L’administration systémique d’atorvastatine s’est montrée neuroprotective suivant un traumatisme médullaire, en diminuant la réponse inflammatoire au site de la lésion ainsi qu’en réduisant l’apoptose des oligodendrocytes. Ce dernier épargne la matière blanche au site de l’insulte et améliore la locomotion. Le but de cette étude était de confirmer l’efficacité neuroprotective de l’atorvastatine ainsi que son action précoce, lorsqu’administré post-trauma, sur la limitation de l’apoptose. Des rats Sprague-Dawley femelles ont reçu une injection intrapéritonéale de : (1) statine/saline (5 mg/kg) 2 h après une lésion contusive; (2) saline physiologique 2 h post-contusion; ou (3) saline physiologique sans lésion. Les rats traités à la statine ont montré une amélioration significative (p<0.05) de leur locomotion après 4 semaines post-trauma, comparée au groupe « véhicule » lésé. Expliquant cette observation, l’activité de la caspase-3 fut diminuée de 50% (p<0.05) et la méthode de TUNEL révéla une diminution d’approximativement 20% du nombre de cellules apoptotiques au site lésionnel (p<0.01) 4 h après l’insulte contusive chez le groupe traité en comparaison aux groupes « véhicules ». Ces résultats démontrent que l’atorvastatine est efficace dans la prévention de l’apoptose précoce au site lésionnel dans un modèle expérimental de traumatisme médullaire après seulement 2 h post-traumatisme. / The systemic administration of atorvastatin has been shown to be neuroprotective after spinal cord injury (SCI), by decreasing the inflammatory response at the lesion site and by reducing neuronal and oligodendrocyte apoptosis. The latter effect spares white matter at the injury site and improves locomotion. The aim of this study was to confirm the neuroprotective efficacy of atorvastatin as well as its early action in limiting apoptosis with its administration post-SCI. Female Sprague-Dawley rats received an intra peritoneal injection of: (1) statin/saline (5 mg/kg) at 2 h after the contusion injury; (2) physiological saline at 2 h post-SCI; or (3) physiological saline without injury. Statin-treated rats showed significant (p<0.05) improvement in locomotion at week 4 post-SCI compared to vehicle-treated animals. Explaining this outcome, caspase-3 activity decreased by 50% (p<0.05), and the histological TUNEL method revealed a decrease of approximately 20% in apoptotic cells at the injury site (p<0.01) at 4 h post-SCI in atorvastatin-treated rats in comparison to vehicle-treated controls. These data demonstrate that atorvastatin is effective after experimental spinal cord contusion injury in preventing early apoptosis at the injury site within 2 h post-administration.

Effet positif de la N-acétylcystéine sur la dysfonction endothéliale des artères coronaires épicardiques associée à une hypertrophie ventriculaire gauche dans un modèle porcin A. A. HORN, M-C AUBIN, YF SHI, J-C TARDIF, M. CARRIER , L. P. PERRAULT INSTITUT DE CARDIOLOGIE DE MONTRÉAL, MONTRÉAL, CANADA, Objectif : Il a été démontré dans le laboratoire que dans notre modèle d’hypertrophie ventriculaire gauche, la dysfonction endothéliale est secondaire à une diminution de la biodisponibilité du NO, celle-ci étant causée par une augmentation du stress oxydant tel que démontré par Malo et al. (2003) et Aubin et al. (2006). Le but de la présente étude est d’étudier l’effet d’un traitement chronique de la N-acétylcystéine (NAC) (un antioxydant) sur la dysfonction endothéliale associée à une hypertrophie ventriculaire gauche (HVG). Méthodologie: L’HVG a été induite par cerclage aortique (CA) chez vingt-et-un porcelets âgés de deux mois qui furent divisés aléatoirement en quatre groupes expérimentaux. Le groupe témoin (groupe 1) a été soumis à une thoracotomie antérolatérale gauche sans cerclage aortique (n=3). Le groupe 2 a été soumis à un cerclage aortique pour une période de 60 jours (n=6). Le groupe 3 a subi un cerclage aortique et a reçu un traitement oral de N-acétylcystéine de 1000 mg/jour per os pendant 60 jours commençant le jour de la chirurgie (n=6). Le groupe 4 a été soumis à un cerclage aortique et a reçu un traitement oral de N-acétylcystéine : 1000 mg/par jour pendant 30 jours commençant le jour 30 (post-chirurgie) (n=6). L’hypertrophie fut évaluée par échocardiographie. La réactivité vasculaire fut étudiée à l’aide de chambres d’organes par la construction des courbes concentration-réponse à la sérotonine (5-HT: relaxations induites par les récepteurs 5-HT1D, couplés aux protéines Gi) et à la bradykinine (BK: relaxations induites par les récepteurs B2, couplés aux protéines Gq). Les quantités de nitrites/nitrates et la production basale de GMPc ont été mesurées pour évaluer la fonction endothéliale. Le stress oxydant a été étudié en quantifiant les concentrations plasmatiques d’hydroperoxydes lipidiques et de glutathion réduit, ainsi que l’activité plasmatique des enzymes antioxydantes peroxydase du glutathion et dismutase du superoxyde. Résultats: Le rapport masse ventricule gauche/masse corporelle était significativement plus élevé pour le groupe 2 comparativement au groupe 1 (p<0,05) confirmant la présence d’une HVG. Le développement de l’HVG dans le groupe 3 a pu être prévenu par la NAC et sa progression fut atténuée dans le groupe 4 (p<0,05 versus groupe 2). La présence de la dysfonction endothéliale a été confirmée chez le groupe 2, tel qu’illustré par une diminution significative des relaxations maximales à la 5-HT et à la BK comparativement au groupe témoin. Le traitement à la NAC a significativement potentialisé les relaxations maximales (p<0,05) induites par la sérotonine et par la bradykinine, chez les deux groupes traités. Cette amélioration des relaxations dépendantes de l’endothélium peut être la conséquence d’une augmentation significative (p<0,05) de la biodisponibilité du monoxyde d’azote pour les cellules musculaires lisses, tel que suggéré par l’augmentation du ratio nitrites/nitrates et de la production basale de GMPc chez les groupes 3 et 4 comparativement au groupe 2. Cette augmentation du facteur relaxant peut résulter d’une augmentation de sa production par les cellules endothéliales ou d’une diminution de sa neutralisation par les espèces réactives oxygénées. De fait, les concentrations d’hydroperoxydes lipidiques étaient significativement inférieures (p<0,05) et associées à une augmentation des concentrations de l’antioxydant glutathion réduit et de l’activité de la peroxydase du glutathion chez les deux groupes traités par rapport au groupe 2. Conclusion: Le traitement à la NAC prévient le développement de la dysfonction endothéliale coronaire