A resistência aos antibióticos adquirida por micro-organismos patogênicos é um problema de saúde mundial e, por isso, o desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos vem sendo amplamente estimulado. Sabendo que muitos peptídeos bioativos correspondem a fragmentos peptídicos de proteínas e/ou seus análogos, este trabalho teve o objetivo de desenvolver novos peptídeos antimicrobianos (AMPs) a partir das sequências aminoacídicas e das estruturas 3D de proteínas possivelmente envolvidas na atividade antimicrobiana de venenos de serpentes pouco estudados. As etapas iniciais seguidas foram: a) escolher uma fosfolipase A2 (PLA2) de veneno de serpente peruana do gênero Bothrops da família Viperidae com sequência de aminoácidos conhecida e modelar por homologia a sua estrutura 3D; b) verificar atividade antimicrobiana em venenos de serpentes peruanas dos gêneros Bothrops e Bothriopsis da família Viperidae, selecionar um veneno ativo, fracioná-lo para isolar proteínas provavelmente envolvidas nessa atividade, tripsinizar as proteínas isoladas, sequenciar os fragmentos trípticos para identificá-las, localizar esses fragmentos em sequências aminoacídicas de proteínas com estruturas 3D disponíveis correlatas às proteínas isoladas/identificadas em classe, função e fonte natural. Em seguida, foram escolhidos fragmentos peptídicos da PLA2 (item a) e das proteínas isoladas do veneno ativo (item b) e/ou desenhados análogos que apresentassem características exibidas por AMPs conhecidos. Os peptídeos desenhados foram sintetizados, purificados, caracterizados e testados em suas atividades antimicrobianas. Os modelos estruturais 3D da PLA2 de Bothrops pictus e quatro peptídeos (PLA2-1 a -4) amidados derivados dela foram obtidos, sendo o PLA2-1 ativo frente a Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Candida krusei e Candida parapsilosis (MICs de 6,25-200 µmol.mL-1). Dos três venenos de serpentes peruanas testados, Bothrops taeniatta, Bothrops barnetti e Bothriopsis oligolepis, os dois últimos inibiram o crescimento de S. aureus (MICs 0,78-50 µmol.mL-1), mas apenas B. oligolepis demonstrou espectro de ação amplo. O seu fracionamento sequencial, acompanhado de ensaios de inibição do crescimento de S. aureus, gerou frações ativas relativamente homogêneas que, tripsinizadas e os fragmentos trípticos sequenciados, continham metalo-peptidases do tipo III, serino-peptidase ou lectinas do tipo C. A verificação de atividade enzimática e de coagulação sanguínea nessas frações confirmaram as naturezas das proteínas isoladas. Dos três peptídeos amidados (Bo-Ser1, Bo-Met1 e Bo-Lec1) desenhados a partir de suas estruturas, um deles foi ativo frente às leveduras C. albicans, C. krusei e C. parapsilosis (Bo-Met1; MIC de 6,25 - 200 µmol.mL-1). Pela primeira vez, foi demonstrado que: a) os venenos das serpentes peruanas B. barnetti e B. oligolepis apresentam ação antimicrobiana, sendo o último de espectro amplo; b) que as proteínas acima citadas, que incluem uma serino-peptidase, estão envolvidas com essa propriedade do veneno de B. oligolepis; c) que as sequências aminoacídicas e modelo 3D de uma PLA2 ácida e de proteínas presentes nos venenos das serpentes peruanas B. pictus e Bothriopsis oligolepis podem funcionar como fontes naturais para o desenvolvimento de novos AMPs de ação potente em micro-organismos de interesse clínico e científico. / Resistance to antibiotics obtained by pathogenic microorganisms is a global health problem, so the search for new antimicrobial agents has been encouraged. Knowing that many protein fragments and analogues are bioactive peptides, the aim of this work was to develop new antimicrobial peptides (AMPs) based on the amino acid sequences and 3D structures of proteins apparently involved in the antimicrobial activity of snake venoms very little or not studied so far. The first steps taken were: a) selection of a phospholipase A2 (PLA2) present in the venom from a Peruvian Bothrops sp. belonging to the family Viperidae, whose amino acid sequence was known, to model by homology its 3D structure; b) detection of antimicrobial activity in venoms from other Peruvian Viperidae Bothrops and Bothriopsis snakes, selection of an active venom, fractionation of it for isolation of proteins possibly involved in the antimicrobial activity, trypsinization of the isolated proteins, sequencing of the tryptic fragments for protein identification, location of such fragments in the amino acid sequences and 3D structures of proteins directly related in class, function and natural source to the isolated proteins. Then, peptide fragments from the chosen PLA2 (item a) and from the isolated proteins (item b) that presented structural features found in the known AMPs were selected and/or their analogues were designed. Finally, synthesis, purification and characterization of the peptides with AMP potential, (viii) verification on whether or not they display antimicrobial activity. The 3D-structure models of Bothrops pictus PLA2 and four amidated peptides (PLA2-1 to -4) derived from it were obtained, being PLA2-1 active against Gram negative bacteria Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa as well as the yeasts Candida albicans, Candida krusei and Candida parapsilosis (MICs de 6.25-200 µmol.mL-1). Among the three Peruvian snake venoms tested Bothrops taeniatta, Bothrops barnetti and Bothriopsis oligolepis, the last two inhibited the growth of S. aureus (MICs 0.78-50 µmol.mL-1) and B. oligolepis presented a wide spectrum of bacterial action. Sequential fractionation followed by S. aureus growth inhibition assays of the main fractions led to active relatively homogeneous ones. Their trypsinization and sequencing of the tryptic fragments indicated that they contained metalloproteinases type III, serine-proteinase or lectins type CTL. Enzymatic activity and blood coagulation assays confirmed the nature of the isolated proteins. From the three amidated peptides (Bo-Ser1, Bo-Met1 e Bo-Lec1) derived from them, Bo-Met1 showed to be active against C. albicans, C. krusei e C. parapsilosis (MIC 6,25 - 200 µmol.mL-1). In summary, for the first time, it was demonstrated that: a) the venoms of the Peruvian snakes B. barnetti and B. oligolepis display antimicrobial activity, being the last of wide spectrum of action, b) the proteins isolated from B. oligolepis snake venom, including a serine-peptidase, are involved in the antimicrobial activity of the B. oligolepis snake venom, c) the amino acid sequences and 3D structures of acidic PLA2 and of other proteins found in the venoms of the Peruvian B. pictus e Bothriopsis oligolepis snakes can be used as safe and natural sources for the development of new AMPs potent against microorganisms of clinical and scientific interest.

