Le bleuet démontre un potentiel thérapeutique dans le traitement du cancer et des maladies cardiovasculaires et neurodégénératives. Ces effets bénéfiques sont attribuables aux composés phénoliques abondants dans le bleuet, tels que les anthocyanines et les flavonoïdes. La biotransformation du jus de bleuet avec les bactéries Serratia vaccinii augmente sa teneur en composés phénoliques et son activité anti-oxydante, et modifie ses activités physiologiques. L’objectif de la présente étude est d’évaluer l’activité neuroprotectrice et le potentiel antidiabétique du jus de bleuet biostranformé (BJ). Le BJ est étudié dans différents tests dont : 1) La protection des neurones (N2a) contre le stress oxydatif (SO) induit par le peroxyde d’hydrogène; 2) La stimulation de la prise de glucose par les cellules musculaires (C2C12) et adipeuses (3T3-L1); 3) L’activité anti-hyperglycémique chez les souris obèses diabétiques KKAy. En effet, tandis que le jus de bleuet normal n’a aucun effet, le BJ augmente l’activité des enzymes anti-oxydantes, comme la catalase et la SOD (Superoxide Dimutase) et protège les neurones contre les changements de la signalisation des MAPKs et contre la toxicité induite par le peroxyde d’hydrogène. Le BJ augmente aussi la prise de glucose de 48% dans les cellules C2C12 et de 142% dans les cellules 3T3-L1. Cette augmentation n’est pas expliquée par une augmentation du calcium cytosolique mais plutôt par une stimulation de la phosphorylation de l’AMPK. De plus, le BJ inhibe l’adipogenèse chez les 3T3-L1. Le BJ diminue également l’hyperglycémie chez les souris obèses diabétiques KKAy et protège les jeunes souris pré-diabétiques contre le développement de l’obésité et du diabète. L’activité anti-hyperglycémique du BJ pourrait impliquer les adipokines puisque le BJ augmente le niveau d’adiponectine chez les souris diabétiques. Le BJ représente ainsi une approche prometteuse pour le traitement du diabète et les maladies neurodégénératives et une source de nouveaux agents thérapeutiques contre ces maladies. / Blueberry demonstrates therapeutic potential against cancer, cardiovascular and neurodegenerative diseases. These desirable effects are thought to involve abundant phenolic compounds in blueberry such as anthocyanins and flavonoids. Blueberry juice biotransformation by Serratia vaccinii bacteria increases its phenolics content, its antioxidant activity and modifies its physiological properties. The purpose of the present study was to evaluate the neuroprotection activity and the antidiabetic potential of biostranformed blueberry juice (BJ). BJ was studied for: 1) Protection of neurons (N2a) against oxidative stress caused by hydrogen peroxide; 2) Stimulation of glucose uptake by muscle cells (C2C12) and adipocytes (3T3-L1); 3) Anti-hyperglycemic activity in diabetic obese KKAy mice. Indeed, whereas normal blueberry juice did not show any effect, BJ increased antioxidant enzymes activities (catalase, SOD) and protected neurons against modifications in MAPKs pathways and toxicity induced by hydrogen peroxide. BJ also increased glucose uptake by 48% in C2C12 cells and by 142% in 3T3-L1 cells. Enhanced glucose uptake could not be explained by an increase of cytosolic calcium but was related to the stimulation of AMPK phosphorylation. Moreover, BJ inhibited 3T3-L1 adiopogenesis. BJ also reduced hyperglycemia of obese diabetic KKAy mice and protected pre-diabetic young mice against the development of obesity and diabetes mellitus. The anti-hyperglycemic effect of BJ may involve adipokine pathways since BJ increased adiponectin levels in diabetic mice. Thus, BJ represents a promising approach for the prevention and treatment of diabetes mellitus and possibly neurogenerative diseases as well as a source of novel therapeutic agents against these disorders.

