La digestion enzymatique des protéines est une méthode de base pour les études protéomiques ainsi que pour le séquençage en mode « bottom-up ». Les enzymes sont ajoutées soit en solution (phase homogène), soit directement sur le gel polyacrylamide selon la méthode déjà utilisée pour l’isolation de la protéine. Les enzymes protéolytiques immobilisées, c’est-à-dire insolubles, offrent plusieurs avantages tels que la réutilisation de l’enzyme, un rapport élevé d’enzyme-sur-substrat, et une intégration facile avec les systèmes fluidiques. Dans cette étude, la chymotrypsine (CT) a été immobilisée par réticulation avec le glutaraldehyde (GA), ce qui crée des particules insolubles. L’efficacité d’immobilisation, déterminée par spectrophotométrie d’absorbance, était de 96% de la masse totale de la CT ajouté. Plusieurs différentes conditions d’immobilisation (i.e., réticulation) tels que la composition/pH du tampon et la masse de CT durant la réticulation ainsi que les différentes conditions d’entreposage tels que la température, durée et humidité pour les particules GA-CT ont été évaluées par comparaison des cartes peptidiques en électrophorèse capillaire (CE) des protéines standards digérées par les particules. Les particules de GA-CT ont été utilisés pour digérer la BSA comme exemple d’une protéine repliée large qui requit une dénaturation préalable à la digestion, et pour digérer la caséine marquée avec de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) comme exemple d’un substrat dérivé afin de vérifier l’activité enzymatique du GA-CT dans la présence des groupements fluorescents liés au substrat. La cartographie peptidique des digestions par les particules GA-CT a été réalisée par CE avec la détection par absorbance ultraviolet (UV) ou fluorescence induite par laser. La caséine-FITC a été, en effet, digérée par GA-CT au même degré que par la CT libre (i.e., soluble). Un microréacteur enzymatique (IMER) a été fabriqué par immobilisation de la CT dans un capillaire de silice fondu du diamètre interne de 250 µm prétraité avec du 3-aminopropyltriéthoxysilane afin de fonctionnaliser la paroi interne avec les groupements amines. Le GA a été réagit avec les groupements amine puis la CT a été immobilisée par réticulation avec le GA. Les IMERs à base de GA-CT étaient préparé à l’aide d’un système CE automatisé puis utilisé pour digérer la BSA, la myoglobine, un peptide ayant 9 résidus et un dipeptide comme exemples des substrats ayant taille large, moyenne et petite, respectivement. La comparaison des cartes peptidiques des digestats obtenues par CE-UV ou CE-spectrométrie de masse nous permettent d’étudier les conditions d’immobilisation en fonction de la composition et le pH du tampon et le temps de réaction de la réticulation. Une étude par microscopie de fluorescence, un outil utilisé pour examiner l’étendue et les endroits d’immobilisation GA-CT dans l’IMER, ont montré que l’immobilisation a eu lieu majoritairement sur la paroi et que la réticulation ne s’est étendue pas si loin au centre du capillaire qu’anticipée. / Digesting proteins using proteolytic enzymes is a standard method in proteomic studies and bottom-up protein sequencing. Enzymes can be added in solution or gel phase depending on how the protein has been isolated. Immobilized, i.e., insoluble, proteolytic enzymes offer several advantages such as reusability of enzyme, high enzyme-to-substrate ratio, and integration with fluidic systems. In this study, we prepared glutaraldehyde-crosslinked chymotrypsin (GA-CT), which creates insoluble particles. The immobilization efficiency was determined by absorbance spectrophotometry and found to be 96% of the total amount of chymotrypsin added. Different immobilization (i.e., crosslinking) conditions such as buffer composition/pH and initial mass of CT during crosslinking as well as different storage conditions such as temperature, time and humidity for the GA-CT particles were evaluated by comparing capillary electrophoretic (CE) peptide maps of protein standards digested with the particles. The GA-CT particles were used to digest BSA as an example of a large folded protein that needs denaturation prior to digestion, and casein-fluorescein isothiocyanate (FITC) as an example of a small, labeled substrate to test enzyme activity in the presence of substrate-bound fluorescent groups. Peptide mapping of digests from GA-CT particles was achieved by CE with ultraviolet (UV) absorbance or laser induced fluorescence (LIF) detection. FITC-labeled casein was digested by GA-CT to the same extent as with free (i.e., soluble) CT. An immobilized enzyme microreactor (IMER) was fabricated by immobilizing CT inside a 250 µm i.d. fused-silica capillary tube pre-treated with 3-aminopropyltriethoxysilane to functionalize the inner walls with amine groups. Glutaraldehyde was reacted with the amine groups and then CT was immobilized by crosslinking to the GA. IMERs based on GA-CT were fabricated using an automated CE system and used to digest BSA, myoglobin, a 9-residue peptide and a dipeptide as examples of large, medium and small substrates. Digests were studied by comparing peptide maps obtained by CE coupled to either UV or mass spectrometric (MS) detection in order to evaluate immobilization conditions as a function of buffer composition/pH and reaction times. A separate study, which used fluorescence microscopy to investigate the extent and location of GA-CT immobilization in the IMER, showed that immobilization only takes place primarily near the capillary walls and that crosslinking does not extend as far into the center of the IMER as had been expected.