Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2007. / Submitted by Luis Felipe Souza (luis_felas@globo.com) on 2009-01-06T11:50:53Z No. of bitstreams: 1 Tese_2007_GuilhermeBrand.pdf: 2881183 bytes, checksum: 288d28ea9218253f925a58ab10586cf5 (MD5) / Approved for entry into archive by Georgia Fernandes(georgia@bce.unb.br) on 2009-02-27T16:09:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_2007_GuilhermeBrand.pdf: 2881183 bytes, checksum: 288d28ea9218253f925a58ab10586cf5 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-02-27T16:09:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_2007_GuilhermeBrand.pdf: 2881183 bytes, checksum: 288d28ea9218253f925a58ab10586cf5 (MD5) / Os capítulos um e dois tratam da prospecção de peptídeos bioativos da secreção de Phyllomedusa hypochondrialis. Mais especificamente, o primeiro aplica técnicas proteômicas, principalmente espectrometria de massa, para o estudo de peptídeos relacionados à bradicinina (BRPs). Estes estavam presentes tanto na secreção solúvel quanto em fragmentos dissecados de pele do anfíbio. Dezoito BRPs, assim como suas modificações pós-traducionais, foram caracterizados por seqüenciamento MS/MS denovo e experimentos de geração de imagens por MALDI em um fragmento de pele. Essas moléculas tiveram alta similaridade de seqüência com as cininas plasmáticas de alguns mamíferos e répteis. Tamanha diversidade de moléculas dentro da mesma família peptídica e pertencendo a mesma espécie pode estar relacionada à especializações funcionais desses peptídeos a uma variedade de receptores correspondentes em diferentes predadores. Também um novo análogo, [Val]1,[Thr]6-bradicinil-Gln,Ser teve sua atividade biológica detectada em culturas celulares expressando o receptor de bradicinina humana B2 e em preparações de íleo de porquinho-da-índia. O capítulo dois descreve a mesma aproximação metodológica para o estudo de peptídeos antimicrobianos da família das dermaseptinas. As estruturas primárias dessas moléculas, nomeadas de DShypo 01, 02, 03, 04, 06 e 07 foram obtidas por experimentos MS/MS de novo, degradação de Edman e seqüenciamento de cDNA. O quinto peptídeo foi o mesmo DS 01 de Phyllomedusa oreades, previamente descrito pelo nosso grupo. A maioria dos peptídeos purificados do extrato cutâneo total de P. hypochondrialis pôde ser diretamente localizada e mapeada em um fragmento de pele dorsal usando técnicas de obtenção de imagens por espectrometria de massa. Comparações foram feitas entre peptídeos e drogas comerciais com relação à suas atividades antimicrobianas e contra Leishmania amazonensis. Também foram executados estudos comparativos dos efeitos líticos em células do sangue de mamíferos e da interação com vesículas de DMPC por ressonância plasmônica de superfície. Os capítulos três e quatro tratam do estudo da interação de peptídeos membranoativos com membranas modelo, com ênfase em sua categorização em grupos e predição de atividade. Para tal, dezessete peptídeos membrano-ativos foram sintetizados e tiveram suas interações com vesículas unilamelares de DMPC e de DMPC/DMPG (2:1 mol/mol) estudadas por uma série de técnicas biofísicas. Estas técnicas permitiram a dissecção das interações entre peptídeos e membranas em termos de sua interação inicial, grau de inserção em membranas e indução de extravasamento de marcadores fluorescentes. Por esta aproximação, ficou clara a existência de no mínimo cinco sub-grupos funcionais de peptídeos membrano-ativos, sendo três desses grupos compostos por antimicrobianos, um de peptídeos penetradores de células e mais um de peptídeos membrano-ativos capazes unicamente de adsorção em membranas. Também as relações estrutura e função são revistas de acordo com esta nova perspectiva. O capítulo quatro descreve a determinação de parâmetros termodinâmicos para a adsorção do mesmo grupo de dezessete peptídeos em vesículas fosfolipídicas. Para tal, as isotermas de interação obtidas por calorimetria de titulação isotérmica (ITC) foram analisadas pelo método de partição em superfície. Esse método é capaz de extrair das isotermas uma constante de afinidade intrínsica ao peptídeo (Kp), a qual exclui efeitos eletrostáticos, além de uma constante de afinidade aparente (Kapp). Somente quatro dos dezessete peptídeos tiveram isotermas passíveis de ajuste com extração de parâmetros verossímeis. Esses peptídeos tiveram interação primariamente eletrostáticas com membranas, conforme classificado no capítulo três. As causas do não ajuste das isotermas de interação para alguns peptídeos foram discutidas em detalhe e relacionadas ao seu mecanismo de interação específico. