Peroxinitrito é um potente agente oxidante, nitrante e nucleofilico formado in vivo pela reação difusional do radical ânion superóxido com óxido nítrico, cuja produção exacerbada em situações de estresse oxidativo e nitrosativo pode resultar em danos a biomoléculas e estruturas sub-celulares. Por outro lado, vários compostos carbonílicos reativos tais como acroleína e compostos α-dicarbonílicos são descritos como citotóxicos e genotóxicos, pois reagem com biomoléculas aminadas resultando em perda de funções nativas, situação esta denominada de \"estresse carbonílico\". Dentre os metabólitos α-dicarbonílicos, altamente suscetíveis a adições nucleofílicas, destacam-se o biacetilo, derivado do metabolismo hepático de etanol e contaminante de alimentos, e metilglioxal e glioxal, ambos catabólitos de glicose, proteínas e lipídios acumulados em doenças relacionadas ao envelhecimento. Neste trabalho, observou-se que, em tampão fosfato normalmente aerado de pH próximo à neutralidade, (i) estes três compostos sofrem adição nucleofílica de peroxinitrito com constantes de velocidade de segunda ordem uma a três ordens de grandeza acima dos valores relatados para compostos monocarbonílicos (k2 ≈ 4-100 M-1s-1); (ii) os sistemas biacetilo ou metilglioxal/peroxinitrito consomem o oxigênio dissolvido com produção de acetato ou acetato e formiato, respectivamente, via radical acetila capaz de acetilar histidina, lisina e 2\'-desoxiguanosina se adicionados à mistura reacional; e (iii) o sistema glioxal/peroxinitrito gera sucessivamente radical formila e radical formilhidroperoxila, cujo desproporcionamento a formiato e gás carbônico é acompanhado da emissão de luz no infra-vermelho próximo (λmax = 1270 nm), atribuída a oxigênio molecular no estado singlete (O21Δg) (Reação de Russell). Estes estudos evidenciam que a reação de metabólitos α-dicarbonílicos com peroxinitrito gera radicais livres e embasam a hipótese de que possam contribuir para a acetilação radicalar, não-enzimática intracelular, de proteínas (epigenética) e DNA, portanto potencialmente implicadas na fisiologia e patologia do envelhecimento e desordens metabólicas, nas quais a participação de espécies reativas de oxigênio, nitrogênio e compostos carbonílicos foi relatada. Deve-se ainda notar que a descoberta de acetilação radicalar de biomoléculas por metabólitos α-dicarbonilicos e peroxinitrito prepara o caminho para a identificação de novas reações químicas de biomoléculas, não catalisadas por enzimas, que possam eventualmente revelar novos biomarcadores teciduais em doenças adquiridas e inatas. / Peroxynitrite is a strong biological oxidant, nitrating and nucleophilic agent, formed by the diffusion-controlled reaction of the superoxide anion radical with nitric oxide, whose exacerbated production in oxidative and nitrosative stress leads to chemical damage to biomolecules and sub-cellular structures. On the other hand, various reactive carbonyl compounds like acrolein and α-dicarbonyls are reportedly cytotoxic and genotoxic for their ability to react with amino biomolecules resulting in loss of native functions, a situation named \"carbonyl stress\". Among very reactive α-dicarbonyls highly prone to nucleophilic additions, we highlight biacetyl, a hepatic alcohol metabolite and food contaminant, and methylglyoxal and glyoxal, both catabolites of glucose, proteins and lipids that accumulate in ageing-related disorders. Here, we report that, in normally aerated phosphate buffer near the physiological pH, (i) these three dicarbonyls undergo nucleophilic addition of peroxynitrite whose second order rate constants are one to three orders of magnitude than those documented for monocarbonyls (k2 ≈ 4-100 M-1s-1); (ii) the biacetyl or methylglyoxal/peroxynitrite systems consume the dissolved oxygen yielding the acetate anion or acetate plus formate anion, respectively, from acetyl radical intermediate which was found to acetylate added histidine, lysine and 2\'-deoxyguanosine; and (iii) the glyoxal/peroxynitrite system ultimately generate formyl radical and formylperoxyl radical, whose dismutation to formate and carbonic oxide is accompanied by near infrared monomol emission (λmax = 1270 nm) characteristic of singlet molecular oxygen (O21Δg) (Russell reaction). Our studies strongly attest that the reaction of α-dicarbonyls with peroxynitrite release free radicals that can potentially contribute for the radical, non-enzymatic acetylation of proteins (epigenetics) and DNA bases possibly implicated in the ageing physiopathology and metabolic disorders, where participation of reactive oxygen, nitrogen and carbonyl species is well recognized. Also noteworthy is that our findings may pave the way to the discovery of novel biochemical reactions whose products can eventually be useful as biomarkers of acquired and innate maladies.