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Une étude récente sur le transfert peptidique pH dépendant effectuée avec divers ARNt aminoacyles a révélé la dépendance au pH du transfert peptidique. L’instabilité hydrolytique rend impossible l’obtention de la valeur expérimentale du pKa de l’eau donné pour le groupement α-amino des esters 3'-aminoacyladenosine. Comme les analogues de la puromycine sont les analogues les plus proches du 3’-terminal des ARNt aminoacyles et qu’ils contiennent une liaison amide stable en position 3’, il est intéressant de déterminer la valeur du pKa du groupement α-amino de différents analogues de la puromycine mais aussi de corréler ces valeurs de pKa aux valeurs de pKa des groupements ARNt aminoacyles correspondants obtenues par le transfert peptidique pH dépendant. Le premier chapitre de la thèse se concentre sur la synthèse de différents analogues de la puromycine et sur la détermination de leur basicité par une analyse RMN pH dépendante. Ce chapitre discutera aussi la conformation intrinsèque des analogues de la puromycine mesurée par la pH dépendance de leur constante de couplage J1’-2’. Les synthèses d’analogues dinucléotidiques, d’un analogue xylo-puromycine et d’un analogue de désoxyxylopuromycine seront aussi décrites. Les conjugués peptidyl-ARN miment des fragments importants d’intermédiaires de la transduction. Ces analogues peuvent être utilisés comme outils expérimentaux pour comprendre l’évolution de la synthèse codée des peptides. L’innovation dans le concept de ‘négoce moleculaire’ entre les peptides, les oligonucléotides et les bicouches lipidiques, qui pourrait être à la base de l’évolution de la synthèse peptidique contrôlée par l’ARN, nous a poussé à synthétiser des conjugués peptidyl-ARN amphiphiliques et à étudier leurs interactions avec les bicouches lipidiques. Dans le deuxième chapitre les stratégies de synthèse sur support solide utilisant des analogues de puromycine comme élément constitutif seront discutées / A recent pH dependent peptidyl transfer assay in the ribosome with various aminoacyl tRNAs revealed the pH dependence of the peptidyl transfer. Hydrolytic instability makes impossible to obtain the experimental bulk water pKa data for the α-amino groups of 3'-aminoacyladenosine esters. Since puromycin analogues are the most similar analogues of the 3’-end of the aminoacyl tRNAs and they contain a stable amide bond in 3’-position, the determination of the pKa value of the α-amino groups of different puromycin analogues and correlation of these pKa values with those of α-amino groups of the corresponding aminoacyl tRNAs obtained by pH dependent peptidyl transfer deserves attention. Chapter 1 of the thesis focuses on the synthesis of different puromycin analogues and on the determination of their basicities by a pH dependent NMR analysis. This chapter also analyses the intrinsic conformations accessed by the puromycin analogues, as measured by the pH dependence of their J1’-2’ coupling constants. The synthesis of dinucleotide analogues, a xylo-puromycin analogue and a deoxyxylopuromycin analogue will also be described. Peptidyl-RNA conjugates mimic important fragments of natural intermediates of translation. These analogues can be used as an experimental tool to understand the evolution of the coded synthesis of peptides. The novelty in the concept of a ‘molecular deal’ between peptides, oligonucleotides and lipidic bilayers, which may be the basis for the evolution of RNA controlled peptide synthesis, prompted us to synthesize amphiphilic peptidyl-RNA conjugates and to study their interactions with lipidic bilayers. In chapter 2 the solid support synthetic strategies using puromycin analogues as the building blocks will be discussed

Le développement d'une nouvelle sonde dite " activity-based probe " pour réaliser la détection de formes actives de protéases appartenant à la famille des protéases à zinc de la matrice (MMP) a été réalisé dans ce travail, en partant d'un inhibiteur phosphinique puissant des MMP dans lequel a été introduit un groupement photoactivable de type diazérine. Ce composé se révèle un inhibiteur puissant de plusieurs MMP avec des affinités nanomolaires. Ce composé incubé avec différentes MMP est par ailleurs capables de modifier de façon covalente un grand nombre de MMP au niveau de leur site actif, avec des rendements de modification variant de plus de 50% à 11%, selon la nature des MMP. En ayant choisi comme moyen de détection la radioactivité, nous démontrons qu'avec cette nouvelle sonde qu'il est possible de détecter des formes actives de MMP avec des sensibilités de l'ordre de la femtomole dans des systèmes modèles de protéomes complexes. Appliquée à l'analyse de lavages broncho alvéolaires de souris traitées par voie pulmonaire avec des nanoparticules pour induire une réponse inflammatoire, cette nouvelle sonde permet de mettre en évidence la présence de formes actives du domaine catalytique de la MMP-12, une métalloprotéase à zinc exprimée par les macrophages, mais pas dans les animaux contrôles. En revanche l'analyse de carotides humaines de patients souffrant d'athérosclérose ne nous pas conduit avec cette sonde à la détection de formes actives de MMP. Malgré ce résultat, il est à noter que la détection de forme active de MMP dans un fluide pathologique est une première dans ce domaine. Cette sonde étant validée pour sa capacité à détecter des formes actives de MMP, elle permettra dans l'avenir de tester d'autres fluides pathologiques d'origine humaine ou bien des extraits de tissu comme des tumeurs pour lesquels les MMP pourraient être des marqueurs de ces pathologies.