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Chapters one and two deal with the isolation and identification of bioactive peptides from the skin secretion of Phyllomedusa hypochondrialis. The first chapter demonstrates the use of protemic techniques, mainly mass spectrometry, for the study of bradykinin related peptides (BRPs) present in the amphibian´s secretion and freshly dissected skin fragments. Eighteen BRPs, along with their post-translational modifications, were characterized in the secretion by de novo MS/MS sequencing and direct MALDI imaging experiments on the frog skin. These molecules revealed strong sequence similarities to the main plasma kinins of mammals and reptiles. Such a diversity of molecules, within the same peptide family, belonging to a single amphibian species may be related to functional specializations of these peptides and a variety of corresponding receptors that might be present in a number of different predators. Also, a novel analog, [Val]1,[Thr]6-bradykinyl-Gln,Ser had its biological activity positively detected in cell culture expressing the human bradykinin B2 receptor and in guinea pig ileum preparations. Chapter two describes the same methodological approach to the study of antimicrobial peptides from the dermaseptin family. The primary structures of these molecules, named DShypo 01, 02, 03, 04, 06, and 07, were determined by de novo MS/MS experiments, Edman degradation, and cDNA sequencing. The fifth peptide was found to be precisely the same DS 01 from Phyllomedusa oreades, previously described by our group. The majority of the peptides purified from the crude skin secretion could be directly localized and mapped onto a freshly dissected dorsal skin fragment using mass spectrometry-imaging techniques. Comparisons between peptides and commercial drugs on their antibacterial and anti-Leishmania amazonensis efficiencies, associated with peptide lytic effects on mammalian blood cells and surface plasmon resonance interaction studies on immobilized DMPC vesicles, were also performed. Chapters three and four describe the study of membrane-active peptides with model membranes, emphasizing their categorization and bioactivity prediction. Seventeen membrane-active peptides were synthesized and had their interaction with DMPC and DMPC/DMPG (2:1 mol/mol) large unilamelar vesicles studied by a series of biophysical techniques. These techniques allowed the dissection of the interaction of peptides with membranes in terms of their initial recognition, degree of insertion in the bilayer and induction of fluorescent dye leakage. This approach made clear the existence of at least five functional groups of membrane-active peptides, three of them composed of antimicrobial molecules, one of cell-penetrating peptides and one of peptides only capable of adsorption. Also, structural and functional relationships relevant to the interaction of peptides and membranes were re-evaluated according to this new perspective. Chapter four deals with the extraction of thermodynamical parameters from the adsorption of the same group of seventeen peptides into phospholipid vesicles. For such, interaction isotherms were obtained by isothermal titration calorimetry (ITC) and analyzed by the surface partition method. This method is capable of estimating an intrinsic affinity constant (Kp), that excludes electrostatic effects, as well as an apparent affinity constant (Kapp). Membrane adsorption of only four out of seventeen peptides resulted in isotherms capable of adjustment to the surface partition model. These peptides had interactions mainly driven by electrostatic effects, as categorized in chapter three. The reasons for the incapacity to fit the isotherms were discussed and related to specific peptide mechanisms.

Os invertebrados impedem o estabelecimento de uma infecção através de uma resposta imune eficiente. Esta resposta envolve reações celulares e humorais. Existem poucos trabalhos sobre a imunidade das aranhas. O principal objetivo deste estudo foi verificar o papel dos hemócitos e dos peptídeos antimicrobianos na resposta imune da aranha Acanthoscurria gomesiana. Inicialmente, a localização relativa da gomesina e da acanthoscurrina foi determinada, mostrando que 58% dos hemócitos armazenam os dois peptídeos antimicrobianos. Além disso, foi verificado que a gomesina é direcionada aos grânulos dos hemócitos da forma de pró-peptídeo. Observou-se ainda, que após um desafio, os hemócitos migram para o sítio de infecção, onde deve secretar componentes da cascata de coagulação e peptídeos antimicrobianos. Além disso, os resultados mostraram que a fagocitose não é o principal mecanismo ativado após uma infecção. Assim sendo, as principais respostas imunes da aranha são através da coagulação e secreção dos peptídeos antimicrobianos. / Invertebrates avoid the infection establishment through an efficient immune response. This response consists in cellular and humoral reactions. Few data are available concerning the spider\'s immunity. The main aim of this study was to determine the role of hemocytes and antimicrobial peptides on the immunity of the spider Acanthoscurria gomesiana. Initially, the localization of gomesin and acanthoscurrin was determined, showing that 58% of hemocytes store both antimicrobial peptides. Moreover, our results show that gomesin is addressed to the hemocyte granules as a pro-peptide. We also demonstrate, by in vivo and in vitro experiments, that hemocytes migrate to the site of microbial infection. Once at the site of infection, hemocytes might secrete components of coagulation cascade and antimicrobial peptides. Besides, our results suggest that phagocytosis is not the major defense mechanism activated after microbial challenge. Therefore the main reactions involved in the spider defense might be through the coagulation and antimicrobial peptides secretion.