ainsi que l’HVG qui lui est associée. / Beneficial effect of N-acetylcysteine on endothelial dysfunction of epicardial coronary arteries associated with left ventricular hypertrophy in a porcine model A.A. HORN, M-C AUBIN, YF SHI, J-C TARDIF, M. CARRIER , L. P. PERRAULT MONTREAL HEART INSTITUTE, MONTREAL, CANADA Objective : In our left ventricular hypertrophy (LVH) model, endothelial dysfunction is secondary to a reduced bioavailability of NO caused by increased oxidative stress demonstrated by Malo and al. (2003) and Aubin and al. (2006). The aim of this study was to investigate the potential effect of chronic administration of N-acetylcysteine (NAC), a thiol drug with antioxidant properties, on the coronary endothelial dysfunction associated with LVH. Design and method: LVH was induced by aortic banding (AB) on swine for a two-month period. Twenty-one 8-week-old Landrace male swine were randomly divided into 4 experimental groups. The sham group (group 1) was submitted to a thoracotomy without aortic banding (AB). The untreated aortic banded group (group 2) was kept for 60 days. The first AB treated group (group 3) received 1000mg/day of NAC per os for 60 days starting on the day of the surgery. The second AB treated group (group 4) received the same oral dose of NAC for 30 days starting on day 30. Hypertrophy was assessed by echocardiography. Coronary vascular reactivity was evaluated in organ chambers, by the construction of concentration-response curves to serotonin (5-HT: relaxations mediated by 5-HT1D receptors, coupled to Gi proteins) and bradykinin (BK: relaxations mediated by B2 receptors, coupled to Gq proteins). Levels of nitrite/nitrate and basal cGMP levels were measured to evaluate endothelial dysfunction. Finally, to assess oxidative stress, plasma lipid hydroperoxide levels (LPO), reduced glutathione as well as the activity of antioxidant enzymes glutathione peroxidase and superoxide dismutase were measured. Results: The LV mass/ body weight ratio was significantly higher in group 2 compared to group 1 confirming the development of LVH (p<0.05). The latter was found to be associated with a significant endothelial dysfunction. NAC did prevent LVH development in group 3 and attenuated its progression in group 4 (p<0.05). Concentration response curves to NAC showed improvement in endothelium-dependent relaxations to serotonin and to bradykinin (p<0.05). NAC treatment markedly improved maximal relaxations mediated by serotonin and bradykinin in both treated groups (p<0.05). The observed improvement in endothelium-dependent relaxations was supported by the increase of the bioavailability of NO for smooth muscle cells as suggested by the increase of the nitrite/nitrate ratio and the basal production of cGMP in groups 3 and 4 in comparison to group 2 (p<0.05). The increase of this relaxing factor could result from an increase of its production by endothelial cells or by a decrease of its neutralization by reactive oxygenated species. The lowering of LPO levels was accompanied by a higher glutathione concentration and glutathione peroxidase activity in both NAC treated groups compared to group 2 (p<0.05). Conclusions: NAC treatment demonstrated potent antioxidant properties in this porcine LVH model by slowing LVH development and restoring coronary endothelium-dependent relaxations.

Les récepteurs couplés aux protéines G forment des complexes multimériques comprenant protéines G et effecteurs. Nous cherchons à caractériser de tels complexes comprenant les récepteurs opioïdes delta (DOR) et les canaux Kir3, qui nous sont d’intérêt vu leur implication dans l’analgésie des opioïdes. Des expériences d’immunopurification, de BRET et de liaison GTPgS ont été réalisées à l’intérieur de cellules HEK293 transfectées. Les canaux Kir3 ont été co-immunopurifiés avec les DOR, suggérant une interaction spontanée entre récepteur et effecteur. Des essais BRET ont corroboré que l’interaction était présente dans des cellules vivantes et nous ont permis d’identifier une interaction spontanée et spécifique entre DOR/Gg et Gg/Kir3, indiquant leur coexistence en un même complexe. Puisque l’activation du récepteur implique la présence de changements conformationnels à l’intérieur de celui-ci, nous étions intéressés à vérifier si l’information conformationnelle circule à partir du récepteur lié au ligand jusqu’à l’effecteur en aval. Ainsi, nous avons déterminé l’effet de différents ligands sur le signal BRET généré par les paires suivantes : DOR/Gbg, DOR/Kir3 et Kir3/Gbg. Nous avons constaté une modulation de l’interaction DOR/Gbg et Gbg/Kir3 suivant l’ordre d’efficacité des ligands à stimuler la protéine G, ce que nous n’avons pas observé entre DOR et Kir3. Donc, nous concluons que l’information conformationnelle circule du récepteur au canal Kir3 via la protéine Gbg. Ces résultats nous ont permis de développer un biosenseur BRET (EYFP-Gg2/Kir3.1-Rluc) qui pourrait être utilisé dans le criblage à haut débit afin de détecter de nouvelles molécules ayant une grande efficacité à activer les canaux Kir3. / G protein-coupled receptors form multimeric complexes comprising G protein and effectors. We want to characterize such complexes comprising delta opioid receptors (DOR) and Kir3 channels, which interest us due to their involvement in opioid analgesia. Immunopurification, BRET and GTPgS binding experiments were done in transfected HEK293 cells. Kir3 channels were co-immunopurified with DOR, implying a spontaneous interaction between the receptor and effector. BRET assays corroborated the presence of this interaction in living cells and allowed us to identify a spontaneous and specific interaction between DOR/Gg and Gg/Kir3, indicating their co-existence within the same complex. Since the activation of the receptor implies it undergoes conformational changes, we were interested in evaluating if the conformational information flows from the ligand-bound receptor until the downstream effector. Hence, we determined the effect of different ligands on the BRET signal that was generated by the following pairs: DOR/Gbg, DOR/Kir3 and Kir3/Gbg. We noticed a modulation of the DOR/Gbg and Gbg/Kir3 interactions that followed the order of efficacy of the ligands to activate the G protein, which we did not observe between DOR and Kir3. Therefore, we concluded that the conformational information flows from the receptor to the Kir3 channel via the Gbg protein. These results allowed us to develop a BRET biosensor (EYFP-Gg2/Kir3.1-Rluc), which could be used in high throughput screening to detect new molecules that activate Kir3 channels with high efficacy.

