Estudos atuais revelam que, mesmo na era da terapia antirretroviral (TARV), a infecção pelo HIV-1 é associada com quadros graves e frequentemente refratários de periodontite crônica (PC), despertando para a possibilidade da existência de outros fatores associados ao desenvolvimento da PC nesses pacientes. Acredita-se que fatores relacionados à população microbiana, incluindo as infecções por Candida spp, e a expressão de peptídeos microbianos possam estar envolvidos na patogênese da PC em pacientes infectados pelo HIV-1. O objetivo desse estudo foi determinar a influência do tratamento periodontal não-cirúrgico, na contagem oral de Candida spp, e nos níveis salivares de lactoferrina (Lf) e histatina, por meio de um estudo quase-experimental. Pacientes infectados (Grupo 1) e não infectados pelo HIV-1 (Grupo 2 - controle), todos com PC, foram submetidos à terapia periodontal não cirúrgica. Os pacientes do grupo 1 apresentaram contagem de linfócitos T CD4+ < 200cel/mm3, e estavam em TARV regular. Foi avaliada a contagem de unidades formadoras de colônias (UFC) de Candida spp por meio de enxaguado bucal e níveis salivares de Lf e histatina antes (Tempo 0-1) e após a terapia periodontal (Tempo 2 e 3; 30 e 90 dias após o tratamento, respectivamente). Pacientes do grupo 1 apresentaram contagem de UFC superiores à verificada nos pacientes do grupo 2 (p=0, 268; ANOVAF). Houve tendência a redução de UFC após o tratamento periodontal em ambos os grupos, mas sem diferenças estatisticamente significantes. Os níveis de Lf foram semelhantes entre os grupos, e reduziram 30 dias após o tratamento periodontal (p=0,0111; Mann Whitney). Os níveis salivares de histatina ao tempo 0 foram mais elevados no grupo 1 quando comparado ao grupo 2 (p= 0,6481; Tukey-kramer), mas tiveram comportamento distinto após o tratamento periodontal: foram mais elevados no grupo 1 e reduziram no grupo 2. Estes resultados sugerem a associação entre a presença de Candida spp e a PC, e também a importância da manutenção da higiene oral na prevenção da candidíase. Além disso, Lf salivar pode ser um marcador da PC, tanto em pacientes não-infectados, quanto infectados pelo HIV. / Current studies reveal that, even in the era of antiretroviral therapy (ART), HIV-1 infection is associated with severe and frequently refractory chronic periodontitis (CP), which leads to the possibility of other factors associated with the development of CP in these patients. It is believed that factors related to the microbial population, including Candida spp infections, and the expression of microbial peptides may be involved in the pathogenesis of CP in patients infected with HIV-1. The aim of this study was to determine the influence of non-surgical periodontal treatment on the oral count of Candida spp and on the salivary levels of lactoferrin (Lf) and histatin, by means of a quasi-experimental study. Patients infected (Group 1) and non-HIV-1 infected (Group 2 - control), all with CP, underwent non-surgical periodontal therapy. Patients in group 1 had a CD4 + T-cell count <200cel / mm³, and were on regular ART. The counts of colony forming units (CFU) of Candida spp were evaluated by oral rinsing and salivary levels of Lf and histatin before (Time 0-1) and after periodontal therapy (Time 2 and 3, 30 and 90 days after the treatment, respectively). Patients in group 1 had a higher CFU count than in patients in group 2 (p = 0.268; ANOVAF). There was a tendency to reduce CFU after periodontal treatment in both groups, but without statistically significant differences. Lf levels were similar between groups, and reduced 30 days after periodontal treatment (p = 0.0111; Mann Whitney). Salivary levels of histatin at time 0 were higher in group 1 when compared to group 2 (p = 0.6481; Tukey-Kramer), but had distinct behavior after periodontal treatment: they were higher in group 1 and reduced in group 2. These results suggest the association between the presence of Candida spp and CP, and also the importance of maintaining oral hygiene in the prevention of candidiasis. In addition, Lf salivary can be a marker of CP in both uninfected and HIV infected patients.