Os mecanismos oxidativos pelos quais macrófagos exercem atividade microbicida permanecem em discussão, e estudos com hospedeiros animais serão essenciais para elucidar tal questão. Nesse trabalho, estudamos os mecanismos microbicidas de macrófagos in vivo comparando parâmetros de infecção nas lesões de camundongos resistentes (C57Bl/6) e suscetíveis (BALB/c) ao protozoário Leishmania amazonensis. A comparação mostrou que o controle da infecção pelos camundongos resistentes é dependente da ativação de macrófagos com expressão da enzima óxido nítrico sintase induzível, síntese de óxido nítrico e extensa nitração e hidroxilação das proteínas dos parasitas dentro dos fagolisossomos dos macrófagos. O principal agente tóxico aos parasitas parece ser derivado do peroxinitrito porque a nitração dos parasitas ocorreu na ausência virtual de células polimorfonucleares e foi acompanhada de hidroxilação. Além disso, tempol um inibidor de reações de nitração mediadas por peroxinitrito, inibiu a nitração de proteínas da lesão e aumentou o número de parasitas nelas presentes. Também, estudos com parasitas em cultura confirmaram que o peroxinitrito é citotóxico aos parasitas enquanto o óxido nítrico é citostático. O camundongo suscetível se mostrou capaz de sintetizar óxido nítrico mas o fez em estágios tardios da infecção e, provavelmente, em resposta a uma infecção secundária por bactérias. Tomados conjuntamente, os resultados indicam que o peroxinitrito e radicais dele derivados são os principais agentes leishmanicidas produzidos por macrófagos in vivo. / Macrophage oxidative microbicidal mechanisms remain debatable and their elucidation is likely to depend on studies with mammalian hosts. To examine macrophage microbicidal mechanisms in vivo, we compared infection parameters in the lesions of resistant (C57Bl/6) and susceptible (BALB/c) mice to the protozoan Leishmania amazonensis. This comparison demonstrated that infection control by resistant mice relied on macrophage activation with inducible nitric oxide synthase expression, nitric oxide synthesis and extensive nitration and hydroxylation of the proteins of the parasites inside macrophage phagolysosomes. The toxic agent to the parasite is likely to be peroxynitrite-derived because parasite nitration occurred in the virtual absence of polymorphonuclear cells and was accompanied by parasite hydroxylation. In addition, tempol, an inhibitor of peroxynitrite-mediated nitrations, inhibited protein nitration of the lesions and increased the number of parasites in them. Also, studies with parasite cultures confmed that peroxynitrite is cytotoxic to the parasites whereas nitric oxide is cytostatic. The susceptible mice were also able to synthesize nitric oxide but only at late infection time and, most likely, in response to a secondary bacterial infection. Taken together, the results indicate that peroxynitrite and derived radicals are the main leishrnanicidal agents produced by macrophages in vivo.

O peroxinitrito é um oxidante versátil, sendo responsável por oxidações uni e bieletrônicas, adições nucleofílicas, nitrações, nitrosações, hidroxilações e geração de oxigênio singlete, possuindo papéis fisiológicos e deletérios. Estudos de EPR captação de spin mostraram que compostos carbonílicos podem sofrer abstração de um elétron por peroxinitrito, seguida de consumo de oxigênio e quimiluminescência; p.ex., isobutiraldeído (IBAL), acetoacetona (AA), 3-metilacetoacetpna (MAA), etil acetoacetato (EAA), etil 2-metilacetoacetato (EMAA) e succinilacetona (SA). A emissão de luz é provavelmente devida à espécies excitadas tripletes, formadas a partir da termólise de intermediários dioxetânicos. Os perfis de pH obtidos por consumo total de oxigênio e quimiluminescência em tampão fosfato, apontam o ânion peroxinitrito como oxidante e a forma enólica dos compostos carbonílicos como substratos. A análise de produtos sugere a ocorrência de uma reação em cadeia na presença de oxigênio. Estas reações podem ter importante papel biológico, considerando-se que (i) compostos carbonílicos são ubíquos em sistemas biológicos em condições fisiológicas e patológicas, (ii) peroxinitrito está relacionado a respostas fisiológicas e patológicas, (iii) carbonilas tripletes podem ser vistas como radicais alcoxil e, dessa forma, possuir papel deletério a biomoléculas. / Peroxynitrite displays an ample repertoire of chemical reactions -one- and two-electron oxidations, nucleophilic addition, nitration, nitrosation, hydroxylation, and singlet oxygen generation conferring it cell toxicity and signalling properties. Carbonyl compounds were shown by EPR spin-trapping to suffer one-electron abstraction by peroxynitrite, which is followed by oxygen consumption and chemiluminescence; e.g., isobutyraldehyde (IBAL), acetoacetone (AA), 3-methylacetoacetone (MAA), ethyl acetoacetate (EAA), ethyl 2-methylacetoacetate (EMAA) and succinylacetone (SA). Light emission probably arises from triplet species formed by the thermolysis of dioxetane intermediates. The pH profiles traced for oxygen uptake ·and chemiluminescence in phosphate buffer point to peroxynitrite anion as the oxidant and enolized carbonyls as the actual substrates. Product analysis suggests that a chain reaction occurs in the presence of oxygen. These reactions may play important biological roles considering that (i) carbonyl compounds are ubiquitous in biological systems under physiological and pathological conditions; (ii) peroxynitrite has been implicated in cell toxicity and signalling; (iii) triplet carbonyls may be viewed as alkoxyl radicals and, therefore, play a deleterious role in biomolecules.