Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Farmácia / Made available in DSpace on 2012-10-19T03:32:47Z (GMT). No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2014-09-26T00:07:31Z : No. of bitstreams: 1 182935.pdf: 5542999 bytes, checksum: 2d570361b04e7f6623421d367aed94e0 (MD5) / O sistema vascular encontra-se constituído por diversas enzimas oxidoredutases dependentes de NAD(P)H, que em situações fisiopatológicas podem gerar o ânion superóxido, um radical livre altamente tóxico aos sistemas biológicos. Este ânion superóxido no sistema vascular apresenta uma alta afinidade pelo óxido nítrico , um mediador da vasodilatação dependente do endotélio, gerado na parede vascular. O produto desta reação é o peroxinitrito, uma espécie reativa, com um grande potencial oxidativo. O presente trabalho avaliou a atividade das oxidoredutases dependentes de NAD(P)H, em artérias ilíacas e carótidas de coelhos, na presença de peroxinitrito. Para confirmar a viabilidade do peroxinitrito foram realizados controles com os subprodutos do peroxinitrito, como nitrato, nitrito e peroxinitrito decaído, nas mesmas concentrações de 0,3 mM e 0,1 mM, não foram observadas diferenças estatísticas entre estes produtos Foi observado um comportamento inibidor no sinal quimiluminescente vinculado a presença de superóxido, determinado por lucigenina. Na presença de NADH não ocorreu inibição estatisticamente significativa do sinal quimiluminescente pelo peroxinitrito nas concentrações estudadas (0,1 mM e 0,3 mM) e foram necessárias concentrações superiores a 0,1 mM de peroxinitrito para inibição efetiva da atividade da oxidoredutase vascular NADPH dependente, indicando que a enzima oxidoredutase vascular seja dependente de NADPH.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica / Made available in DSpace on 2013-12-05T23:33:59Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013Bitstream added on 2014-09-24T20:21:05Z : No. of bitstreams: 1 317556.pdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Na atualidade as doenças cardiovasculares representam a principal causa de mortes no mundo, sendo esta situação reflexo do estilo de vida populacional. A aterosclerose, uma das principais causa das doenças cardiovasculares, inter-relaciona diversos fatores de risco que convergem em um ponto: a produção anormal de espécies reativas de oxigênio (EROs). O aumento de EROs, e a subsequente queda na biodisponibilidade de óxido nítrico (oNO) têm sido proposto como o mecanismo patogênico da disfunção endotelial. Superóxido (O2o-) produzido principalmente pela mitocôndria endotelial reage rapidamente com oNO produzindo peroxinitrito, uma espécie reativa de nitrogênio (ERNs) que causa alterações profundas na mitocôndria, superprodução de EROs, conduzindo a disfunção endotelial e morte celular. Estes fenômenos têm sido implicados no início e na progressão do processo aterosclerótico. Este estudo teve por objetivo principal a determinação do efeito de um fluxo de peroxinitrito promovido por 1,3-morfolinosidnonimina (SIN-1), sobre a função mitocondrial e endotelial de células endoteliais de aorta bovina (BAEC). Além disso, investigamos se o disseleneto de difenila (PhSe)2, um simples composto orgânico de selênio, poderia ser utilizado como uma estratégia farmacológica para proteção contra os danos causados pelo peroxinitrito, tendo em vista as importantes propriedades antioxidantes descritas para este composto. Nossos resultados experimentais mostraram que a exposição à SIN-1 (250 ?M) causou um profundo comprometimento no consumo de oxigênio, na geração de energia e na capacidade de reserva mitocondrial nas BAEC. A disfunção mitocondrial resultou em produção adicional de peroxinitrito, amplificando o fenômeno e levando a disfunção endotelial. Além disso, observamos um extensivo declínio no potencial de membrana mitocondrial ( m), induzido pelo peroxinitrito, e este evento foi associado à morte celular apoptótica. Por outro lado, o pré-tratamento das BAEC com (PhSe)2, foi capaz de prevenir os danos celulares mediados pelo peroxinitrito possivelmente por promover um aumento na expressão de duas diferentes isoformas da enzima peroxirredoxina (Prx). O aumento na expressão da Prx em conjunto com a melhora no sistema antioxidante vinculado à glutationa (GSH), já demonstrado anteriormente por nosso grupo, contribui para a melhoria do sistema antioxidante nas células endoteliais, tornando-as mais resistentes ao dano oxidativo.<br> / Abstract : Nowadays cardiovascular diseases are the leading cause of death worldwide, and this situation reflects the lifestyle of the population. Atherosclerosis, one of the main causes of cardiovascular disease, interrelates several risk factors that converge on one point: the abnormal production of reactive oxygen species (EROs). The increase in EROs and the subsequent decrease in the bioavailability of nitric oxide (oNO) have been proposed as the pathogenic mechanism of endothelial dysfunction. Superoxide (O2o-) mainly produced by endothelial mitochondria rapidly reacts with oNO producing peroxynitrite, a reactive nitrogen species (ERNs) which causes profound changes in the mitochondria, overproduction of EROs, leading to endothelial dysfunction and cell death. These phenomena have been implicated in the onset and progression of the atherosclerotic process. This study was designed to determine the effect of a flow of peroxynitrite promoted by 1,3-morpholinylsydnonimine (SIN-1), in mitochondrial and endothelial function of bovine aortic endothelial cells (BAEC). Furthermore, we investigated whether diphenyl diselenide (PhSe)2 , a simple organic selenium compound, could be used as a pharmacological strategy for protection against peroxynitrite-mediated damage, taking into account the significant antioxidant properties described for this compound. Experimental results showed that overnight exposure to SIN-1 (250 µM) caused a profound impairment on oxygen consumption, energy generation and reserve capacity in mitochondria of BAEC. Mitochondrial dysfunction resulted in an additional intracellular production of peroxynitrite, amplifying the phenomenon and leading to endothelial dysfunction. Moreover, we observed an extensive decline in mitochondrial membrane potential (??m), induced by peroxinytrite, and this event was associated with apoptotic-type cell death. In another hand, pretreatment of BAEC with (PhSe)2, was capable to prevent peroxynitrite-mediated cell damage possibly by promoting an increase in the expression of two different isoforms of peroxiredoxin (Prx) enzyme. The increase in the expression of Prx together with the amelioration of the glutathione (GSH) antioxidant system, previously demonstrated by our group, contributes to the improvement of the antioxidant system in endothelial cells, making them more resistant to oxidative damage.