Os insetos desenvolveram um sistema imune eficiente contra parasitas e patógenos, que compreende a resposta celular e a humoral. Os mecanismos celulares envolvem a fagocitose e a encapsulação pelos hemócitos, enquanto que as respostas humorais incluem a ativação da Profenoloxidase, e a síntese pelo corpo gorduroso dos peptídeos antimicrobianos, que são liberados na hemolinfa. Duas vias de sinalização intracelular, Toll e Imd, controlam a expressão dos genes codificadores dos peptídeos antimicrobianos. A análise do Genoma da abelha Apis mellifera permitiu a identificação dos genes dessas vias. No entanto, pouco se conhece do mecanismo de resposta imune nessas abelhas. Desta maneira, nos propusemos analisar a transcrição de genes efetores da resposta imune (abaecina, hymenoptaecina, defensina, transferrina, profenoloxidase), assim como os genes integrantes das vias de sinalização, tais como os genes de reconhecimento de microorganismos (PGRP, GNBP) e ainda, os de sinalização (cactus, relish, dorsal 1-B). Avaliamos também possíveis proteínas implicadas na resposta imune, como as proteínas de estocagem Vitelogenina, Hexamerina 70a, Lipoforina I/II e Lipoforina III. Finalmente, analisamos o efeito da nutrição e do envelhecimento sobre a imunidade em abelhas. Para análise da expressão dos genes das vias de sinalização, as abelhas foram infectadas com bactérias Serratia marcescens ou Micrococcus luteus por injeção ou via alimentação. A infecção com esses microorganismos provocou a transcrição de peptídeos antimicrobianos e de transferrina em altas quantidades após 3 e 12 horas de tratamento, além da alteração na quantidade de transcritos de outros genes. O papel dos genes profenoloxidase e dorsal na imunidade, descritos como codificadores de importantes proteínas em outros insetos, foi avaliado através da metodologia de silenciamento gênico por RNA de interferência. Observamos a diminuição da transcrição do gene alvo, mostrando a eficiência da metodologia. No entanto, a simples injeção de um RNA de fita dupla foi capaz de ativar o sistema imune de abelhas. Este efeito contribuiu para a dificuldade de atribuição do papel da Profenoloxidase na imunidade de abelhas. Contudo, os resultados de silenciamento de dorsal e suas isoformas, nos levaram a considerar que dorsal 1-A ou dorsal 2 participam da via de sinalização intracelular para produção de peptídeos antimicrobianos, principalmente de defensina. Em relação às proteínas de estocagem, tanto a quantidade de transcritos quanto de proteínas diminui após infecção com bactérias, indicando que estas proteínas estão envolvidas de alguma forma no processo de imunidade em abelhas. Além disso, consumo de alimentos ricos em proteína aumentou os níveis de transcritos das proteínas de estocagem, o que muito provavelmente favorece a manutenção da capacidade de resposta imune de abelhas. O efeito do envelhecimento no declínio da imunidade foi analisado em abelhas nutridoras (novas) e forrageiras (velhas) de uma colônia típica. Além disso, foram utilizadas abelhas de uma colônia single-cohort, que eram de uma mesma idade, mas algumas eram nutridoras, enquanto outras eram forrageiras. Todas as abelhas, independentemente da idade ou comportamento, foram capazes de ativar o sistema imune após infecção pela bactéria S. marcescens. No entanto, as abelhas com o comportamento de forrageira, independentemente da idade, sempre foram mais susceptíveis a infecções que as nutridoras. Este fato se deve, muito provavelmente, às diferenças fisiológicas entre essas abelhas, que proporciona às nutridoras maior competência à sobrevivência. / Insects have developed an efficient immune system against parasites and pathogens, which is comprised of both cellular and humoral responses. The cellular mechanisms involve phagocytosis and encapsulation by hemocytes, whereas the humoral responses include activation of prophenoloxidase and synthesis of antimicrobial peptides by the fat body, which are released into the hemolymph. Two signaling pathways, Toll and Imd, control the expression of genes encoding antimicrobial peptides. Genome-wide analyses of the honey bee, Apis mellifera, have identified predicted genes for these signaling pathways. However, immune response mechanisms in honey bees were not yet in depth studied. We analyzed the transcription of effector genes (abaecin, hymenoptaecin, defensin, transferin, prophenoloxidase), as well as other immune genes, such as pathogen recognition genes (PGRP, GNBP) and signaling genes (cactus, relish, dorsal 1- B). We also investigated the role of the storage proteins Vitellogenin, Hexamerin 70a, Lipophorin I/II and Lipophorin III in the honey bee immunity. Finally, we analyzed the effect of nutrition and aging on honey bee immunity. Gene expression of signaling pathway components was assessed in honey bees that had been infected with the bacteria Serratia marcescens or Micrococcus luteus through injection or oral challenge. Honey bees infected with these microorganisms had strong up-regulation of antimicrobial peptide genes and of transferin, and also other changes in transcript abundance after 3 and 12 hours of challenge. The roles of prophenoloxidase and dorsal in the immune response, described as genes encoding important proteins in other insects, were also investigated. In this case we used RNA interference (RNAi) to silence the expression of these genes. RNAi efficiently silenced the target genes. However, injection of doublestranded RNA in honey bees induced a reaction by the immune system. This made it difficult to determine the role of prophenoloxidase in honey bee immunity. Yet, silencing of dorsal and its isoforms led us to consider dorsal 1-A or dorsal 2 as members of the signaling pathways that produce antimicrobial peptides, especially defensin. The abundance of storage proteins transcripts and proteins was lower in infected bees than in controls, giving evidence that these proteins participate in the immune process in honey bees. Moreover, protein consumption caused up-regulation of genes encoding storage proteins, which may favor the maintenace of the immune response capacity. The effect of aging on decline in immunity was analyzed in (young) nurse bees and (old) foragers from normal free-flying colony. We also examined bees from a single-cohort colony, in which all individuals were at the same age; but some were nursing, while others were foraging. All the bees, independent of age or behavior, were able to activate the immune system after infection with S. marcescens. However, foragers, independent of age, were always more susceptible to infections than were nurse bees. This is probably due to physiological differences between bees, which confers to the nurses more competence to survivorship.

