Η καλλικρεΐνη 6 (του ανθρώπου συμβολίζεται ως ΚLK6, ενώ του ποντικού ως Klk6), φαίνεται πως σχετίζεται με νευροεκφυλιστικές ασθένειες, όπως η σκλήρυνση κατά πλάκας και η νόσος του Parkinson, καθώς επίσης και με διάφορους τύπους καρκίνου. Επομένως, η μελέτη του ρόλου που διαδραματίζει η ΚLK6 στις παραπάνω ασθένειες σε πειραματικά πρότυπα ποντικού, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την κατανόηση αυτών των ασθενειών και στον άνθρωπο. Στην παρούσα εργασία αρχικά παρήχθη η ώριμη Κlk6 ποντικού ως ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη στο σύστημα έκφρασης του μεθυλοτροφικού ζυμομύκητα Pichia pastoris KM71 και δείχθηκε ότι η παραχθείσα πρωτεΐνη ήταν ενζυμικά δραστική. Το cDNA που κωδικοποιεί την ώριμη Klk6 πρωτεΐνη απομονώθηκε με RT-PCR από τον εγκέφαλο ποντικού C57BL6. Το προϊόν πολλαπλασιάστηκε με αντίδραση PCR και μετά από πέψη με τα περιοριστικά ένζυμα XhoI και EcoRI κλωνοποιήθηκε στον φορέα pPIC9. Ο ζυμομύκητας Pichia pastoris KM71 μετασχηματίσθηκε με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο pPIC9/ώριμη Klk6 με τη μέθοδο των σφαιροπλαστών. Από τους ανασυνδυασμένους κλώνους του ζυμομύκητα που μετασχηματίσθηκαν με το πλασμίδιο έκφρασης απομονώθηκε πλασμιδικό DNA και η ορθή κλωνοποίηση και η απουσία μεταλλάξεων στην προς έκφραση αλληλουχία DNA επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχηση. Στη συνέχεια, οι ανασυνδυασμένοι κλώνοι αναπτύχθηκαν σε υγρή καλλιέργεια και ελέχθηκε στο υπερκείμενο η παραγωγή ανασυνδυασμένης Klk6, δεδομένου ότι το σύστημα έκφρασης έχει σχεδιασθεί ώστε η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη να εκκρίνεται. Η ανασυνδυασμένη Klk6 απομονώθηκε από το υπερκείμενο και καθαρίσθηκε με χρωματογραφία υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων ανοικτής στήλης. Μετά τον καθαρισμό, η απόδοση της παραγωγής ήταν 4,16 mg ανασυνδυασμένης Klk6 πρωτεΐνης ανά λίτρο (lt) αρχικής καλλιέργειας Η ενζυμική δραστικότητα της ανασυνδυασμένης Klk6 πρωτεΐνης ελέγχθηκε με ζυμογραφία ζελατίνης και καζεΐνης (ως υποστρώματα), καθώς και με βάση την ικανότητα υδρόλυσης χρωμογόνων συνθετικών πεπτιδικών υποστρωμάτων και πρωτεϊνικών υποστρωμάτων. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε η παραγωγή πολυκλωνικού αντισώματος ειδικού για την Klk6 πρωτεΐνη του ποντικού. Για την ανοσοποποίηση χρησιμοποιήθηκαν συνθετικά πεπτίδια με αλληλουχία που αντιστοιχεί σε δύο μη επικαλυπτόμενες περιοχές της Klk6, οι οποίες -κατά την υπολογιστική πρόβλεψη- χαρακτηρίζονται από υψηλή υδροφιλικότητα και αντιγονικότητα. Για την ανοσοποίηση, τον έλεγχο του τίτλου και τον καθορισμό των αντισωμάτων ακολουθήθηκαν καθιερωμένα πρωτόκολλα. Μετά τον καθαρισμό το κλάσμα των IgG αντισωμάτων αξιολογήθηκε ως προς την εξειδίκευση και τη συγγένεια έναντι της Klk6 ποντικού, χρησιμοποιώντας αρχικά την ανασυνδυασμένη Klk6 πρωτεΐνη, που παρήχθη όπως περιγράφηκε. Βρέθηκε ότι το παραχθέν πολυκλωνικό αντίσωμα αναγνωρίζει την πρωτεΐνη με υψηλή εξειδίκευση και ευαισθησία και το όριο ανίχνευσης προσδιορίσθηκε με ανοσοαποτύπωση πρωτεϊνών στα 50 ng. Τέλος, με RT-PCR αναλύθηκε το προφίλ έκφρασης της Klk6 σε ιστούς του ποντικού χρησιμοποιώντας εκκινητές ειδικούς για το γονίδιο Klk6. Χρησιμοποιώντας ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα από τους ιστούς εκείνους του ποντικού που βρέθηκε ότι εκφράζουν την Klk6, δείξαμε ότι το παραχθέν αντι-Klk6 πολυκλωνικό αντίσωμα αναγνωρίζει την ενδογενή Klk6 πρωτεΐνη με υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα. Συνοπτικά, στην παρούσα εργασία παρήχθη με μεγάλη απόδοση ανασυνδυασμένη Klk6 πρωτεΐνη και με ενζυμικές δοκιμές δείχθηκε ότι είναι ενζυμικά δραστική, δηλαδή είχε την προβλεπόμενη πρωτεολυτική δράση. Επίσης, παρήχθη το πολυκλωνικό αντίσωμα αντι-Klk6 και δείχθηκε ότι αναγνωρίζει με υψηλή συγγένεια και ειδικότητα τόσο την ανασυνδυασμένη όσο και την ενδογενή Klk6 πρωτεΐνη σε ιστούς ποντικού και ως εκ τούτου θα αποτελέσει πολύτιμο εργαλείο για να μελετηθεί σε πρότυπα ποντικού ο ρόλος της πρωτεάσης Klk6 και η συμμετοχή της σε σηματοδοτικά μονοπάτια που σχετίζονται με σοβαρές ασθένειες, όπως η σκλήρυνση κατά πλάκας και η νόσος του Parkinson. / The kallikrein-related peptidase 6 (KLK6 for human; Klk6 for mouse) has been implicated in neurodegenerative diseases including multiple sclerosis and Parkinson’s disease and in various types of cancer. Therefore, the investigation of the role(s) of Klk6 in mouse models used for the study of the aforementioned human diseases becomes a necessity. First in this study, active recombinant mouse Klk6 protein was produced in Pichia pastoris KM71. The cDNA encoding for the mature mouse Klk6 protein was obtained by RT-PCR from RNA extracted from