A família Tiol Peroxidases (TPxs - Peroxirredoxinas e Glutationa peroxidases) purificadas definitivamente reduzem peróxidos rapidamente (peroxinitrito, ONOOH/ONOO; peróxido de hidrogênio, H2O2), mas nenhuma evidência direta desta atividade foi demonstrada em células vivas. Isto é particularmente importante pois o ciclo catalítico da atividade peróxido redutase de TPxs depende de sucessivas reações de trocas de tióis que podem limitar a velocidade de redução do peróxido. Neste trabalho, esta questão foi investigada em Saccharomyces cerevisiae (Sc) por meio de cinética de competição com um indicador fluorescente que é específico para ONOO (ácido borônico de cumarina; CBA), com a expectativa de que quanto maior a atividade peroxinitrito redutase, menor a oxidação do indicador. Também foi investigado o papel de duas peroxirredoxinas (Prxs) específicas na remoção deste peróxido. O estudo mostrou que a oxidação do indicador CBA dependente de ONOO foi sempre significativamente maior em células de Saccharomyces cerevisiae deficientes em TPxs (cepa 8) relativo a cepa nativa (WT). Além disso, a transfecção do gene que codifica a Prx mais abundante em Saccharomyces cerevisiae (Tsa1) na cepa 8 diminui parcialmente a oxidação de CBA. Além disso, a oxidação de CBA foi maior na cepa deficiente apenas da peroxirredoxina Tsa1 (a mais abundante da família) relativo à cepa WT, mostrando a relevância desta isoforma especificamente. De forma adversa, a oxidação de CBA na cepa deficiente da peroxirredoxina Tsa2 foi semelhante à cepa WT. Também, foi constatado que o processo de remoção de ONOO é catalítico (e não estequiométrico) para crescentes fluxos de peroxinitrito em todas as cepas e condições utilizadas no estudo. Finalmente, o estudo sugere que células possuem sistemas catalíticos peroxinitrito redutase redundantes, já que a própria cepa 8 apresenta e pode modular esta atividade. Estes resultados confirmam a expectativa da relevância de TPxs na remoção de ONOO e por extensão de outros peróxidos biologicamente relevantes e são a primeira evidência direta e em tempo real da atividade peroxinitrito redutase de TPxs em células. / The purified Thiol Peroxidases family (TPxs - Peroxiredoxins and Glutathione peroxidases) rapidly reduces peroxides (peroxynitrite, ONOOH/ONOO-, hydrogen peroxide, H2O2), but no direct evidence of this activity has been demonstrated in living cells. This is particularly important since the catalytic cycle of the TPxs peroxide reductase activity depends on successive thiol exchange reactions, which may limit the rate of peroxide reduction. In this work, this question was investigated in Saccharomyces cerevisiae (Sc) by competition kinetics using a fluorescent indicator that is specific for ONOO- (coumarin boronic acid; CBA). It is expected that the higher the peroxynitrite reductase activity, the lower the oxidation of the indicator. The role of two specific peroxiredoxins (Prxs) in the removal of this peroxide has also been investigated. The study showed that the oxidation of ONOO- dependent CBA indicator was always significantly higher in TPxs-deficient Saccharomyces cerevisiae cells (strain 8) compared to the native strain (WT). In addition, the transfection of the gene encoding the most abundant Prx into Saccharomyces cerevisiae (Tsa1) in the 8 strain partially diminishes CBA oxidation. Besides that, CBA oxidation was greater in the deficient strain only of the peroxiredoxin Tsa1 (the most abundant in the family) compared to the WT strain, showing the relevance of this isoform specifically. On the other hand, CBA oxidation in the deficient strain of the Tsa2 peroxiredoxin was similar to the WT strain. Also, it was found that the ONOO- removal process is catalytic (and not stoichiometric) for increasing peroxynitrite fluxes in all strains and conditions used in the study. Finally, the study suggests that cells have redundant peroxynitrite reductase catalytic systems, since the 8 strain itself presents and can modulate this activity. These results confirm the expectation of the relevance of TPxs in the removal of ONOO- and by extension of other biologically relevant peroxides and are the first direct and real-time evidence of peroxynitrite reductase activity of TPxs in cells.