Submitted by isabela.moljf@hotmail.com (isabela.moljf@hotmail.com) on 2017-04-27T12:18:28Z No. of bitstreams: 1 osmarnascimentosilva.pdf: 3091891 bytes, checksum: 8e0f2ed0de0225b3ed16c08cdd6fee62 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-05-12T15:47:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 osmarnascimentosilva.pdf: 3091891 bytes, checksum: 8e0f2ed0de0225b3ed16c08cdd6fee62 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-12T15:47:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 osmarnascimentosilva.pdf: 3091891 bytes, checksum: 8e0f2ed0de0225b3ed16c08cdd6fee62 (MD5) Previous issue date: 2010-02-24 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / As infecções relacionadas à assistência à saúde (IrAS), são uma das principais causas de mortalidade e aumento dos custos hospitalares em países desenvolvidos e em desenvolvimento. Nos casos em que um paciente adquire uma IrA e esta não é tratada adequadamente, a mesma pode evoluir para um quadro mais grave, podendo levar a sepse e consequentemente na maioria dos casos a morte. A sepse representa um importante problema de saúde pública, entretanto, um tratamento eficaz para esta síndrome ainda não foi encontrado. Peptídeos antimicrobianos foram relatados para modular a resposta à infecção bacteriana na sepse, independente dos mecanismos de resistência conhecidos para os antibióticos. Desta forma, procurou-se investigar a atividade imunomodulatória de duas formas de clavaninas sobre monócitos RAW 264.7, bem como a atividade antimicrobiana e a citotoxicidade in vitro. Em ensaios in vivo a genotoxicidade, a ação das clavaninas sobre a migração de neutrófilos e a eficácia do tratamento com as clavaninas em um modelo de infecção de ferida operatória por S. aureus e sepse polimicrobiana grave também foram avaliadas. Os estudos in vitro demostraram que as clavaninas inibiram completamente o crescimento de E. coli, K. pneumoniae e S. aureus, preveniram a secreção de citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-12) e NO, e aumentaram a secreção de IL-10. Além disso, as clavaninas não apresentaram atividade citotóxica sobre as células RAW 264.7. Nos experimentos in vivo, as clavaninas não apresentaram genotoxicidade, além de apresentarem-se quimoatraentes para neutrófilos. As clavaninas, também, reduziram significativamente as unidades formadoras de colônias de S. aureus no modelo experimental de ferida operatória, e reduziram a mortalidade dos animais sépticos em mais de 50%, quando comparados com animais controle. Devido à sua ação direta sobre células do sistema imune e microorganismos, as clavaninas aparentam ser compostos potenciais para o tratamento de infecções bacterianas graves como a sepse, demonstrando alto valor biotecnológico. / Healthcare-associated infections (HAIs) are a major cause of mortality, also increasing hospital costs in developed and developing countries. When a patient acquires HAIs and this is not properly handled, disease may clearly worst, leading to sepsis and consequently in major to death. Despite of sepsis represents an important public health problem, any effective treatment for this syndrome was obtained until now. In this view, antimicrobial peptides have been reported as modulators of immune response to bacterial infection in sepsis, with independent activity of mechanisms that lead to antibiotic. Thus, the immunomodulatory activity of two different forms of clavanins over RAW 264.7 monocytes, as well the in vitro antimicrobial and cytotoxic activities were here investigated. Furthermore, in vivo genotoxicity assays, the evaluation of clavanins activity on neutrophil migration and also the efficacy of treatment with clavanins in a wound S. aureus infection model and severe polymicrobial sepsis were also evaluated. Moreover, in vitro studies demonstrated that clavanins are able of inhibit the growth of E. coli, K. pneumoniae and S. aureus. Clavanins also prevented the secretion of proinflammatory cytokines (TNF-α, IL-12) and NO, and increased the IL-10secretion. In addition, clavanins showed none cytotoxicity on RAW 264.7 cells. During in vivo experiments, the clavanins showed no genotoxicity, showing however, a clear chemotactic effect for neutrophils. Clavanins also significantly reduced the colony-forming units of S. aureus in an experimental model of surgical wound infection and reduced the mortality of septic animals in more than 50 %, when compared to control group. Due to their direct activities over immune cells and microorganisms, clavanins are potential compounds for the treatment of serious bacterial infections such as sepsis, showing an enormous and remarkable biotechnological value.