mouse C57BL6 brain. The PCR product was digested with XhoI and EcoRI, purified and subsequently cloned into the pPIC9 expression vector. The methylotrophic yeast strain Pichia Pastoris KM71 was transformed with the pPIC9/mature Klk6 construct, linearized with SalI, with the spheroplast method. Recombinant yeast clones transformed with the expression construct pPIC9/mature Klk6 were identified, confirmed by DNA sequencing and grown in liquid culture for recombinant protein production. Recombinant Klk6 was isolated from the yeast culture supernatant and was purified by hydrophobic interaction chromatography (HIC). The yield of recombinant protein production was 4.16 mg/lt culture after purification. Then, rKlk6 was characterized, in terms of proteolytic activity, by gelatin and casein zymography and by digestion of chromogenic synthetic peptide substrates and protein substrates. Νo antibody is currently available that is highly specific for mouse Klk6. Here, a novel rabbit anti-peptide polyclonal for mouse Klk6 was generated. Peptides corresponding to two non-overlapping Klk6 sequences of high hydrophilicity and predicted antigenicity were synthesized, conjugated to keyhole limpet hemocyanin (KLH) and used for immunization. The specificity and affinity of the purified polyclonal was assessed against active recombinant mouse Klk6 protein produced in Pichia pastoris KM71 as described, and the detection limit was determined at 50 ng by Western blot. Finally, the expression of Klk6 in mouse tissues was analyzed by semi-quantitative RT-PCR using gene-specific primers. Using whole extracts of Klk6 expressing mouse tissues, we showed that the purified anti-Klk6 polyclonal (IgG fraction) recognizes the endogenous Klk6 protein with a high sensitivity and specificity. Conclusively, the produced αντι-Klk6 polyclonal should be a valuable tool in studies employing mouse models in order to decipher the putative role(s) of Klk6 in signaling pathways involved in major human diseases, such as the multiple sclerosis and Parkinson’s disease.

Le fonctionnement du cerveau nécessite une organisation finement régulée des neurones. Cette organisation s'établit durant le développement et dépend de mécanismes tels que la neurogénèse, la neuromigration et la synaptogénèse. Ces mécanismes mettent à contribution plusieurs molécules, dont des facteurs de croissance, des protéases, des molécules d'adhésion cellulaire et de guidage ainsi que des composantes de la matrice extracellulaire. Une défaillance de ces mécanismes peut entraîner le développement de désordres neurologiques tels que la schizophrénie, l'épilepsie et le retard mental. La céruloplasmine (CP) pourrait être comptée parmi les molécules susceptibles de contribuer au développement du cerveau. La CP, une protéine à cuivre de 132 kDa (K), possède une activité ferroxydasique qui en fait un régulateur majeur du métabolisme du fer dans l'organisme. Elle est sécrétée dans la circulation par le foie. On la retrouve aussi dans le cerveau, sous une forme ancrée à la surface de cellules gliales par un groupement glycosylphosphatidylinositol. Des travaux publiés par les équipes des Drs Paquin et Mateescu ont montré que la CP peut induire l'agrégation de neurones nouvellement différenciés de cellules souches embryonnaires murines P19. Cette nouvelle action de la CP soulève l'hypothèse d'un rôle de cette protéine dans le développement du système nerveux, possiblement dans l'organisation spatiale des neurones. Les objectifs de cette thèse étaient d'investiguer les mécanismes de l'action agrégative de la CP sur les neurones P19 et une pertinence physiologique de la CP dans le développement. Pour guider notre travail, nous avons envisagé que la neuroagrégation pouvait avoir des mécanismes communs avec la migration neuronale qui se produit lors du développement et nous avons ainsi considéré deux types de protéines ayant un rôle dans ce processus : les protéases à sérine extracellulaires et la reeline. Des protéases à sérine ont en effet été rapportées comme modulateurs de la migration neuronale et la reeline a un rôle essentiel dans cette migration ainsi que dans le bon positionnement final des neurones. La reeline existe sous la forme du polypeptide pleine longueur de 400K et sous la forme de fragments de 300K et de 180K portant la terminaison NH2 native. Le profil d'expression et le rôle de ces fragments durant le développement ainsi que les mécanismes responsables de leur formation sont peu connus. La reeline se lie à ses récepteurs ApoER2 et VLDLr, ce qui stimule la phosphorylation de la protéine intracellulaire Dab-1 et, plus distalement, la phosphorylation de