Diante da busca por abordagens mais sustentáveis para o controle de insetos, os inibidores de peptidases de plantas surgem como uma ferramenta promissora para a proteção de culturas via obtenção de plantas transgênicas. Efeitos nocivos da ingestão de inibidores de peptidases de soja (IPS) sobre o desenvolvimento de Diatraea saccharalis já foram reportados em trabalhos anteriores, entretanto, esses efeitos não foram estudados em nível molecular para essa espécie. Esse trabalho teve como objetivos identificar e analisar a expressão gênica e a atividade de serino peptidases intestinais de D. saccharalis em resposta à ingestão de um concentrado ativo de inibidores de peptidases de soja, relacionando essas informações com a presença ou não de algum mecanismo adaptativo desse inseto em resposta à ingestão desses inibidores. Para isso, foi obtido o transcriptoma intestinal de lagartas de D. saccharalis no quinto ínstar do desenvolvimento, submetidas à ingestão crônica de IPS. Em seguida foram identificadas as sequências correspondentes a serino peptidases do tipo tripsinas e quimotripsinas nesse transcriptoma, as quais foram utilizadas para o estudo da expressão gênica relativa por RT-PCR quantitativo, em resposta à ingestão aguda (por 24 e 48 horas) e crônica e de 0,5% (m/v) de um concentrado ativo de IPS por lagartas de D. saccharalis no terceiro e no quinto ínstares do desenvolvimento larval. As mesmas sequências foram utilizadas para a proposição de filogenias, sendo comparadas inclusive com sequências de serino peptidases de Spodoptera frugiperda identificadas em outro estudo paralelo. Ensaios de atividade tríptica e quimotríptica foram realizados utilizando substratos específicos (BApNA e SApNA) para determinar o efeito da ingestão de IPS sobre a atividade enzimática e finalmente, a integridade e a atividade inibitória do IPS foram analisadas após sua passagem pelo trato digestório das lagartas. Os resultados obtidos permitiram concluir que, nas condições experimentais empregadas nesse estudo, as lagartas de D. saccharalis não foram capazes de modular a expressão gênica das serino peptidases em resposta à ingestão crônica ou aguda de IPS. Os resultados de atividade tríptica e quimotríptica em função da ingestão de IPS podem sugerir um sinergismo na ação dessas enzimas em lagartas do quinto instar. Não foram detectadas diferenças na atividade de tripsinas e quimotripsinas em lagartas do terceiro ínstar em função da ingestão de IPS. A separação eletroforética das proteínas das fezes de lagartas permitiu a visualização de uma banda com massa molecular em torno de 20 kDa possivelmente correspondente ao inibidor do tipo Kunitz presente em soja que, juntamente com os dados de atividade antitríptica das fezes, indicam que D. saccharalis não é capaz de hidrolisar esse inibidor como um mecanismo de adaptação à sua presença na dieta. / Given the importance of search for more sustainable approaches for pest control, plant peptidases inhibitors emerge as a promising tool for the protection of crops by obtaining transgenic plants. Harmful effects of soybean peptidases inhibitors (SPI) intake by Diatraea saccharalis on its development were already reported in previous studies, however, these effects have not been studied at the molecular level for this specie. This study aimed to identify and analyze the gene expression and the gut serine peptidases activity of D. saccharalis in response to the intake of an active extract of soybean peptidases inhibitors. These informations were related to the presence or absence of some adaptive mechanism of this insect in response to these inhibitors. The gut transcriptome of larvae of D. saccharalis in the fifth developmental instar was obtained, undergoing chronic intake of IPS. Then, sequences of serino peptidases like trypsin and chymotrypsin were identified and used for gene expression studies on a real-time PCR in response to acute (for 24 and 48 hours) and chronic intake of 0.5 % (w/v) of SPI active extract by larvae of D. saccharalis in the third and fifth instars of larval development. The same sequences were used to propose phylogenies, including comparisons with sequences of Spodoptera frugiperda serine peptidases identified in another parallel study. Tryptic and chymotryptic activity assays were performed using specific substrates (BApNA and SApNA) to determine the effect of the SPI intake on enzyme activity and finally, the integrity and the inhibitory activity of the SPI were analyzed after passing through the digestive tract of caterpillars. The results showed that under the experimental conditions employed in this study, the larvae of D. saccharalis were not able to modulate the gene expression of serine peptidases in response to acute or chronic SPI intake. The results of tryptic and chymotryptic activity due to the SPI intake can suggest a synergism in the action of these enzymes in larvae of the fifth developmental instar. SPI intake did not cause differences in enzymatic activity of third instar larvae. Electrophoretic separation of proteins from the feces of caterpillars enabled visualization of a band with a molecular mass around 20 kDa possibly corresponding to the Kunitz inhibitor present in soybean. The antitryptic activity of the feces indicates that D. saccharalis is not able to hydrolyze soybean peptidases inhibitor as a mechanism of adaptation to their presence in the diet.