Submitted by Geandra Rodrigues (geandrar@gmail.com) on 2018-05-10T13:03:57Z No. of bitstreams: 1 carolinadossantosfernandesdasilva.pdf: 3138226 bytes, checksum: 48d21f2f7120dba69bf9b23c69d8ed0b (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2018-05-22T15:24:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 carolinadossantosfernandesdasilva.pdf: 3138226 bytes, checksum: 48d21f2f7120dba69bf9b23c69d8ed0b (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-22T15:24:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 carolinadossantosfernandesdasilva.pdf: 3138226 bytes, checksum: 48d21f2f7120dba69bf9b23c69d8ed0b (MD5) Previous issue date: 2016-10-31 / Peptídeos antimicrobianos são um grupo diverso de moléculas bioativas produzidas naturalmente por uma variedade de organismos procariotos e eucariotos, e que tem atividade antimicrobiana. Tendo em vista que o Brasil representa o país de maior incidência de leishmaniose no continente americano e a inexistência de peptídeos bacterianos com atividade neste parasito, o objetivo desde trabalho foi a prospecção de peptídeos produzidos por bactérias com ênfase na atividade anti-Leishmania. Foram utilizadas 466 amostras bacterianas para a obtenção de extratos brutos extracelulares, investigados quanto a atividade antimicrobiana total, utilizando como células-alvo culturas de bactérias (Grampositivas e negativas), leveduras (Candida sp) e Leishmania sp. Esta avaliação da atividade antimicrobiana total permitiu definir as amostras produtoras de substâncias bioativas, bem como a caracterização do espectro de ação da substância antimicrobiana. E somente os extratos que tiveram atividade anti- Leishmania foram submetidos a precipitação protéica para avaliação da produção de peptídeos antimicrobianos. Quanto à caracterização da amostra produtora, foram realizados testes morfo-tintoriais, genéticos e metabólicos para garantia da pureza da cultura e determinação do melhor momento fisiológico de produção da substância antimicrobiana. Em relação ao espectro de ação, 222 extratos tiveram atividade antagônica ao crescimento bacteriano; 05 extratos tiveram atividade antagônica à Candida sp.; e 20 extratos tiveram atividade antagônica ao crescimento de Leishmania sp., totalizando 51 % de amostras positivas para produção de substâncias antimicrobianas. Quanto à atividade anti-Leishmania, os valores médios de inibição de extratos a 20 mg/mL em formas promastigotas do parasito pelo método do MTT foi de 33 % em L. braziliensis e L. chagasi, 30,7 % em L. major e 29 % em L. amazonensis. A redução da viabilidade de formas amastigotas também foi observada para o extrato bruto a 40 mg/mL de Staphylococcus edpidermidis (CGP360), com valor de 60 %. E esse mesmo extrato não apresentou toxicidade para macrófagos peritoneais, resultado importante para novas drogas de uso sistêmico. Quanto à caracterização da amostra produtora, observou-se que a produção da substância antagonista com maior atividade anti- Leishmania ocorreu em extratos advindos de culturas crescidas em meios TSB e BHI e provenientes da fase estacionária de crescimento. Estudos adicionais devem ser realizados para uma melhor compreensão da interação dos extratos bacterianos em espécies de Leishmania, mas os resultados descritos neste trabalho são promissores e inéditos na literatura científica. / Antimicrobial peptides are a diverse group of bioactive molecules naturally produced by a variety of prokaryotic and eukaryotic organisms with antimicrobial activity. Brazil represents the highest incidence country of leishmaniasis in the American continent, so the objective of this work was prospect bacteria peptides with anti-Leishmania activity. A total of 466 bacterial samples were used to produce extracellular crude extracts to evaluate antimicrobial activity against bacterial cells (Gram-positive and negative bacteria), yeast (Candida sp) and Leishmania sp. and characterize antimicrobial spectrum of action. Only Leishmania activity extracts were submitted to protein precipitation and tested to peptides production. The producing sample were characterized by genetic, morphologic and metabolic tests, and the best physiological moment of peptides production was determinate. The results showed that 222 extracts had bacterial activity, 05 extracts had Candida activity, and 20 extracts had Leishmania activity, summarizing 51 % of positive samples to antimicrobial substances production. For promastigote Leishmania activity, 20 mg/ mL extracts showed inhibition values by MTT method of 33 % in L. braziliensis and L. chagasi, 30.7 % in L. major and 29 % in L. amazonensis. The amastigote forms viability was observed for 40 mg/mL crude extract of Staphylococcus edpidermidis (CGP360), with a reduction value of 60 %. And this same extract did not have toxicity to peritoneal macrophages, an important result for new drugs of systemic use. Concerning the characterization of the producing sample, it was observed that the production of the antagonistic substance with the highest anti-Leishmania activity occurred in TSB and BHI media extracts coming from stationary phase. Additional studies should be performed to better understand the interaction of bacterial extracts in Leishmania species, but the results described in this paper are promising and unpublished in the scientific literature.