la cofiline, une protéine régulatrice de l'assemblage des filaments d'actine. D'autre part, l'AMPc et les kinases ERK.1/2 activées par des mitogènes sont des molécules signalisatrices capables de moduler la morphologie et la motilité cellulaires. Les résultats du premier volet de la recherche montrent que le traitement des neurones avec la CP non seulement induit leur agrégation mais stimule aussi la formation du fragment 300K de la reeline. La formation de ce fragment est postérieure à l'agrégation. L'ajout des inhibiteurs de protéases SBTI et aprotinine abolit l'agrégation des neurones et la formation de la reeline 300K, indiquant qu'une ou des protéases à sérine extracellulaires sont impliquées dans ces actions de la CP. Globalement, les résultats suggèrent deux modèles de relation entre la neuroagrégation et la génération de la reeline 300K : un modèle dans lequel la génération de la reeline 300K est une conséquence de la neuroagrégation et un modèle dans lequel les deux phénomènes sont indépendants l'un de l'autre. Comme indiqué plus bas, les études du troisième volet de la recherche favorisent le dernier modèle. Dans le deuxième volet, nous avons voulu déterminer si l'action de la CP sur la reeline dans des cultures de neurones naissants P19 pouvait exister in vivo. Nous avons comparé, par immunobuvardage, les profils d'expression ontogéniques de la CP, la reeline et la cofiline et ce, dans des cerveaux de souris de type sauvage et de souris déficientes en CP (CP-/-). Chez les souris de type sauvage, la CP est détectée dès le jour embryonnaire 12.5, ses niveaux augmentent jusqu'à la naissance et demeurent soutenus jusqu'à l'âge adulte. L'expression globale de la reeline suit à peu près celle de la CP mais les niveaux du fragment 300K sont plus élevés durant la période embryonnaire qu'après la naissance. La cofiline est fortement phosphorylée au cours de la première semaine postnatale. Par comparaison, chez les souris CP-/-, la reeline 300K est peu détectée avant la naissance et la déphosphorylation postnatale de la cofiline survient plus tôt. La CP a donc un impact sur l'expression de la reeline et de la cofiline durant le développement du cerveau. L'expression accrue de la reeline 300K dans les cerveaux embryonnaires de type sauvage par rapport aux cerveaux déficients en CP valide les résultats obtenus avec les neurones P19. Enfin, les études du troisième volet de la recherche, basées sur l'utilisation d'agents pharmacologiques, ont montré que l'action agrégative de la CP et l'influence de la protéine sur la reeline peuvent se produire indépendamment l'une de l'autre. Ainsi, l'AMPc a inhibé l'action neuroagrégative de la CP sans empêcher la génération de la reeline 300K et des inhibiteurs de la signalisation d'ERK1/2 ont diminué le taux de formation de la reeline 300K sans affecter la neuroagrégation. En conclusion, l'ensemble des résultats obtenus ex vivo et in vivo appuie l'hypothèse d'un rôle possible de la CP dans le développement du système nerveux. La définition de ce rôle demande des investigations supplémentaires. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Céruloplasmine, Reeline, Protéases à sérine, Cofiline, AMPc, PKA, ERK, Neurones P19, Développement du système nerveux, Immunobuvardage

This thesis is an investigation of the role of the prosegment (PS) of pepsinogen in the binding, refolding and inhibition of pepsin. Native pepsin (Np) is irreversibly denatured, and folds to a stable, non-native state under refolding conditions, termed refolded pepsin (Rp) (Dee and Yada 2010). When added separately, the PS binds Rp, catalyzes folding to the native-like state and inhibits Np (Dee and Yada 2010). It was hypothesized, owing to the high sequence conservation, that N-terminal PS residues are critical to PS catalyzed folding. Synthetic peptides of N-terminal truncations (N16, N29), C-terminal truncations (C15, C28), and full length, wild-type (Wt) PS were examined. N-terminal residues were required for binding to Rp and catalyzing folding, while both N29 and C28 truncations had similar inhibition constants. Remarkably, the foldase activity of N-terminal truncation (N29) was only 2.5 fold slower than Wt, supporting that PS foldase activity is stored almost entirely within the highly conserved N29 region.

Title from PDF of title page (University of Missouri--Columbia, viewed on February 23, 2010). The entire thesis text is included in the research.pdf file; the official abstract appears in the short.pdf file; a non-technical public abstract appears in the public.pdf file. Dissertation advisor: Dr. Jonathan A. Green. Vita Includes bibliographical references.