L’objectif central de cette thèse de Doctorat était d’investiguer les dysfonctions mitochondriales qui surviennent précocement au cours de la phase compensée du remodelage ventriculaire pathologique et qui pourraient jouer un rôle causal dans la progression vers l’insuffisance cardiaque. Nos travaux antérieurs, réalisés à l’aide d’un modèle de surcharge volumique chronique induite par une fistule aorto-cavale (ACF) chez le Rat WKHA, ont montré qu’au cours du remodelage ventriculaire, les mitochondries développaient une vulnérabilité à l’ouverture du pore de perméabilité transitionnelle (PTP : un élément clé de la signalisation de la mort cellulaire) [1]. Ceci était observable au stade compensé du remodelage en absence des dysfonctions mitochondriales majeures typiquement observées dans le cœur insuffisant. Ces résultats nous ont amenés à suggérer que la vulnérabilité à l’ouverture du PTP pourrait constituer un mécanisme précoce favorisant la progression de la cardiopathie. Dans l’étude 1 de cette thèse, nous avons tenté de tester cette hypothèse en induisant une ACF chez deux souches de rats affichant de très nettes différences au niveau de la propension à développer l’insuffisance cardiaque : les souches WKHA et Sprague Dawley (SD). Nos études in vitro sur organelles isolées et in situ sur l’organe entier ont permis de confirmer que, dans le cœur ACF, les mitochondries développent une vulnérabilité à l’ouverture du PTP et à l’activation de la voie mitochondriale de la mort cellulaire lorsqu’exposées à des stress pertinents à la pathologie (surcharge calcique, ischémie-reperfusion [I-R]). Cependant, bien que comparativement aux animaux WKHA, les animaux SD démontraient un remodelage ventriculaire plus rapide et prononcé et une progression précoce vers l’insuffisance cardiaque, aucune différence n’était observable entre les deux groupes au niveau des dysfonctions mitochondriales, suggérant quelles ne sont pas à l’origine de la progression plus rapide de la pathologie chez la souche SD, à tout le moins en réponse à la surcharge volumique. Nous avons par la suite déterminé, à l’aide des mêmes approches expérimentales, si cette vulnérabilité mitochondriale était observable dans une cardiopathie d’étiologie différente, plus spécifiquement celle qui est associée à la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), une maladie génétique causée par une mutation de la protéine dystrophine. Nos études menées (études 2-4) sur de jeunes souris mdx (le modèle murin de la DMD) exemptes de tout signe clinique de cardiopathie n’ont révélé aucune différence au niveau des fonctions mitochondriales de base. Cependant, tout comme dans le modèle d’ACF, les mitochondries dans le cœur de souris mdx étaient significativement plus vulnérables à l’ouverture du PTP lorsque soumises à une I-R (étude 2). Par ailleurs, nous avons démontré que l’administration aiguë de sildénafil aux souris mdx induisait une abolition de l’ouverture du PTP et de ses conséquences signalétiques, une diminution marquée du dommage tissulaire et une meilleure récupération fonctionnelle à la suite de l’I-R (étude 3). Nous avons ensuite testé chez la souris mdx l’administration aiguë de SS31, un peptide anti-oxydant ciblé aux mitochondries, cependant aucun effet protecteur n’a été observé, suggérant que le tamponnement des radicaux libres est d’une utilité limitée si les perturbations de l’homéostasie calcique typiques à cette pathologie ne sont pas traitées simultanément (étude 4). Globalement, les travaux effectués au cours de cette thèse démontrent que la vulnérabilité à l’ouverture du PTP constitue une dysfonction précoce et commune qui survient au cours de remodelages ventriculaires pathologiques d’étiologies différentes. Par ailleurs, ces travaux suggèrent des stratégies d’intervention pharmacologiques ciblant ce processus, dont l’efficacité pour la prévention de l’insuffisance cardiaque demande à être établie. / The central objective of this doctoral thesis was to investigate the mitochondrial dysfunction that occurs early during the compensated phase of pathological ventricular remodeling and which may play a causal role in the progression to heart failure. Our previous work using a model of chronic volume overload induced by aorto-caval fistula (ACF) in rats WKHA showed that during the ventricular remodeling, mitochondria developed a vulnerability to permeability transition pore opening (PTP: a key component of cell death signaling) [1]. This was observed at the stage of compensated remodeling in the absence of major mitochondrial dysfunction typically observed in the failing heart. These results led us to suggest that the vulnerability to PTP opening could be a mechanism facilitating the progression of the cardiomyopathy. In our first study of this thesis we have attempted to test this hypothesis by inducing ACF in two strains of rats displaying sharp differences in the propensity to develop heart failure: WKHA strains and Sprague Dawley (SD). Our studies in vitro on isolated organelles and in situ on the whole organ have confirmed that, in the ACF heart, mitochondria develop a vulnerability to PTP opening and activation of mitochondrial cell death when exposed to stresses relevant to the pathology (calcium overload, ischemia-reperfusion [I-R]). However, SD animals compared to WKHA showed a more rapid and pronounced ventricular remodeling and early progression to heart failure, no difference was found between the two groups in terms of mitochondrial dysfunction, suggesting that this is not behind the more rapid progression of the disease in the SD strain, at least in response to volume overload. We subsequently determined, using the same experimental approaches, if this vulnerability was observed in mitochondria of heart disease from other etiology more specifically that associated with Duchenne muscular dystrophy (DMD), a genetic disease caused by a mutation of the protein dystrophin. Our studies (studies 2-4) on young mdx mice (the mouse model of DMD) free of clinical signs of heart disease showed no difference in basal mitochondrial functions. However, as in the model of ACF, the mitochondria of mdx mice heart were significantly more vulnerable to PTP opening when subjected to I-R (study 2). Furthermore, we demonstrated that acute administration of sildenafil to mdx mice abolished the PTP opening and its signaling consequences, markedly reduced of tissue damage and improved functional recovery following I-R (Study 3). We then tested in mdx mice acute administration of SS31, an antioxidant peptide that targets and accumulates in mitochondria. However, no protective effect was observed, suggesting that the buffering of free radicals have a limited utility if the typical perturbations of the calcium homeostasis in this disease are not treated simultaneously (Study 4). Overall, the work done during this thesis show that the vulnerability to PTP opening is a common and early dysfunction that occurs during pathological ventricular remodeling of different etiologies. Moreover, these studies suggest pharmacological intervention strategies targeting this process, whose effectiveness in preventing heart failure needs to be established.