Nous avons démontré la présence d'apoptose dans le système limbique suivant un infarctus du myocarde. Cette mort cellulaire serait partiellement reliée à l'augmentation de cytokines pro-inflammatoires. Des études démontrent que certains probiotiques ont des effets bénéfiques en diminuant le ratio de cytokines pro/anti-inflammatoires. La prise de probiotiques en prévention, avant l’occlusion d’une artère coronarienne, pourrait-elle diminuer l’apoptose dans le système limbique? Méthodes : La combinaison de probiotiques Lactobacillus helveticus R0052 et Bifidobacterium longum R0175 ou son véhicule fut additionné dans l’eau des rats pendant 28 jours consécutifs. Un infarctus du myocarde fut provoqué par l’occlusion de l’artère coronaire gauche. Après 40 minutes d'occlusion, les régions ischémiques ont été reperfusées pour 72 heures. Les animaux furent sacrifiés et la taille de l'infarctus mesurée. L'amygdale et l'hippocampe furent prélevés pour déterminer l'activité de la caspase-3 (pro-apoptotique), le ratio Bax/Bcl2(proapoptotique/ anti-apoptotique) et l'activité d'Akt (survie cellulaire). Résultats : La taille de l’infarctus n'est pas diminuée dans le groupe probiotique (45% de la région à risque)comparé au groupe placebo. Nos marqueurs d’apoptose démontrent une diminution dans les régions du gyrus denté, de l’amygdale latérale et médiane dans le groupe probiotique par rapport au placebo. L’activité de la caspase-3 et le ratio Bax:Bcl2 furent réduits dans le groupe probiotique de 50% et 40% respectivement (p < 0.05) et phosphorylation d’Akt fut augmentée de 35% (p<0.05). Aucune différence fut observée pour les régions Ca1 et Ca3. Conclusion : La combinaison de probiotiques utilisée réduit l’apoptose dans différentes régions du système limbique 72 heures après un IM. / Apoptosis is observed in limbic system after a myocardial infarction (MI). This cell death is due to the release of pro-inflammatory cytokines. Since probiotics reduce the pro/anti-inflammatory cytokine ratio, we hypothesise that probiotics will lessen apoptosis in the limbic system following MI. Methods: Rats were given probiotics or placebo for 4 consecutive weeks. Rat in the probiotic group received a daily dose of over 1 billion live bacterial cells of Lactobacillus helveticus R0052 and Bifidobacterium longum R0175 in combination. A MI was then induced in anesthetised rats by a 40-minute occlusion of the left anterior coronary artery followed by a 72 hours of reperfusion. Infarct size was measured and apoptosis was determined in the amygdala and hippocampus in both groups. Results: Infarct size was not diminished in the probiotic group (45% of the risk area), apoptosis was lessened in the dentate gyrus (DG), the lateral (LA) and medial (MA)amygdala compared to the placebo group. Caspase-3 and Bax/Bcl2 ratio were reduced in the probiotic group by about 50% and 40% respectively. Akt activity was increased by 35% in these regions. No difference was observed in the hippocampus Ca1 and Ca3 regions. Conclusion: This probiotic combination can reduce the apoptosis found in specific regions of the limbic system following a MI, which may have significance for post-MI depression.

INTRODUCTION Des réponses thérapeutiques variables aux glucocorticoïdes (GCs) sont observées parmi les patients atteints de la leucémie lymphoblastique aiguë (LLA). Les protéines Bax et Bim ont déjà montré un rôle important dans l’apoptose des cellules leucémiques. L’expression de Bax était plus basse chez les patients leucémiques résistants au médicament, de même une sensibilité diminuée aux GCs a été associée avec une expression réduite de Bim. La différence dans l’expression pourrait être due à des polymorphismes présents dans ces gènes et donc être associés avec la résistance aux GCs. MÉTHODE Dix-huit polymorphismes en régions régulatrices, 2 polymorphismes exoniques et 7 polymorphismes en région 3’UTR de ces gènes ont été analysés chez les témoins (n=50) et ont permis de déterminer un nombre minimal de polymorphismes suffisants pour définir les haplotypes (tagSNPs). Ces 8 polymorphismes ont ensuite été génotypés chez 286 enfants atteints de la LLA et ont été testés pour l’issue de la maladie par l’analyse de survie. RÉSULTATS Une survie sans évènement et une survie sans rechute diminuées ont été observées pour l’haplotype 3 (p=0,03 et p=0,02). Une survie globale diminuée a été associée avec l’homozygotie pour l’allèle exonique T298C>T (p=0,03), de même que pour les haplotypes 1 et 4 (p=0,04 et p=0,02) du gène Bim. CONCLUSION Les polymorphismes ont été associés avec une survie diminuée chez des enfants atteints de LLA. Il reste à tester d’autres polymorphismes présents dans ces deux gènes ainsi qu’à définir leurs fonctions afin de comprendre leurs rôles dans la réponse aux GCs. / INTRODUCTION Variable therapeutic responses to glucocorticoids (GCs) are observed for acute lymphoblastic leukemia (ALL) patients. Proteins Bax and Bim have already shown to play a major role in mediating GC-induced apoptosis in leukemia cells. Bax expression was lower in drug-resistant leukemia samples; likewise lower sensitivity to GC was associated with reduced Bim expression. The difference in the expression can be due to polymorphisms in these genes and therefore associated to GC resistance. METHOD Eighteen polymorphisms in the regulatory region, two exonic polymorphisms and seven polymorphisms in 3’UTR of these genes were analysed in controls (n=50) and have permitted to determine a minimal number of polymorphisms sufficient to define haplotypes (tagSNPs). These 8 single nucleotide polymorphisms (SNPs) were then genotyped in 286 LLA children and were tested for disease outcome by survival analysis. RESULTS A diminished event free survival and a diminished relapse free survival were observed for haplotype 3 (p=0,03 and p=0,02). A diminished overall survival was associated with the exonic T298C>T allele (p=0,03) and with haplotypes 1 and 4 (p=004 and p=0,02) of Bim gene. CONCLUSION Bax and Bim were associated with a diminished survival in LLA children. We still have to test other polymorphisms located in these genes and to define their functions in order to understand their roles in GC response.