A importância da praga Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) deve-se não somente aos danos provocados às lavouras de milho, mas a capacidade de se alimentar de uma ampla variedade de famílias de plantas. Lagartas desta espécie são capazes de se adaptar a dietas contendo inibidores de peptidase de soja (IPS). Há uma hipótese de que a microbiota intestinal neste inseto poderia estar envolvida com estes mecanismos de adaptação. Neste contexto, um dos objetivos do trabalho foi verificar se estas bactérias poderiam alterar a expressão gênica de serino peptidases e atividade enzimática nestes lepidópteros em ensaios in vitro. Observouse que no tratamento com tetraciclina, não houve influência na alteração da expressão gênica e da atividade quantitativa das respectivas serino peptidases nas lagartas provenientes dos ambientes diferentes. Ao mesmo tempo, objetivou-se estudar se haveria uma contribuição das bactérias na atividade proteolítica intestinal de S. frugiperda ao longo do processo digestivo de insetos, analisando se influenciam no perfil qualitativo das serino peptidases intestinais destas lagartas em zimograma. As lagartas de campo que sofreram a primeira exposição à uma dieta com antibiótico aumentaram a atividade de duas peptidases provavelmente trípticas, também sintetizadas nos tratamentos com IPS e IPS com antibiótico provavelmente como provável resposta adaptativa. Para analisar o efeito do IPS e da tetraciclina em folhas ingeridas por lagartas criadas em laboratório e coletadas em campo, além da influência da dieta natural (cartucho de milho) e da dieta artificial sobre a composição e diversidade da microbiota fecal de S. frugiperda, foi feito o sequenciamento das regiões V3-V4 do gene 16S rRNA de procariotos utilizando a plataforma de alto desempenho Illumina Miseq. Os valores médios de diversidade de UTOs do índice Shannon detectados nas fezes de S. frugiperda foram mais baixos nas amostras de dieta artificial e o segundo índice médio mais baixo foi calculado naquelas provenientes de cartucho de milho no campo, revelando que ambas as amostras apresentaram menor diversidade de espécies na composição da comunidade bacteriana. A abundância relativa em nível de filo bacteriano gerada para todos os conjuntos de amostras fecais demonstrou que os filos mais predominantes foram Proteobacteria (73,3%) e Firmicutes (24,2%), sendo ambos os filotipos mais abundantes nos grupos de insetos. Os quatro filotipos mais abundantes em nível de gênero corresponderam a Enterococcus (23,5%), Acinetobacter (20,5%), Stenotrophomonas (11,4%) e Klebsiella (10,4%). Verificamos que a dieta foi a principal variável que modulou a estrutura das comunidades bacterianas das fezes de S. frugiperda. Entretanto, não é possível afirmar se haveria uma contribuição das peptidases das bactérias simbiontes ao processo digestivo de insetos. Com estes novos dados taxonômicos, poderemos isolar as bactérias a partir das fezes destas lagartas e estudar a significância funcional destes simbiontes tais como, detoxificação de compostos tóxicos como inibidores de peptidases de plantas, papel digestivo e nutricional destas bactérias para as lagartas desta espécie. / The importance of the pest Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) is due not only to corn crops damage, but the ability to attack a wide variety of plant families. Caterpillars of this species are able to circumvent diets containing soybean peptidase inhibitors (SPI). There is a hypothesis that this insect gut microbiota might be involved in these adaptation mechanisms. One of the goals of this study was to determine whether these bacteria could alter the serine peptidase gene expression or enzymatic activity in vitro assays in these Lepidoptera. It was observed that there was no alteration of the gene expression and the quantitative activity of serine peptidases in the caterpillars collected from both different environments fed with tetracycline leaves. At the same time, other objective was to study if there was a contribution from bacteria in the gut proteolytic activity of S. frugiperda in the digestive process of insects, analyzing its influence in the qualitative profile of serine peptidase gut worms in zymogram. The field caterpillars that suffered the first exposure to a diet with antibiotic increased the activity of two probably tryptic type peptidases which were also synthesized in IPS and IPS plus antibiotic treatments, probably as likely adaptive response. In order to analyze the effect of IPS and tetracycline in leaves eaten by caterpillars reared in the laboratory and collected in the field, beyond the influence of the natural diet (maize cartridge) and artificial diet on the composition and diversity of fecal microbiota of S. frugiperda, the sequencing using high performance Miseq Illumina platform was done in V3-V4 regions of 16S rRNA gene typical of prokaryotes. The average values of Shannon index related to OTUs diversity detected in the feces of S. frugiperda were lower in artificial diet samples and second lower mean index was calculated from those collected in the field, showing that both samples showed lower species diversity in the composition of bacterial communities. The relative abundance of bacterial phylum level generated for all fecal samples showed that the most prevalent phyla were Proteobacteria (73.3%) and Firmicutes (24.2%). Both phylotypes are predominant in insect groups. The four most abundant phylotypes at genus level accounted for Enterococcus (23.5%), Acinetobacter (20.5%), Stenotrophomonas (11.4%) and Klebsiella (10.4%). We found that the diet was the main variable that modulated the bacterial communities structure in the feces of S. frugiperda. However, it is not possible to state that there would be a contribution of peptidase bacterial symbionts to the digestive process of insects. With these new taxonomic data, we may isolate bacteria from S. frugiperda feces and study the functional significance of these symbionts such as detoxification of toxic plant compounds as inhibitors of peptidases, the digestive and nutrition role of these bacteria for the caterpillars species.