A imunidade inata que o mosquito apresenta tenta combater os patógenos dentro do organismo do mosquito impedindo que este seja transmitido para outros hospedeiros. A resposta celular apresenta três diferentes processos: fagocitose, encapsulamento e formação nodular, todos estes processos buscam eliminar os patógenos. Peptídeos antimicrobianos fazem parte da resposta humoral do mosquito, sendo codificados por genes e secretados por diversos tipos celulares. Um peptídeo novo pouco conhecido descoberto em Anopheles gambiae, a gambicina, demonstrou bons resultados no combate de parasitas. Na infecção por Plasmodium galleceum, não há diferença significativa na expressão deste peptídeo entre o grupo controle e infectado nos intervalos analisados. Na infecção por vírus dengue, sorotipo 2, a gambicina não apresenta diferença significativa no intervalo de 24 horas após a infecção, quando comparamos grupo controle e infectado, nos intervalos de 7 dias e 14 dias após a infecção, a expressão da gambicina é maior no grupo controle quando comparemos com o grupo infectado. / Innate immunity presents a mosquito tries to combat the pathogens inside the body of the mosquito preventing it from being transmitted to other hosts. The cellular response has three different processes: phagocytosis, encapsulation and nodule formation, all these processes seek to eliminate pathogens. Antimicrobial peptides are part of the humoral response mosquito being encoded by genes and secreted by several cell types. A little known new peptide discovered in Anopheles gambiae, the gambicina showed good results in controlling pests. In Plasmodium infection galleceum, there is no significant difference in the expression of this peptide between the control group and infected in the analyzed intervals. In infection with dengue virus serotype 2, the gambicina no significant difference within 24 hours after infection when comparing the control group and infected at intervals of 7 days and 14 days after infection, the expression is higher in gambicina control group when compare to the infected group.

O desenvolvimento de resistência antimicrobiana e a consequente seleção de microrganismos multirresistentes consolidam-se como grandes ameaças à saúde global. Neste contexto, a busca por novas drogas antimicrobianas/microbicidas é fundamental e compostos como os peptídeos antimicrobianos (AMPs) tornaram-se alvos atraentes. Os AMPs são compostos químicos de massa molar média e grande diversidade estrutural, produzidos por todos os seres vivos e com capacidade de inibir o crescimento de e/ou matar microrganismos. O AMP Cheferina I (Chef I) foi isolado das raízes de Capsella bursa-pastoris e é resultado da proteólise de uma proteína da família das proteínas ricas em glicina, que em plantas estão relacionadas às funções de defesa e cicatrização. O nosso grupo de pesquisa foi pioneiro no desenvolvimento e estudo de análogos truncados amidados deste AMP atípico rico em glicina (67,9%) e histidina (28,6%), que se mostraram ativos frente às diferentes cepas de Candida e a S. cerevisiae pela internalização/ação celular acompanhada de manutenção da integridade da membrana plasmática; o análogo amidado (Chef Ia) e o análogo marcado com 5(6)-carboxifluoresceína/FAM (FAM-Chef Ia) tiveram as suas atividades antifúngicas potencializadas por íons Zn2+. Este trabalho deu continuidade ao estudo do efeito dos íons metálicos divalentes Zn2+, Cu2+, Ca2+ e Mg2+ nas atividades anticandida/fungistática e candidacida/fungicida a diferentes pHs e forças iônicas, estruturas e localizações intracelulares destes análogos. Os resultados na ausência de íons em pH 5,1 revelaram maior atividade do análogo fluorescente em relação à do não fluorescente. Neste mesmo pH, as atividades anticandida e candidacida de Chef Ia foram influenciadas negativamente pelos íons Ca2+ e Mg2+ (2-4 vezes) enquanto que, na presença de íons Zn2+ as atividades anticandida de ambos os análogos foram aumentadas (Chef Ia: 8-64 vezes; FAM-Chef Ia: 4-32 vezes). Os íons Cu2+ aumentaram a atividade anticandida de Chef Ia (2-4 vezes), mas não a do análogo fluorescente, mas as atividades candidacidas de ambos foram melhoradas (Chef Ia: 2-8 vezes; FAM-Chef Ia: 2 vezes). Em pH 5,1, os íons Zn2+ mantiveram a atividade anticandida de Chef Ia em alta força iônica, mas só FAM-Chef Ia exibiu atividade candidacida. Em pH 7,4 ambos análogos foram inativos em baixa e alta forças iônicas na ausência e presença de Zn2+ ou Cu2+. As maiores porcentagens de folhas-&#946;-antiparalelas e dobras foram observadas no espectro de DC de Chef Ia em pH 7,4, sendo que aqueles registrados em pH 5,1 e 7,4 em presença de íons Zn2 e Cu2+ indicaram a formação de quelatos estruturalmente distintos. Ambos os peptídeos são bioquelantes em potencial, sendo as proporções peptídeo: íon obtidas as seguintes: FAM-Chef Ia = 1:2 para Cu2+, 1:10 para Zn2+; Chef Ia = 1:1 para Cu2+. A análise da internalização celular de FAM-Chef Ia permitiu a suposição de dois mecanismos de internalização (translocação direta e endocitose), sendo que nas células vivas a presença de Zn2+ afetou