Le projet porte sur l’étude de l’effet de l’eugénol, composant principal du clou de girofle, sur la douleur neuropathique. L’objectif principal du projet était de déterminer la contribution du système nerveux central dans l’effet analgésique de l’eugénol. Lors d’une étude préliminaire, la pénétrabilité de l’eugénol a été évaluée dans le système nerveux central du rat. Des échantillons de sang, de cerveau et de moelle épinière ont été prélevés et les concentrations d’eugénol dans ces différents tissus ont été analysées à l’aide d’un spectromètre de masse. Les résultats ont montré que l’eugénol pénètre bien le système nerveux central avec une distribution plus importante dans la moelle épinière. Après l’induction de la douleur neuropathique à des rats Sprague-Dawley par le modèle de ligatures du nerf sciatique, des injections intrathécales d’eugénol furent réalisées afin d’évaluer l’effet central de l’eugénol. La plus forte dose d’eugénol a atténué l’allodynie secondaire après 15min, 2h et 4h et a aussi amélioré l’hyperalgésie thermique après 2h et 4h. Ces résultats confirment l’hypothèse que l’eugénol atténue les deux aspects de la douleur neuropathique que sont l’allodynie et l’hyperalgésie. Les injections au niveau lombaire permettent de penser que l’eugénol, un agoniste/antagoniste des récepteurs vanilloïdes pourrait diminuer la douleur neuropathique en agissant notamment au niveau des récepteurs vanilloïdes situés dans la corne dorsale de la moelle épinière. / The project is based on the study of the effects of eugenol, the main component of clove oil, on neuropathic pain. The main objective was to determine the central effect of eugenol. In a preliminary study we evaluated the penetrability of eugenol in the central nervous system of rats. Blood, brain and spinal cord samples were collected and concentrations were determined by mass spectrometry. Brain-toplasma and spinal cord-to-plasma ratios suggest that eugenol penetrates the central nervous system of rats relatively well, with a preferential distribution in the spinal cord. Following the induction of neuropathic pain in male Sprague-Dawley rats using the sciatic nerve ligation model, intrathecal injections of eugenol were done to evaluate the central effect of eugenol. Treatment with the high dose of eugenol significantly decreased secondary mechanical allodynia measured by the Von Frey test after 15min, 2h and 4h and improved thermal hyperalgesia measured by the Hargreaves device after 2h and 4h. Results support the hypothesis that eugenol may alleviate neuropathic pain, both allodynia and hyperalgesia. Eugenol, a vanilloid agonist/antagonist may therefore reduce neuropathic pain by acting on vanilloid receptors at the level of the dorsal horn of the spinal cord.

Le récepteur A des peptides natriurétiques (NPRA) fait partie de la famille des guanylates cyclases membranaires. L’activation du NPRA par ses agonistes naturels, ANP et BNP, induit une production de GMPc qui est responsable de leur rôle dans l’homéostasie cardiovasculaire, l’inhibition de l’hypertrophie et de la fibrose cardiaques et la régulation de la lipolyse. Le NPRA est un homodimère non covalent composé d’un domaine extracellulaire de liaison du ligand (ECD), d’un unique domaine transmembranaire (TM), d’un domaine d’homologie aux kinases et d’un domaine guanylate cyclase. Bien que le NPRA ait un rôle physiologique important, les mécanismes moléculaires régissant son processus d’activation restent inconnus. Nous avons donc analysé les premières étapes du processus d’activation du NPRA. Nous avons d'abord étudié le rôle de la dimérisation des ECD dans l’activation du récepteur. Nous avons utilisé les techniques de liaison de radioligand, de FRET et de modélisation moléculaire, pour caractériser la liaison à l’ECD des agonistes naturels, d’un superagoniste et d’un antagoniste. L’ANP se lie à un dimère d’ECD préformé et la dimérisation spontanée est l’étape limitante du processus de liaison. De plus, comme le démontrent nos études de FRET, tous les peptides, incluant l’antagoniste, stabilisent le récepteur sous sa forme dimérique. Cependant, l’antagoniste A71915 stabilise le dimère d’ECD dans une conformation différente de celle induite par l’ANP. La dimérisation du NPRA semble donc nécessaire, mais non suffisante à l’activation du récepteur. L’état d’activation du NPRA dépend plutôt de l’orientation des sous unités dans le dimère. Nous avons ensuite étudié le mécanisme moléculaire de transduction du signal à travers la membrane. Plusieurs études ont suggéré que l’activation du NPRA implique un changement de conformation du domaine juxtamembranaire (JM). Cependant, les études de cristallographie de l’ECD soluble de NPRA n’ont pas permis de documenter la structure du JM et le changement de conformation impliqué dans la transduction du signal reste inconnu. Pour analyser ce changement de conformation, nous avons d’abord séquentiellement substitué les neuf acides aminés du JM par une cystéine. En étudiant la capacité des mutants à former des dimères covalents de façon constitutive ou induite par l’ANP, nous avons pu évaluer la proximité relative des résidus du JM, avant et après activation du NPRA. Ces résultats ont démontré la proximité élevée de certains résidus spécifiques et sont en contradiction avec les données cristallographiques. Nous avons également démontré que le domaine intracellulaire impose une contrainte conformationnelle au JM à l’état de base, qui est levée après liaison de l’ANP. En introduisant de 1 à 5 alanines dans l’hélice-α transmembranaire, nous avons montré qu’une rotation des TM de 40° induit une activation constitutive du NPRA. Le signal d’activation pourrait donc être transmis à travers la membrane par un mécanisme de rotation des TM. En utilisant nos données expérimentales, nous avons généré le premier modèle moléculaire illustrant la conformation active du NPRA, où les domaines JM et TM sont représentés. Dans son ensemble, cette étude apporte une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires régissant les premières étapes du processus complexe d’activation du NPRA. / Natriuretic peptide receptor-A (NPRA) is a member of the particulate guanylate cyclase family. NPRA activation by natural agonists, ANP and BNP, leads to cGMP production, which is responsible for their role in cardiovascular homeostasis, cardiac