Introdução/Objetivo: Este estudo teve como objetivo testar a hipótese de que a atividade e/ou expressão da dipeptidil peptidase IV (DPPIV), uma enzima que inativa peptídeos com ações cardioreno protetoras, como o peptídeo-1 semelhante ao glucagon (GLP-1) e o peptídeo natriurético cerebral (BNP), estaria associada a um pior prognóstico na insuficiência cardíaca (HF). Métodos: Injúria do miocárdio foi realizada através da ablação do ventrículo esquerdo (VE) por radiofrequência em ratos Wistar machos (200-250 g). Os ratos foram divididos em três grupos: Sham, HF e HF + inibidor de DPPIV (sitagliptina 200mg/kg/b.i.d). Seis semanas após a cirurgia, os animais foram alojados individualmente em gaiolas metabólicas durante 3 dias para avaliação da função renal. Atividade e expressão da DPPIV no plasma e coração foram medidas por espectrofotometria e por immunoblotting, respectivamente. Para a avaliação da função cardíaca um cateter de pressão-volume foi posicionado dentro da cavidade do VE. A análise histológica foi realizada para os parâmetros morfométricos. A atividade da DPPIV no plasma também foi medida em pacientes com HF (n = 190). Resultados: A atividade DPPIV e sua abundância estavam aumentadas em animais com HF em comparação com Sham. Além disso, a atividade de DPPIV no plasma se correlacionou positivamente com o volume diastólico final (R = 0,517; p < 0,001) e o peso do pulmão/peso corporal (R = 0,492; p < 0,01). Uma correlação negativa entre a atividade DPPIV plasmática e a fração de ejeção também foi observada (R = 0,602; p < 0,001). Curiosamente, os animais HF também exibiram um aumento da expressão/atividade de DPPIV no tecido cardíaco, especialmente em células endoteliais. Seis semanas de tratamento com o inibidor de DPPIV sitagliptina atenuou a disfunção cardíaca, fibrose intersticial, congestão pulmonar e infiltração de macrófagos. O tratamento com sitagliptina também elevou os níveis plasmáticos de GLP-1 ativo, e aumentou a ativação de vias de sinalização cardioprotetoras como PKA e Akt; e reduziu os níveis de apoptose e marcadores pró-inflamatórios em comparação com ratos não tratados. Ratos com HF apresentaram maiores níveis circulantes de BNP, contudo a atividade da PKG renal foi mais baixa nesses animais em comparação com o grupo tratado com sitagliptina, sugerindo uma diminuição da razão BNP ativo/total. A função renal não diferiu entre os grupos, mas o ritmo de filtração glomerular estava ligeiramente aumentado no grupo tratado em comparação com os animais HF. Pacientes com HF apresentaram uma maior atividade plasmática da DPPIV e correlações foram encontradas com a com a fração de ejeção (R = -0,20; p = 0,009) e a quimiocina Ccl2 (R² =0,30; p < 0.01). Conclusões: Em conjunto, nossos resultados demonstram que a atividade plasmática da DPPIV se correlaciona com um pior prognóstico em pacientes e animais com HF e que a DPPIV possui um papel importante na fisiopatologia desta doença / Aim: The present study aimed to test the hypothesis that the activity and/or expression of dipeptidyl peptidase IV (DPPIV), an enzyme that inactivates cardiorenal protective peptides including glucagon-like peptide-1 (GLP-1) and brain natriuretic peptide (BNP), would be associated with poorer outcomes in heart failure (HF). Methods: Experimental HF was induced in male Wistar rats (200-250 g) by left ventricular (LV) myocardial injury after radiofrequency catheter ablation. Rats were divided in three groups: Sham, HF and HF+DPPIV inhibitor (sitagliptin 200mg/kg/b.i.d). Six weeks after surgery, animals were individually housed in metabolic cages during 3 days for assessment of renal function. Plasma and heart DPPIV activity/expression were measured spectrophotometrically and by immunoblotting respectively. For evaluation of cardiac function a pressure-volume catheter was positioned into the LV cavity. Histological analysis was performed for morphometric parameters. Plasma DPPIV activity was also measured in patients (n = 190) with heart failure. Results: Plasma DPPIV activity and abundance were increased in animals with HF compared to Sham. Additionally, plasma DPPIV activity positively correlated with ventricular end diastolic volume (R² =0.517; p < 0.001) and lung/body weight (R² =0.492; p < 0.01). A negative correlation between plasma DPPIV activity and ejection fraction was also observed (R² =0.602; p < 0.001). Interestingly, HF animals also exhibited an increase of expression and activity of DPPIV in heart tissue, especially in endothelial cells. Six-week treatment with the DPPIV inhibitor sitagliptin attenuated cardiac dysfunction, mitigated cardiac hypertrophy, interstitial fibrosis, lung congestion and macrophage infiltration. Sitagliptin also raised the plasma levels of active GLP-1, increased activation of cardioprotective signaling pathways including PKA, and Akt; and reduced the levels of apoptosis and pro-inflammatory biomarkers compared to non-treated HF rats. Despite the higher circulating total BNP, renal PKG activity was lower in HF rats compared with sham and sitagliptin-treated rats, suggesting a decrease in active/total BNP ratio. Renal function did not differ between groups, but glomerular filtration rate was modestly, but significantly increased by Sitagliptin compared to HF. Plasma DPPIV activity in patients was also increased compared to healthy subjects and correlations was found with ejection fraction (R² =-0.20; p=0.009) and the chemokine Ccl2 (R² =0.30; p < 0.01). Conclusions: Taken together, our results demonstrate that circulating DPPIV activity correlates with poorer cardiovascular outcomes in human and experimental HF and might play an important role in the pathophysiology of HF.