Submitted by TAMIRIS KEMPNER (tamireskempner@yahoo.com.br) on 2018-08-08T19:23:03Z No. of bitstreams: 1 Tese - Tamiris Kempner.pdf: 3257644 bytes, checksum: b017074bfe0af2c7904609b1f22127e9 (MD5) / Approved for entry into archive by Neli Silvia Pereira null (nelisps@fcav.unesp.br) on 2018-08-08T19:33:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 kempner_t_dr_jabo.pdf: 3257644 bytes, checksum: b017074bfe0af2c7904609b1f22127e9 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-08T19:33:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 kempner_t_dr_jabo.pdf: 3257644 bytes, checksum: b017074bfe0af2c7904609b1f22127e9 (MD5) Previous issue date: 2018-03-02 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Diante da importância do cancro cítrico para a citricultura mundial, a bactéria Xanthomonas citri subsp. citri, o agente causal da doença, tem sido amplamente estudada. Pesquisadores brasileiros realizaram o sequenciamento completo do genoma da X. citri subsp. citri isolado 306 (Xac306), com o intuito de elucidar os genes e mecanismos envolvidos na patogenicidade e/ou virulência da bactéria. As ORFs XAC2361 e XAC3898 possuem tamanhos e locais diferentes no genoma da Xac306, mas têm em comum o domínio Peptidase_M23, cujo processo biológico predito é de hidrolase de parede celular, mas a real função destas proteínas em Xac ainda é desconhecida. Este trabalho teve como objetivo avaliar, por meio da mutação sítio-dirigida, se as ORFs XAC2361 e XAC3898 estão relacionadas com a virulência e/ou patogenicidade de X. citri subsp. citri 306 e com o desenvolvimento do cancro cítrico. Para isso, foram realizados testes in vitro e in planta dos mutantes obtidos, visando observar alterações fenotípicas. Devido a presença de peptídeo sinal, a ORF XAC2361 foi fundida à proteína fluorescente mCherry (XAC2361-mCherry) para expressão in vivo e avaliação por microscopia de fluorescência. As análises fenotípicas demonstraram que o mutante ΔXAC2361 não apresentou alterações nos sintomas quando avaliado em limoeiro cravo (Citrus limonia Osbeck), porém apresentou menor capacidade de crescimento in vitro, menor motilidade swimming e swarming e menor capacidade de sobrevivência em SDS. Por outro lado, o mutante ΔXAC3898 apresentou uma significativa redução na virulência, menor capacidade de crescimento in planta, maior capacidade de crescimento in vitro, menor capacidade de agregação, maior produção de goma e biofilme e a avaliação por microscopia eletrônica de varredura mostrou que houve uma redução no comprimento das células da bactéria. A análise por microscopia de florescência da proteína de fusão XAC2361-mCherry mostrou, predominantemente, uma fluorescência dispersa, o que é um indício de que a mesma pode estar sendo direcionada para o citoplasma. Apesar disso, não foi possível confirmar a expressão da proteína de fusão XAC2361-mCherry por meio de Western-blot. Diante dos resultados obtidos, sugere-se que o domínio Peptidase_M23 está de alguma forma envolvido com a virulência e/ou patogenicidade de Xac, atuando na formação da parede celular. / In view of the importance of citrus canker in citrus culture worlwide, the bacterium Xanthomonas citri subsp. citri, the causal agent of this disease, has been extensively studied. Brazilian researchers performed the complete sequencing of the genome of X. citri subsp. citri isolate 306 (Xac306), in order to elucidate the genes and mechanisms involved in the pathogenicity and/or virulence of Xac. The ORFs XAC2361 and XAC3898 have different sizes and location in the genome, but have in common the M23 Peptidase domain, whose biological process is predicted to act as cell wall hydrolase, but the actual function of these proteins in Xac is still unknown. This work aimed to evaluate, through site-directed mutagenesis, whether XAC2361 and XAC3898 ORFs are related to the virulence and / or pathogenicity of Xac306 and the development of citrus canker. In order to observe phenotypic changes, in vitro and in planta tests of the mutants were carried out. Due to the presence of signal peptide, the ORF XAC2361 was fused to the mCherry fluorescent protein (XAC2361-mCherry) for in vivo expression and fluorescence microscopy evaluation. Phenotypic analyzes demonstrated that the ΔXAC2361 mutant showed no change in symptoms when evaluated in Mexican lime (Citrus limonia Osbeck), but presented lower in vitro growth capacity, lower swimming and swarming motility, and lower survival capacity in SDS. On the other hand, the ΔXAC3898 mutant showed a significant reduction in virulence, lower in plant growth capacity, higher in vitro growth capacity, lower aggregation capacity, higher gum production and biofilm, and scanning electron microscopy evaluation showed that there was a reduction in cell length. Microscopy analysis of the XAC2361-mCherry fusion protein showed predominantly dispersed fluorescence, which is an indication that it may be being directed to the cytoplasm. Despite this, the expression of XAC2361-mCherry fusion protein could not be confirmed by Western blotting. In view of the obtained results, it is suggested that the Peptidase_M23 domain is in some way involved with the virulence and/or pathogenicity of Xac, acting in the formation of the cellular wall.