Nous avons préalablement démontré que l'endothéline-1 (ET-1), un peptide vasoconstricteur de 21 acides aminés, joue un rôle central dans le métabolisme des tissus articulaires et a des fonctions cataboliques sur le cartilage articulaire dans l'ostéoarthrose, en liant son récepteur de type A (ETA). Suite à la relâche du nonapeptide vasodilatateur bradykinine (BK), et l'augmentation d'expression du récepteur B1 des kinines (BKB1), ces médiateurs engendrent un cycle d'inflammation, une destruction du cartilage, et une douleur articulaire. Lors de cette étude, l'efficacité thérapeutique des antagonistes spécifiques du ETA et/ou BKB1 dans un modèle animal d'ostéoarthrose a été testée. Notre hypothèse est que l'antagonisme va diminuer la progression de la pathologie et de la douleur articulaire. L'ostéoarthrose a été induite chez des rats par rupture chirurgicale du ligament croisé antérieur. Les animaux ont été traités par injections intra articulaire hebdomadaires des antagonistes peptidiques spécifiques du ETA et/ou BKB1. La douleur articulaire a été évaluée par le test d'incapacitance statique durant les deux mois postopératoires ; la morphologie articulaire a été examinée post mortem par radiologie et histologie. On constate que le traitement a diminué la douleur et a préservé la morphologie articulaire ; la double inhibition a été plus efficace que la simple inhibition. En conclusion, l'antagonisme double d'ETA et BKB1 améliore la douleur chronique et prévient la dégradation articulaire dans l'ostéoarthrose, ce qui suggère que ces récepteurs peuvent être des cibles thérapeutiques potentiels pour le traitement de cette pathologie. / The author's laboratory has previously shown that endothelin-1 (ET-1), a 21-residue vasoconstrictive peptide, plays a central role in joint tissue metabolism, and has a catabolic function in matrix collagen degradation in osteoarthritis. These effects occur primarily through ligation of the endothelin-1 receptor A subtype (ETA). The subsequent release of the nonapeptide vasodilator bradykinin (BK) in the joint microenvironment, and up-regulation of bradykinin receptor B1 (BKB1) expression, engenders a vicious cycle of synovial membrane inflammation, articular cartilage destruction, and joint pain. In the present work, we describe a preclinical study of the efficacy of treatment of surgically induced osteoarthritis with ETA and/or BKB1 specific peptide antagonists. We hypothesize that antagonism will diminish osteoarthritis progress and articular pain. Osteoarthritis was surgically induced in rats by transection of the anterior cruciate ligament. Animals were subsequently treated with weekly intra-articular injections of specific peptide antagonists of ETA and BKB1. Hind limb pain was measured by the static weight bearing test for two months post-operatively. Post-mortem, knee joints were analyzed radiologically and histologically. Local antagonist treatment diminished overall limb pain, and accelerated postoperative recovery, after disease induction. Treatment also protected joint radiomorphology and histomorphology, with dual antagonism being slightly more protective. ETA and BKB1 dual antagonism improves chronic pain and prevents joint degradation in osteoarthritis. They therefore represent a novel therapeutic target: specific receptor dual antagonism may prove beneficial in disease management.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Les nanocristaux de cellulose (NCC), obtenus par hydrolyse acide des microfibrilles de cellulose native sous forme de suspensions colloïdales aqueuses, sont des nanoparticules biosourcées ayant des propriétés mécaniques et optiques particulièrement séduisantes pour la conception de nanomatériaux à haute performance. Pour éliminer certaines de leurs limitations comme la sensibilité au sel et l'absence de contrôle de leurs interactions, nous nous sommes attachés au cours de ce travail à modifier chimiquement ces NCC par greffage de chaînes de polymère thermosensible de la famille de polyétheramines Jeffamine® sur leur surface. La première méthode de greffage utilisée faisait appel à une oxydation TEMPO suivie d'un couplage peptidique. Après l'optimisation de la réaction de greffage, les nouveaux systèmes (NCC-g-Jeffamine) ont été caractérisés et de nouvelles