Os oxidantes derivados do peroxinitrito e das peroxidases, como mieloperoxidase (MPO), e os danos que ocasionam em proteínas vêm sendo muito estudados pela sua relevância em processos inflamatórios. Neste trabalho, as proteínas RNase e lisozima foram empregadas como alvos de oxidação e nitração mediadas por peroxinitrito e MPO/H<SUB.2O2/NO2-. Experimentos de EPR indicaram que as oxidações envolvem a formação de radicais protéicos sendo que os principais foram caracterizados como RNase-tirosila e lisozima-tirosila exposto e não exposto ao solvente, respectivamente. Estimativas do rendimento de radicais protéicos e produtos nitrados nos pHs 5,4, 6,4 e 7,4 mostrou que o peroxinitrito e o sistema MPO/H<SUB.2O2/NO2- são oxidantes mais efetivos nos pHs 7,4 e 5,4, respectivamente. Na condição ótima para cada oxidante foram identificados produtos de oxidação/nitração de resíduos de Tyr e Trp por HPLC-UV/MS-ESI. Para localização dos resíduos modificados nas estruturas das proteínas tratadas, elas foram digeridas com tripsina e os peptídeos resultantes submetidos a análise por HPLC/MS-MALDI-ToF. Desses resultados pode-se concluir que a RNase foi nitrada preferencialmente nos fragmentos contendo o(s)resíduo(s) Tyr115 > Tyr92/97 > Tyr73/76 por peroxinitrito e em praticamente todos os resíduos de tirosina por MPOH<SUB.2O2/NO2-. No caso da lisozima, o peroxinitrito oxidou principalmente o fragmento contendo os resíduos Trp62/63 que se mostrou nitrado e oxidado a dímero e quinurenina. Já o sistema MPO/H<SUB.2O2/NO2- nitrou o fragmento contendo os resíduos Tyr23/28 e nitrou e oxidou a dímeros e quinurenina o fragmento contendo os resíduos Trp62/63. As relações entre a acessibilidade dos resíduos específicos nas estruturas terciárias e a formação de produtos de oxidação/nitração são discutidas. Também, a possível importância da oxidação de resíduos de triptofano em agregação de proteínas é enfatizada. Paralelamente, examinou-se os efeitos do nitróxido tempol sobre a nitração da RNase mediada por MPO ou HRP/H<SUB.2O2/NO2- em condições de máxima nitração. De fato, as interações de tempol com peroxidases eram pouco conhecidas apesar da eficiência do nitróxido em reduzir a injúria e os níveis de 3-nitrotirosina em proteínas de tecidos de animais submetidos a condições inflamatórias. Foram determinadas as constantes de velocidade da reação do tempol com os intermediários oxidantes da MPO e HRP e também, o consumo de reagentes e a formação de produtos. A simulação dos resultados experimentais indicou que o tempol inibe a nitração da RNase mediada por peroxidases principalmente pela sua capacidade de reagir rapidamente com o &#8226;NO2 com formação de nitrito e cátion oxamônio que, por sua vez, recicla para tempol reagindo com H2O2 para produzir O2. / The oxidants derived from peroxynitrite and peroxidase enzymes, such as myeloperoxidase (MPO), and the lesions they promote in proteins are being extensively investigated because of their relevance in inflammatory processes. Here, the proteins RNase and lysozyme were employed as targets of oxidations/nitrations mediated by peroxynitrite and MPO/H<SUB.2O2/NO2-. EPR experiments showed that the oxidations produced protein radicals of which the prominent ones were characterized as RNase-tyrosyl and lysozyme-tyrosil solvent-exposed and non-exposed, respectively. Estimates of protein radical and nitrated product yields at pH 5.4, 6.4 and 7.4 indicated that peroxynitrite and MPO/H<SUB.2O2/NO2- were more effective oxidants at pH 7.4 and 5.4, respectively. At the best condition for each oxidant, the oxidation/nitration products of Tyr and Trp residues were identified by HPLC-UV/ESI-MS analysis. The site of oxidation in the protein structures were identified by HPLC/MALDI-ToF-MS analysis of tryptic digests after oxidative treatment. From these results, it was concluded that RNase was nitrated mainly in Tyr115 > Tyr92/97 > Tyr62/63 by peroxynitrite and in all Tyr by MPO/H<SUB.2O2/NO2-. In the case of lysozyme, peroxynitrite modified mainly Trp62/63 that resulted nitrated and oxidized to a dimer and kynurenine. The MPO/H<SUB.2O2/NO2- system promoted the nitration of Tyr23/Trp28 and nitration and oxidation to dimer and kynurenine of Trp62/63. The relationships between residue accessibility in the structure of the proteins and their oxidation/nitration are discussed. The possible importance of Trp oxidation in protein aggregation is emphasized. In parallel, the effects of the nitroxide tempol upon RNase nitration mediated by MPO or HRP/H<SUB.2O2/NO2- was examined. Indeed, the interactions of tempol with peroxidases have been little investigated although the nitroxide is very efficient in reducing injury and 3-nitrotyrosine protein levels in tissues of animals submitted to inflammatory conditions. The second order rate constants of tempol reactions with the ferryl oxidants of MPO and HRP were determined. The consumption of reactants and formation of products were also determined. Computer simulation of the results indicated that tempol inhibits RNAse nitration mediated by peroxidases mainly because of its capability to rapidly react with &#8226;NO2 with formation of nitrite and the oxammonium cation, which, in turn, recycles back to tempol, by reacting with H2O2 to produce O2.