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-08-23Bitstream added on 2014-06-13T18:49:52Z : No. of bitstreams: 1 melo_dc_me_sjrp.pdf: 881669 bytes, checksum: 1b76ce59e1e8c41bdd0b4d83a5fe4207 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O tetradecapeptídeo Eumenine mastoparano - AF (EMP-AF) extraído do veneno de vespa, em solução aquosa contendo trifluoretanol (TFE) mostra conformação helicoidal anfipática de acordo com os dados de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) e Dicroísmo Circular (CD). A seqüência de aminoácidos tem o N-terminal amidado e três lisinas carregadas (5, 8 e 12). Nesse trabalho, investigamos a estrutura conformacional desse peptídeo em solução aquosa contendo TFE por simulação de dinâmica molecular usando o pacote GROMACS. As simulações foram feitas usando uma caixa cúbica que inclui o TFE (30%) e moléculas de água (70%). O método da troca de réplica foi usado para simular o sistema no intervalo de temperatura (280K - 350K) uniformemente distribuída em 14 processadores. Cada réplica numa dada temperatura T tem uma estrutura aleatória como conformação inicial. Em intervalos fixos de tempo, duas réplicas vizinhas tentam trocar conformações de acordo com a probabilidade de Boltzmann ( - onde = ( )( U), é 1/kBT e U a energia potencial). Apresentamos trajetórias que mostram claramente a formação de uma estrutura helicoidal (resíduos 3 e 12). Juntamente com a estrutura helicoidal, outras conformações tais como estruturas helicoidais parciais e folhas- também exibem estabilidade relativamente alta. A estrutura helicoidal está de acordo com as 20 estruturas disponíveis obtidas por RMN, com valores pequenos de RMSD. Também mostramos que a diversidade de estruturas obtidas por RMN está relacionada com flutuações globais da cadeia, como indicado pela análise de componentes principais. A projeção da trajetória de equilíbrio na primeira componente principal, de uma estrutura helicoidal obtida como conformação inicial, mostrou flutuações que aproximadamente reproduzem a diversidade de estruturas de RMN, que são devidas principalmente à flexibilidade do N- terminal do peptídeo. / Tetradecapeptide eumenine mastoparan-AF (EMP-AF) (14 residues) extracted from wasp venom, in solution with water and trifluoroethanol (TFE) show amphiphatic helical conformation, according with Nuclear Magnetic Resonance (NMR) and Circular Dichroism (CD) data. The amino acid sequence has amidated N-terminus and three charged lysine (5, 8 and 12). In this work, we have investigated structural conformations of this peptide in TFE aqueous solution by molecular dynamics simulations using GROMACS package. The simulations have been done using a cubic box that included TFE (30%) and water molecules (70%). The replica-exchange method was used to simulate the system in the temperature range (280K - 350K) uniformly distributed in 14 processors. Each replica, at a given T has a coil structure as the initial conformation. At fixed time intervals, two neighboring replica try to exchange configurations with Boltzmann probability e-D, where D = (Db)(DU), b is 1/kBT and U is potential energy. We present trajectories, which clearly show the formation of the helix structure of the peptide (residues 3 to 12). Along with the helix structure, other conformations, such as partial helical structure and b-sheet, also show relatively high stability. The helical structure shows good agreement with the twenty available NMR structures, with relatively small values of RMSD. It is also shown that this diversity of the NMR structures is related to global fluctuations of the chain, as indicated by a principal component analysis. The projection of equilibrium trajectory, with the obtained helix as the initial conformation, on the first principal component, showed fluctuations that nearly reproduce the diversity of the NMR structures, which are due, mainly, to the flexibility of the N-terminus of the peptide.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-03-22Bitstream added on 2014-06-13T18:49:56Z : No. of bitstreams: 1 lopesfilho_fc_me_sjrp.pdf: 770782 bytes, checksum: 9373005f0d61b57eee8eaf4f430acc27 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Mastoparanos são peptídeos helicoidais, anfipáticos e catiônicos que apresentam diversas funções biológicas, entre elas temos a ação antimicrobiana, que está relacionada à sua afinidade por membranas aniônicas de bactérias e sua capacidade lítica. Recentes estudos têm mostrado que a formação de poros em membranas é facilitada pela agregação de peptídeos carregados. Esta situação favoreceria a hipótese de que a formação de poro é essencialmente similar a eletroporação molecular. Neste trabalho investigamos a estabilidade de um dímero do Eumenine Mastoparan-AF, um membro catiônico (+4) da família dos mastoparanos, em