FARIAS, Vilmara Albuquerque de. Peptidases cisteínicas do fruto de noni (Morinda citrifolia L.) como agentes coagulantes de leite. 2016. 103 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-07-04T22:32:48Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_vafarias.pdf: 3744946 bytes, checksum: 498727253a7b625743f5ee4f1eb84bae (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-07-04T22:33:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_vafarias.pdf: 3744946 bytes, checksum: 498727253a7b625743f5ee4f1eb84bae (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-04T22:33:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_vafarias.pdf: 3744946 bytes, checksum: 498727253a7b625743f5ee4f1eb84bae (MD5) Previous issue date: 2016 / Milk-clotting is a basic step in the production of the whole cheese. The calf rennet, which has as the main constituent chymosin has been widely used for this purpose since it has high specificity for hydrolysis of the κ-casein. As a result of increased global cheese demand, along with a reduced supply of calf rennet, it has intensified the search for alternative sources. Chymosin produced by genetically modified microorganisms have proven to be an efficient substituent, however, attention has been focused on natural sources of peptidases which may promote different characteristics to the final product. Therefore this study aimed to characterize biochemically the peptidases of the pulp of the fruits of noni, and evaluate their technological potential and possible application in the hydrolysis of milk proteins and the production of cheese. For this, PPN obtained in sodium phosphate buffer 50 mM pH 7.0 was subjected: (i) proteolytic activity assays and (ii) milk-clotting by varying assay conditions and pretreatments PPN; (Iii) Hydrolysis of the total casein and κ-casein, over time analyzed by SDS-PAGE in gels of 15% polyacrylamide; (IV) Cheese production type "rennet". PPN peptidases have optimum pH activity around 6.0 and temperature 50 °C, inhibited by iodoacetamide and E-64. They showed low stability at alkaline pHs and temperatures above 40 °C after incubation for 30 min. Under the effect of divalent ions, proteolytic activity was inhibited by Mn, Co, Cu and Zn, however, it was not affected by Fe, Mg and Ca, either in the presence of NaCl, where there was even a significant increase in activity in all concentrations tested. The clotting activity, a reduction in the MCA (Milk-Clotting Activity) values when that activity occurred at concentrations above 60 mM CaCl2 and 0.1 M NaCl. PPN was able of to hydrolyse the three types of casein (α, β and κ). β- and κ- casein showed greater susceptibility to degradation. The products obtained from the hydrolysis of the κ-casein performed either by PPN as the commercial rennet (Coalhopar) had a mass of approximately 16 kDa, probably corresponding to the peptide para-κ-casein. The cheeses produced by PPN and commercial rennet have similar characteristics as the moisture values, fresh and dry mass, differing in clotting time. Coalhopar coagulated milk in about 3 min, while PPN extended to 8 min. PEN showed a yield (w:w) to about 79.02 g of noni pulp for the production a kilogram of cheese, which is equivalent to a mass of less than whole fruit. / A coagulação do leite é uma etapa básica na produção de todo queijo. O coalho de vitelo, que possui como principal constituinte a quimosina tem sido amplamente utilizado para esta finalidade, por apresentar alta especificidade de hidrólise pela κ-caseína. Em decorrência do aumento da demanda mundial de queijo e a escassez de coalho animal, tem se intensificado a busca por fontes alternativas. Quimosina produzida através de microrganismos geneticamente modificados provaram ser um substituinte eficiente, no entanto, a atenção tem sido voltada para fontes naturais de peptidases que possam conferir características diferenciadas ao produto final. Diante disso este trabalho objetivou caracterizar bioquimicamente as peptidases da polpa de noni (PPN), bem como avaliar seu potencial tecnológico e possível aplicação na hidrólise das proteínas do leite e na produção de queijos. Para isso, PPN extraídas em tampão fosfato de sódio 50 mM pH 7,0, foi submetido à: (I) Ensaios de atividade proteolítica e de (II) coagulação do leite variando-se as condições do ensaio e os pré-tratamentos de PPN; (III) Hidrólise da caseína total e κ-caseína, analisadas ao longo do tempo através de SDS-PAGE, em géis de 15% de poliacrilamida; (IV) Produção de queijo tipo “coalho”. Peptidases da polpa de noni apresentaram um pH ótimo de atividade em torno de 6,0 e temperatura ótima de 50 °C, sendo inibida por iodoacetamida e E-64. Apresentaram baixa estabilidade em pHs alcalinos e em temperaturas acima de 40 °C, após incubação por 30 min. Sob o efeito de íons divalentes, a atividade proteolítica foi inibida por Mn, Co, Cu e Zn, no entanto, não foi afetada por Fe, Mg e Ca, tampouco na presença de NaCl, onde houve, inclusive, um aumento significativo na atividade em todas as concentrações testadas. Quanto à atividade de coagulação do leite, houve uma redução nos valores de MCA (inglês, Milk-Clotting Activity) quando essa atividade ocorreu na presença de concentrações acima de 60 mM de CaCl2 e 0,1 M de NaCl. PPN foram capazes de hidrolisar os três tipos de caseínas (α, β e κ), com β e κ-caseína apresentando maior susceptibilidade à degradação. Os produtos obtidos a partir da hidrólise da κ-caseína, realizados tanto com PPN quanto pelo coalho comercial (Coalhopar) apresentaram massa de aproximadamente 16 kDa, provavelmente correspondendo ao peptídeo para-κ-caseína. Os queijos produzidos com PPN e coalho comercial apresentam características semelhantes quanto aos valores de umidade, massa fresca e seca, diferindo no tempo de coagulação. Coalhopar coagulou o leite em cerca de 3 min, enquanto que PPN estendeu-se até 8 min. PPN apresentou um rendimento (m:m) cerca de 79,02 g de polpa de noni para a produção de cada quilo de queijo, o que equivale à massa inferior a de um fruto inteiro.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:18Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-10-28 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Paracoccidioides brasiliensis (Pb), é uma micose sistêmica grave com formas aguda e crônica. As proteases ou peptidases são enzimas proteolíticas que ocorrem em todos os organismos e correspondem a 1-5% de seus conteúdos genéticos. Estas enzimas estão envolvidas em processos biológicos essenciais, como a coagulação sanguínea, morte celular e diferenciação de tecidos. Várias etapas proteolíticas importantes ocorrem durante a invasão metastática de tumores, assim como no ciclo de infecção de um grande número de vírus e microrganismos patogênicos. Um número reduzido de proteases do Pb já foram isoladas e caracterizadas, tampouco sua atividade durante o desenvolvimento da doença foi determinado, e até o momento, nenhuma atividade oligopeptidásica foi descrita nesse fungo. No presente trabalho foi demonstrada a presença de uma atividade metalo-peptidásica thimet oligopeptidase (TOP)-like no