A família Tiol Peroxidases (TPxs - Peroxirredoxinas e Glutationa peroxidases) purificadas definitivamente reduzem peróxidos rapidamente (peroxinitrito, ONOOH/ONOO; peróxido de hidrogênio, H2O2), mas nenhuma evidência direta desta atividade foi demonstrada em células vivas. Isto é particularmente importante pois o ciclo catalítico da atividade peróxido redutase de TPxs depende de sucessivas reações de trocas de tióis que podem limitar a velocidade de redução do peróxido. Neste trabalho, esta questão foi investigada em Saccharomyces cerevisiae (Sc) por meio de cinética de competição com um indicador fluorescente que é específico para ONOO (ácido borônico de cumarina; CBA), com a expectativa de que quanto maior a atividade peroxinitrito redutase, menor a oxidação do indicador. Também foi investigado o papel de duas peroxirredoxinas (Prxs) específicas na remoção deste peróxido. O estudo mostrou que a oxidação do indicador CBA dependente de ONOO foi sempre significativamente maior em células de Saccharomyces cerevisiae deficientes em TPxs (cepa 8) relativo a cepa nativa (WT). Além disso, a transfecção do gene que codifica a Prx mais abundante em Saccharomyces cerevisiae (Tsa1) na cepa 8 diminui parcialmente a oxidação de CBA. Além disso, a oxidação de CBA foi maior na cepa deficiente apenas da peroxirredoxina Tsa1 (a mais abundante da família) relativo à cepa WT, mostrando a relevância desta isoforma especificamente. De forma adversa, a oxidação de CBA na cepa deficiente da peroxirredoxina Tsa2 foi semelhante à cepa WT. Também, foi constatado que o processo de remoção de ONOO é catalítico (e não estequiométrico) para crescentes fluxos de peroxinitrito em todas as cepas e condições utilizadas no estudo. Finalmente, o estudo sugere que células possuem sistemas catalíticos peroxinitrito redutase redundantes, já que a própria cepa 8 apresenta e pode modular esta atividade. Estes resultados confirmam a expectativa da relevância de TPxs na remoção de ONOO e por extensão de outros peróxidos biologicamente relevantes e são a primeira evidência direta e em tempo real da atividade peroxinitrito redutase de TPxs em células. / The purified Thiol Peroxidases family (TPxs - Peroxiredoxins and Glutathione peroxidases) rapidly reduces peroxides (peroxynitrite, ONOOH/ONOO-, hydrogen peroxide, H2O2), but no direct evidence of this activity has been demonstrated in living cells. This is particularly important since the catalytic cycle of the TPxs peroxide reductase activity depends on successive thiol exchange reactions, which may limit the rate of peroxide reduction. In this work, this question was investigated in Saccharomyces cerevisiae (Sc) by competition kinetics using a fluorescent indicator that is specific for ONOO- (coumarin boronic acid; CBA). It is expected that the higher the peroxynitrite reductase activity, the lower the oxidation of the indicator. The role of two specific peroxiredoxins (Prxs) in the removal of this peroxide has also been investigated. The study showed that the oxidation of ONOO- dependent CBA indicator was always significantly higher in TPxs-deficient Saccharomyces cerevisiae cells (strain 8) compared to the native strain (WT). In addition, the transfection of the gene encoding the most abundant Prx into Saccharomyces cerevisiae (Tsa1) in the 8 strain partially diminishes CBA oxidation. Besides that, CBA oxidation was greater in the deficient strain only of the peroxiredoxin Tsa1 (the most abundant in the family) compared to the WT strain, showing the relevance of this isoform specifically. On the other hand, CBA oxidation in the deficient strain of the Tsa2 peroxiredoxin was similar to the WT strain. Also, it was found that the ONOO- removal process is catalytic (and not stoichiometric) for increasing peroxynitrite fluxes in all strains and conditions used in the study. Finally, the study suggests that cells have redundant peroxynitrite reductase catalytic systems, since the 8 strain itself presents and can modulate this activity. These results confirm the expectation of the relevance of TPxs in the removal of ONOO- and by extension of other biologically relevant peroxides and are the first direct and real-time evidence of peroxynitrite reductase activity of TPxs in cells.

Os oxidantes derivados do peroxinitrito e das peroxidases, como mieloperoxidase (MPO), e os danos que ocasionam em proteínas vêm sendo muito estudados pela sua relevância em processos inflamatórios. Neste trabalho, as proteínas RNase e lisozima foram empregadas como alvos de oxidação e nitração mediadas por peroxinitrito e MPO/H<SUB.2O2/NO2-. Experimentos de EPR indicaram que as oxidações envolvem a formação de radicais protéicos sendo que os principais foram caracterizados como RNase-tirosila e lisozima-tirosila exposto e não exposto ao solvente, respectivamente. Estimativas do rendimento de radicais protéicos e produtos nitrados nos pHs 5,4, 6,4 e 7,4 mostrou que o peroxinitrito e o sistema MPO/H<SUB.2O2/NO2- são oxidantes mais efetivos nos pHs 7,4 e 5,4, respectivamente. Na condição ótima para cada oxidante foram identificados produtos de oxidação/nitração de resíduos de Tyr e Trp por HPLC-UV/MS-ESI. Para localização dos resíduos modificados nas estruturas das proteínas tratadas, elas foram digeridas com tripsina e os peptídeos resultantes submetidos a análise por HPLC/MS-MALDI-ToF. Desses resultados pode-se concluir que a RNase foi nitrada preferencialmente nos fragmentos contendo o(s)resíduo(s) Tyr115 > Tyr92/97 > Tyr73/76 por peroxinitrito e em praticamente todos os resíduos de tirosina por MPOH<SUB.2O2/NO2-. No caso da lisozima, o peroxinitrito oxidou principalmente o fragmento contendo os resíduos Trp62/63 que se mostrou nitrado e oxidado a dímero e quinurenina. Já o sistema MPO/H<SUB.2O2/NO2- nitrou o fragmento contendo os resíduos Tyr23/28 e nitrou e oxidou a dímeros e quinurenina o fragmento contendo os resíduos Trp62/63. As relações entre a acessibilidade dos resíduos específicos nas estruturas terciárias e a formação de produtos de oxidação/nitração são discutidas. Também, a possível importância da oxidação de resíduos de triptofano em agregação de proteínas é enfatizada. Paralelamente, examinou-se os efeitos do nitróxido tempol sobre a nitração da