O pré-condicionamento isquêmico (PCI) é um importante mecanismo de proteção celular, capaz de favorecer a diminuição da necrose dos cardiomiócitos durante isquemia aguda. Fármacos hipoglicemiantes orais, tais como glibenclamida e repaglinida, podem provocar a perda dessa proteção por sua propriedade bloqueadora de canais de potássio dependentes de adenosina trifosfato (K-ATP). Já a vildagliptina, pertencente à classe dos inibidores da enzima dipeptidil peptidase 4 (DPP-4), exerce seus efeitos sobre a glicemia principalmente via hormônio peptídeo-1 tipo glucagon (GLP-1). Receptores de GLP-1 estão presentes no miocárdio e seu papel nesse tecido é alvo de investigadores. Este estudo avaliou o efeito da vildagliptina sobre o pré-condicionamento isquêmico em portadores de diabetes mellitus 2 (DM2) e doença coronariana multiarterial estável (DAC). Foram admitidos 54 pacientes diabéticos com doença multiarterial coronariana estável, documentada pela angiografia e com teste ergométrico positivo para isquemia. Na fase 1, betabloqueadores e fármacos hipoglicemiantes orais foram suspensos por 7 dias, e todos paciente foram submetidos a 2 testes ergométricos (TE) seguenciais, com intervalo de descanso de 30 minutos entre eles (TE1 e TE2). Para a fase 2, os pacientes receberam vildagliptina 100mg/dia por 7 dias consecutivos e foram submetidos a mais 2 TE seguenciais (TE3 e TE4). Na fase 1, todos os pacientes desenvolveram isquemia esforço induzida (depressão de ST>=1 mm) no TE1. O tempo para alcançar 1,0mm de depressão do segmento ST (T-1,0mm) em TE2 foi maior que em TE1, caracterizando a presença do PCI em todos os pacientes. Na fase 2, todos desenvolveram isquemia em TE3, e 76% apresentaram isquemia mais tardia em TE4, isto é, aumentaram a tolerância miocárdica em TE4 em comparação a TE3, caracterizando PCI preservado (p<0,001). Somente 24% dos pacientes revelaram bloqueio do PCI (p=0,006). A vildagliptina preservou o pré-condicionamento isquêmico em pacientes com DM2 e DAC. / Ischemic preconditioning (IPC) refers to the phenomenon in which short periods of myocardial ischemia and reperfusion promote resistance to a subsequent prolonged ischemic insult. Some hypoglycemic drugs, such as glibenclamide and repaglinide, are able to inhibit this protective phenomenon probably by its effects as blockers of adenosine triphosphate-dependent potassium (K-ATP) channels. Moreover, vildagliptin, belonging to the class of dipeptidyl peptidase-4 enzyme (DPP-4) inhibitor, performs its action by incretin system, mainly by hormone glucagon-like peptide 1 (GLP-1). GLP-1 receptors are present in various body tissues, including myocardium. Multiple actions of GLP-1 and structurally related GLP-1 agonists have been reported in heart. We aimed to evaluate the effect of vildagliptin on IPC in patients with type 2 diabetes and symptomatic coronary artery disease. We evaluated 54 patients with DM2 and a positive exercise test that also had with multivessel coronary disease confirmed by coronary angiography. In phase I, without drug, all patients underwent 2 consecutive treadmill exercise tests (ET1 and ET2). After that, all patients received vildagliptin 100 mg per day for one week and underwent more 2 more sequential tests (ET3 and ET4). The time interval between the exercises tests was 30 minutes. In phase 1, all patients demonstrated IPC that was observed by the improvement in time to 1mm of ST segment depression (T-1.0mm) in ET2 compared with T1 In phase 2, with vildagliptin, all patients (54) developed ischemia in ET3, however, 76 % (41) of patients showed experienced later ischemia in ET4 compared with ET3 (p<0.001), characterizing IPC preserved. Only 24% (13) patients demonstrated T-1.0mm earlier in ET4 compared with ET3, indicating the cessation of IPC (p=0.006). Vildagliptin did not affect this protective mechanism in a relevant way in patients with type 2 diabetes and symptomatic coronary artery disease.

A resistência aos antibióticos adquirida por micro-organismos patogênicos é um problema de saúde mundial e, por isso, o desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos vem sendo amplamente estimulado. Sabendo que muitos peptídeos bioativos correspondem a fragmentos peptídicos de proteínas e/ou seus análogos, este trabalho teve o objetivo de desenvolver novos peptídeos antimicrobianos (AMPs) a partir das sequências aminoacídicas e das estruturas 3D de proteínas possivelmente envolvidas na atividade antimicrobiana de venenos de serpentes pouco estudados. As etapas iniciais seguidas foram: a) escolher uma fosfolipase A2 (PLA2) de veneno de serpente peruana do gênero Bothrops da família Viperidae com sequência de aminoácidos conhecida e modelar por homologia a sua estrutura 3D; b) verificar atividade antimicrobiana em venenos de serpentes peruanas dos gêneros Bothrops e Bothriopsis da família Viperidae, selecionar um veneno ativo, fracioná-lo para isolar proteínas provavelmente envolvidas nessa atividade, tripsinizar as proteínas isoladas, sequenciar os fragmentos trípticos para identificá-las, localizar esses fragmentos em sequências aminoacídicas de proteínas com estruturas 3D disponíveis correlatas às proteínas isoladas/identificadas em classe, função e fonte natural. Em seguida, foram escolhidos fragmentos peptídicos da PLA2 (item a) e das proteínas isoladas do veneno ativo (item b) e/ou desenhados