água e mistura TFE-água, mimetizando meio aquoso e meio membranar, respectivamente. Particular atenção foi colocada nas interações eletrostáticas de grupos carregados e polares, principalmente naqueles que participam de ligações de hidrogênio entre os dois peptídeos e na hidratação da cadeia principal e cadeias laterais apolares. Uma estrutura dimérica representativa foi inicialmente obtida por um método de docking rígido e submetida às simulações de dinâmica molecular usando o pacote GROMACS. Resultados de 50 ns de simulação em água mostram uma perda parcial do conteúdo helicoidal dos peptídeos e a estrutura dimérica se desestrutura devido às interações desfavoráveis dos resíduos hidrofóbicos com a água. Por outro lado, simulações em mistura TFE-água mostram que o dímero é estável durante o tempo observado, porque as moléculas de TFE se agrupam ao redor de resíduos hidrofóbicos criando um meio apropriado que protege as ligações de hidrogênio intra- e inter-peptídeos. Surpreendentemente, parece que a repulsão eletrostática não é a principal razão para a desagregação do dímero, o que reforça a importância da. / Mastoparans are helical, amphipathic and cationic peptides that display many biological functions, among which is the antimicrobial activity, which is related to its affinity for anionic membranes of bacteria and its lytic capacity. Recent studies have shown that pore formation on membranes is facilitated by the aggregation of charged peptides. This situation would favor the hypothesis that pore formation is essentially similar to the molecular electroporation. In this work, we investigate the stability of a dimer of the Eumenine Mastoparan-AF, a cationic (+4) member of the Mastoparan family, in water and TFE-water mixture, mimicking aqueous and membrane environments, respectively. Particular attention have been put on the electrostatic interactions of charged and polar groups, mainly those participating of hydrogen bonds between the two peptides and on the hydration of the backbone and apolar side chains. A representative dimer conformation was initially obtained by a rigid docking procedure and submitted to molecular dynamics simulations using the GROMACS package. Results of 50 ns of simulation in water show a partial loose of the helical content of the peptides and the dimer structure breaks down due to unfavorable interactions of hydrophobic residues with water. On the other hand, simulations in TFE-water mixture show the dimer is stable in the running time, because TFE molecules assemble around hydrophobic residues creating a suitable environment that protect the intra- and inter-peptides hydrogen bonds. Surprisingly, it seems that electrostatic repulsion is not the main reason for disaggregation of the dimer what reinforces both the importance of aggregation and the molecular electroporation mechanism for pore formation.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-05-04Bitstream added on 2014-06-13T19:49:18Z : No. of bitstreams: 1 valder_tr_me_sjrp.pdf: 1809932 bytes, checksum: 8e85d4281d284b8a21374552b1591c82 (MD5) / Moléculas de Dodecil Sulfato de Sódio (SDS) em solução aquosa podem formar aglomerados micelares em condições adequadas de concentrações, pH, temperatura e força iônica, devido às características polar/apolar de suas cabeças/caudas. Essas micelas, aniônicas, mimetizam o ambiente da membrana de células procariontes e são usados como modelo no estudo da interação de peptídeos antimicrobianos com membranas das bactérias. Neste trabalho usamos simulações por dinâmica molecular de equilíbrio para estudar a interação do peptídeo Polybia MP-I com micela de SDS em solução aquosa, considerando tanto a situação em que a micela está pré-formada como a de automontagem da micela na presença do peptídeo. Mostramos que em ambos os casos o peptídeo se insere na micela de forma aproximadamente paralela à membrana, com a cadeia principal enterrada na região de interface entre as caudas e as cabeças polares das moléculas de SDS e os grupos carregados localizados na interface das cabeças polares com a solução. Estes dados confirmam modelos de inserção de peptídeos antimicrobianos em membranas existentes na literatura. Discutimos também a estabilidade da estrutura helicoidal anfipática do peptídeo em função da solvatação de sua cadeia principal, que proporciona a manutenção de uma rede de ligações de hidrogênio do tipo NH --- O entre resíduos do tipo n-(n+4) da cadeia principal, típicos de estruturas em α – hélice. Além disso, os resultados indicam que pontes salinas formadas entre os grupos negativos dos resíduos do ácido aspártico (Asp) 2 e 8 com resíduos de lisinas 5 e 11 são importantes para a manutenção da estrutura do peptídeo. Os resultados indicam também que a estrutura micelar mantém-se aproximadamente esférica com ou sem o peptídeo independente... / The Sodium Dodecyl Sulphate (SDS) molecules can form micellar agregates in aqueous solution under appropriate concentration, pH, temperature and ionic strength conditions due to the polar/apolar features of its head and tail. The anionic micelles formed mimic