RNase mediada por MPO ou HRP/H<SUB.2O2/NO2- em condições de máxima nitração. De fato, as interações de tempol com peroxidases eram pouco conhecidas apesar da eficiência do nitróxido em reduzir a injúria e os níveis de 3-nitrotirosina em proteínas de tecidos de animais submetidos a condições inflamatórias. Foram determinadas as constantes de velocidade da reação do tempol com os intermediários oxidantes da MPO e HRP e também, o consumo de reagentes e a formação de produtos. A simulação dos resultados experimentais indicou que o tempol inibe a nitração da RNase mediada por peroxidases principalmente pela sua capacidade de reagir rapidamente com o &#8226;NO2 com formação de nitrito e cátion oxamônio que, por sua vez, recicla para tempol reagindo com H2O2 para produzir O2. / The oxidants derived from peroxynitrite and peroxidase enzymes, such as myeloperoxidase (MPO), and the lesions they promote in proteins are being extensively investigated because of their relevance in inflammatory processes. Here, the proteins RNase and lysozyme were employed as targets of oxidations/nitrations mediated by peroxynitrite and MPO/H<SUB.2O2/NO2-. EPR experiments showed that the oxidations produced protein radicals of which the prominent ones were characterized as RNase-tyrosyl and lysozyme-tyrosil solvent-exposed and non-exposed, respectively. Estimates of protein radical and nitrated product yields at pH 5.4, 6.4 and 7.4 indicated that peroxynitrite and MPO/H<SUB.2O2/NO2- were more effective oxidants at pH 7.4 and 5.4, respectively. At the best condition for each oxidant, the oxidation/nitration products of Tyr and Trp residues were identified by HPLC-UV/ESI-MS analysis. The site of oxidation in the protein structures were identified by HPLC/MALDI-ToF-MS analysis of tryptic digests after oxidative treatment. From these results, it was concluded that RNase was nitrated mainly in Tyr115 > Tyr92/97 > Tyr62/63 by peroxynitrite and in all Tyr by MPO/H<SUB.2O2/NO2-. In the case of lysozyme, peroxynitrite modified mainly Trp62/63 that resulted nitrated and oxidized to a dimer and kynurenine. The MPO/H<SUB.2O2/NO2- system promoted the nitration of Tyr23/Trp28 and nitration and oxidation to dimer and kynurenine of Trp62/63. The relationships between residue accessibility in the structure of the proteins and their oxidation/nitration are discussed. The possible importance of Trp oxidation in protein aggregation is emphasized. In parallel, the effects of the nitroxide tempol upon RNase nitration mediated by MPO or HRP/H<SUB.2O2/NO2- was examined. Indeed, the interactions of tempol with peroxidases have been little investigated although the nitroxide is very efficient in reducing injury and 3-nitrotyrosine protein levels in tissues of animals submitted to inflammatory conditions. The second order rate constants of tempol reactions with the ferryl oxidants of MPO and HRP were determined. The consumption of reactants and formation of products were also determined. Computer simulation of the results indicated that tempol inhibits RNAse nitration mediated by peroxidases mainly because of its capability to rapidly react with &#8226;NO2 with formation of nitrite and the oxammonium cation, which, in turn, recycles back to tempol, by reacting with H2O2 to produce O2.

Biacetilo (2,3-butanediona) é um contaminante de comida e cigarro, também implicado na hepatoxicidade do álcool e em doenças pulmonares. O metilglioxal (MG), um &#945;-oxoaldeído reativo frequentemente associado ao diabetes e envelhecimento, é produto da fragmentação oxidativa de trioses fosfato, acetona e aminoacetona. Por sua vez, peroxinitrito - um potente oxidante, agente nitrante e nucleófilo formado in vivo pela reação controlada por difusão do ânion radical superóxido com o radical óxido nítrico (k ~1010 M-1s-1) é capaz de se adicionar a CO2 e compostos carbonílicos, gerando produtos potencialmente tóxicos ou sinalizadores celulares. Aminoácidos, peptídeos e nucleobases podem ser acetilados nos grupos amina e na porção desoxiribose. Relativamente ao tratamento com peroxinitrito isolado, níveis superiores de 3-nitrotirosina foram detectados quando tirosina foi tratada com peroxinitrito/biacetilo ou metilglioxal. Ambos os grupos amina de lisina (Lys) ou um deles de derivados de lisina bloqueados e um deles (Ac-Lys-OMe, Z-Lys-OMe) foram acetilados pelo sistema biacetilo ou metilglioxal/peroxinitrito. Em tetrapeptídeos sintéticos contendo lisina como aminoácido amino-terminal (H-KALA-OH, Ac-KALA-OH and H-K(Boc)ALA-OH), a lisina foi acetilada pelo sistemas dicarbonilico/peroxinitrito no grupo &#945;-amina (em maior extensão) e/ou no &#949;-amina (em menor extensão). No conjunto, estes resultados podem ser interpretados à luz do mecanismo proposto para a reação de compostos &#945;-dicarbonílicos com peroxinitrito, o qual envolve sequencialmente: (i) adição nucleofílica de peroxinitrito à carbonila; (ii) homólise do aduto peroxinitroso formado, liberando &#8226;NO2 e um radical oxila do reagente carbonílico; (iii) &#946;-clivagem do radical oxila a um ácido carboxílico (ácido acético no caso de biacetilo e ácido fórmico, a partir de metilglioxal) e radical acetila; (iv) captação do radical acetila pelo oxigênio molecular dissolvido dando acetato, ou por aminoácido ou nucleobase, se presentes, gerando o produto acetilado. Tais resultados são interessantes ao levantar a hipótese de acetilação radicalar como mecanismo de modificação pós-traducional de proteínas, até então considerado um processo realizado apenas por acetilases. / Diacetyl (2,3-butanedione) is a food and cigarette contaminant recently implicated in alcohol hepatotoxicity and lung disease. In turn, methylglyoxal (MG) is an &#945;-oxoaldehyde frequently associated with diabetes and aging that is putatively formed by the oxidative fragmentation of trioses phosphate, acetone and aminoacetone. Peroxynitrite - a potent oxidant, nitrating agent and nucleophile formed in vivo by the diffusion-controlled reaction of superoxide radical with nitric oxide (k ~1010 M-1s-1) - is able to form adducts with carbon dioxide and carbonyl compounds. When initially present in the reaction mixtures before addition of ONOO-, amino acids, peptides and nucleobases undergo