análogos que apresentassem características exibidas por AMPs conhecidos. Os peptídeos desenhados foram sintetizados, purificados, caracterizados e testados em suas atividades antimicrobianas. Os modelos estruturais 3D da PLA2 de Bothrops pictus e quatro peptídeos (PLA2-1 a -4) amidados derivados dela foram obtidos, sendo o PLA2-1 ativo frente a Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Candida krusei e Candida parapsilosis (MICs de 6,25-200 &#181;mol.mL-1). Dos três venenos de serpentes peruanas testados, Bothrops taeniatta, Bothrops barnetti e Bothriopsis oligolepis, os dois últimos inibiram o crescimento de S. aureus (MICs 0,78-50 &#181;mol.mL-1), mas apenas B. oligolepis demonstrou espectro de ação amplo. O seu fracionamento sequencial, acompanhado de ensaios de inibição do crescimento de S. aureus, gerou frações ativas relativamente homogêneas que, tripsinizadas e os fragmentos trípticos sequenciados, continham metalo-peptidases do tipo III, serino-peptidase ou lectinas do tipo C. A verificação de atividade enzimática e de coagulação sanguínea nessas frações confirmaram as naturezas das proteínas isoladas. Dos três peptídeos amidados (Bo-Ser1, Bo-Met1 e Bo-Lec1) desenhados a partir de suas estruturas, um deles foi ativo frente às leveduras C. albicans, C. krusei e C. parapsilosis (Bo-Met1; MIC de 6,25 - 200 &#181;mol.mL-1). Pela primeira vez, foi demonstrado que: a) os venenos das serpentes peruanas B. barnetti e B. oligolepis apresentam ação antimicrobiana, sendo o último de espectro amplo; b) que as proteínas acima citadas, que incluem uma serino-peptidase, estão envolvidas com essa propriedade do veneno de B. oligolepis; c) que as sequências aminoacídicas e modelo 3D de uma PLA2 ácida e de proteínas presentes nos venenos das serpentes peruanas B. pictus e Bothriopsis oligolepis podem funcionar como fontes naturais para o desenvolvimento de novos AMPs de ação potente em micro-organismos de interesse clínico e científico. / Resistance to antibiotics obtained by pathogenic microorganisms is a global health problem, so the search for new antimicrobial agents has been encouraged. Knowing that many protein fragments and analogues are bioactive peptides, the aim of this work was to develop new antimicrobial peptides (AMPs) based on the amino acid sequences and 3D structures of proteins apparently involved in the antimicrobial activity of snake venoms very little or not studied so far. The first steps taken were: a) selection of a phospholipase A2 (PLA2) present in the venom from a Peruvian Bothrops sp. belonging to the family Viperidae, whose amino acid sequence was known, to model by homology its 3D structure; b) detection of antimicrobial activity in venoms from other Peruvian Viperidae Bothrops and Bothriopsis snakes, selection of an active venom, fractionation of it for isolation of proteins possibly involved in the antimicrobial activity, trypsinization of the isolated proteins, sequencing of the tryptic fragments for protein identification, location of such fragments in the amino acid sequences and 3D structures of proteins directly related in class, function and natural source to the isolated proteins. Then, peptide fragments from the chosen PLA2 (item a) and from the isolated proteins (item b) that presented structural features found in the known AMPs were selected and/or their analogues were designed. Finally, synthesis, purification and characterization of the peptides with AMP potential, (viii) verification on whether or not they display antimicrobial activity. The 3D-structure models of Bothrops pictus PLA2 and four amidated peptides (PLA2-1 to -4) derived from it were obtained, being PLA2-1 active against Gram negative bacteria Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa as well as the yeasts Candida albicans, Candida krusei and Candida parapsilosis (MICs de 6.25-200 &#181;mol.mL-1). Among the three Peruvian snake venoms tested Bothrops taeniatta, Bothrops barnetti and Bothriopsis oligolepis, the last two inhibited the growth of S. aureus (MICs 0.78-50 &#181;mol.mL-1) and B. oligolepis presented a wide spectrum of bacterial action. Sequential fractionation followed by S. aureus growth inhibition assays of the main fractions led to active relatively homogeneous ones. Their trypsinization and sequencing of the tryptic fragments indicated that they contained metalloproteinases type III, serine-proteinase or lectins type CTL. Enzymatic activity and blood coagulation assays confirmed the nature of the isolated proteins. From the three amidated peptides (Bo-Ser1, Bo-Met1 e Bo-Lec1) derived from them, Bo-Met1 showed to be active against C. albicans, C. krusei e C. parapsilosis (MIC 6,25 - 200 &#181;mol.mL-1). In summary, for the first time, it was demonstrated that: a) the venoms of the Peruvian snakes B. barnetti and B. oligolepis display antimicrobial activity, being the last of wide spectrum of action, b) the proteins isolated from B. oligolepis snake venom, including a serine-peptidase, are involved in the antimicrobial activity of the B. oligolepis snake venom, c) the amino acid sequences and 3D structures of acidic PLA2 and of other proteins found in the venoms of the Peruvian B. pictus e Bothriopsis oligolepis snakes can be used as safe and natural sources for the development of new AMPs potent against microorganisms of clinical and scientific interest.