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-05-24T17:40:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 338128.pdf: 2873785 bytes, checksum: 55675b858483a8a04254782459b2cae6 (MD5) Previous issue date: 2015 / O mecanismo pelo qual a disfunção vascular séptica é iniciada, e como baixas concentrações de óxido nítrico (NO) podem estar relacionadas às vias de sinalização dos receptores de glicocorticoides (GR), são pouco entendidas. Os objetivos desse trabalho foram avaliar como a produção inicial de NO, induzida por lipopolissacarídeo (LPS), pode interferir na ativação de células musculares lisas obtidas de aorta de ratos (A7r5) e na distribuição celular dos GR. Células A7r5 estimuladas com LPS e Interferon-? (IFN) apresentaram um rápido (em minutos) aumento na produção de NO e ânion superóxido, formando peroxinitrito, e posterior ativação do NF-kB, expressão da NOS-2 e acúmulo de nitrito no sobrenadante celular. A inibição da NO sintase (NOS) e NADPH oxidase (NOX), ou o sequestro do NO e do ânion superóxido, diminuíram todos estes eventos. O silenciamento das enzimas envolvidas demonstrou que apenas a ativação das isoformas NOS-1 e NOX-1 são importantes para a expressão da NOS-2 nas células A7r5. O pré-tratamento de ratos adrenalectomizados (ADX) com 7-nitroindazol (7-NI), antes do desafio com LPS reduziu os níveis plasmáticos de IL-6 e de NOx, diminuiu a translocação nuclear de GR e reduziu a mortalidade induzida por LPS em 65%. Observou-se que a translocação nuclear de GR mediada pelo pulso de NO e peroxinitrito depende da integridade do domínio de dimerização do GR, pois não foi observada translocação de GR em fibroblastos de camundongos deficientes na dimerização de GR (GRdim/dim), bem como o pré-tratamento com 7-NI não preveniu a mortalidade destes camundongos quando desafiados com LPS. Dessa forma, concluímos que a rápida formação de NO, ânion superóxido e peroxinitrito, derivados da atividade da NOS-1 e da NOX-1, respectivamente, atuam como agentes sinalizadores para a expressão da NOS-2 através da ativação de NF-kB, sendo importantes para o início da disfunção vascular séptica. Além disso, demonstramos de forma inédita que este pulso de espécies reativas participa de uma nova via de translocação nuclear de GR induzida por LPS/IFN, na ausência de corticoides. Esta nova via pode ser importante para ajudar a entender as causas da falha dos glicocorticoides em conter a inflamação em fases avançadas da sepse. Palavras-chave: células musculares lisas vasculares, óxido nítrico, óxido nítrico sintases, peroxinitrito, receptores de glicocorticoides, translocação nuclear.<br> / Abstract : The mechanism whereby the vascular dysfunction is initiated, and how low concentrations of nitric oxide (NO) are related to glucocorticoid receptors (GR) signaling pathways are poorly understood. The objectives of this study were to understand how an initial NO release induced by lipopolysaccharide (LPS) could interfere with the activation of smooth muscle cells from rat aorta (A7r5) and cellular distribution of GR. A7r5 cells stimulated with LPS and interferon-? (IFN) showed a rapid (within minutes) increase in NO and superoxide production, forming peroxynitrite with subsequent NF-kB activation, NOS-2 expression and nitrite accumulation in cell supernatant. The inhibition of NO synthase (NOS) and NADPH oxidase (NOX) or the scavenging of NO and superoxide anion, decreased all these events. The silencing of involved enzymes showed that only the activation of NOS-1 and NOX-1 isoforms are important for the expression of NOS-2 in A7r5 cells. Pretreatment of adrenalectomized (ADX) rats with 7-nitroindazole (7-NI) before LPS challenge, reduced the plasma levels of IL-6 and NOx, decreased nuclear translocation of GR and reduced mortality induced by LPS in 65%. It was observed that the nuclear translocation of GR mediated by the NO and peroxynitrite pulse depends on the integrity of the dimerization domain of the receptor, once GR translocation in fibroblasts obtained from GR dimerization deficient mice (GRdim/dim) was not observed. Also, pre-treatment with 7-NI did not prevent the death of these mice when they were challenged with LPS. Thus, we conclude that rapid formation of NO, superoxide and peroxynitrite derived from the activity of NOS-1 and NOX-1, respectively, act as signaling agents for the expression of NOS-2 through the activation of NF-kB, being important for the initiation of septic vascular dysfunction. Furthermore, we demonstrated for the first time that this pulse of reactive species participate in a new route of GR nuclear translocation induced by LPS/IFN, in the absence of steroids. This new pathway may be important to help understand the causes of glucocorticoids failure to contain inflammation in advanced stages of sepsis.