hypertrophy and fibrosis inhibition and lipolysis regulation. NPRA is a non covalent dimer composed of an extracellular domain (ECD) with a ligand binding site, a single transmembrane region (TM), a kinase homology domain, and a guanylyl cyclase domain. Although NPRA plays an important physiologic role, molecular mecanisms driving its activation process are yet unknown. We thus analysed the first steps of NPRA’s activation process. First, we studied the role of ECD dimerization in receptor activation and determined the sequential steps of this dimerization process. We used radioligand binding, FRET and molecular modeling to characterize the interaction of ECD with natural agonists, a superagonist and an antagonist. ANP binds to preformed ECD dimers and spontaneous dimerization is the rate-limiting step of the ligand binding process. Furthermore, like demonstrated with fluorescence homoquenching, all the studied peptides, including A71915 antagonist, stabilize a dimeric form of the receptor. However, A71915 stabilizes the ECD dimer in a conformation distinct from those induced by ANP. Thus, ECD dimerization is necessary but not sufficient for NPRA activation. The activation state of NPRA seems to depend on the orientation of the receptor subunits within the dimer. Then, we tried to identify the molecular mechanism of signal transduction through the plasma membrane. Previous studies have shown that activation of NPRA involves a conformational change of the juxtamembrane domain (JM). However, crystallographic study of the soluble ECD of NPRA has failed to document JM structure, and the conformational change involved in transmembrane signal transduction is still unknown. To analyse this conformational change, we first sequentially substituted nine amino acids of JM by a cysteine residue. By studying the mutant’s capacity to form ANP-induced or constitutive covalent disulfide dimers, we evaluated the relative proximity of JM residues, before and after NPRA activation. These results demonstrate a high proximity of specific JM residues and are in disagreement with crystallography data. We also demonstrated that intracellular domain imposes a conformational constraint on JM at basal state, which becomes relaxed upon ANP binding. We finally confirmed, with a full-length receptor, that A71915 stabilizes NPRA in a dimeric form where JM are in a conformation distinct from the basal state. By introducing 1 to 5 alanine residues in the transmembrane α-helix, we showed that a TM rotation of 40° leads to constitutive NPRA activation. Activation signal could thus be transmitted through the membrane by a TM rotation mechanism. We finally studied the role of the TM in NPRA dimerization. By using the ToxR system, we demonstrated that the last JM residues are required to stabilize the TM dimer. Using these experimental data, we generated the first molecular model illustrating the active conformation of NPRA, where JM and TM are depicted. In summary, this study allows a better understanding of molecular mecanisms driving the first steps of NPRA’s complex activation process.

Introduction: Le principal objectif de cette étude est de mesurer l’effet du GDF-5 sur l’homéostasie du cartilage. Le GDF-5 est un gène de susceptibilité de l’OA faisant partie de la famille des BMPs et qui favorise la synthèse du cartilage. Le but de notre étude a été de déterminer l’effet du GDF-5 sur le métabolisme catabolique ainsi que sur l’équilibre global des chondrocytes, principalement au niveau de l’Aggrécan. Méthode : Des chondrocytes arthrosiques canins et humains OA ont été exposés au GDF-5. L’expression des ARNm et des protéines a été analysée afin d’évaluer la production de l’Aggrécan et le ratio Col-II/Col-I au niveau des facteurs anaboliques et du phénotype. Pour le catabolisme, l’expression et l’activité des aggrécanases ADAMTS-4 et ADAMTS-5 ont été mesurées. Les épitopes NITEGE et CTX-II ont aussi été quantifiés dans le liquide synovial canin après des injections intraarticulaires de GDF-5. Résultats : Le GDF-5 provoque une augmentation de l’activité cellulaire des chondrocytes canins et humains. Pour les ARNm et l’expression protéique, le GDF-5 augmente l’expression de l’Aggrécan alors que les facteurs cataboliques le diminuent. Le phénotype reste inchangé en présence du produit, sauf à haute dose où on augmente le ColI. L’activité des aggrécanases diminue puisque l’épitope NITEGE diminue alors que le CTX-II augmente dans l’articulation. Conclusion : En somme, les facteurs anaboliques du cartilage sont favorisés, alors que les facteurs cataboliques sont diminués par le GDF-5. Cette action double permet d’illustrer l’effet du GDF-5, le classant comme un potentiel médicament modifiant la maladie de l’OA qui mérite d’être étudiée. / Purpose: The objective of this study is to assess the effect of GDF-5 on cartilage homeostasis. GDF-5 is a susceptibility gene for OA and member of the BMP super family. Studies have shown that it can increase expression of anabolic factors in chondrocytes. Therefore, our study indentifies how GDF-5 influences this metabolism and the global homeostasis of chondrocytes, aiming mainly towards Aggrecan. Methods : Osteoarthritic (OA) chondrocytes from canine and human models were exposed to GDF-5. Protein expressions, along with mRNA expression were assessed in order to investigate Aggrecan production and the ratio of Col-II/Col-I, for the anabolic phenotype markers. The aggrecanases ADAMTS-4 and ADAMTS-5 and their global activity were assed for the catabolic factors. The NITEGE and CTX-II epitope were also measured in synovial fluid of Pond-Nuki dogs that received intraarticular GDF-5 injections. Results : GDF-5 increases chondrocyte cellular activity, in our canine and human models. Both mRNA and protein expression of the chondrocytes Aggrecan were increased and the aggrecanases expression and activity were decreased. Collagen ratio did not show a phenotype, except et high dosage where the Col-I production is induced. Aggrecanase activity was lowered while CTX-II was increased. Conclusion : In conclusion, the anabolic cellular activity of OA chondrocytes increases while the catabolic factors decrease in presence of GDF-5. This double action illustrates the global effect of GDF-5, identifying it as a potential disease modifying factor of OA that should be further investigated.