extrato citosólico de leveduras de P. brasiliensis, isolado 18 (Pb18). Nossos resultados mostraram a hidrólise do peptídeo com supressão intramolecular de fluorescência Abz-GFSPFRQ-EDDnp pelo extrato citosólico de leveduras de P. brasiliensis. Esse substrato é clivado preferencialmente pela TOP de mamíferos, e corroborando esse resultado, observou-se a inibição da hidrólise desse peptídeo por ο-fenantrolina e JA-2, inibidores seletivos de metalo-proteases e TOP, respectivamente. Utilizando-se peptídeos e inibidores seletivos para diferentes proteases, não se detectou a presença de atividade neurolisina-like ou neprilisina-like, e também se descartou a presença de serino-peptidases, cisteíno-peptidases e enzima conversora da angiotensina I. A maior atividade enzimática do extrato citosólico sobre os outros preparados (membrana/parede celular ou lisado total das leveduras) pode indicar uma localização citosólica dessa enzima. Não foi observada a secreção da peptidase no sobrenadante de cultura in vitro, mesmo após adição de soro fetal bovino. Todavia, a peptidase com atividade TOP-like de Pb parece ser secretada in vivo, ou liberada após lise do fungo por componentes efetores da resposta imune, uma vez que anticorpos capazes de inibir a atividade peptidásica são encontrados em soros de pacientes com paracoccidioidomicose, e soros com maior título em imunodifusão contém maiores concentrações de anticorpos enzima-específicos. Várias enzimas da família M3 clivam bradicinina, importante mediador inflamatório in vivo. A hidrólise da bradicinina e do substrato Abz-GFSPFRQEDDnp pelo extrato citosólico de P. brasiliensis, gera os mesmos fragmentos observados após clivagem pela TOP de mamíferos, que são diferentes dos gerados pela clivagem com MIP de mamíferos e OpdA bacteriana, sendo mais um indicador da presença majoritária de uma peptidase com atividade TOP-like em P. brasiliensis. A clivagem da bradicinina pela metalooligopeptidase com atividade TOP-like de Pb, poderia ocorrer no sítio inflamatório e poderia estar envolvida na inibição da indução de uma resposta imune protetora contra o fungo, favorecendo a permanência do mesmo no hospedeiro. Observamos ainda que o gene homólogo de TOP em P. brasiliensis é quase duas vezes mais expresso no virulento em comparação ao não virulento. O aumento da hidrólise do substrato Abz-GFSPFRQ-EDDnp também foi observado no isolado de maior virulência quando comparado ao de menor virulência. A possível relação entre a expressão da metalooligopeptidase com a virulência do fungo sugere que essa peptidase possa ser classificada como um fator de virulência fúngica, no entanto experimentos complementares são necessários para sua confirmação. A expressão da gp43 também foi analisada no isolado virulento e não virulento e observou-se uma expressão aumentada em até treze vezes no primeiro. Para melhor caracterização dessas metalo-oligopeptidases é necessária a obtenção da proteína recombinante, ou da proteína purificada nativa, isolada do lisado fúngico. Não obtivemos sucesso na expressão das proteínas recombinantes, tampouco no isolamento da peptidase nativa por métodos cromatográficos. Nossos resultados sugerem a presença de uma atividade metalooligopeptidásica TOP-like na fração citosólica de leveduras de P. brasiliensis. Liberação in vivo dessa enzima após a lise de fungos ou secreção estimulada por fatores do hospedeiro, pode ter um papel na inflamação e desenvolvimento da micose. / Paracoccidioidomycosis (PCM), caused by the pathogenic fungus Paracoccidioides brasiliensis (Pb) is a systemic mycosis with severe acute and chronic forms. Proteases or peptidases are proteolytic enzymes that occur in all organisms and constitute 1-5% of their genetic contents. These enzymes are involved in biological processes such as blood clotting, cell death and tissue differentiation. Several important proteolytic steps occur during the invasion of metastatic tumors, as well as in the infection of a large number of viruses and pathogens. To date, a small number of Pb proteases were isolated and characterized, also, their activities during the development of the disease was not determined, and an oligopeptidase activity was not detected in this fungus. In the present work, we demonstrated a metallopeptidase thimet oligopeptidase (TOP)-like activity in the cytosolic extract of Pb18 yeasts. Our results shown a major hydrolysis of the fluorescence resonance energy transfer (FRET) peptide Abz-GFSPFRQ-EDDnp, preferentially cleaved by TOP from mammals, and the inhibition of the hydrolysis of this peptide by orthophenantrolin and JA-2, selective inhibitors of metalloproteases and TOP, respectively. The presence of neurolysin- like and neprilysin-like, serinepeptidases, cysteine-peptidases and angiotensin converting enzyme I was discarded by analyzing selective FRET peptides and inhibitors. The higher peptidase activity of cytosolic extracts over the membrane/cell wall and total yeast lysate preparations may indicate that this enzyme is localized in the yeast cytosol. The metallo-oligopeptidase activity was not detected on in vitro culture supernatants, even after addition of fetal calf serum. However, the peptidase with TOP-like activity of P. brasiliensis seems to be secreted in vivo, or released after fungal lysis by immune factors, since antibodies that can inhibit this enzymatic activity were found in sera from paracoccidioidomycosis patients, and serum with highest titer in immunodiffusion contains higher concentrations of enzymespecific antibodies. Bradykinin, an important inflammatory mediator in vivo, is cleaved by several enzymes from the M3 family. The same fragments observed after hydrolysis by TOP were observed after cytosolic extract hydrolysis of bradykinin and the substrate Abz-GFSPFRQ-EDDnp. MIP and bacterial OpdA hydrolysis of these peptides generate different fragments, and this is an additional indicator of a major TOP-like activity in P. brasiliensis yeast cells Bradykinin hydrolysis by the TOP-like metallopeptidase of P. brasiliensis may occur in inflammatory processes and this suggests that the enzyme may be involved in the inhibition of a protective anti-fungal response