Proteína dissulfeto isomerase (PDI) é uma ditiol-dissulfeto óxido redutase ubíqua que é responsável por uma série de funções celulares, inclusive na sinalização celular e nas respostas a eventos que causam dano celular. Entretanto, a PDI pode se tornar disfuncional através das modificações pós-traducionais, incluindo as promovidas por oxidantes biológicos. Estes oxidantes são provavelmente os responsáveis pelas modificações oxidativas pós-traducionais da PDI que foram detectadas em várias condições associadas ao estresse oxidativo, levando à disfunção da proteína. Devido a falta de estudos cinéticos com a PDI nativa e a falta de caracterização dos produtos dessas reações, investigamos se a diminuição da fluorescência da PDI nativa pode ser empregada para estudos da cinética de oxidação com peróxido de hidrogênio. Posteriormente, investigamos a cinética e os produtos da reação entre PDI e peroxinitrito. Nossos experimentos mostraram que a oxidação por excesso de peróxido de hidrogênio levava a uma diminuição da fluorescência de forma dependente do tempo e da concentração do oxidante, permitindo a determinação da constante de velocidade de segunda ordem (k = (17,3±1,3) M-1 s-1, pH 7,4, 25 ºC). Relevantemente, mostramos que o processo era totalmente revertido por DDT, mostrando que o peróxido de hidrogênio oxida quase que exclusivamente os grupos ditióis da PDI (Cys53 e Cys56 e Cys397 e Cys400). Utilizando a mesma abordagem para estudar a oxidação da PDI por peroxinitrito, notamos que o decréscimo da fluorescência intrínseca da PDI nativa e a velocidade só era proporcional à concentrações sub-estequiométricas ou estequiométricas do oxidante em relação aos tióis reativos da PDI. Somente nessas condições o processo se mostrava reversível por DDT, indicando que os ditióis da PDI eram o alvo preferencial do peroxinitrito mas que a oxidação de outros resíduos também ocorria. A reação dos tióis reativos da PDI com peroxinitrito foi considerada relativamente rápida (6,9 ± 0,6 × 104 M-1 s-1, pH 7,4, 25 °C), e os resíduos de Cys reativos dos domínios a e a\' aparentam reagir com constantes de velocidade similares. Experimentos de proteólise limitada, simulações cinética e análises de MS e MS/MS confirmaram que o peroxinitrito oxida preferencialmente os tióis redox ativos da PDI para os ácidos sulfênicos correspondentes, que, subsequentemente, reagem com os tióis vizinhos, produzindo dissulfetos (Cys53- Cys56 e Cys397- Cys400). Entretanto, uma fração de peroxinitrito decai para radicais levando à hidroxilação e nitração de outros resíduos próximos ao sítio redox ativo (Trp52 Trp396 e Tyr393). Assim, investigamos também a oxidação da PDI por excesso de peroxinitrito em relação aos grupos tióis reativos por diferentes metodologias. Experimentos de SDS-PAGE, western-blot e atividade redutase mostraram que o peroxinitrito promove inativação, nitração e agregação da PDI de forma dependente da concentração de peroxinitrito. Análises de MS e MS/MS mostraram que, em excesso, o peroxinitrito promove nitração (Tyr43, Tyr49, Tyr196, Tyr393, Trp52, Trp396) e hidroxilação (Trp52, Trp396) da PDI. Em síntese, nossos estudos contribuem para melhor compreensão da oxidação da PDI por peroxinitrito e de suas possíveis consequências biológicas. / Protein disulfide isomerase (PDI) is a ubiquitous dithiol-disulfide oxidoreductase that performs an array of cellular functions, including in cellular signaling and responses to cell-damaging events. Nevertheless, PDI can become dysfunctional by post-translational modifications, including those promoted by biological oxidants. These oxidants are likely responsible for the oxidative post-translational modifications of PDI, which have detected under various conditions associated with oxidative stress, leading to protein dysfunction. However, the kinetics of the reactions of PDI with biological oxidants received limited studies and the products of these reactions were not characterized. Here, we examined whether the decrease in PDI fluorescence can be employed to follow the kinetics of the reaction of the full-length protein with biological oxidants. Also, we investigated the kinetics and products of the reaction between PDI and peroxynitrite. Our experiments showed that oxidation by excess hydrogen peroxide led to a decrease of PDI intrinsic fluorescence in a time- and concentration-dependent manner , permitting the determination of the second-order rate constant of the reaction (k = (17.3 ± 1.3 ) M1 s-1, pH 7.4, 25 ° C). The oxidation was reversed by DDT, indicating that hydrogen peroxide oxidizes mainly PDI dithiols (Cys53 and Cys56 and Cys397 and Cys400). Using the same approach to study PDI oxidation by peroxynitrite we noted that the decrease of the native PDI fluorescence was proportional to sub-stoichiometric or stoichiometric concentrations of the oxidant relative to that of PDI reactive thiols. Only under these conditions, PDI oxidation was reversed by DDT, indicating that PDI dithiols were the preferred target of peroxynitrite but that oxidation of other residues also occurred. The reaction of the active redox thiols of the PDI with peroxynitrite can be considered relatively fast (6.9 ± 0.6 × 104 M-1 s-1, pH 7.4, 25 ° C), and the reactive Cys residues of domains a and a\' were kinetically indistinguishable. Limited proteolysis experiments, kinetic simulations, and MS and MS/MS analyses confirmed that peroxynitrite preferentially oxidizes the redox-active Cys residues of PDI to the corresponding sulfenic acids, which subsequently react with the resolving thiols to produce disulfides (Cys53-Cys56 and Cys397-Cys400). However, a fraction of peroxynitrite decays to radicals leading to hydroxylation and nitration to other residues located close to the active site (Trp52 Trp396 and Tyr393). SDS-PAGE, western blotting and inhibition of the reductase activity experiments confirmed that excess peroxynitrite promotes further PDI oxidation, nitration, inactivation and aggregation in a concentration-dependent manner. MS and MS/MS analyzes showed that peroxynitrite in a ten times excess relative to PDI reactive thiols promote PDI nitration (Tyr43, Tyr49, Tyr196, Tyr393, Trp52, Trp396) and hydroxylation (Trp52, Trp396). In conclusion, our studies contribute to a better understanding of PDI oxidation by peroxynitrite and its possible biological consequences