L’administration systémique d’atorvastatine s’est montrée neuroprotective suivant un traumatisme médullaire, en diminuant la réponse inflammatoire au site de la lésion ainsi qu’en réduisant l’apoptose des oligodendrocytes. Ce dernier épargne la matière blanche au site de l’insulte et améliore la locomotion. Le but de cette étude était de confirmer l’efficacité neuroprotective de l’atorvastatine ainsi que son action précoce, lorsqu’administré post-trauma, sur la limitation de l’apoptose. Des rats Sprague-Dawley femelles ont reçu une injection intrapéritonéale de : (1) statine/saline (5 mg/kg) 2 h après une lésion contusive; (2) saline physiologique 2 h post-contusion; ou (3) saline physiologique sans lésion. Les rats traités à la statine ont montré une amélioration significative (p<0.05) de leur locomotion après 4 semaines post-trauma, comparée au groupe « véhicule » lésé. Expliquant cette observation, l’activité de la caspase-3 fut diminuée de 50% (p<0.05) et la méthode de TUNEL révéla une diminution d’approximativement 20% du nombre de cellules apoptotiques au site lésionnel (p<0.01) 4 h après l’insulte contusive chez le groupe traité en comparaison aux groupes « véhicules ». Ces résultats démontrent que l’atorvastatine est efficace dans la prévention de l’apoptose précoce au site lésionnel dans un modèle expérimental de traumatisme médullaire après seulement 2 h post-traumatisme. / The systemic administration of atorvastatin has been shown to be neuroprotective after spinal cord injury (SCI), by decreasing the inflammatory response at the lesion site and by reducing neuronal and oligodendrocyte apoptosis. The latter effect spares white matter at the injury site and improves locomotion. The aim of this study was to confirm the neuroprotective efficacy of atorvastatin as well as its early action in limiting apoptosis with its administration post-SCI. Female Sprague-Dawley rats received an intra peritoneal injection of: (1) statin/saline (5 mg/kg) at 2 h after the contusion injury; (2) physiological saline at 2 h post-SCI; or (3) physiological saline without injury. Statin-treated rats showed significant (p<0.05) improvement in locomotion at week 4 post-SCI compared to vehicle-treated animals. Explaining this outcome, caspase-3 activity decreased by 50% (p<0.05), and the histological TUNEL method revealed a decrease of approximately 20% in apoptotic cells at the injury site (p<0.01) at 4 h post-SCI in atorvastatin-treated rats in comparison to vehicle-treated controls. These data demonstrate that atorvastatin is effective after experimental spinal cord contusion injury in preventing early apoptosis at the injury site within 2 h post-administration.