acetylation at the amino group and purine moieties in the presence of biacetyl or methylglyoxal. Higher levels of 3-nitrotyrosine nitration were measured when peroxynitrite/biacetyl or metilglioxal was added to tyrosine, in comparison with peroxynitrite alone. Both amino groups of L-lysine or one of the amino groups of L-lysine derivatives (Z-Lys-OH and Ac-Lys-OH) were acetylated by biacetyl and methylglyoxal/peroxynitrite system. Using tetrapeptides containing lysine at the terminal amino acid (H-KALA-OH, Ac-KALA-OH and H-K(Boc)ALA-OH), the lysine residue was acetylated at both or either &#945;-amino (major adduct) and &#949;-amino group (minor adduct). Altogether these data can be interpreted by the mechanism proposed to describe the reaction of &#945;-dicarbonyls with peroxynitrite as follows: (i) nucleophilic addition of peroxynitrite to the carbonyl group of the reagent; (ii) homolysis of the formed peroxynitroso carbonyl adduct to &#8226;NO2 and a carbonyloxyl radical; (iii) &#946;-cleavage of the oxyl radical to acetyl radical plus acetic acid (from diacetyl) or formic acid (from methylglyoxal); (iv) competitive scavenging of the acetyl radical by dissolved molecular oxygen and by added amino acid, peptide or nucleobase, ultimately yielding acetate or acetylated biomolecule. If occurring in vivo, these radical reactions may contribute to the post-translational modification of proteins catalyzed by transacetylases.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-10-19T13:04:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 338128.pdf: 2873785 bytes, checksum: 55675b858483a8a04254782459b2cae6 (MD5) Previous issue date: 2015 / O mecanismo pelo qual a disfunção vascular séptica é iniciada, e como baixas concentrações de óxido nítrico (NO) podem estar relacionadas às vias de sinalização dos receptores de glicocorticoides (GR), são pouco entendidas. Os objetivos desse trabalho foram avaliar como a produção inicial de NO, induzida por lipopolissacarídeo (LPS), pode interferir na ativação de células musculares lisas obtidas de aorta de ratos (A7r5) e na distribuição celular dos GR. Células A7r5 estimuladas com LPS e Interferon-? (IFN) apresentaram um rápido (em minutos) aumento na produção de NO e ânion superóxido, formando peroxinitrito, e posterior ativação do NF-kB, expressão da NOS-2 e acúmulo de nitrito no sobrenadante celular. A inibição da NO sintase (NOS) e NADPH oxidase (NOX), ou o sequestro do NO e do ânion superóxido, diminuíram todos estes eventos. O silenciamento das enzimas envolvidas demonstrou que apenas a ativação das isoformas NOS-1 e NOX-1 são importantes para a expressão da NOS-2 nas células A7r5. O pré-tratamento de ratos adrenalectomizados (ADX) com 7-nitroindazol (7-NI), antes do desafio com LPS reduziu os níveis plasmáticos de IL-6 e de NOx, diminuiu a translocação nuclear de GR e reduziu a mortalidade induzida por LPS em 65%. Observou-se que a translocação nuclear de GR mediada pelo pulso de NO e peroxinitrito depende da integridade do domínio de dimerização do GR, pois não foi observada translocação de GR em fibroblastos de camundongos deficientes na dimerização de GR (GRdim/dim), bem como o pré-tratamento com 7-NI não preveniu a mortalidade destes camundongos quando desafiados com LPS. Dessa forma, concluímos que a rápida formação de NO, ânion superóxido e peroxinitrito, derivados da atividade da NOS-1 e da NOX-1, respectivamente, atuam como agentes sinalizadores para a expressão da NOS-2 através da ativação de NF-kB, sendo importantes para o início da disfunção vascular séptica. Além disso, demonstramos de forma inédita que este pulso de espécies reativas participa de uma nova via de translocação nuclear de GR induzida por LPS/IFN, na ausência de corticoides. Esta nova via pode ser importante para ajudar a entender as causas da falha dos glicocorticoides em conter a inflamação em fases avançadas da sepse. Palavras-chave: células musculares lisas vasculares, óxido nítrico, óxido nítrico sintases, peroxinitrito, receptores de glicocorticoides, translocação nuclear.<br> / Abstract : The mechanism whereby the vascular dysfunction is initiated, and how low concentrations of nitric oxide (NO) are related to glucocorticoid receptors (GR) signaling pathways are poorly understood. The objectives of this study were to understand how an initial NO release induced by lipopolysaccharide (LPS) could interfere with the activation of smooth muscle cells from rat aorta (A7r5) and cellular distribution of GR. A7r5 cells stimulated with LPS and interferon-? (IFN) showed a rapid (within minutes) increase in NO and superoxide production, forming peroxynitrite with subsequent NF-kB activation, NOS-2 expression and nitrite accumulation in cell supernatant. The inhibition of NO synthase (NOS) and NADPH oxidase (NOX) or the scavenging of NO and superoxide anion, decreased all these events. The silencing of involved enzymes showed that only the activation of NOS-1 and NOX-1 isoforms are important for the expression of NOS-2 in A7r5 cells. Pretreatment of adrenalectomized (ADX) rats with 7-nitroindazole (7-NI) before LPS challenge, reduced the plasma levels of IL-6 and NOx, decreased nuclear translocation of GR and reduced mortality induced by LPS in 65%. It was observed that the nuclear translocation of GR mediated by the NO and peroxynitrite pulse depends on the integrity of the dimerization domain of the receptor, once GR translocation in fibroblasts obtained from GR dimerization deficient mice (GRdim/dim) was not observed. Also, pre-treatment with 7-NI did not prevent the death of these mice when they were challenged with LPS. Thus, we conclude that rapid formation of NO, superoxide and peroxynitrite derived from the activity of NOS-1 and NOX-1, respectively, act as signaling agents for the expression of NOS-2 through the activation of NF-kB, being important for the initiation of septic vascular dysfunction. Furthermore, we demonstrated for the first time that this pulse of reactive species participate in a new route of GR nuclear translocation induced by LPS/IFN, in the absence of steroids. This new pathway may be important to help understand the causes of glucocorticoids failure to contain inflammation in advanced stages of sepsis.