réalisé avec la codirection de Marek Jankowski / Introduction: L’ocytocine (OT) était connue pour ses effets lors de la parturition et de la lactation. Depuis quelques années, d’autres rôles de l’OT ont été proposés. Ainsi, la découverte de l’OT et de son récepteur (OTR) dans le cœur a suggéré le rôle fonctionnel de cette hormone dans cet organe. Aujourd’hui, il existe une controverse concernant l’implication de l’OT dans la régulation de la pression artérielle (PA). Des études additionnelles sont donc requises pour préciser le rôle de l’OT dans le contrôle de la PA. C’est dans ce cadre que se situe la présente étude. Méthodes: Deux types d’expériences ont été faites: Une pour l’étude des paramètres métaboliques et l’autre pour les paramètres cardiovasculaires. Pour la première, l’OT (0.04 mg/kg) a été testée pour son effet métabolique. Les rats SD sont injectés avec l’OT et immédiatement placés dans des cages métaboliques individuelles et adaptées pour recueillir les urines. Les urines recueillies sur 3 heures nous ont permis de mesurer la diurèse, la natriurèse et la kaliurèse chez les rats. Pour le 2ème type, des rats spontanément hypertendus (SHR) et des Sprague-Dawley (SD) ont subi une chirurgie pour l’implantation de la sonde de télémétrie. Après 10 jours de récupération, nous avons commencé l’expérience qui s’est déroulée en 2 séries: la série des injections intraveineuses (i.v.) (0.04, 0.08, 0.1, 0.2 et 0.4 mg/kg en une seule injection) et la série des injections sous-cutanées (s.c.) (0.5 et 1 mg/kg/jour pendant 5 jours d’injection). La pression artérielle (PA), la fréquence cardiaque (FC) et de l’activité des rats ont été mesurées continuellement pendant toute l’expérience. Résultats: En i.v. la plus petite dose d’OT (0.04 mg/kg/0.3 ml) utilisée pour les effets rénaux a amené une diurèse significative, montre une tendance de natriurèse et de diminution de kaliurèse. Cette dose et celle d’OT (0.08 mg⁄kg⁄0.3 ml) sont sans effets sur la PA mais diminuent la FC des SHR et des SD (seulement les nuits). Pour les doses élevées en i.v. (0.1, 0.2 et 0.4 mg/kg d’OT), à l’exception de l’effet vasopresseur transitoire observé avec OT 0.4 mg/kg chez SD, l’OT 0.1 et 0.2 mg/kg ont diminué la PA. Les doses (0.2 et 0.4 mg/kg) d’OT ont diminué la PA chez les SHR. Elles ont augmenté la FC en journée aussi bien chez les SD que chez les SHR pendant que 0.1 mg/kg l’a diminuée. Pendant les nuits, c’est seulement la dose de 0.4 mg/kg qui a un effet sur la FC qu’elle diminue aussi bien chez les SD que les SHR. Les doses de 0.5 et 1 mg/kg injectées en s.c. ont diminué significativement la PA chez les SHR. Mais, chez les SD c’est l’OT à la dose de 1 mg/kg qui a amené une baisse de PA. À l’exception de OT 0.5 mg/kg/jour qui a augmenté la FC et l’activité chez les SHR en journée et ce au cours des injections, l’OT en s.c. a également entraîné une diminution de la FC et de l’activité. Conclusion: Ces résultats démontrent que l’OT intervient dans la régulation de la PA et la FC et les effets de l’OT dépendent de la souche de rats, de la dose, de la voie d’administration et du moment d’enregistrement des paramètres cardiovasculaires (jour ou nuit). Parlant de dépendance des résultats en fonction des voies d’administration, force est de signaler qu’avec les injections s.c. l’effet hypotenseur de l’OT est puissant et sans équivoque. Cela serait dû au fait que la duré de vie de l’OT est très courte (5 à 10 minutes) quand elle entre dans le sang. Ainsi, contrairement à la voie i.v., l’efficacité de l’OT en s.c. résulterait de sa libération lente dans le sang et donc toute la quantité administrée en s.c. ne se dégrade pas d’un seul coup. / Introduction: Oxytocin (OT) is known for its effects during parturition and lactation. In recent years, new roles of OT have been brought to light. Thus, the discovery of OT and its receptors (OTR) in the heart suggest a functional role in the body. Nowadays, the involvement of OT in blood pressure (BP) regulation is still controversial. Additional studies are therefore required to accurately determine the role of OT in the control of BP. Methods: Two types of experiments were carried out: Diuretic effect: conscious male, Sprague-Dawley rats were administered OT intravenously (0.04 mg/kg) and immediately placed in metabolic and individual cage; urine was collected and measured every hour for 3 hours. Urine measurement allowed diuresis, natriuresis and kaliuresis to be determined Telemetry: telemetry implants and catheters were inserted into the abdominal aorta of spontaneously hypertensive (SHR) and Sprague-Dawley (SD) rats. After 10 days (of necessary recovery), heart rate (HR), BP and animal locomotor activities were measured continuously. The same experiment was done on two batches of rats. Different doses of OT: 0.04; 0.08; 0.1, 0.2 or 0.4 mg/kg were injected once by intravenous (i.v) route. After each injection, we waited for the normalization of BP and HR before the next dose. Further more, 5 consecutive injections of OT were made (0.5 and 1 mg/kg) subcutaneously (s.c.). Results: The dose of 0.04 mg/kg of OT administrated for renal effects led to significant diuresis, a tendancy in natriuresis and kaliuresis decreased with no effect on BP. That dose as well as 0.08 mg/kg decreased HR in SHR and SD rats (only in the night). Whereas the highest doses in i.v. (0.1, 0.2 et 0.4 mg/kg d’OT), except a transient vasopressor effect observed with the OT 0.4 mg/kg in SD rats, OT 0.1 and 0.2 mg/kg decreased BP. OT 0.2 and 0.4 mg/kg decreased BP in SHR but increased HR during the days in both strains. The dose of 0.4 mg/kg led to a decrease of HR in SHR and in SD rats. The s.c. injections (0.5 and 1 mg/kg) of OT led to a significant decrease in BP in SHR, whereas in SD rats the lowering was only significant with a dose OT 1 mg/kg. HR significantly decreased in both strain with 1 mg/kg, whereas with 0.5 mg/kg, HR increased in SHR only and during the day. Conclusion: These results demonstrate that oxytocin acts on blood pressure and heart rate depending on strain, dose and route of administration. It’s important to point out that with s.c. injections the hypotensive effect of OT is powerful and unequivocal. This is probably because OT administered s.c. is slowly released into the bloodstream. Therefore the entire amount administered s.c. does not degrade at once and leads to the effectiveness of s.c. results.