Effet positif de la N-acétylcystéine sur la dysfonction endothéliale des artères coronaires épicardiques associée à une hypertrophie ventriculaire gauche dans un modèle porcin A. A. HORN, M-C AUBIN, YF SHI, J-C TARDIF, M. CARRIER , L. P. PERRAULT INSTITUT DE CARDIOLOGIE DE MONTRÉAL, MONTRÉAL, CANADA, Objectif : Il a été démontré dans le laboratoire que dans notre modèle d’hypertrophie ventriculaire gauche, la dysfonction endothéliale est secondaire à une diminution de la biodisponibilité du NO, celle-ci étant causée par une augmentation du stress oxydant tel que démontré par Malo et al. (2003) et Aubin et al. (2006). Le but de la présente étude est d’étudier l’effet d’un traitement chronique de la N-acétylcystéine (NAC) (un antioxydant) sur la dysfonction endothéliale associée à une hypertrophie ventriculaire gauche (HVG). Méthodologie: L’HVG a été induite par cerclage aortique (CA) chez vingt-et-un porcelets âgés de deux mois qui furent divisés aléatoirement en quatre groupes expérimentaux. Le groupe témoin (groupe 1) a été soumis à une thoracotomie antérolatérale gauche sans cerclage aortique (n=3). Le groupe 2 a été soumis à un cerclage aortique pour une période de 60 jours (n=6). Le groupe 3 a subi un cerclage aortique et a reçu un traitement oral de N-acétylcystéine de 1000 mg/jour per os pendant 60 jours commençant le jour de la chirurgie (n=6). Le groupe 4 a été soumis à un cerclage aortique et a reçu un traitement oral de N-acétylcystéine : 1000 mg/par jour pendant 30 jours commençant le jour 30 (post-chirurgie) (n=6). L’hypertrophie fut évaluée par échocardiographie. La réactivité vasculaire fut étudiée à l’aide de chambres d’organes par la construction des courbes concentration-réponse à la sérotonine (5-HT: relaxations induites par les récepteurs 5-HT1D, couplés aux protéines Gi) et à la bradykinine (BK: relaxations induites par les récepteurs B2, couplés aux protéines Gq). Les quantités de nitrites/nitrates et la production basale de GMPc ont été mesurées pour évaluer la fonction endothéliale. Le stress oxydant a été étudié en quantifiant les concentrations plasmatiques d’hydroperoxydes lipidiques et de glutathion réduit, ainsi que l’activité plasmatique des enzymes antioxydantes peroxydase du glutathion et dismutase du superoxyde. Résultats: Le rapport masse ventricule gauche/masse corporelle était significativement plus élevé pour le groupe 2 comparativement au groupe 1 (p<0,05) confirmant la présence d’une HVG. Le développement de l’HVG dans le groupe 3 a pu être prévenu par la NAC et sa progression fut atténuée dans le groupe 4 (p<0,05 versus groupe 2). La présence de la dysfonction endothéliale a été confirmée chez le groupe 2, tel qu’illustré par une diminution significative des relaxations maximales à la 5-HT et à la BK comparativement au groupe témoin. Le traitement à la NAC a significativement potentialisé les relaxations maximales (p<0,05) induites par la sérotonine et par la bradykinine, chez les deux groupes traités. Cette amélioration des relaxations dépendantes de l’endothélium peut être la conséquence d’une augmentation significative (p<0,05) de la biodisponibilité du monoxyde d’azote pour les cellules musculaires lisses, tel que suggéré par l’augmentation du ratio nitrites/nitrates et de la production basale de GMPc chez les groupes 3 et 4 comparativement au groupe 2. Cette augmentation du facteur relaxant peut résulter d’une augmentation de sa production par les cellules endothéliales ou d’une diminution de sa neutralisation par les espèces réactives oxygénées. De fait, les concentrations d’hydroperoxydes lipidiques étaient significativement inférieures (p<0,05) et associées à une augmentation des concentrations de l’antioxydant glutathion réduit et de l’activité de la peroxydase du glutathion chez les deux groupes traités par rapport au groupe 2. Conclusion: Le traitement à la NAC prévient le développement de la dysfonction endothéliale coronaire ainsi que l’HVG qui lui est associée. / Beneficial effect of N-acetylcysteine on endothelial dysfunction of epicardial coronary arteries associated with left ventricular hypertrophy in a porcine model A.A. HORN, M-C AUBIN, YF SHI, J-C TARDIF, M. CARRIER , L. P. PERRAULT MONTREAL HEART INSTITUTE, MONTREAL, CANADA Objective : In our left ventricular hypertrophy (LVH) model, endothelial dysfunction is secondary to a reduced bioavailability of NO caused by increased oxidative stress demonstrated by Malo and al. (2003) and Aubin and al. (2006). The aim of this study was to investigate the potential effect of chronic administration of N-acetylcysteine (NAC), a thiol drug with antioxidant properties, on the coronary endothelial dysfunction associated with LVH. Design and method: LVH was induced by aortic banding (AB) on swine for a two-month period. Twenty-one 8-week-old Landrace male swine were randomly divided into 4 experimental groups. The sham group (group 1) was submitted to a thoracotomy without aortic banding (AB). The untreated aortic banded group (group 2) was kept for 60 days. The first AB treated group (group 3) received 1000mg/day of NAC per os for 60 days starting on the day of the surgery. The second AB treated group (group 4) received the same oral dose of NAC for 30 days starting on day 30. Hypertrophy was assessed by echocardiography. Coronary vascular reactivity was evaluated in organ chambers, by the construction of concentration-response curves to serotonin (5-HT: relaxations mediated by 5-HT1D receptors, coupled to Gi proteins) and bradykinin (BK: relaxations mediated by B2 receptors, coupled to Gq proteins). Levels of nitrite/nitrate and basal cGMP levels were measured to evaluate endothelial dysfunction. Finally, to assess oxidative stress, plasma lipid hydroperoxide levels (LPO), reduced glutathione as well as the activity of antioxidant enzymes glutathione peroxidase and superoxide dismutase were measured. Results: The LV mass/ body weight ratio was significantly higher in group 2 compared to group 1 confirming the development of LVH (p<0.05). The latter was found to be associated with a significant endothelial dysfunction. NAC did prevent LVH development in group 3 and attenuated its progression in group 4 (p<0.05). Concentration response curves to NAC showed improvement in endothelium-dependent relaxations to serotonin and to bradykinin (p<0.05). NAC treatment markedly improved maximal relaxations mediated by serotonin and bradykinin in both treated groups (p<0.05). The observed improvement in endothelium-dependent relaxations was supported by the increase of the bioavailability of NO for smooth muscle cells as suggested by the increase of the nitrite/nitrate ratio and the basal production of cGMP in groups 3 and 4 in comparison to group 2 (p<0.05). The increase of this relaxing factor could result from an increase of its production by endothelial cells or by a decrease of its neutralization by reactive oxygenated species. The lowering of LPO levels was accompanied by a higher glutathione concentration and glutathione peroxidase activity in both NAC treated groups compared to group 2 (p<0.05). Conclusions: NAC treatment demonstrated potent antioxidant properties in this porcine LVH model by slowing LVH development and restoring coronary endothelium-dependent relaxations.