O peroxinitrito é um oxidante versátil, sendo responsável por oxidações uni e bieletrônicas, adições nucleofílicas, nitrações, nitrosações, hidroxilações e geração de oxigênio singlete, possuindo papéis fisiológicos e deletérios. Estudos de EPR captação de spin mostraram que compostos carbonílicos podem sofrer abstração de um elétron por peroxinitrito, seguida de consumo de oxigênio e quimiluminescência; p.ex., isobutiraldeído (IBAL), acetoacetona (AA), 3-metilacetoacetpna (MAA), etil acetoacetato (EAA), etil 2-metilacetoacetato (EMAA) e succinilacetona (SA). A emissão de luz é provavelmente devida à espécies excitadas tripletes, formadas a partir da termólise de intermediários dioxetânicos. Os perfis de pH obtidos por consumo total de oxigênio e quimiluminescência em tampão fosfato, apontam o ânion peroxinitrito como oxidante e a forma enólica dos compostos carbonílicos como substratos. A análise de produtos sugere a ocorrência de uma reação em cadeia na presença de oxigênio. Estas reações podem ter importante papel biológico, considerando-se que (i) compostos carbonílicos são ubíquos em sistemas biológicos em condições fisiológicas e patológicas, (ii) peroxinitrito está relacionado a respostas fisiológicas e patológicas, (iii) carbonilas tripletes podem ser vistas como radicais alcoxil e, dessa forma, possuir papel deletério a biomoléculas. / Peroxynitrite displays an ample repertoire of chemical reactions -one- and two-electron oxidations, nucleophilic addition, nitration, nitrosation, hydroxylation, and singlet oxygen generation conferring it cell toxicity and signalling properties. Carbonyl compounds were shown by EPR spin-trapping to suffer one-electron abstraction by peroxynitrite, which is followed by oxygen consumption and chemiluminescence; e.g., isobutyraldehyde (IBAL), acetoacetone (AA), 3-methylacetoacetone (MAA), ethyl acetoacetate (EAA), ethyl 2-methylacetoacetate (EMAA) and succinylacetone (SA). Light emission probably arises from triplet species formed by the thermolysis of dioxetane intermediates. The pH profiles traced for oxygen uptake ·and chemiluminescence in phosphate buffer point to peroxynitrite anion as the oxidant and enolized carbonyls as the actual substrates. Product analysis suggests that a chain reaction occurs in the presence of oxygen. These reactions may play important biological roles considering that (i) carbonyl compounds are ubiquitous in biological systems under physiological and pathological conditions; (ii) peroxynitrite has been implicated in cell toxicity and signalling; (iii) triplet carbonyls may be viewed as alkoxyl radicals and, therefore, play a deleterious role in biomolecules.

Peroxinitrito é um potente agente oxidante, nitrante e nucleofilico formado in vivo pela reação difusional do radical ânion superóxido com óxido nítrico, cuja produção exacerbada em situações de estresse oxidativo e nitrosativo pode resultar em danos a biomoléculas e estruturas sub-celulares. Por outro lado, vários compostos carbonílicos reativos tais como acroleína e compostos &#945;-dicarbonílicos são descritos como citotóxicos e genotóxicos, pois reagem com biomoléculas aminadas resultando em perda de funções nativas, situação esta denominada de \"estresse carbonílico\". Dentre os metabólitos &#945;-dicarbonílicos, altamente suscetíveis a adições nucleofílicas, destacam-se o biacetilo, derivado do metabolismo hepático de etanol e contaminante de alimentos, e metilglioxal e glioxal, ambos catabólitos de glicose, proteínas e lipídios acumulados em doenças relacionadas ao envelhecimento. Neste trabalho, observou-se que, em tampão fosfato normalmente aerado de pH próximo à neutralidade, (i) estes três compostos sofrem adição nucleofílica de peroxinitrito com constantes de velocidade de segunda ordem uma a três ordens de grandeza acima dos valores relatados para compostos monocarbonílicos (k2 &#8776; 4-100 M-1s-1); (ii) os sistemas biacetilo ou metilglioxal/peroxinitrito consomem o oxigênio dissolvido com produção de acetato ou acetato e formiato, respectivamente, via radical acetila capaz de acetilar histidina, lisina e 2\'-desoxiguanosina se adicionados à mistura reacional; e (iii) o sistema glioxal/peroxinitrito gera sucessivamente radical formila e radical formilhidroperoxila, cujo desproporcionamento a formiato e gás carbônico é acompanhado da emissão de luz no infra-vermelho próximo (&#955;max = 1270 nm), atribuída a oxigênio molecular no estado singlete (O21&#916;g) (Reação de Russell). Estes estudos evidenciam que a reação de metabólitos &#945;-dicarbonílicos com peroxinitrito gera radicais livres e embasam a hipótese de que possam contribuir para a acetilação radicalar, não-enzimática intracelular, de proteínas (epigenética) e DNA, portanto potencialmente implicadas na fisiologia e patologia do envelhecimento e desordens metabólicas, nas quais a participação de espécies reativas de oxigênio, nitrogênio e