negativamente a translocação direta (p 0,0343) e potencializou a endocitose (p 0,0002). / The development of antimicrobial resistance and the consequent selection of multiresistant microorganisms have become major threats to global health. In this context, the search for new antimicrobial/microbicidal drugs is crucial and the antimicrobial peptides (AMPs) have been seen as attractive targets. AMPs are chemical compounds of medium molecular mass and high structural diversity produced by all living beings, capable of inhibiting the growth of microorganisms and killing them. The AMP Shepherin I (Shep I) was isolated from the roots of Capsella bursa-pastoris, being a bioactive peptide encrypted in a glycine-rich protein from a family that in plants are strictly related to defense and healing functions. Our research group has pioneered the development and study of amidated truncated analogues of this atypical glycine- (67.9%) and histidine-rich (28.6%) AMP, which has shown activity against different strains of Candida and S. cerevisiae through cellular internalization with maintenance of the plasma membrane integrity. The amide analogue (Chef Ia) and its fluorescent analog labeled with 5 (6) - carboxyfluorescein / FAM (FAM-Chef Ia) had their antifungal activities potentiated by Zn2+ ions, so the present work continued examining the effect of the divalent metallic ions Zn2+, Cu2+, Ca2+ and Mg2+ on the anticandidal/fungistatic and candidacidal/fungicide activities at different pHs and ionic forces, structures and intracellular locations of these analogues. The results in the absence of those ions at pH 5.1 revealed that the fluorescently labelled analog was more potent than the nonfluorescent. At the same pH, Shep Ia anticandidal and candidacidal activities were negatively influenced by Ca2+ and Mg2+ ions (2-4 fold), whereas in the presence of Zn2+ ions the anticandidal activities of both analogues were increased (Shep Ia: 8-64 fold, FAM- Shep Ia: 4-32 fold). Cu2+ ions increased Shep Ia anticandidal activity (2-4 fold) but not that of FAM-Shep Ia, nevertheless, the candidacidal activities of both analogues were increased (Shep Ia: 2-8 fold, FAM-Shep Ia: 2 fold). Also at pH 5.1, the Zn2+ ions helped retaining the anticandidal activity of Shep Ia at high ionic strength, although only FAM-Shep Ia exhibited candidacidal activity. At pH 7.4 both analogues were inactive at low and high ionic strengths in the absence or presence of Zn2+ or Cu2+. The highest percentages of antiparallel &#946;-sheet and turns were observed in Shep Ia CD spectrum at pH 7.4, while those recorded at pH 5.1 and 7.4 in the presence of Zn2+ or Cu2+ ions indicated the formation of structurally different chelates. Both peptides are potential biochelates, with the following peptide:ion ratios: FAM-Shep Ia = 1: 2 for Cu2+, 1:10 for Zn2+; Shep Ia = 1: 1 for Cu2+. The analysis of the cellular internalization of FAM-Chef Ia allowed the assumption of two mechanisms of internalization (direct translocation and endocytosis) and in the living cells the presence of Zn2+ negatively affected the direct translocation (p 0.0343) and potentiated endocytosis (p 0.0002).

O carrapato bovino Rhipicephalus (Boophilus) microplus é o principal vetor da riquétsia Anaplasma marginale, o agente etiológico da anaplasmose, uma doença que acomete os rebanhos e causa sérios prejuízos econômicos à pecuária no Brasil. Estabelecemos em nosso laboratório o cultivo da linhagem de células BME26 que são originárias do R. (B.) microplus e também a infecção dessas células por A. marginale, um patógeno que é naturalmente transmitido pelo carrapato. Detectamos que a expressão gênica da defensina e da ixodidina nas células é aumentada frente à infecção por A. marginale, embora nenhuma alteração da expressão gênica da microplusina foi constatada. As células foram expostas a microorganismos inativados por calor e LPS, sendo que a expressão gênica da microplusina é aumentada frente a todos os estímulos. Na exposição das células BME26 com a bactéria Microccocus luteus, a expressão gênica da defensina e da ixodidina não foi alterada e no estimulo com leveduras a expressão gênica da ixodidina foi reprimida. Frente à infecção por A. marginale detectamos, aumento expressão da defensina e ixodidina. Os genes da microplusina e defensina foram silenciadas por RNAi em células infectadas por A. marginale, mas não houve alteração no número de riquétsias / The cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus is the main vector of the rickettsia Anaplasma marginale, the etiological agent of anaplasmosis, a disease that affects cattle and causes serious economic losses to the Brazilian cattle industry. We established in our laboratory the embryonic cell culture line BME26 from R. (B.) microplus and infection by A. marginale, a pathogen naturally transmitted by R. (B.) microplus. We verified that defensin and ixodidin gene expression increased in these cells after an infection by A. marginale and no alteration in microplusin gene expression was detected. The BME26 cells were exposed to heat-inactivated microorganims or to LPS, microplusin gene expression increased after all stimuli. After exposure of BME26 cells to Micrococcus luteus, expression levels of defensin and ixodidin did not change and ixodidin gene expression reduced after exposure of these cells to yeast. In the infection by A. marginale we detected defensin and ixodidin gene expression. Also, microplusin and defensin genes were silenced by RNA interference (RNAi) in A. marginale-infected BME26 cells, but we did not observe alteration in the number of MSP4 rickettsias