Les récepteurs couplés aux protéines G forment des complexes multimériques comprenant protéines G et effecteurs. Nous cherchons à caractériser de tels complexes comprenant les récepteurs opioïdes delta (DOR) et les canaux Kir3, qui nous sont d’intérêt vu leur implication dans l’analgésie des opioïdes. Des expériences d’immunopurification, de BRET et de liaison GTPgS ont été réalisées à l’intérieur de cellules HEK293 transfectées. Les canaux Kir3 ont été co-immunopurifiés avec les DOR, suggérant une interaction spontanée entre récepteur et effecteur. Des essais BRET ont corroboré que l’interaction était présente dans des cellules vivantes et nous ont permis d’identifier une interaction spontanée et spécifique entre DOR/Gg et Gg/Kir3, indiquant leur coexistence en un même complexe. Puisque l’activation du récepteur implique la présence de changements conformationnels à l’intérieur de celui-ci, nous étions intéressés à vérifier si l’information conformationnelle circule à partir du récepteur lié au ligand jusqu’à l’effecteur en aval. Ainsi, nous avons déterminé l’effet de différents ligands sur le signal BRET généré par les paires suivantes : DOR/Gbg, DOR/Kir3 et Kir3/Gbg. Nous avons constaté une modulation de l’interaction DOR/Gbg et Gbg/Kir3 suivant l’ordre d’efficacité des ligands à stimuler la protéine G, ce que nous n’avons pas observé entre DOR et Kir3. Donc, nous concluons que l’information conformationnelle circule du récepteur au canal Kir3 via la protéine Gbg. Ces résultats nous ont permis de développer un biosenseur BRET (EYFP-Gg2/Kir3.1-Rluc) qui pourrait être utilisé dans le criblage à haut débit afin de détecter de nouvelles molécules ayant une grande efficacité à activer les canaux Kir3. / G protein-coupled receptors form multimeric complexes comprising G protein and effectors. We want to characterize such complexes comprising delta opioid receptors (DOR) and Kir3 channels, which interest us due to their involvement in opioid analgesia. Immunopurification, BRET and GTPgS binding experiments were done in transfected HEK293 cells. Kir3 channels were co-immunopurified with DOR, implying a spontaneous interaction between the receptor and effector. BRET assays corroborated the presence of this interaction in living cells and allowed us to identify a spontaneous and specific interaction between DOR/Gg and Gg/Kir3, indicating their co-existence within the same complex. Since the activation of the receptor implies it undergoes conformational changes, we were interested in evaluating if the conformational information flows from the ligand-bound receptor until the downstream effector. Hence, we determined the effect of different ligands on the BRET signal that was generated by the following pairs: DOR/Gbg, DOR/Kir3 and Kir3/Gbg. We noticed a modulation of the DOR/Gbg and Gbg/Kir3 interactions that followed the order of efficacy of the ligands to activate the G protein, which we did not observe between DOR and Kir3. Therefore, we concluded that the conformational information flows from the receptor to the Kir3 channel via the Gbg protein. These results allowed us to develop a BRET biosensor (EYFP-Gg2/Kir3.1-Rluc), which could be used in high throughput screening to detect new molecules that activate Kir3 channels with high efficacy.