compostos carbonílicos foi relatada. Deve-se ainda notar que a descoberta de acetilação radicalar de biomoléculas por metabólitos &#945;-dicarbonilicos e peroxinitrito prepara o caminho para a identificação de novas reações químicas de biomoléculas, não catalisadas por enzimas, que possam eventualmente revelar novos biomarcadores teciduais em doenças adquiridas e inatas. / Peroxynitrite is a strong biological oxidant, nitrating and nucleophilic agent, formed by the diffusion-controlled reaction of the superoxide anion radical with nitric oxide, whose exacerbated production in oxidative and nitrosative stress leads to chemical damage to biomolecules and sub-cellular structures. On the other hand, various reactive carbonyl compounds like acrolein and &#945;-dicarbonyls are reportedly cytotoxic and genotoxic for their ability to react with amino biomolecules resulting in loss of native functions, a situation named \"carbonyl stress\". Among very reactive &#945;-dicarbonyls highly prone to nucleophilic additions, we highlight biacetyl, a hepatic alcohol metabolite and food contaminant, and methylglyoxal and glyoxal, both catabolites of glucose, proteins and lipids that accumulate in ageing-related disorders. Here, we report that, in normally aerated phosphate buffer near the physiological pH, (i) these three dicarbonyls undergo nucleophilic addition of peroxynitrite whose second order rate constants are one to three orders of magnitude than those documented for monocarbonyls (k2 &#8776; 4-100 M-1s-1); (ii) the biacetyl or methylglyoxal/peroxynitrite systems consume the dissolved oxygen yielding the acetate anion or acetate plus formate anion, respectively, from acetyl radical intermediate which was found to acetylate added histidine, lysine and 2\'-deoxyguanosine; and (iii) the glyoxal/peroxynitrite system ultimately generate formyl radical and formylperoxyl radical, whose dismutation to formate and carbonic oxide is accompanied by near infrared monomol emission (&#955;max = 1270 nm) characteristic of singlet molecular oxygen (O21&#916;g) (Russell reaction). Our studies strongly attest that the reaction of &#945;-dicarbonyls with peroxynitrite release free radicals that can potentially contribute for the radical, non-enzymatic acetylation of proteins (epigenetics) and DNA bases possibly implicated in the ageing physiopathology and metabolic disorders, where participation of reactive oxygen, nitrogen and carbonyl species is well recognized. Also noteworthy is that our findings may pave the way to the discovery of novel biochemical reactions whose products can eventually be useful as biomarkers of acquired and innate maladies.

Os mecanismos oxidativos pelos quais macrófagos exercem atividade microbicida permanecem em discussão, e estudos com hospedeiros animais serão essenciais para elucidar tal questão. Nesse trabalho, estudamos os mecanismos microbicidas de macrófagos in vivo comparando parâmetros de infecção nas lesões de camundongos resistentes (C57Bl/6) e suscetíveis (BALB/c) ao protozoário Leishmania amazonensis. A comparação mostrou que o controle da infecção pelos camundongos resistentes é dependente da ativação de macrófagos com expressão da enzima óxido nítrico sintase induzível, síntese de óxido nítrico e extensa nitração e hidroxilação das proteínas dos parasitas dentro dos fagolisossomos dos macrófagos. O principal agente tóxico aos parasitas parece ser derivado do peroxinitrito porque a nitração dos parasitas ocorreu na ausência virtual de células polimorfonucleares e foi acompanhada de hidroxilação. Além disso, tempol um inibidor de reações de nitração mediadas por peroxinitrito, inibiu a nitração de proteínas da lesão e aumentou o número de parasitas nelas presentes. Também, estudos com parasitas em cultura confirmaram que o peroxinitrito é citotóxico aos parasitas enquanto o óxido nítrico é citostático. O camundongo suscetível se mostrou capaz de sintetizar óxido nítrico mas o fez em estágios tardios da infecção e, provavelmente, em resposta a uma infecção secundária por bactérias. Tomados conjuntamente, os resultados indicam que o peroxinitrito e radicais dele derivados são os principais agentes leishmanicidas produzidos por macrófagos in vivo. / Macrophage oxidative microbicidal mechanisms remain debatable and their elucidation is likely to depend on studies with mammalian hosts. To examine macrophage microbicidal mechanisms in vivo, we compared infection parameters in the lesions of resistant (C57Bl/6) and susceptible (BALB/c) mice to the protozoan Leishmania amazonensis. This comparison demonstrated that infection control by resistant mice relied on macrophage activation with inducible nitric oxide synthase expression, nitric oxide synthesis and extensive nitration and hydroxylation of the proteins of the parasites inside macrophage phagolysosomes. The toxic agent to the parasite is likely to be peroxynitrite-derived because parasite nitration occurred in the virtual absence of polymorphonuclear cells and was accompanied by parasite hydroxylation. In addition, tempol, an inhibitor of peroxynitrite-mediated nitrations, inhibited protein nitration of the lesions and increased the number of parasites in them. Also, studies with parasite cultures confmed that peroxynitrite is cytotoxic to the parasites whereas nitric oxide is cytostatic. The susceptible mice were also able to synthesize nitric oxide but only at late infection time and, most likely, in response to a secondary bacterial infection. Taken together, the results indicate that peroxynitrite and derived radicals are the main leishrnanicidal agents produced by macrophages in vivo.