O carrapato Rhipicephalus microplus é o vetor da bactéria Anaplasma marginale, agente etiológico da anaplasmose bovina. Este trabalho teve como objetivo a caracterização molecular e funcional das vias de sinalização Toll, Imd, Jnk e Jak/Stat do R. microplus. Através de análises in silico, a maioria dos genes que compõe as vias de sinalização de R. microplus foi identificada. Além disso, verificou-se uma modulação negativa da expressão dos genes dessas vias, nas células BME26, pela infecção por A. marginale. Após o silenciamento dos genes codificadores dos fatores de transcrição das vias de sinalização, através da técnica de RNAi, em carrapatos R. microplus, observou-se que o fator de transcrição Relish (Imd) está envolvido no controle da A. marginale, possivelmente através do peptídeo antimicrobiano microplusina. Com este trabalho, ampliamos o conhecimento sobre o sistema imune de carrapatos para compreender melhor a interface vetor-patógeno. / The cattle tick Rhipicephalus microplus is the vector of the bacteria Anaplasma marginale, the etiological agent of bovine anaplasmosis. This study aimed to evaluate the molecular and functional role of the signaling pathways Toll, Imd, Jnk, and Jak/Stat in R. microplus. An in silico analysis allowed the identification of several genes of these signaling pathways. In addition, there was a negative modulation of expression of genes of these pathways in the tick cell line BME26 upon infection with A. marginale. The silencing of some transcription factor genes via RNA interference in ticks indicated that the transcription factor Relish (from the Imd pathway) was involved in the control of bacterial infection, possibly via regulation of the expression of the antimicrobial peptide microplusin. This study helped elucidate the role of the immune system of ticks in the vector-pathogen interface.

Peptídeos antimicrobianos, também chamados na literatura médica de AMPs (Antimicrobial Peptides), são agrupamentos de 12 a 50 aminoácidos que têm funções antimicrobianas e imunorregulatórias. Os AMPs são produzidos principalmente nos epitélios, destacando-se o epitélio intestinal, onde participam da homeostase da barreira intestinal. A Pancreatite Aguda (PA) é uma doença com altas taxas de mortalidade e morbidade, na qual frequentemente ocorre translocação de bactérias e endotoxinas para o epitélio intestinal e para a corrente sanguínea. A translocação bacteriana ocorre, principalmente, devido à falência da barreira intestinal. Em idosos, a PA tende a ser uma doença mais grave, porém os mecanismos que justificam essa maior gravidade ainda não são bem compreendidos. O objetivo deste trabalho é fazer um estudo da expressão gênica dos peptídeos antimicrobianos alfa-defensina 5 e 7 e da catelicidina CRAMP em ratos jovens e idosos submetidos a um modelo de Pancreatite Aguda. Ratos jovens e idosos foram submetidos à PA utilizando-se Ácido Taurocólico 2,5% e, após doze horas, foram sacrificados. Foi coletado 1cm do íleo terminal para realização de RTPCR para os genes das alfa-defensinas 5 e 7 e da catelicidina CRAMP. Adicionalmente, foram quantificados os níveis de mRNA das citocinas TNF-alfa e IL10. Através da técnica de Milliplex, foram dosadas no soro as citocinas IFN-y, IP-10, IL-10, IL-6, IL-18, TNF-alfa, IL-1beta e Leptina. Como resultado, detectou-se maior expressão gênica das alfa-defensinas 5 e 7 no grupo de animais idosos, na vigência de insulto pancreático, quando comparado a animais jovens na mesma condição. Com relação à CRAMP, não houve diferença significativa entre os grupos. Igualmente, obteve-se expressão significativamente maior de TNF-alfa no íleo terminal dos ratos idosos com Pancreatite Aguda. Interessantemente, as dosagens de citocinas séricas foram semelhantes entre os grupos, demonstrando que a diferença entre a resposta inflamatória de ratos idosos e jovens é localizada. Peptídeos antimicrobianos, portanto, devem apresentar um papel central na resposta inflamatória decorrente de injúria pancreática / Antimicrobial peptides, also called AMPs, are 12-50 amino acids molecules that have antimicrobial and immunoregulatory properties. AMPs are produced mainly in epithelial cells, and participate in the homeostasis of the intestinal barrier. Acute pancreatitis (AP) is a disease with high mortality and morbidity and presents a worst outcome when bacterial translocation occurs to the intestinal epithelium and to the bloodstream. Bacterial translocation occurs mainly due to the failure of the intestinal barrier. In the elderly, AP has a worst prognosis, but the mechanisms that justify that higher severity, compared to the young, are poorly understood. The objective of this work is to study the gene expression levels of antimicrobial peptides ?