L’objectif central de cette thèse de Doctorat était d’investiguer les dysfonctions mitochondriales qui surviennent précocement au cours de la phase compensée du remodelage ventriculaire pathologique et qui pourraient jouer un rôle causal dans la progression vers l’insuffisance cardiaque. Nos travaux antérieurs, réalisés à l’aide d’un modèle de surcharge volumique chronique induite par une fistule aorto-cavale (ACF) chez le Rat WKHA, ont montré qu’au cours du remodelage ventriculaire, les mitochondries développaient une vulnérabilité à l’ouverture du pore de perméabilité transitionnelle (PTP : un élément clé de la signalisation de la mort cellulaire) [1]. Ceci était observable au stade compensé du remodelage en absence des dysfonctions mitochondriales majeures typiquement observées dans le cœur insuffisant. Ces résultats nous ont amenés à suggérer que la vulnérabilité à l’ouverture du PTP pourrait constituer un mécanisme précoce favorisant la progression de la cardiopathie. Dans l’étude 1 de cette thèse, nous avons tenté de tester cette hypothèse en induisant une ACF chez deux souches de rats affichant de très nettes différences au niveau de la propension à développer l’insuffisance cardiaque : les souches WKHA et Sprague Dawley (SD). Nos études in vitro sur organelles isolées et in situ sur l’organe entier ont permis de confirmer que, dans le cœur ACF, les mitochondries développent une vulnérabilité à l’ouverture du PTP et à l’activation de la voie mitochondriale de la mort cellulaire lorsqu’exposées à des stress pertinents à la pathologie (surcharge calcique, ischémie-reperfusion [I-R]). Cependant, bien que comparativement aux animaux WKHA, les animaux SD démontraient un remodelage ventriculaire plus rapide et prononcé et une progression précoce vers l’insuffisance cardiaque, aucune différence n’était observable entre les deux groupes au niveau des dysfonctions mitochondriales, suggérant quelles ne sont pas à l’origine de la progression plus rapide de la pathologie chez la souche SD, à tout le moins en réponse à la surcharge volumique. Nous avons par la suite déterminé, à l’aide des mêmes approches expérimentales, si cette vulnérabilité mitochondriale était observable dans une cardiopathie d’étiologie différente, plus spécifiquement celle qui est associée à la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), une maladie génétique causée par une mutation de la protéine dystrophine. Nos études menées (études 2-4) sur de jeunes souris mdx (le modèle murin de la DMD) exemptes de tout signe clinique de cardiopathie n’ont révélé aucune différence au niveau des fonctions mitochondriales de base. Cependant, tout comme dans le modèle d’ACF, les mitochondries dans le cœur de souris mdx étaient significativement plus vulnérables à l’ouverture du PTP lorsque soumises à une I-R (étude 2). Par ailleurs, nous avons démontré que l’administration aiguë de sildénafil aux souris mdx induisait une abolition de l’ouverture du PTP et de ses conséquences signalétiques, une diminution marquée du dommage tissulaire et une meilleure récupération fonctionnelle à la suite de l’I-R (étude 3). Nous avons ensuite testé chez la souris mdx l’administration aiguë de SS31, un peptide anti-oxydant ciblé aux mitochondries, cependant aucun effet protecteur n’a été observé, suggérant que le tamponnement des radicaux libres est d’une utilité limitée si les perturbations de l’homéostasie calcique typiques à cette pathologie ne sont pas traitées simultanément (étude 4). Globalement, les travaux effectués au cours de cette thèse démontrent que la vulnérabilité à l’ouverture du PTP constitue une dysfonction précoce et commune qui survient au cours de remodelages ventriculaires pathologiques d’étiologies différentes. Par ailleurs, ces travaux suggèrent des stratégies d’intervention pharmacologiques ciblant ce processus, dont l’efficacité pour la prévention de l’insuffisance cardiaque demande à être établie. / The central objective of this doctoral thesis was to investigate the mitochondrial dysfunction that occurs early during the compensated phase of pathological ventricular remodeling and which may play a causal role in the progression to heart failure. Our previous work using a model of chronic volume overload induced by aorto-caval fistula (ACF) in rats WKHA showed that during the ventricular remodeling, mitochondria developed a vulnerability to permeability transition pore opening (PTP: a key component of cell death signaling) [1]. This was observed at the stage of compensated remodeling in the absence of major mitochondrial dysfunction typically observed in the failing heart. These results led us to suggest that the vulnerability to PTP opening could be a mechanism facilitating the progression of the cardiomyopathy. In our first study of this thesis we have attempted to test this hypothesis by inducing ACF in two strains of rats displaying sharp differences in the propensity to develop heart failure: WKHA strains and Sprague Dawley (SD). Our studies in vitro on isolated organelles and in situ on the whole organ have confirmed that, in the ACF heart, mitochondria develop a vulnerability to PTP opening and activation of mitochondrial cell death when exposed to stresses relevant to the pathology (calcium overload, ischemia-reperfusion [I-R]). However, SD animals compared to WKHA showed a more rapid and pronounced ventricular remodeling and early progression to heart failure, no difference was found between the two groups in terms of mitochondrial dysfunction, suggesting that this is not behind the more rapid progression of the disease in the SD strain, at least in response to volume overload. We subsequently determined, using the same experimental approaches, if this vulnerability was observed in mitochondria of heart disease from other etiology more specifically that associated with Duchenne muscular dystrophy (DMD), a genetic disease caused by a mutation of the protein dystrophin. Our studies (studies 2-4) on young mdx mice (the mouse model of DMD) free of clinical signs of heart disease showed no difference in basal mitochondrial functions. However, as in the model of ACF, the mitochondria of mdx mice heart were significantly more vulnerable to PTP opening when subjected to I-R (study 2). Furthermore, we demonstrated that acute administration of sildenafil to mdx mice abolished the PTP opening and its signaling consequences, markedly reduced of tissue damage and improved functional recovery following I-R (Study 3). We then tested in mdx mice acute administration of SS31, an antioxidant peptide that targets and accumulates in mitochondria. However, no protective effect was observed, suggesting that the buffering of free radicals have a limited utility if the typical perturbations of the calcium homeostasis in this disease are not treated simultaneously (Study 4). Overall, the work done during this thesis show that the vulnerability to PTP opening is a common and early dysfunction that occurs during pathological ventricular remodeling of different etiologies. Moreover, these studies suggest pharmacological intervention strategies targeting this process, whose effectiveness in preventing heart failure needs to be established.