the environment of the prokaryotic cells membrane of bacteria. In this work we use equilibrium molecular dynamics simulation to study the interaction of the peptide Polybia MP-I with SDS micelles in aqueous solution considering both a preformed micelle and a micelle obtained by self-assembling the SDS molecules in the presence of the peptide. We show that in both cases the peptide inserts in an almost parallel way relative to the micelle surface, with the main chain buried in the interface region between the tails and polar heads of SDS molecules and the charged groups of the peptide located at the interface with the polar heads the solution. These data support models of insertion of antimicrobial peptides in membranes in the literature. We also discuss the stability of the amphipathic helical structure of the peptide as a function of salvation of the main chain, which contributes to the maintenance of the network of hydrogen bonds in the main chain of type NH --- O between residues n and n+4 that are typical of structures in α-helix. Furthermore, the results indicate that salt bridges formed between the negative groups of aspartic acid residues (Asp) 2 and 8 with lysine residues 5 and 11 are importance in maintaining the structure of the peptide. The results also indicate that the micellar structure remains approximately spherical with and without the peptide, independent of the process as it is obtained, whether preformed or self-assembled. The micellar radius increases to accommodate the peptide and in the case of self-assembled micelle... (Complete abstract click electronic access below)

Realizou-se a síntese de nanopartículas de Prata (AgNps) estabilizadas com Citrato de Sódio através de redução química utilizando Borohidreto de Sódio, com posterior avaliação da interação destas com o peptídeo antimicrobiano Dermaseptina 01. Para a caracterização da conjugação dos constituintes, foram empregadas técnicas dentre as quais espectroscopia no ultravioleta-visível (UV-Vis), espalhamento dinâmico de luz (DLS), medidas de potencial Zeta (ζ), espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (FTIRS), espectroscopia de dicroísmo circular (CD), calorimetria de titulação isotérmica (ITC) e espectroscopia de fluorescência. Alterações em intensidade e posição das bandas no espectro de extinção, aumento dos diâmetros hidrodinâmicos das nanopartículas e transição do sinal do potencial Zeta apresentado sugerem uma interação dependente da razão das concentrações das espécies empregadas. Medidas de FTIRS sugerem alterações em bandas relacionadas ao grupo tiol presente no resíduo de Cisteína do C-terminal da DS 01, sugerindo uma interação covalente desta com as nanopartículas. Observou-se por ITC, qualitativamente, uma interação exotérmica de ambas as espécies, enquanto medidas de CD demonstraram alterações características de estrutura secundária da DS 01 quando em contado com superfícies hidrofóbicas. A espectroscopia de fluorescência, empregadas aqui em Nps menores, sugere supressão da fluorescência do Triptofano da DS 01 por formação de complexo, em detrimento de processo colisional. Ensaios antimicrobianos contra cepas de E. coli DH5-α realizados em diluição seriada do complexo sugerem ser este menos efetivo do que as AgNps livres, supomos em virtude da menor quantidade de íons Ag+ liberados. Ensaios de citotoxicidade com fibroblastos de fígado saudável (FCH3) demonstraram indução de apoptose e estado de necrose para o complexo e seus constituintes. / The chemical synthesis of Citrate stabilized Silver nanoparticles (AgNps) using Sodium Borohydride as a reducing agent was performed, with further evaluation of its interaction with the antimicrobial peptide Dermaseptin 01. For such, techniques as UV-Vis spectroscopy, Dynamic Light Scattering (DLS), Zeta Potential measurements (ζ), Fourier transform infrared spectroscopy (FTIRS), Circular Dichroism spectroscopy (CD), Isothermal titration calorimetry (ITC) and Fluorescence Spectroscopy were employed. Changes in intensity and position of the plasmon band, increase in hydrodynamic diameter and Zeta potential signal transitions were observed in a concentration ratio-dependent fashion. FTIRS measurements showed displacement in bands related to the thiol group of the C-terminal Cysteine residue of the peptide, which suggests a covalent interaction between the DS 01 and the AgNps. Exothermic interactions and secondary structure changes commonly observed for the DS 01 in contact with hydrophobic surfaces resulted from ITC and CD analysis, respectively. Quenching of the peptide\'s Tryptophan residue fluorescence, performed with AgNps of smaller size, indicates the formation of a static complex rather than a collision-driven process. AgNps showed to be more effective against E. coli (DH5-α strain) than the complex AgNp-DS 01, probably due to the slower Ag+ release provided by the stabilizing effect of covalent attachment of the peptide. Increase in apoptosis and necrosis were observed as an outcome of exposing healthy liver fibroblast (FCH3) to the complex and, separately, to its constituents.