-defensins 5 and 7 and the cathelicidin CRAMP in young and elderly rats submitted to acute pancreatitis. Young and old rats received a taurocholic acid 2.5% injection in the pancreatic ductus and after twelve hours, were sacrificed. 1cm of the terminal ileum was collected for detection of AMPs gene expression levels. In addition, RT-PCR was performed to detect TNF-alfa and IL-10 mRNA levels. Using Milliplex technique, serum levels of IFN-gamma, IP-10, IL-10, IL-6, IL-18, TNF-alfa, IL-1beta and Leptin were measured. As a result, we detected significant higher mRNA levels of alfa-defensins 5 and 7 in the elderly (pancreatitis group). CRAMP gene expression was not significantly different between groups. TNF-alfa gene expression levels was significantly higher in old rats (pancreatitis group). Any difference in the cytokines serum levels could be detected when old and young rats in the pancreatitis groups were compared. We conclude that AMPs may play a pivotal role in the development of acute pancreatic injury

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-08-18Bitstream added on 2014-06-13T19:19:38Z : No. of bitstreams: 1 cabrera_mps_dr_sjrp.pdf: 1625766 bytes, checksum: 6073fec2bef34125e9db4700102a3680 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Neste trabalho estudamos a conformação em ambientes anisotrópicos e a atividade lítica em vesículas aniônicas e zwitteriônicas de um conjunto de peptídeos biologicamente ativos, extraídos de veneno de vespas solitárias, que se caracterizam por usar seus venenos para paralisar as presas com as quais alimentam suas larvas. Esses peptídeos que são desgranuladores de mastócitos, apresentam atividade antimicrobiana e a maioria deles não é hemolítica. Possuem entre 10 e 15 resíduos, são catiônicos, com alta proporção de resíduos carregados e polares, e são lineares e helicoidais em meios miméticos de membranas. Buscamos correlacionar a atividade lítica em vesículas de diferentes composições, analisada em experimentos de fluorimetria, às mudanças conformacionais, induzidas por diferentes ambientes miméticos, monitoradas por dicroísmo circular, complementando com a análise das características físico-químicas como comprimento da cadeia, amidação do terminal-C, carga líquida, influências no macrodipolo da hélice, hidrofobicidade, momento hidrofóbico e ângulo polar. Observamos que estes peptídeos apresentam intensa atividade em membranas modelo, interagem preferencialmente com bicamadas aniônicas, e sua atividade lítica acontece de modo cooperativo tanto em vesículas aniônicas como nas zwitteriônicas. Com exceção de Anoplin, todos os peptídeos com ação antimicrobiana apresentam curvas de dose-resposta que mostram uma dependência sigmoidal com a concentração do peptídeo. Isso sugere que esses peptídeos se acumulam na superfície da vesícula até atingir uma concentração crítica, além da qual o vazamento aumenta cooperativamente. De uma forma geral os peptídeos mais eficientes como antimicrobianos, são também aqueles caracterizados pela maior eficiência em permeabilizar vesículas aniônicas do tipo PCPG 7030 e por baixas razões limite P/L. / Solitary wasps use their venoms to paralise prays to feed their larvae. A set of biologically active peptides, obtained from these venoms, have been investigated in relation to the conformational changes they undergo in anisotropic environments and their lytic activity on zwitterionic and anionic vesicles. These peptides are mast cell degranulators, present antimicrobial activities and most of them are not hemolytic. They are cationic, their chain length are 10 to 15 residues long, with high hydrophilic / hydrophobic ratio; they are linear and helical in membrane mimetic environments. We searched correlation between the lytic activity in vesicles of different compositions, monitored in fluorimetric experiments, and conformational changes, induced by varied mimetic media, monitored by circular dichroism. The results have been also correlated with peptides' physical-chemical parameters such as chain length, amidated or carboxylated C-terminal, net charge, influences on the helix macrodipole, hydrophobicity, hydrophobic moment and polar angle. We observed that these peptides present intense activity on model membranes, they interact preferentially with anionic bilayers, and their lytic activity is a cooperative process either in anionic or in zwitterionic vesicles. Exception made to Anoplin, all the other peptides that have antimicrobial activity present in their dose-response curves a sigmoidal dependence with the peptide concentration. This fact suggests that these peptides accumulate on the vesicles surface until they reach a threshold concentration, beyond which leakage increases cooperatively. As a general rule, the most efficient antimicrobial peptides are also those characterized by efficient permeabilization of anionic vesicles, namely PCPG 7030 and by small threshold P/L ratios.