A importância da praga Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) deve-se não somente aos danos provocados às lavouras de milho, mas a capacidade de se alimentar de uma ampla variedade de famílias de plantas. Lagartas desta espécie são capazes de se adaptar a dietas contendo inibidores de peptidase de soja (IPS). Há uma hipótese de que a microbiota intestinal neste inseto poderia estar envolvida com estes mecanismos de adaptação. Neste contexto, um dos objetivos do trabalho foi verificar se estas bactérias poderiam alterar a expressão gênica de serino peptidases e atividade enzimática nestes lepidópteros em ensaios in vitro. Observouse que no tratamento com tetraciclina, não houve influência na alteração da expressão gênica e da atividade quantitativa das respectivas serino peptidases nas lagartas provenientes dos ambientes diferentes. Ao mesmo tempo, objetivou-se estudar se haveria uma contribuição das bactérias na atividade proteolítica intestinal de S. frugiperda ao longo do processo digestivo de insetos, analisando se influenciam no perfil qualitativo das serino peptidases intestinais destas lagartas em zimograma. As lagartas de campo que sofreram a primeira exposição à uma dieta com antibiótico aumentaram a atividade de duas peptidases provavelmente trípticas, também sintetizadas nos tratamentos com IPS e IPS com antibiótico provavelmente como provável resposta adaptativa. Para analisar o efeito do IPS e da tetraciclina em folhas ingeridas por lagartas criadas em laboratório e coletadas em campo, além da influência da dieta natural (cartucho de milho) e da dieta artificial sobre a composição e diversidade da microbiota fecal de S. frugiperda, foi feito o sequenciamento das regiões V3-V4 do gene 16S rRNA de procariotos utilizando a plataforma de alto desempenho Illumina Miseq. Os valores médios de diversidade de UTOs do índice Shannon detectados nas fezes de S. frugiperda foram mais baixos nas amostras de dieta artificial e o segundo índice médio mais baixo foi calculado naquelas provenientes de cartucho de milho no campo, revelando que ambas as amostras apresentaram menor diversidade de espécies na composição da comunidade bacteriana. A abundância relativa em nível de filo bacteriano gerada para todos os conjuntos de amostras fecais demonstrou que os filos mais predominantes foram Proteobacteria (73,3%) e Firmicutes (24,2%), sendo ambos os filotipos mais abundantes nos grupos de insetos. Os quatro filotipos mais abundantes em nível de gênero corresponderam a Enterococcus (23,5%), Acinetobacter (20,5%), Stenotrophomonas (11,4%) e Klebsiella (10,4%). Verificamos que a dieta foi a principal variável que modulou a estrutura das comunidades bacterianas das fezes de S. frugiperda. Entretanto, não é possível afirmar se haveria uma contribuição das peptidases das bactérias simbiontes ao processo digestivo de insetos. Com estes novos dados taxonômicos, poderemos isolar as bactérias a partir das fezes destas lagartas e estudar a significância funcional destes simbiontes tais como, detoxificação de compostos tóxicos como inibidores de peptidases de plantas, papel digestivo e nutricional destas bactérias para as lagartas desta espécie. / The importance of the pest Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) is due not only to corn crops damage, but the ability to attack a wide variety of plant families. Caterpillars of this species are able to circumvent diets containing soybean peptidase inhibitors (SPI). There is a hypothesis that this insect gut microbiota might be involved in these adaptation mechanisms. One of the goals of this study was to determine whether these bacteria could alter the serine peptidase gene expression or enzymatic activity in vitro assays in these Lepidoptera. It was observed that there was no alteration of the gene expression and the quantitative activity of serine peptidases in the caterpillars collected from both different environments fed with tetracycline leaves. At the same time, other objective was to study if there was a contribution from bacteria in the gut proteolytic activity of S. frugiperda in the digestive process of insects, analyzing its influence in the qualitative profile of serine peptidase gut worms in zymogram. The field caterpillars that suffered the first exposure to a diet with antibiotic increased the activity of two probably tryptic type peptidases which were also synthesized in IPS and IPS plus antibiotic treatments, probably as likely adaptive response. In order to analyze the effect of IPS and tetracycline in leaves eaten by caterpillars reared in the laboratory and collected in the field, beyond the influence of the natural diet (maize cartridge) and artificial diet on the composition and diversity of fecal microbiota of S. frugiperda, the sequencing using high performance Miseq Illumina platform was done in V3-V4 regions of 16S rRNA gene typical of prokaryotes. The average values of Shannon index related to OTUs diversity detected in the feces of S. frugiperda were lower in artificial diet samples and second lower mean index was calculated from those collected in the field, showing that both samples showed lower species diversity in the composition of bacterial communities. The relative abundance of bacterial phylum level generated for all fecal samples showed that the most prevalent phyla were Proteobacteria (73.3%) and Firmicutes (24.2%). Both phylotypes are predominant in insect groups. The four most abundant phylotypes at genus level accounted for Enterococcus (23.5%), Acinetobacter (20.5%), Stenotrophomonas (11.4%) and Klebsiella (10.4%). We found that the diet was the main variable that modulated the bacterial communities structure in the feces of S. frugiperda. However, it is not possible to state that there would be a contribution of peptidase bacterial symbionts to the digestive process of insects. With these new taxonomic data, we may isolate bacteria from S. frugiperda feces and study the functional significance of these symbionts such as detoxification of toxic plant compounds as inhibitors of peptidases, the digestive and nutrition role of these bacteria for the caterpillars species.