A astaxantina (AST) é um carotenóide derivado do &#946;-caroteno produzido por algas e cianobactérias, mas que também pode ser encontrada em animais marinhos. Em animais, é reportada como interceptadora de radicais de oxigênio mais eficiente que o &#946;-caroteno. O objetivo central dessa dissertação foi avaliar a capacidade antioxidante da AST em lipossomos enriquecidos com citocromo c (cit c) desafiados com 3-morfolinosidnonimina (SIN-1), um doador de óxido nítrico, em diferentes microambientes (pH e composição das vesículas). Diferenças na interação destas vesículas com o cit c periférico, com reflexos na atividade antioxidante da AST também foram avaliadas. O SIN-1 gera, por termólise, quantidades equimolares de radical superóxido e óxido nítrico, quando há oxigênio no meio. Vesículas unilamelares de fosfatidilcolina (PC), PC contendo 5% ou 10% de fosfatidilglicerol (PG), com ou sem AST, foram incubadas com SIN-1 e/ou cit c. Medidas do índice de lipoperoxidação pelo teste das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) revelaram que SIN-1 não causa aumento de TBARS, enquanto o cit c foi capaz de aumentar significativamente este índice. Este fato pode ser explicado pela atividade peroxidásica do cit c. Apenas em vesículas de PCPG10%, ao realizar a incubação do cit c concomitantemente com SIN-1, o índice de TBARS foi maior ao observado em vesículas incubadas apenas com cit c. É conhecido que a interação entre cit c e membranas aniônicas pode alterar a conformação da proteína, aumentando sua atividade peroxidásica. A presença da AST fez com que os índices de lipoperoxidação chegassem a valores próximos aos do controle. A alteração no pH do meio revelou que a AST possui ação antioxidante mais pronunciada em pHs 7,4 e 8,0, em comparação com pHs levemente ácidos. A presença de PG evidenciou ainda mais esta tendência e em pH 6,2, a AST apresentou inclusive pequena atividade próoxidante. Estes resultados podem ser discutidos à luz de alterações da permeabilidade da membrana e da reatividade de espécies reativas induzidas por mudanças da fluidez e de pH. O efeito dos produtos gerados por SIN-1 sobre o cit c foi estudado em condições de normóxia e hipóxia. Resultados de EPR e de fluorescência demonstram que a presença do radical superóxido previne lesões oxidativas causada por peróxido orgânico (t-butOOH) tanto no cit c quanto nas membranas, pois é capaz de reduzir o ferro hemínico do cit c. Através de CD e espectrofotometria UV-Vis e EPR, foi observado que a incubação com SIN-1 promove alterações estruturais no cit c causando ruptura na sexta coordenação do ferro hemínico, levando à geração de uma espécie de cit c com rombicidade menor em comparação ao cit c nativo e que apresenta maior atividade peroxidásica. Este trabalho contribui com informações para entendimento do mecanismo antioxidante da AST em diferentes microambientes, além de demonstrar o efeito paradoxal do superóxido que é capaz de proteger o cit c, através da redução do ferro hemínico, mas também pode expor a proteína à oxidação promovida por peroxinitrito. / Astaxanthin (AST) is a &#946;-carotene derived carotenoid, produced by algae and cyanobacteria, but can also be found in marine animals. In phytoplankton it has the function to absorb light radiation for photosinthesys occurence. In animals AST acts as a scavenger of oxygen free radicals, even more efficiently than &#946;-carotene itself. The main objective of this work is to evaluate the antioxidant capacity of AST over cytochrome c (cyt c) incorporated in liposomes and challenged with 3-morpholinosidnonimine (SIN-1), a nitric oxide donor, under different experimental conditions, namely vesicles composition and pH. Distinct interactions between cyt c and vesicles affecting the AST antioxidant activity were also evaluated. SIN-1 spontaneously generates equal amount of nitric oxide and superoxide anion when oxygen is present. Unilamellar vesicles made from phosphatidylcholine (PC) or PC with 5% or 10% of phosphatidylglycerol (PG), with or without AST, were incubated with SIN-1 and/or cyt c. The extent of lipid peroxidation was evaluated by the classical method of thiobarbituric reactive substances (TBARS). Control experiments with SIN-1 alone showed no increase in TBARS content, whereas cyt c significantly increased TBARS. Concomitant addition of cyt c, SIN-1 to PCPG10% vesicles led to lipid peroxidation indices even higher than those found when cyt c was incubated with PCPG10% vesicles. A peroxidase activity of cyt c resulting from the interaction between this protein and anionic membranes can explain this result. In this system, the presence of AST inhibited formation of TBARS, whose levels were near the control values. Astaxanthin was found to exhibit a more effective antioxidant capacity under basic pH (7.4 and 8.0), in comparison with pH 6.2 and 6.8. In the presence of PG, this trend became more evident. Interestingly, at pH 6.2, AST showed a slight pro-oxidant activity. These results can be explained by differences in membrane permeability and reactivity of reactive species, caused by pH and membrane fluidity alterations. The effects of products of SIN-1 decomposition on cyt c structure and its peroxidase activity were investigated under hypoxia and normoxia. EPR and fluorescence experiments revealed that superoxide anion radical, due to its ability to reduce heme iron, prevents oxidative damage of cyt c and membrane lipids by peroxide-derived free radicals. By means of CD and UV-Visible spectroscopy, we have found that concomitant incubation of SIN-1 and cyt c promoted structural alterations in the protein which changes the irons sixth axial coordination, leading to generation of a less rhombic cyt c, which is reportedly a better peroxidase than native cyt c. This work contributes with information aiming to better understand the antioxidant mechanism of AST under different membrane microenvironments and unveil a paradoxal effect of superoxide ion, which can protect cyt c from oxidative lesions by transferring electron to ferricyt c, but can also expose cyt c to oxidation by peroxynitrite.