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-02-14T15:49:46Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese -Richardson Alves de Almeida.pdf: 6059708 bytes, checksum: aa22a530cee33dcce7f300d9cc1d7452 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-02-14T15:50:01Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese -Richardson Alves de Almeida.pdf: 6059708 bytes, checksum: aa22a530cee33dcce7f300d9cc1d7452 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-02-14T15:50:17Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese -Richardson Alves de Almeida.pdf: 6059708 bytes, checksum: aa22a530cee33dcce7f300d9cc1d7452 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-14T15:50:17Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese -Richardson Alves de Almeida.pdf: 6059708 bytes, checksum: aa22a530cee33dcce7f300d9cc1d7452 (MD5) Previous issue date: 2015-12-20 / FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / Peptides identified in frogs exhibit various biological activities the main one being the antimicrobial activity (bacteria and/or pathogenic fungi). Antimicrobial peptides known to AMPs represent a promising source of active compounds to overcome the problem of the increase in resistant strains to antibiotics used. AMPs Identification requires the use of sensitive analytical techniques since the amount of material is limited. In this regard, mass spectrometry (MS) coupled chromatographic techniques play an important role in identification peptides. MS modern techniques such as image by mass spectrometry and molecular biology tools such as deoxyribonucleic acid sequencing are also used in combination to provide quick identification / sequencing novel peptides. In this work the study of skin secretion of two species of frogs, Hypsiboas cinerascens and H. geographicus. At the time of H. geographicus species were identified 4 new peptides, which showed significant identity with biologically active peptides of amphibians, and 3 of them presented with homologous fragments of the protein bombesin. For H. cinerascens species was identified 36 new peptides, which were organized in distinct groups according to the similarity of their sequences, some of which showed significant identity with deposited in the database. These 36 peptides only 3 were had their sequences confirmed by MS and c-DNA and one of them was synthesized having activity against fungi and bacteria. / Peptídeos identificados em anuros exibem diversas atividades biológicas sendo a principal delas a atividade antimicrobiana (bactérias e/ou fungos patogênicos). Peptídeos antimicrobianos conhecidos com PAMs representam uma promissora fonte de compostos ativos para superar o problema do aumento de cepas resistentes aos antibióticos utilizados. A identificação de PAMs requer a utilização de técnicas analíticas sensíveis uma vez que a quantidade de material é limitada. Neste sentido, espectrometria de massa (MS) acoplada a técnicas cromatográficas desempenham um papel importante para identificação de peptídeos. Técnicas modernas de MS tais como imagem por espectrometria de massa e ferramentas de biologia molecular como o sequenciamento do ácido desoxirribonucleico também são utilizados em combinação para proporcionar a rápida identificação/sequenciamento de novos peptídeos. Neste trabalho foi realizado o estudo da secreção cutânea de duas espécies de anuros, Hypsiboas cinerascens e H. geographicus. Até o momento da espécie H. geographicus foi possível identificar 4 novos peptídeos, que apresentaram identidade significativa com peptídeos biologicamente ativos de anfíbios, sendo que 3 deles apresentaram-se com homólogos a fragmentos da proteína bombesina. Em relação a espécie H. cinerascens foi possível identificar 36 novos peptídeos, que foram organizados em grupos distintos de acordo com a similaridade de suas sequências, sendo que alguns apresentaram identidade significativa com os depositados em banco de dados. Desses 36 peptídeos 3 tiveram suas sequências confirmadas por MS e c-DNA, sendo que um deles foi sintetizado tendo atividade contra fungos e bactérias.