Biacetilo (2,3-butanediona) é um contaminante de comida e cigarro, também implicado na hepatoxicidade do álcool e em doenças pulmonares. O metilglioxal (MG), um &#945;-oxoaldeído reativo frequentemente associado ao diabetes e envelhecimento, é produto da fragmentação oxidativa de trioses fosfato, acetona e aminoacetona. Por sua vez, peroxinitrito - um potente oxidante, agente nitrante e nucleófilo formado in vivo pela reação controlada por difusão do ânion radical superóxido com o radical óxido nítrico (k ~1010 M-1s-1) é capaz de se adicionar a CO2 e compostos carbonílicos, gerando produtos potencialmente tóxicos ou sinalizadores celulares. Aminoácidos, peptídeos e nucleobases podem ser acetilados nos grupos amina e na porção desoxiribose. Relativamente ao tratamento com peroxinitrito isolado, níveis superiores de 3-nitrotirosina foram detectados quando tirosina foi tratada com peroxinitrito/biacetilo ou metilglioxal. Ambos os grupos amina de lisina (Lys) ou um deles de derivados de lisina bloqueados e um deles (Ac-Lys-OMe, Z-Lys-OMe) foram acetilados pelo sistema biacetilo ou metilglioxal/peroxinitrito. Em tetrapeptídeos sintéticos contendo lisina como aminoácido amino-terminal (H-KALA-OH, Ac-KALA-OH and H-K(Boc)ALA-OH), a lisina foi acetilada pelo sistemas dicarbonilico/peroxinitrito no grupo &#945;-amina (em maior extensão) e/ou no &#949;-amina (em menor extensão). No conjunto, estes resultados podem ser interpretados à luz do mecanismo proposto para a reação de compostos &#945;-dicarbonílicos com peroxinitrito, o qual envolve sequencialmente: (i) adição nucleofílica de peroxinitrito à carbonila; (ii) homólise do aduto peroxinitroso formado, liberando &#8226;NO2 e um radical oxila do reagente carbonílico; (iii) &#946;-clivagem do radical oxila a um ácido carboxílico (ácido acético no caso de biacetilo e ácido fórmico, a partir de metilglioxal) e radical acetila; (iv) captação do radical acetila pelo oxigênio molecular dissolvido dando acetato, ou por aminoácido ou nucleobase, se presentes, gerando o produto acetilado. Tais resultados são interessantes ao levantar a hipótese de acetilação radicalar como mecanismo de modificação pós-traducional de proteínas, até então considerado um processo realizado apenas por acetilases. / Diacetyl (2,3-butanedione) is a food and cigarette contaminant recently implicated in alcohol hepatotoxicity and lung disease. In turn, methylglyoxal (MG) is an &#945;-oxoaldehyde frequently associated with diabetes and aging that is putatively formed by the oxidative fragmentation of trioses phosphate, acetone and aminoacetone. Peroxynitrite - a potent oxidant, nitrating agent and nucleophile formed in vivo by the diffusion-controlled reaction of superoxide radical with nitric oxide (k ~1010 M-1s-1) - is able to form adducts with carbon dioxide and carbonyl compounds. When initially present in the reaction mixtures before addition of ONOO-, amino acids, peptides and nucleobases undergo acetylation at the amino group and purine moieties in the presence of biacetyl or methylglyoxal. Higher levels of 3-nitrotyrosine nitration were measured when peroxynitrite/biacetyl or metilglioxal was added to tyrosine, in comparison with peroxynitrite alone. Both amino groups of L-lysine or one of the amino groups of L-lysine derivatives (Z-Lys-OH and Ac-Lys-OH) were acetylated by biacetyl and methylglyoxal/peroxynitrite system. Using tetrapeptides containing lysine at the terminal amino acid (H-KALA-OH, Ac-KALA-OH and H-K(Boc)ALA-OH), the lysine residue was acetylated at both or either &#945;-amino (major adduct) and &#949;-amino group (minor adduct). Altogether these data can be interpreted by the mechanism proposed to describe the reaction of &#945;-dicarbonyls with peroxynitrite as follows: (i) nucleophilic addition of peroxynitrite to the carbonyl group of the reagent; (ii) homolysis of the formed peroxynitroso carbonyl adduct to &#8226;NO2 and a carbonyloxyl radical; (iii) &#946;-cleavage of the oxyl radical to acetyl radical plus acetic acid (from diacetyl) or formic acid (from methylglyoxal); (iv) competitive scavenging of the acetyl radical by dissolved molecular oxygen and by added amino acid, peptide or nucleobase, ultimately yielding acetate or acetylated biomolecule. If occurring in vivo, these radical reactions may contribute to the post-translational modification of proteins catalyzed by transacetylases.