induction, limiting fungal elimination. We also observed that the expression of the TOP homologous gene in P. brasiliensis has almost a two-fold increased in the virulent isolate 18 compared to the non-virulent isolate. Increased hydrolysis of the substrate Abz-GFSPFRQ-EDDnp was also observed in the most virulent isolate compared to the non-virulent. The possible correlation between TOP-like peptidase expression and fungal virulence suggests that this peptidase could be classified as a fungal virulence factor, however, additional experiments are needed to confirm this hypothesis. Gp43 expression was also analyzed in both isolates, and it was observed a thirteen-fold increase in the expression on the virulent isolate. In order to better characterize the P. brasiliensis TOP-like activity, we attempted to obtain the purified recombinant or the native protein, isolated from fungal lysate. However, we were not successful in the expression of recombinant proteins and neither on the isolation of the native protein using chromatographic methods. Our results suggest the presence of a TOP-like activity in the cytosolic fraction of P. brasiliensis yeasts. In vivo release of this enzyme after fungal lysis, or host factors-stimulated secretion, may have a role in inflammation and development of the disease. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-05-27. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:27Z : No. of bitstreams: 1 Publico-00268a.pdf: 1567152 bytes, checksum: edde41fc5183eb2ec3800911222b1493 (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:27Z : No. of bitstreams: 2 Publico-00268a.pdf: 1567152 bytes, checksum: edde41fc5183eb2ec3800911222b1493 (MD5) Publico-00268b.pdf: 2029279 bytes, checksum: 0ce31c253ab625a6b402e5c0b4abffe0 (MD5) / O vírus da febre aftosa (FMDV), um patógeno que afeta animais no mundo todo, possui um RNA genômico de fita simples que, após infectar a célula, é imediatamente traduzido numa única poliproteína. Esta poliproteína produzida é processada durante a síntese em várias proteínas maduras através de peptidases codificadas pelo próprio vírus. A primeira clivagem da poliproteína viral é realizada pela Lbpro entre sua própria região C-terminal e a região N-terminal da proteína VP4. Lbpro também cliva especificamente dois homólogos dos fatores eucarióticos de iniciação (eIF) 4G, resultando na supressão da translação proteica do hospedeiro realizadas através dos mRNAs cap-dependentes. Consequentemente, o RNA do FMDV, que inicia a tradução via IRES, e não requer o eIF4G intacto, pode usar livremente a maquinaria de síntese protéica do hospedeiro para tradução viral. Nós usamos uma série de peptídeos fluorogênicos desenhados especificamente para examinar a especificidade por substratos, efeitos do pH e força iônica sobre a atividade catalítica da Lbpro e sua mutante sLbpro. Comparadas com outras cisteínos peptidases, como a papaína e catepsinas, Lbpro e sLbpro possuem muitas caracteríticas únicas como alta sensibilidade à sais e um sítio de ligação ao substrato muito específico, extendendo-se até a posição P7. Análises de dados estruturais mostraram que Lbpro liga os resíduos P1-P3 do substrato em uma conformação extendida, enquanto os resíduos P4-P7 são ligados numa curta hélice 310. A especificidade da Lbpro, revelada através dos peptídios substituídos pode ser explicada para todas as posições, exceto para P5. / Foot-and-mouth disease virus (FMDV), a global animal pathogen, possesses a single-stranded RNA genome that, on release into the infected cell, is immediately translated into a single polyprotein. This polyprotein product is cleaved during synthesis by proteinases contained within it into the mature viral proteins. The first cleavage is performed by the leader protease (Lbpro) between its own C-terminus and the N-terminus of VP4. Lbpro also specifically cleaves the two homologues of the cellular eukaryotic initiation factor (eIF) 4G, resulting in shut-off of host capdependent mRNA translation. Consequently, FMDV RNA, which initiates translation via IRES, and does not require intact eIF4G, can freely use the host protein synthesis machinery for viral protein synthesis. We used a panel of specifically designed fluorogenic peptides to examine the substrate specificity, effects of pH and ionic strength on Lbpro activity and of its shorter mutant sLbpro. Compared with other cysteine peptidases, how papain and the cathepsins, Lbpro and sLbpro possesses several unusual characteristics, including a high sensitivity to salt and a very specific substrate binding site extending up to P7. Indeed, almost all substitutions investigated were detrimental to Lbpro and sLbpro activity. Analysis of structural data showed that Lbpro binds residues P1 to P3 in an extended conformation whereas residues P4 to P7 are bound in a short 310 helix. The specificity of Lbpro as revealed by the substituted peptides could be explained for all positions except P5. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:20:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4145.pdf: 3961758 bytes, checksum: 03f9f6459289842cf630d2dd53be5ba6 (MD5) Previous issue date: 2012-02-28 / Financiadora de Estudos e Projetos / Plant legumains, also termed vacuolar processing enzymes (VPEs), are cysteine peptidases that play key roles in seed maturation, germination, senescence, stress response, programmed cell death during development and defense against pathogens. Despite the increasing number of reports on VPEs, most of studies are on dicotyledonous legumain and their role in seeds. In this study, it was performed the characterization of sugarcane legumain, named CaneLEG. Kinetic characterization of the recombinant CaneLEG expressed in Pichia pastoris revealed that this enzyme has the main characteristics of VPEs, such as self-activation and activity under acidic pH. CaneLEG activity was strongly inhibited by the sugarcane cystatin named CaneCPI-3. In vivo interaction between legumain and cystatin was observed to barley proteins, indicating that legumains might be inhibited by cystatins in the plant. Furthermore, the CaneLEG and CaneCPI-3 gene expression was analyzed throughout sugarcane