Digestion of proteins in the midgut of lepidopteran larvae relies on different types of peptidases, among the trypsins and chymotrypsins. In this work four chymotrypsinlike peptidases (MsCTLP1–4) were identified from the larval midgut of M. sexta, which are distantly related to another chymotrypsin (MsCT), a previously described peptidase present in the larval midgut of M. sexta. MsCTLP1–4 fit perfectly into a novel subgroup of insect CTLPs by sequence similarity and by the replacement of GP by SA in the highly conserved GDSGGP motif. Examination of MsCTLP expression in different tissues showed that most of the peptidases were predominantly expressed in the anterior and median midgut, while some were found in the Malpighian tubules. Expression analysis of MsCTLPs at different physiological states revealed that the mRNA amounts did not differ considerably in feeding and starving larvae except for MsCTLP2, whose mRNA dropped significantly upon starvation. During molting, however, the mRNA amounts of all MsCTLPs dropped significantly. Immunological determination of MsCTLP1 amounts showed that the mature peptidase was only detectable in the gut lumen of feeding and re-fed larvae, but not in that of starving or molting larvae, suggesting that MsCTLP1 secretion is suspended during starvation or molt. Differential regulation of transcript levels as well as their partial expression in Malpighian tubules might point to a role, which is distinct from digestion for at least some MsCTLPs. In line with this assumption, MsCTLP1 was shown to interact with the chitin synthase 2 (MsCHS2), necessary for chitin synthesis in the course of peritrophic matrix formation in the midgut of M. sexta. The occurrence of this interaction in vivo is supported by colocalization and co-immunoprecipitation. The data suggest that chitin synthesis is controlled by an intestinal proteolytic signaling cascade linking chitin synthase activity to the nutritional state of the larvae. As MsCTLP1 appears to be involved in such signaling cascades, other midgut peptidases could have other targets and may therefore regulate different activities. To gain more insight into the functions of CTLPs, the gene family encoding these peptidases in the genome of the red flour beetle, T. castaneum, was analyzed. Using an extended search pattern, 14 TcCTLP genes were identified that encode peptidases with S1 specificity pocket residues typically found in chymotrypsin-like enzymes. Analysis of the expression patterns of seven TcCTLP genes at various developmental stages revealed that some TcCTLP genes were exclusively expressed in feeding larval and adult stages (TcCTLP-5A/B, TcCTLP-6A). Others were also detected in non-feeding embryonic (TcCTLP-5C, TcCTLP-6D) and pupal stages (TcCTLP-5C, TcCTLP- 6C/D/E). TcCTLP genes were expressed predominantly in the midgut where they presumably function in digestion. However, TcCTLP-5C and TcCTLP-6C also showed considerable expression in the carcass. The latter two genes might therefore encode peptidases that act as molting fluid enzymes. To test this hypothesis, western blots were performed using protein extracts from larval exuviae. The extracts reacted with antibodies to TcCTLP-5C and TcCTLP-6C suggesting that the corresponding peptidases are secreted into the molting fluid. Finally, systemic RNAi experiments were performed. While injections of dsRNAs to TcCTLP-5A/B and TcCTLP-6A/D/E into penultimate larvae did not affect growth or development, injection of dsRNA for TcCTLP-5C and TcCTLP-6C resulted in severe molting defects. Recombinant expressed TcCTLP-5C2 was moreover activated by trypsin and was able to hydrolyze AAPF, hence making TcCTLP-5C the first described chymotrypsin-like peptidase ever to be involved in molting.

L'ilot génomique pks de Escherichia coli et d'autres Enterobacteriaceae code des synthases depolycétides et de peptides non ribosomaux qui permettent l'assemblage d'un composé hybride polycétidepeptidenon ribosomal putative. Ce composé nommé colibactine induit des cassures double-brin de l'ADN descellules eucaryotes.La machinerie enzymatique codée par l'ilot pks comporte une protéine essentielle ClbP, atypique dansce type d'ilot. Nous avons montré que ClbP possède une partie N-terminale catalytique et périplasmique, et unepartie C-terminale associée à la membrane cytoplasmique. La structure cristalline de ClbP et des expériences demutagenèse ont révélé un site actif à sérine et des caractéristiques structurales originales, qui sont compatiblesavec une activité peptidase, confirmée par des analyses biochimiques. Dix homologues de ClbP ont été identifiésin silico dans des ilots génomiques de synthases de peptides non ribosomaux d'espèces bactériennes proches etéloignées. Tous les homologues testés ont présenté une promiscuité fonctionnelle avec ClbP. ClbP est donc leprototype d'une nouvelle sous-famille de peptidases, qui sont probablement impliquées dans la maturation decomposés peptidiques non ribosomaux.Par ailleurs, nous avons réalisé deux études épidémiologiques sur la prévalence de l'ilot pks dansl'espèce E. coli dans deux contextes physiopathologiques, l'urosepsis et les cancers coliques et rectaux. L'ilotpks était significativement associé aux souches issues d'urosepsis comparé à des souches commensales, et auxsouches issues de biopsies de tumeurs coliques comparé à des souches commensales ou issues de biopsies detumeurs rectales, de diverticuloses et de lésions iléales de maladie de Crohn.

Biofilm accounts for 65%-80% of microbial infections in humans. Considerable evidence links biofilm formation to oral disease and consequently systemic infections. Eradication of biofilm-associated infections is important. Streptococcus sanguinis, a Gram-positive bacterium, is one of the most abundant species in oral biofilm. It contributes to biofilm development in oral cavities and is one of the recognized causes of infective endocarditis. To study and identify biofilm genes in S. sanguinis, biofilm formation of 51 mutants was compared with the wild type SK36 strain using crystal violet (CV) staining in a microtiter plate. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) and image analysis was done to compare biofilm formation by the mutant to the wild type SK36 strain. A biofilm mutant XG2_0351, encoding a type I signal peptidase (SPase I), was further investigated. SPase I cleaves proteins that are transported through secretory machinery and is necessary for the release of translocated preproteins from a cytoplasmic site of synthesis to extracytoplasmic/membrane destinations. S. sanguinis, like many Gram-positive bacteria, has multiple SPases I. The objective of this project is to investigate the distinctive role that SPase I plays in biofilm formation in S. sanguinis. Using a plate reader, the growth curves of the wild type strain SK36 and XG2_0351 were compared. The scanning electron microscope (SEM) was utilized to compare the cell surface morphologies. Coomassie staining was done to narrow the list of potential substrates of XG2_0351. CV staining and CLSM images indicated phenotypic differences between the SPase I mutant and SK36. The growth curves of XG2_0351 and SK36 showed no significant difference although SEM illustrated a difference in the cell surface morphologies. Coomassie staining illustrated a number of substrates that were present in SK36 but not XG2_0351. In addition bioinformatics was used to understand the gene function. In conclusion, XG2_0351 reduces biofilm formation in S. sanguinis but further research is necessary to elucidate the specific proteins that are involved. Clarifying the vii role that SPase I plays in reduced biofilm formation in S. sanguinis will give a better understanding of the biofilm formation mechanism.