propriétés ont été identifiées notamment leur insensibilité au sel, leur capacité de redispersion dans des solvants organiques, leur caractère tensioactif, leur stabilité thermique améliorée ainsi que leur thermoagrégation réversible. L'étude structurale par diffusion des neutrons aux petits angles a permis d'avoir des informations sur les épaisseurs des couches de polymère greffé ainsi que sur la conformation des chaînes. De nouvelles caractéristiques de l'auto-organisation en phase chirale-nématique de ces nouveaux systèmes ont été notées concernant leur diagramme de phase et leur pas cholestériques. La deuxième méthode de greffage explorée consistait en une oxydation aux ions métapériodate suivie d'une amination réductrice. Les résultats ont montré un détachement partiel des chaînes de cellulose suite à l'oxydation puis leur détachement complet après le greffage du polymère pour obtenir des copolymères cellulose-Jeffamine ayant éventuellement des propriétés intéressantes à étudier.

L'allergie de contact est une pathologie très répandue. Il n'existe cependant aucun traitement permettant de la soigner. L'éviction de l'allergène reste à ce jour reste le seul moyen de la prévenir. De nombreux tests visant à déterminer le pouvoir allergisant des molécules ont été développés. L'un de ces tests est le Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA), une méthode chimique visant à mimer une étape clé du mécanisme immunitaire menant à l'allergie de contact : la formation d'un complexe antigénique par réaction entre l'allergène et une protéine cutanée. Dans le cadre de la législation actuelle sur les cosmétiques, il pourrait être intéressant d'adapter ce test aux mélanges complexes. Le but de ce travail de thèse a été d'étudier la réactivité de différents mélanges d'allergènes connus vis-à-vis des trois peptides utilisés dans le DPRA et de la comparer à celle de chaque composant seul.Trois types de mélanges ont étés étudiés. Un mélange d'isothiazolinones utilisées comme conservateurs, trois mélanges binaires de trois aldéhydes utilisés comme parfums et enfin un mélange des deux responsables majeurs de l'allergie à l'absolu de mousse de chêne, un extrait utilisé en parfumerie.

Synthèse et utilisation de mimes de quadruplexes contraints pour l'évaluation de ligands II est maintenant bien connu que l'ADN simple brin peut s'associer sous différentes conformations telles que la double hélice, les triplexes, les i-motifs ou bien encore les G-quadruplexes. Ces dernières années les structures de type quadruplexes (G-quadruplexes et i-motif) ont suscité un certain intérêt notamment pour leur implications au niveau cellulaire (maintenance des télomères, activation de gènes...). C'est pourquoi de nombreuses équipes travaillent sur le développement de ligands affins pour ces structures qui pourraient agir en tant qu'anticancéreux. Cependant, le fait que les quadruplexes présentent un polymorphisme important(variabilité du nombre de brins dans la structure, des différents types de boucles et de l'orientation des brins) rend la compréhension des interactions entre un ligand et le quadruplexe plus difficile. Dans ce contexte, l'équipe développe un nouveau concept, " Template Assisted Synthesis of Quadruplexes " (TASQ) dont le but est d'obtenir un quadruplexe ne présentant qu'une topologie de façon contrôlée afin de permettre des études plus précises sur la façon dont un ligand pourrait interagir avec les quadruplexes. La première partie de ce manuscrit reporte l'évaluation par résonnance plasmonique de surface de complexes métalliques en tant que ligands de G-quadruplexe. Ces études reposent sur l'utilisation d'un premier mime de G-quadruplexe parallèle sur lequel deux séries de complexes sont testées : des métalloporphyrines et des ligands de type salphen. La seconde partie du manuscrit décrit la synthèse de mimes de G-quadruplexes antiparallèle. Elle repose sur l'utilisation du gabarit peptidique qui relié aux séquences spécifiques d'oligonucléotides de façon adéquat contraint la structure. Pour se faire, deux réactions chimiosélectives ont été utilisées : la cycloaddition 1,3 dipolaire de Huisgen et la ligation oxime. Les travaux reportés concernent trois types de structure mimant un i-motifs, des G-quadruplexes tétramoléculaires ou bimoléculaires.