development and in plantlets treated with phytohormones. From these results, it was observed that these genes showed a tissue-specific expression pattern, with the strong accumulation of CaneLEG transcripts throughout the internode development. The up-regulation of CaneLEG and CaneCPI-3 genes in plantlets treated with ABA suggests that these proteins encoded by these genes may be involved in stress response and CaneCPI-3 may act on endogenous cysteine peptidase regulation. Our results suggest the CaneCPI-3 as the endogenous inhibitor of CaneLEG and the involvement of these proteins on the ABA-regulated stress response. Further, the gradual increase on CaneLEG expression in internode suggests the action of this enzyme on the development of this storage tissue. The results obtained in this work will serve as an initial tool to understand the roles played by CaneLEG and CaneCPI-3 on sugarcane. / As legumaínas de plantas, também denominadas enzimas de processamento vacuolar (VPEs), são cisteíno-peptidases que atuam nos processos de maturação de sementes, germinação, senescência, resposta a estresse e morte celular programada durante o desenvolvimento da planta ou em resposta a patógenos. Apesar do crescente número de estudos com legumaínas de plantas, a maioria dos estudos está relacionada às legumaínas de dicotiledôneas e suas funções em sementes. No presente trabalho, foi realizada a caracterização de uma legumaína de cana-de-açúcar, denominada CaneLEG. A caracterização cinética da CaneLEG recombinante produzida em Pichia pastoris mostrou que esta enzima possui as características comuns de legumaínas de plantas, como a auto-ativação e atividade ótima em pH ácido. Além disso, a atividade da CaneLEG foi fortemente inibida pela cistatina de cana-de-açúcar denominada CaneCPI-3. A interação in vivo legumaínacistatina foi observada para as proteínas de cevada, indicando que as legumaínas podem ser inibidas por cistatinas na planta. Além disso, foi analisada a expressão dos genes da CaneLEG e CaneCPI-3 durante o desenvolvimento da cana e em plântulas tratadas com fitohormônios. A partir destes resultados, foi observado que estes genes apresentam um padrão de expressão temporal tecido-específica, com forte acúmulo de transcritos da CaneLEG durante o desenvolvimento do entrenó. A superexpressão dos genes CaneLEG e CaneCPI-3 em plântulas tratadas com ABA sugere que as proteínas por eles codificadas devem estar envolvidas na resposta a estresse, sendo possível que a CaneCPI-3 atue na regulação de cisteíno-peptidases endógenas. Nossos resultados sugerem a CaneCPI-3 como um inibidor endógeno da CaneLEG e o possível envolvimento dessas proteínas na resposta a estresse regulada por ABA. Além disso, o aumento gradual na expressão da CaneLEG em entrenó sugere a atuação desta enzima no desenvolvimento deste tecido de reserva. Os resultados obtidos neste trabalho servirão como base inicial para auxiliar no entendimento das funções desempenhadas pela CaneLEG e CaneCPI-3 na canade- açúcar.

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós Graduação em Ciências da Saúde, da Universidade do Extremo Sul Catarinense – UNESC, para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde. / A diabete Mellitus (DM) é na atualidade um dos maiores problemas de saúde pública, sendo caracterizada como um distúrbio metabólico complexo, resultante tanto da resistência à ação da insulina, como da disfunção das células β. Atualmente, uma nova classe de fármacos, os inibidores da enzima dipeptidil peptidase 4 (DPP-4), demonstrou eficiência terapêutica e segurança no tratamento de pacientes com DM devido ao aumento do hormônio peptídeo-1 semelhante ao glucagon. Entretanto, por tratar-se de uma classe nova de medicamentos, pouco se sabe sobre os efeitos desses fármacos no que diz respeito aos parâmetros metabólicos, bem como a função mitocondrial. Neste contexto, o presente trabalho, tem como objetivo avaliar os efeitos da administração de diferentes inibidores de DPP-4 (linagliptina, vildagliptina, sitagliptina e saxagliptina) sobre parâmetros do metabolismo energético em cérebro, coração e fígado de ratos adultos. Os resultados desse estudo demonstraram que a administração subcrônica de linagliptina aumentou a atividade dos complexos I e IV no hipocampo e cerebelo, enquanto no fígado, houve um aumento na atividade dos complexos II e II-III. No entanto, no coração observou-se uma inibição da atividade do complexo IV e da succinato desidrogenase. Já a administração de vildagliptina aumentou a atividade do complexo I no hipocampo, e a atividade da creatina quinase no cerebelo e córtex cerebral. No fígado observou-se um aumento na atividade dos complexos II e II-III, enquanto no coração houve um aumento na atividade dos complexos I e II-III. A administração de sitagliptina causou um aumento na atividade do complexo I no hipocampo e cerebelo, enquanto que a atividade do complexo II foi reduzida no córtex cerebral. Observou-se também um aumento na atividade da creatina quinase em todas as estruturas cerebrais analisadas. Já no fígado verificou-se um aumento apenas na atividade do complexo II, e no coração um aumento na atividade dos complexos I e II-III, ao passo que a atividade da succinato desidrogenase foi inibida nessa estrutura. Finalizando, constatou-se, que a administração de saxagliptina aumentou a atividade dos complexos I e IV no hipocampo e cerebelo, e a atividade da creatina quinase no hipocampo, cerebelo, estriado e córtex cerebral. No fígado observou-se um aumento na atividade dos complexos II e II-III e da creatina quinase, enquanto no coração verificou-se um aumento da atividade do complexo II-III e da creatina quinase, e uma diminuição da succinato desidrogenase. Por fim, os resultados do presente estudo demonstraram que a administração subcrônica de diferentes inibidores de DPP-4 altera a atividade de enzimas do metabolismo energético. Tomados em conjunto os dados deste estudo e os dados já descritos na literatura, é tentador especular que o aumento na atividade de enzimas do metabolismo energético pode estar envolvido com o mecanismo pelo qual a função mitocondrial é restaurada pelo tratamento com inibidores de DPP-4.