais foram testadas rendendo M-CLEAs com diferentes características e com resposta robusta a campos magnéticos externos. Derivados imobilizados com boa atividade recuperada e incremento na estabilidade térmica e frente a metanol 50% (v/v) foram obtidos. M-CLEAs apresentaram desempenho superior ao observado para a enzima livre em experimentos de hidrólise de penicilina G, sendo reutilizados por três ciclos reacionais sem perda de atividade. No Capítulo 4 foi avaliada a imobilização do complexo celulolítico de Trichoderma reesei em 17 suportes, empregando 60 diferentes condições de imobilização. Os experimentos de imobilização realizados empregando técnicas de imobilização por união covalente ocasionaram perda total de atividade enquanto métodos de imobilização por adsorção permitiram conservar boa atividade enzimática, porém a enzima dessorveu do suporte com o aumento na força iônica do meio. Os melhores resultados foram alcançados para adsorção em MANAE-agarose seguido de entrecruzamento com glutaraldeído. Experimentos de hidrólise de substratos insolúveis mostraram que é possível hidrolisar este tipo de substrato mesmo com enzima imobilizada em suportes porosos. O derivado foi reutilizado por dez ciclos (hidrólise de papel filtro) conservando mais de 90% de sua atividade. Por fim, no Capítulo 5, o complexo celulolítico de T. reesei foi imobilizado por adsorção em SMMp ativado com grupos amino seguido de entrecruzamento com glutaraldeído apresentando bons resultados em termos de atividade recuperada.