Le traitement du cancer à l’aide d’une exposition aux radiations ionisantes peut mener au développement de plusieurs effets secondaires importants, dont un retard de réparation et de régénération du tissu hématopoïétique. Les mécanismes responsables de ces effets demeurent encore inconnus, ce qui limite le développement de nouvelles approches thérapeutiques. À l’aide d’un modèle murin de prise de greffe, nos résultats démontrent que l’endommagement du microenvironnement par l’irradiation a un impact limitant sur le nichage hématopoïétique. Parce que le microenvironnement est composé principalement de cellules dérivées des cellules souches mésenchymateuses (CSM), nous avons évalué le potentiel des CSM à régénérer le tissu hématopoïétique par la reconstitution de la niche osseuse. Cette thérapie a mené à une augmentation remarquable du nichage hématopoïétique chez les souris irradiées. Les causes moléculaires impliquées dans le nichage hématopoïétiques sont encore inconnues, mais nous avons remarqué l’augmentation de la sécrétion de la cytokine « granulocyte-colony stimulating factor » (G-CSF) dans l’espace médullaire suite à l’irradiation. Le G-CSF est impliqué dans la mobilisation cellulaire et est fort possiblement nuisible à une prise de greffe. Nous avons évalué le potentiel d’une thérapie à base de CSM sécrétant le récepteur soluble du G-CSF afin de séquestrer le G-CSF transitoirement et les résultats obtenus démontrent que le blocage du G-CSF favorise le nichage hématopoïétique. Globalement, les données présentées dans ce mémoire démontrent que le microenvironnement osseux et le niveau de G-CSF dans la moelle sont importants dans le processus de nichage hématopoïétique et que la baisse du potentiel de régénération du tissu hématopoïétique suite à l’irradiation peut être renversée à l’aide d’une thérapie cellulaire de CSM génétiquement modifiées ou non. / Cancer treatment using ionizing radiation may lead to significant side effects, including delayed hematopoietic tissue repair and regeneration. The mechanisms mediating these defects remain unknown, thus limiting the development of new therapeutic approaches. Using a mouse engraftment model, our results show that microenvironment damage by irradiation limits hematopoietic homing. Since the microenvironment is mainly composed of mesenchymal stem cells (MSCs)-derived cells, we evaluated the potential of MSCs to improve hematopoietic tissue regeneration by bone marrow niche reconstitution. This therapy led to remarkable enhancement of hematopoietic homing in irradiated mice. The molecular causes involved in hematopoietic homing remain unknown, but we noticed an increased in “granulocyte-colony stimulating factor” (G-CSF) secretion within the medullary space after irradiation. G-CSF is involved in cellular mobilization and may possibly be harmful to engraftment. We evaluated the therapeutical potential of MSC genetically-engineered to secrete a soluble G-CSF decoy receptor that would transiently sequester G-CSF. Results obtained show that G-CSF blocking improved hematopoietic homing. Overall, the findings presented in this thesis indicate that bone marrow microenvironment and G-CSF levels are important in hematopoietic homing process, and that the decline in hematopoietic tissue regeneration potential following irradiation can be reversed by cellular therapy using MSC genetically modified or not.