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Atherosclerosis is a chronic inflammatory condition associated with an overproduction of oxidant species. Since low density lipoprotein (LDL) oxidation plays a key role in the pathogenesis of atherosclerosis, antioxidants that can inhibit this oxidative process might be useful in preventing atherosclerosis-related pathological conditions, such as cardiovascular diseases and stroke. Here, we investigated the potential toxicological effects and the anti-atherogenic properties of diphenyl diselenide (PhSe)2, a simple organoselenium compound that presents important antioxidant properties. Toxicological studies, revealed that (PhSe)2, orally administered, produced minor toxicological effects in rabbits exposure for a long term. The toxic potential of (PhSe)2 was evidenced by a decrease in the ascorbic acid contents in blood, liver and brain of rabbits. Nevertheless, the prolonged exposition with (PhSe)2 was not hepato or renotoxic and not modified the others oxidative stress parameters. The consumption of (PhSe)2 by hipercholesterolemic rabbits significantly decreased the serum cholesterol levels and also diminished the serum and hepatic levels of TBARS, as well as the production of free radical species in blood and brain. In vitro studies demonstrated that (PhSe)2 showed a dosedependent protective effect against Cu2+ and 2,2-azobis-2-amidinopropane (AAPH)-induced oxidation of LDL or parinaric acid (PnA) incorporated into isolated human LDL. Interestingly, (PhSe)2 also protected protein moieties from human isolated LDL against Cu2+-induced oxidation. These effects were related to its thiol-peroxidase activity. In experiments with primary cultures of bovine aortic endothelial cells (BAEC), (PhSe)2 protected endothelial cells from the damage promoted by peroxynitrite exposure, in a more effective way than ebselen. The intracellular levels of glutathione (GSH) were almost completely consumed by peroxynitrite and although the compounds did not restore the normal levels, (PhSe)2 per se increases significantly GSH in a concentration-dependent manner. This effect may be related with the significant increase in cellular glutathione peroxidase (GPx) activity promoted by this compound. Taken together, the results indicated that (PhSe)2 is relatively safe for rabbits even after a prolonged time of ingestion and suggest a new role for diphenyl diselenide as a potential anti-atherogenic agent. / A aterosclerose é uma condição inflamatória crônica associada à produção de espécies oxidantes. A oxidação da lipoproteína de baixa densidade (LDL) parece ter um papel fundamental na patogênese da aterosclerose, desta forma os antioxidantes, substâncias capazes de inibir o processo oxidativo, podem ser úteis na prevenção das condições patológicas associadas à aterosclerose, como doenças cardiovasculares e acidentes vasculares cerebrais. Nesta tese, investigou-se os potenciais efeitos toxicológicos e as propriedades anti-aterogênicas do disseleneto de difenila (PhSe)2, um simples composto orgânico de selênio que apresenta importantes propriedades antioxidantes. Os estudos toxicológicos revelaram que o (PhSe)2 oralmente administrado produziu poucos efeitos tóxicos nos coelhos expostos ao composto por um longo período de tempo. O principal efeito tóxico do (PhSe)2 foi a diminuição dos níveis de ácido ascórbico no sangue, fígado e cérebro dos coelhos. Todavia, a exposição prolongada ao (PhSe)2 não alterou os marcadores clássicos de lesão hepática e renal e os demais marcadores do estresse oxidativo. O consumo de (PhSe)2 por coelhos hipercolesterolêmicos diminuiu significativamente os níveis sorológicos de colesterol total e ainda reduziu os níveis sanguíneos e hepáticos de TBARS, bem como a produção de espécies oxidativas no sangue e no cérebro destes animais. Estudos in vitro demonstraram que o (PhSe)2 protegeu LDLs humanas isoladas contra a oxidação induzida por Cu2+ e AAPH e a oxidação do ácido parinárico (PnA) incorporado nas LDLs de maneira concentração dependente. O (PhSe)2 também foi capaz de prevenir a oxidação da porção protéica das LDLs. Estes efeitos protetores do (PhSe)2 foram associados a sua atividade tiol peroxidase. Em experimentos utilizando cultura primária de células endoteliais de aorta bovina (BAEC), evidenciou-se o efeito protetor do (PhSe)2 contra a morte celular induzida pelo peroxinitrito, de forma mais efetiva que o ebselen. Os níveis intracelulares de glutationa (GSH) foram completamente consumidos pelo peroxinitrito. O (PhSe)2 per se aumentou significativamente os níveis de GSH de maneira concentração dependente, todavia, a adição dos compostos não preveniu o consumo de GSH pelo peroxinitrito. Este efeito pode ser relacionado com o significativo aumento na atividade celular da glutationa peroxidase (GPx) promovido pelo (PhSe)2. Em conclusão estes resultados indicam que a suplementação oral com (PhSe)2 demonstrou baixa toxicidade nos coelhos mesmo após uma ingestão prolongada do composto e sugere-se um novo papel para o (PhSe)2 como um potencial agente anti-aterogênico.