Interações de peptídeos antimicrobianos com modelos de membranas biológicas têm sido extensivamente estudadas para entender as funções destes peptídeos e para elucidar seus mecanismos de ação. Muitos esforços têm sido realizados para aumentar a potência e a especificidade desses peptídeos com o propósito de serem mais seletivos aos organismos patogênicos do que às células dos hospedeiros, como também para um melhor entendimento desta classe de processo biológico. Os mecanismos geralmente propostos para a atividade antimicrobiana envolvem a permeabilização das membranas celulares pela formação de poros ou por outras mudanças nas membranas. Um ponto fundamental no entendimento da atividade é que a composição de lipídeos das membranas dos patógenos e dos hospedeiros é diferente, observação que é entendida como a chave principal da seletividade dos peptídeos antimicrobianos. O objetivo do presente trabalho é contribuir para o entendimento da ação de peptídeos antimicrobianos pelo estudo, por simulação molecular, do peptídeo antimicrobiano indolicidina e de alguns de seus mutantes. A indolicidina é um peptídeo constituído por 13 resíduos de aminoácidos que foi isolada dos neutrófilos de bovinos cuja função é ingerir e matar bactérias. Apesar de numerosos estudos experimentais, não se sabe ainda como a indolicidina atua. Este conhecimento é importante tanto no entendimento dos processos de defesa dos organismos multicelulares como no desenvolvimento de novos antibióticos. Estas questões foram abordadas através do estudo do comportamento da indolicidina e de alguns dos seus mutantes em solução aquosa e em interação com modelos de membranas celulares. / Interactions of the antimicrobial peptides with biological membrane models have been broadly studied to understand the function and the action mechanism of this class of peptides. Many efforts have been realized to increase the potency and the specificity of these peptides with the purpose of obtain more selective pathogen antimicrobials with decrease of the toxic effects and for a better explanation of the biological process concerned in the peptide action. The action mechanism approached to antimicrobial peptides concern the cellular membrane permeation by pore formation or other type of membrane disruption. A fundamental point in the knowledge of the activity is the distinct lipid composition of pathogen and host cells that is conceived as the principal key point in the selectivity of the antimicrobial peptides. The aim of the present work is to contribute for the knowledge of the action of the antimicrobial peptide indolicidin and some of its mutants by molecular dynamics simulation. The indolicidin is a short 13 amino acid residues antimicrobial peptide that was isolated from bovine neutrofils that have the function of ingest and kill pathogens. The action mechanism of the indolicidin is not yet known despite of numerous experimental studies realized with this peptide. The interaction of the indolicidin with the membrane models is important both for the knowledge of the defense machinery of the live organisms and for the development of new antimicrobials. These questions were approached by the study of the indolicidin and some of its mutants in solution and in interaction with cell membrane models.

Submitted by Rosangela Silva (rosangela.silva3@unioeste.br) on 2018-05-24T20:32:41Z No. of bitstreams: 2 Charles Seuchuco.pdf: 1461597 bytes, checksum: d1fe07c8c4b16541956c362cc1acb19c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-24T20:32:41Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Charles Seuchuco.pdf: 1461597 bytes, checksum: d1fe07c8c4b16541956c362cc1acb19c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-03-05 / Diatraea saccharalis, known as a sugarcane borer, is a moth of the Lepidoptera order, being one of the main pests on sugarcane, responsible for damage to the sugar and alcohol industries. The fat body is the organ responsible for several functions during the larval phase of insects, mainly in charge of synthesizing molecules with metabolic actions. The success in insects’ adaptation is due to its efficient defense system, in which the fat body is able to synthesize antimicrobial peptides (AMP’s) and secrete them in the hemolymph, where they act as a defense mechanism against pathogens. AMP’s has a cationic character and present the capacity to interact with negative charge molecules of the bacteria, leading to the disintegration of their membranes. Considering the concerns regarding bacterial resistance to antibiotics and antimicrobial properties of AMP’s, such as fast-acting, varied mechanisms of action and wide range against Gram-positive and Gram-negative bacteria; it has become appropriate to carry out studies to use AMP’s as alternative or complementary antibiotic. In D. saccharalis, AMP’s with antimicrobial action have been reported in recently published papers using proteomic methodology. Thereby, this study aimed to perform the differential analysis of the proteins and peptides of the fat body in the 5th instar of larvae challenged with Escherichia coli, Bacillus subtilis and Beauveria bassiana; using the two-dimensional electrophoresis technique (2-DE), with 12.5% SDS-PAGE tricine gels, MALDI-TOF type mass spectrometry and the research in protein databases (Mascot and TagIdent). After analysis, six defense proteins of the innate immune system were found using the TagIdent identification tool: apolipophorin-3, attacin, attacin-F, Peptidoglycan recognition protein (PGRPs), putative defense protein 1 and putative defense protein 3. The AMP attacin presented a positive regulation in relation to the control gel indicating that the B. bassiana septic challenge stimulated the immune system of D. saccharalis. This study provides the first reports of proteins of the immune system produced by the adipose tissue of D. saccharalis. / A