La sclérose systémique (ScS) est une maladie auto-immune dévastatrice d'étiologie inconnue. Le dysfonctionnement immunitaire, la fibrose et la vasculopathie sont les trois principales caractéristiques de cette maladie. Une récente étude a révélé un nouveau lien entre l'auto-immunité et la fibrose, par la présence d'auto-anticorps stimulant le récepteur du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFR) des fibroblastes. Ces auto-anticorps sont capables de stimuler les espèces réactives de l'oxygène et d’activer la kinase régulée par un signal extracellulaire (ERK1/2). L’hypothèse que nous formulons est que les cellules musculaires lisses vasculaires (VSMCs) exprimant conjointement les PDGFR, répondront elles aussi aux autoanticorps anti-PDGF-R. Le travail présenté ici vise à valider la présence d'auto-anticorps PDGFR dans les sérums de patients ScS, et à caractériser ensuite la réponse de VSMCs exposées à de l'immunoglobuline G (IgG) de ces sérums, en mesurant l’activation des cascades de signalisation spécifiques, ainsi que l'induction des gènes impliqués dans la réponse fibrotique. Nos résultats démontrent la présence d'une fraction IgG stimulant une réponse phénotypique dans les cultures de VSMCs. Notamment, d’importantes régulations positive et négative des gènes pro-fibrotiques tgfb1 et tgfb2 respectivement, ont été observées dans les VSMCs exposées à des fractions de ScS-IgG. Les fractions de IgG positives pour l'activation de ERK étaient présentes dans la plupart, mais pas dans tous les échantillons de SSc (68%, 19/28), et moins présentes dans les contrôles 27% (11/3). Bien que, les fractions de SSc-IgG ont pu considérablement immunoprécipiter le PDGFR, l'utilisation d'un inhibiteur spécifique des récepteurs au PDGF (AG1296), n'a pas inhibé l'activation de ERK médiée par les fractions de SSc-IgG. Globalement, nos résultats indiquent la présence d'autoanticorps stimulants avec activité pro-fibrotique dans les sérums des patients ScS. Des travaux sont en cours pour identifier l'entité moléculaire responsable de la réponse d’IgG observée dans les cultures de VSMCs. / Systemic Sclerosis (SSc) is a devastating autoimmune disease of unknown etiology. Immune dysfunction, fibrosis and vasculopathy are the three major features of the disease; however, the interactions between these components are poorly understood. A novel link between autoimmunity and fibrosis has been proposed by the presence of stimulatory autoantibodies to the platelet-derived growth factor receptor (PDGFR) on fibroblasts. These autoantibodies were capable of stimulating reactive oxygen species and subsequent activation of ERK1/2. If the anti-PDGFR autoantibodies are present in the systemic circulation of SSc patients, they will most certainly encounter vascular smooth muscle cells (VSMCs). The latter are known to express the PDGFR and response to PDGF, which is a known phenotypic modulator of VSMCs. The work presented here seeks to readdress the presence of stimulatory anti-PDGFR autoantibodies in serum derived from SSc-patients and to characterize the effects of SSc-IgG on VSMCs by measuring the activation of specific signaling cascades and the induction of genes involved in fibrotic responses. Our results demonstrate the presence of an IgG fraction stimulating a phenotypic response in cultured VSMCs. Notably, a significant up-regulation of the pro-fibrotic gene tgfb1 and a significant down-regulation of the anti-fibrotic gene tgfb2 were observed in VSMC exposed to SSc-IgG fractions. Positive IgG fractions for ERK activation were present in most, but not all, SSc samples (68%, 19/28), and they were less present in controls (27%) (3/11). Although, the SSc-IgG fractions were able to significantly immunoprecipitate the PDGFR, the use of a selective PDGFR inhibitor, AG1296, did not inhibit the activation of ERK mediated by SSc-IgG fractions. Altogether, our findings suggest the presence of stimulatory autoantibodies with profibrotic activity in serum derived form SSc patients. Work is in progress to identify the molecular entity responsible for the IgG response observed in cultured VSMCs.

Le CD36 est un récepteur de type éboueur de classe B exprimé à la surface de nombreux types cellulaires dont les macrophages, les cellules endothéliales de la microvasculature et les plaquettes. Ce récepteur multiligand est impliqué dans plusieurs processus pathologiques notamment l’athérosclérose, l’angiogénèse et la malaria via la liaison spécifique de ligands comme les lipoprotéines oxydées de basse densité, la thrombospondine-1 et la protéine PfEMP-1, respectivement. Les peptides de la relâche de l’hormone de croissance (GHRP) ont été identifiés comme les premiers ligands synthétiques du CD36. Afin de développer de nouveaux ligands synthétiques du CD36, l’établissement d’une méthode de criblage est essentiel pour découvrir des composés avec une liaison de haute affinité pour ce récepteur. Pour y parvenir, nous avons surexprimé le domaine extracellulaire du CD36 humain dans les cellules d’insectes Sf9. La protéine soluble purifiée par chromatographie d’affinité fut immobilisée à la surface d’une plaque de résonance de plasmons de surface (SPR) pour les études de liaison. La méthodologie développée a permis de caractériser les ligands du CD36 en déterminant leurs constantes de dissociation (KD), et d’établir une relation structure-activité des ligands de la famille des azapeptides, des composés dérivés du GHRP-6. Afin de valider la méthode par spectroscopie SPR, une corrélation a été établie entre les valeurs de KD obtenues en SPR et les valeurs d’CI50 de courbes d’inhibition de la phosphorylation des MAP kinases JNK1/2 induite par un phospholipide oxydé, le POVPC, en présence de concentrations croissantes de ligands du CD36 dans les macrophages RAW 264.7. / CD36 is a class B scavenger receptor expressed at the cell surface of macrophages, endothelial cells and platelets, among others. This multiligand receptor is implicated in various diseases such as atherosclerosis, angiogenesis and malaria through the specific binding of ligands, such as oxidized low-density lipoproteins, thrombospondin-1 and the PfEMP-1 protein, respectively. Growth hormone-releasing peptides (GHRP) were identified as the first CD36 synthetic ligands. In order to identify new CD36 synthetic ligands, the development of a high-throughput method is essential to unveil compounds of high binding affinity. We have expressed a recombinant CD36 ectodomain protein in Sf9 insect cells. The soluble and affinity purified protein was immobilized on a surface plasmon resonance (SPR) sensor for binding studies. Synthetic ligands were analyzed by SPR spectroscopy for determination of their respective dissociation constant (KD). A structure-activity relationship of CD36 ligands was established. To validate the SPR binding signal, a good correlation was observed between KD and the IC50 values obtained from the inhibition curves of the MAPK kinase JNK1/2 phosphorylation induced by an oxidized phospholipid, the POVPC, in the presence of increasing concentrations of CD36 ligands in RAW 264.7 macrophage cells.