Proteína dissulfeto isomerase (PDI) é uma ditiol-dissulfeto óxido redutase ubíqua que é responsável por uma série de funções celulares, inclusive na sinalização celular e nas respostas a eventos que causam dano celular. Entretanto, a PDI pode se tornar disfuncional através das modificações pós-traducionais, incluindo as promovidas por oxidantes biológicos. Estes oxidantes são provavelmente os responsáveis pelas modificações oxidativas pós-traducionais da PDI que foram detectadas em várias condições associadas ao estresse oxidativo, levando à disfunção da proteína. Devido a falta de estudos cinéticos com a PDI nativa e a falta de caracterização dos produtos dessas reações, investigamos se a diminuição da fluorescência da PDI nativa pode ser empregada para estudos da cinética de oxidação com peróxido de hidrogênio. Posteriormente, investigamos a cinética e os produtos da reação entre PDI e peroxinitrito. Nossos experimentos mostraram que a oxidação por excesso de peróxido de hidrogênio levava a uma diminuição da fluorescência de forma dependente do tempo e da concentração do oxidante, permitindo a determinação da constante de velocidade de segunda ordem (k = (17,3±1,3) M-1 s-1, pH 7,4, 25 ºC). Relevantemente, mostramos que o processo era totalmente revertido por DDT, mostrando que o peróxido de hidrogênio oxida quase que exclusivamente os grupos ditióis da PDI (Cys53 e Cys56 e Cys397 e Cys400). Utilizando a mesma abordagem para estudar a oxidação da PDI por peroxinitrito, notamos que o decréscimo da fluorescência intrínseca da PDI nativa e a velocidade só era proporcional à concentrações sub-estequiométricas ou estequiométricas do oxidante em relação aos tióis reativos da PDI. Somente nessas condições o processo se mostrava reversível por DDT, indicando que os ditióis da PDI eram o alvo preferencial do peroxinitrito mas que a oxidação de outros resíduos também ocorria. A reação dos tióis reativos da PDI com peroxinitrito foi considerada relativamente rápida (6,9 ± 0,6 × 104 M-1 s-1, pH 7,4, 25 °C), e os resíduos de Cys reativos dos domínios a e a\' aparentam reagir com constantes de velocidade similares. Experimentos de proteólise limitada, simulações cinética e análises de MS e MS/MS confirmaram que o peroxinitrito oxida preferencialmente os tióis redox ativos da PDI para os ácidos sulfênicos correspondentes, que, subsequentemente, reagem com os tióis vizinhos, produzindo dissulfetos (Cys53- Cys56 e Cys397- Cys400). Entretanto, uma fração de peroxinitrito decai para radicais levando à hidroxilação e nitração de outros resíduos próximos ao sítio redox ativo (Trp52 Trp396 e Tyr393). Assim, investigamos também a oxidação da PDI por excesso de peroxinitrito em relação aos grupos tióis reativos por diferentes metodologias. Experimentos de SDS-PAGE, western-blot e atividade redutase mostraram que o peroxinitrito promove inativação, nitração e agregação da PDI de forma dependente da concentração de peroxinitrito. Análises de MS e MS/MS mostraram que, em excesso, o peroxinitrito promove nitração (Tyr43, Tyr49, Tyr196, Tyr393, Trp52, Trp396) e hidroxilação (Trp52, Trp396) da PDI. Em síntese, nossos estudos contribuem para melhor compreensão da oxidação da PDI por peroxinitrito e de suas possíveis consequências biológicas. / Protein disulfide isomerase (PDI) is a ubiquitous dithiol-disulfide oxidoreductase that performs an array of cellular functions, including in cellular signaling and responses to cell-damaging events. Nevertheless, PDI can become dysfunctional by post-translational modifications, including those promoted by biological oxidants. These oxidants are likely responsible for the oxidative post-translational modifications of PDI, which have detected under various conditions associated with oxidative stress, leading to protein dysfunction. However, the kinetics of the reactions of PDI with biological oxidants received limited studies and the products of these reactions were not characterized. Here, we examined whether the decrease in PDI fluorescence can be employed to follow the kinetics of the reaction of the full-length protein with biological oxidants. Also, we investigated the kinetics and products of the reaction between PDI and peroxynitrite. Our experiments showed that oxidation by excess hydrogen peroxide led to a decrease of PDI intrinsic fluorescence in a time- and concentration-dependent manner , permitting the determination of the second-order rate constant of the reaction (k = (17.3 ± 1.3 ) M1 s-1, pH 7.4, 25 ° C). The oxidation was reversed by DDT, indicating that hydrogen peroxide oxidizes mainly PDI dithiols (Cys53 and Cys56 and Cys397 and Cys400). Using the same approach to study PDI oxidation by peroxynitrite we noted that the decrease of the native PDI fluorescence was proportional to sub-stoichiometric or stoichiometric concentrations of the oxidant relative to that of PDI reactive thiols. Only under these conditions, PDI oxidation was reversed by DDT, indicating that PDI dithiols were the preferred target of peroxynitrite but that oxidation of other residues also occurred. The reaction of the active redox thiols of the PDI with peroxynitrite can be considered relatively fast (6.9 ± 0.6 × 104 M-1 s-1, pH 7.4, 25 ° C), and the reactive Cys residues of domains a and a\' were kinetically indistinguishable. Limited proteolysis experiments, kinetic simulations, and MS and MS/MS analyses confirmed that peroxynitrite preferentially oxidizes the redox-active Cys residues of PDI to the corresponding sulfenic acids, which subsequently react with the resolving thiols to produce disulfides (Cys53-Cys56 and Cys397-Cys400). However, a fraction of peroxynitrite decays to radicals leading to hydroxylation and nitration to other residues located close to the active site (Trp52 Trp396 and Tyr393). SDS-PAGE, western blotting and inhibition of the reductase activity experiments confirmed that excess peroxynitrite promotes further PDI oxidation, nitration, inactivation and aggregation in a concentration-dependent manner. MS and MS/MS analyzes showed that peroxynitrite in a ten times excess relative to PDI reactive thiols promote PDI nitration (Tyr43, Tyr49, Tyr196, Tyr393, Trp52, Trp396) and hydroxylation (Trp52, Trp396). In conclusion, our studies contribute to a better understanding of PDI oxidation by peroxynitrite and its possible biological consequences