Diatraea saccharalis, conhecida como broca-da-cana, é uma mariposa da ordem Lepidoptera, tratando-se de uma das principais pragas da cana-de-açúcar, responsável por prejuízos à indústria de açúcar e de álcool. O corpo gorduroso é o órgão responsável por várias funções durante a fase larval dos insetos, principalmente encarregado de sintetizar moléculas com ações metabólicas. O sucesso na adaptação dos insetos se deve ao seu eficiente sistema de defesa, no qual o tecido gorduroso é capaz de sintetizar peptídeos antimicrobianos (PAM’s) e secretá-los na hemolinfa, onde atuam como mecanismo de defesa contra patógenos. Os PAM’s têm caráter catiônico e apresentam capacidade de interagir com as moléculas de carga negativas das bactérias, levando a desintegração de suas membranas. Considerando as preocupações em relação à resistência bacteriana a antibióticos e às propriedades antimicrobianas dos PAM’s como ação rápida, mecanismos de ação variados e amplo espectro contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, têm se tornado atrativo para a realização de estudos para utilização de PAM’s como antibiótico alternativo ou complementar. Em D. saccharalis já foram relatados PAM’s com ação antimicrobiana em artigos recentemente publicados empregando metodologia proteômica. Desta forma, este trabalho teve como objetivo realizar a análise diferencial das proteínas e peptídeos do corpo gorduroso no 5° instar de larvas controles e desafiadas com Escherichia coli, Bacillus subtilis e Beauveria bassiana, utilizando eletroforese bidimensional (2-DE) com géis tricina SDS-PAGE 12,5%, espectrometria de massas do tipo MALDI-ToF e a pesquisa em bancos de dados de proteínas (Mascot e TagIdent). Após análise, foram encontradas seis proteínas de defesa do sistema imune inato utilizando a ferramenta de identificação TagIdent, sendo elas Apolipophorin-3, Atacina, Atacina-F, Proteína de reconhecimento de peptidoglicano (PGRPs), Provável proteína de defesa 1 e Provável proteína de defesa 3. O PAM Atacina apresentou regulação positiva em relação ao gel controle, indicando que o desafio séptico por B. bassiana estimulou o sistema imune da D. saccharalis. Este trabalho fornece os primeiros relatos de proteínas do sistema imune produzidas pelo corpo gorduroso de D. saccharalis.

A saliva é uma mistura de água, eletrólitos, proteínas e enzimas. A secreção diária normal é de 800-1500ml em adultos. A chamada saliva total, o fluído que realmente está presente na cavidade bucal, é produzida por diferentes glândulas salivares e contém ainda fluído crevicular e elementos transudados do plasma, e derivados da rede capilar da mucosa bucal. É importante entender o papel da saliva na proteção dos tecidos bucais, principalmente porque a co-infecção pode ser um fator importante na ativação e supressão do sistema imune, com papel importante no desenvolvimento e severidade das doenças bucais. Além disso, a cavidade bucal tem um vasto número de microrganismos e antígenos presentes, o que faz com que seja considerada em permanente estado de inflamação, em muitos casos, subclínica. Nosso estudo se propõe a observar a variação da composição salivar frente a presença de alterações locais - gengivites e periodontites. O estudo compara as citocinas salivares TNF-α, IL-1β e IL-6, e os fatores de defesa, beta defensinas 1 e 2, catelicidina e mucina 2, em três diferentes grupos de pacientes: Grupo 1 (controle) - 40 Pacientes, total ou parcialmente dentados, sem inflamação/infecção bucal; Grupo 2 - 40 Pacientes total ou parcialmente dentados, com sinais clínicos de gengivite; e Grupo 3 - 40 Pacientes total ou parcialmente dentados, com sinais clínicos de periodontite. A presença das citocinas e fatores salivares foram avaliadas por testes ELISA. Foram significativas as alterações encontradas entre os grupos para os diferentes fatores: TNF-α, e IL-6, beta defensinas 1 e 2, catelicidina e mucina 2. Apenas IL-1β não teve resultados significantes. Assim, indica-se que os componentes salivares possuem importante papel salivar frente à alterações locais. / Saliva is a mixture of water, electrolytes, proteins and enzymes. The daily secretion ranges between 800-1500mL in adults. The called whole saliva is composed by the production of different salivary glands, gingival crevicular fluid, and contain elements transudate from plasma derived from the capillary bed beneath the oral mucosa. It is important to consider the evident and important role of saliva in defense and protection of oral tissues. The effects of co-infecting pathogens have been postulated as an important factor in the activation and/or suppression of immune system, important in many situations, including the severity and rate of disease progression. The oral cavity is continually confronted with a vast number of pathogens and antigens, so, in some way, may be considered an inflammatory environment, although the level of inflammation may be sub-clinical. This study proposed to observe how the presence of local inflammation - gingivitis or periodontitis, may influence the presence of salivary cytokines or defense factors in saliva. The study compared saliva molecular components in three different groups of patients: Group 1 (as control group) - 40 Patients, total or partially dentate, without oral infectious; Group 2 - 40 Patients total or partially dentate, with clinical signs of gingivitis; Group 3 - 40 patients, total or partially dentate, with clinical signs of periodontitis. It checked the presence of TNF-α, IL-1β and IL-6 cytokines, and defense factors, 1 and 2 beta defensins, cathelicidin and mucin 2. ELISA kits determined the levels of these proteins. Found alterations were significant between groups to TNF-α, IL-6, 1 and 2 beta defensins, cathelicidin and mucin 2. Only IL-1β had not significant results. Therefore, it indicated that salivary components have important hole related to local situations.