Les antipsychotiques sont utilisés en clinique depuis plus de 50 ans pour pallier aux symptômes de la schizophrénie. Malgré une recherche intensive, les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de l’effet clinique de cette médication demeurent encore nébuleux. Ces drogues sont reconnues comme des antagonistes des récepteurs D2 de la dopamine et peuvent moduler la transcription génique dans le striatum. Au cours des recherches qui ont mené à l'écriture de cette thèse, nous avons exploré l’expression de Nur77, un facteur de transcription de la famille des récepteurs nucléaires, afin de caractériser le rôle de la dopamine, la sérotonine, l’adénosine et le glutamate dans la régulation génique contrôlée par les antagonistes D2. En premier lieu, nous avons examiné l’impact de la co-administration d’agents sérotonergiques et adrénergiques sur l’expression de l’ARNm de Nur77 induite par l’halopéridol, un antipsychotique de première génération. Nous avons observé que le 8-OH-DPAT et le MDL11939 préviennent partiellement l’induction de Nur77 dans le striatum. Au contraire, l’idazoxan potentialise l’effet de l’halopéridol sur l’expression de Nur77 alors que le prazosin reste sans effet. Ces résultats démontrent que l’expression striatale de Nur77 induite par l’halopéridol peut être modulée à la baisse avec un agoniste 5-HT1A ou un antagoniste 5-HT2A. Par la suite, nous avons évalué dans divers paradigmes expérimentaux l’effet de l’éticlopride, un antagoniste spécifique D2, afin d’explorer davantage le mécanisme de l’effet transcriptionnel des antagonistes D2. Étonnamment, la suppression de l’isoforme D2L chez la souris D2L KO ne réduit pas la réponse de l’éticlopride dans le striatum. Par contre, une lésion corticale avec l’acide iboténique bloque l’effet de l’éticlopride sur la transcription de Nur77, suggérant un rôle du glutamate. La combinaison d’un antagoniste des récepteurs métabotropes du glutamate de types 5 (mGluR5) et d’un antagoniste des récepteurs de l’adénosine A2A abolit complètement l’augmentation de la transcription de Nur77 induit par l’éticlopride dans le striatum. La modulation directe de l’expression striatale de Nur77 par les récepteurs mGluR5 et A2A a été confirmée dans un modèle de cultures organotypiques de tranches cérébrales. Ces résultats démontrent clairement que la modulation de l’expression génique dans le striatum, à la suite d’un traitement avec un antagoniste D2 pourrait être indépendante d’une interaction directe avec les récepteurs D2 post-synaptiques, et reposerait plutôt sur son interaction avec les récepteurs D2 hétérosynaptiques des afférences corticostriées et l’activation subséquente des récepteurs post-synaptiques du glutamate et de l’adénosine. En résumé, nos résultats suggèrent que l’interaction des antipsychotiques atypiques avec les récepteurs 5-HT2A et 5-HT1A pourrait expliquer la différence dans le patron d’expression génique induit par ces drogues en comparaison avec les antipsychotiques typiques. De plus, nos résultats révèlent un nouveau mécanisme d’action des antagonistes D2 et supportent un rôle primordial du glutamate et de l’adénosine dans les effets des antipsychotiques de première génération. / Antipsychotic drugs have been used to alleviate schizophrenia symptoms for more than 50 years. Despite extensive research, little is known about the molecular and cellular mechanism responsible for their clinical outcome. These drugs are usually recognized as dopamine D2 antagonists and are known to modulate gene expression in the striatum. In the present thesis, we used the expression of Nur77, a transcription factor of the orphan nuclear receptor family, to explore the role of dopamine, serotonin, glutamate and adenosine receptors in the effect of a dopamine D2 antagonist in the striatum. First, we examined the abilities of serotoninergic and adrenergic receptor drugs to modify the pattern of Nur77 mRNA expression induced by haloperidol, a first generation antipsychotic drug. We observed that 8-OH-DPAT and MDL11939 partially prevent haloperidol-induced Nur77 upregulation. On the contrary, idazoxan consistently potentiated haloperidol-induced Nur77 mRNA levels in the striatum whereas prazosin remained without effect. Taken together, these results show the ability of a 5-HT1A agonist or a 5-HT2A antagonist to reduce haloperidol-induced Nur77 striatal expression. Subsequently, we evaluated in different experimental designs the effect of eticlopride, a specific D2 antagonist, to provide additional information on the mechanism by which D2 antagonist controls transcriptional activity in the striatum. Surprisingly, deletion of the D2L receptor isoform did not reduce eticlopride-induced upregulation of Nur77 mRNA levels in the striatum. However, cortical lesions with ibotenic acid strongly reduced eticlopride-induced upregulation of Nur77 mRNA, suggesting a role for glutamate neurotransmission. A combination of a metabotropic glutamate type 5 (mGluR5) antagonist with an antagonist of its synergistic partner adenosine A2A receptor abolished eticlopride-induced upregulation of Nur77 mRNA levels in the striatum. Direct modulation of striatal Nur77 expression by glutamate and adenosine receptors was confirmed using corticostriatal organotypic cultures. Taken together, these results indicate that modulation of gene expression in the striatum, following a D2 antagonist, might not involve a direct interaction of the drug at postsynaptic D2 receptors, but rather relies on its interaction with corticostriatal presynaptic D2 receptors and subsequent activation of postsynaptic glutamate and adenosine receptors in the striatum. In summary, our results suggest that interaction of atypical antipsychotic drugs with 5-HT2A and 5-HT1A receptors participate in the differential pattern of gene expression induced by these drugs when compared with typical antipsychotic drugs. Moreover, our results uncover a new mechanism of action of D2 antagonists and support a prominent role of glutamate and adenosine in the effect of classic antipsychotic drugs.

Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de morbidité et de mortalité dans les pays industrialisés. Le récepteur CD36, exprimé à la surface des macrophages, joue un rôle déterminant dans l’internalisation des lipoprotéines oxydées menant à la formation des cellules spumeuses dans l’espace sous endothélial, première étape du développement des lésions athérosclérotiques. Nous avons montré précédemment que les sécrétines de l’hormone de croissance sont des ligands du récepteur CD36 qui possèdent un site de liaison qui chevauche celui des lipoprotéines oxydées. Cependant, aucune étude n’avait rapporté les effets potentiels des ligands sélectifs du CD36 sur la progression des lésions athérosclérotiques et le métabolisme lipidique au niveau des macrophages. Ainsi, ce projet de doctorat visait à évaluer le potentiel anti-athérosclérotique du EP 80317, un ligand sélectif du CD36, et élucider les mécanismes à l’origine de ses effets sur le métabolisme et le transport des lipides au niveau des macrophages. À cette fin, des souris déficientes en apolipoprotéine E (apoE-/-), nourries avec une diète riche en lipides et en cholestérol, ont été traitées quotidiennement pendant 12 semaines avec le EP 80317, montrant un puissant effet anti-athérosclérotique associé à une réduction de 51% des lésions aortiques et de 30% du taux plasmatique de cholestérol total. Cette même étude a permis de montrer une réduction de l’internalisation des lipoprotéines oxydées ainsi qu’une augmentation de l’expression des gènes/protéines impliqués dans l’efflux du cholestérol au niveau des macrophages, comme le peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ), liver x receptor α (LXRα) et les transporteurs ABCA1 et ABCG1, entraînant une réduction de la formation des cellules spumeuses. Ces observations nous ont conduits à élucider les mécanismes moléculaires engendrés par la liaison d’un ligand sélectif au récepteur CD36 dans les macrophages. Les études ont permis de montrer que les ligands du CD36 entraînent une augmentation de l’efflux du cholestérol vers les transporteurs ABCA1 et ABCG1 en augmentant l’expression protéique de la cyclooxygénase 2 (COX-2) consécutive à la phosphorylation de la MAP kinase ERK1/2. L’activation de COX-2 stimule la production intracellulaire de la prostaglandine 15d-PGJ2, cette dernière conduisant à l’activation du PPARγ. Finalement, une troisième étude nous a permis de mettre en évidence les effets du EP 80317 sur le transport inverse du cholestérol in vivo. L’injection de macrophages J774 radiomarqués avec du cholestérol tritié dans la cavité péritonéale de souris avec le EP 80317 nous a permis de montrer que le EP 80317 entraîne une réduction de la radioactivité retrouvée dans le foie tandis qu’il augmente celle retrouvée dans les fèces par comparaison aux souris contrôles, sans néanmoins modifier le profil plasmatique du radiotraceur entre les deux groupes. De plus, l’expression des gènes impliqués dans le transport du cholestérol au niveau intestinal comme le LXRα, ABCA1, ABCG5 ainsi que ABCG8 ont été régulés à la hausse par le EP 80317 tandis que l’expression de NPC1L1, un transporteur impliqué dans l’absorption du cholestérol, a été régulé à la baisse. Toutefois, les gènes impliqués dans le métabolisme du cholestérol au niveau du foie ne sont pas modulés par le EP 80317. En conclusion, les travaux effectués dans le cadre de cette thèse nous ont permis de montrer que l’activation du récepteur CD36 par le EP 80317 pourrait s’avérer être une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement de l’athérosclérose. Les effets anti-athérosclérotiques et hypocholestérolémiants des ligands synthétiques du récepteur CD36 sont en partie engendrés par 1) la régulation du métabolisme des lipides au niveau des macrophages en réponse à l’activation du PPARγ par son ligand endogène, le 15d-PGJ2 et 2) par une augmentation du transport inverse du cholestérol, particulièrement par une augmentation de l’efflux transintestinal. / Cardiovascular diseases are the major cause of mortality and morbidity in industrialized countries. CD36, a type B scavenger receptor expressed on macrophages, appears to play a major role in foam cell formation through scavenging oxidatively modified lipoproteins, thus leading to fatty streak lesion formation in the arterial wall. We have previously reported that growth hormone-releasing peptides (GHRP) are synthetic ligands that share the same binding site as oxidized low density lipoprotein (oxLDL) on the CD36 receptor. However, no study has reported the anti-atherosclerotic effects of CD36 ligands and their role in macrophage lipid metabolism. Thus, this project aimed to evaluate the anti-atherosclerotic effects of EP 80317, a CD36 selective ligand, and to elucidate the role of GHRP on macrophage lipid metabolism and transport. Apolipoprotein E deficient mice (apoE-/-) fed a high fat high cholesterol diet were treated for 12 weeks with EP 80317. Our study showed that EP 80317 exerted potent anti-atherosclerotic effects as shown by reduced lesion areas (up to 51%) and hypocholesterolemia. We further showed that a chronic treatment with EP 80317 reduced oxLDL uptake and increased the expression of genes/proteins involved in macrophage cholesterol efflux, such as peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ), liver x receptor α (LXRα) and ATP-binding cassette A1 (ABCA1) and ABCG1, thus reducing foam cell formation. Our second study aimed to elucidate the molecular mechanisms by which CD36 ligands lead to an increase in macrophage cholesterol efflux following PPARγ activation. [3H]-cholesterol-labeled murine macrophages incubated in the presence of EP 80317 showed a significant increase in cholesterol efflux to both ABCA1 and ABCG1 transporters of cholesterol. EP 80317-mediated macrophage cholesterol efflux through PPARγ involved an increase in intracellular 15d-PGJ2 levels that were elicited by extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) stimulation, itself dependent on COX-2 activation. The third and last study of this thesis aimed to investigate the effect of CD36 selective ligand on reverse cholesterol transport in vivo. ApoE-/- mice treated or not with EP 80317 were injected intraperitoneally with [3H]-cholesterol-labeled murine J774 macrophage-like cells. The radioactivity recovered in the livers of EP 80317-treated mice was significantly lower than that found in vehicle-treated mice whereas feces radioactivity was higher. Yet, the radioactivity in plasma did not achieve statistical differences between the two groups. Furthermore, the expression of genes involved in intestinal cholesterol transport such as LXRα, ABCA1, ABCG5 and ABCG8 was upregulated in EP 80317-treated mice while the expression of NPC1L1, a transporter involved in cholesterol absorption, was downregulated compared to vehicle-treated mice. In contrast, genes involved in hepatic cholesterol metabolism were not modulated by EP 80317. In conclusion, the work conducted in this thesis supported that activation of CD36 signaling pathways by EP 80317 may constitute a novel therapeutic approach for the treatment of atherosclerosis. The anti-atherosclerotic and hypocholesterolemic effects of synthetic CD36 selective ligands might be explained, at least in part, by 1) the regulation of macrophage cholesterol metabolism as a result of an increase in PPARγ activation by its endogenous ligand, 15d-PGJ2 and 2) the stimulation of reverse cholesterol transport, in particular that of transintestinal cholesterol efflux.