La diminution des doses administrées ou même la cessation complète d'un traitement chimiothérapeutique est souvent la conséquence de la réduction du nombre de neutrophiles, qui sont les globules blancs les plus fréquents dans le sang. Cette réduction dans le nombre absolu des neutrophiles, aussi connue sous le nom de myélosuppression, est précipitée par les effets létaux non spécifiques des médicaments anti-cancéreux, qui, parallèlement à leur effet thérapeutique, produisent aussi des effets toxiques sur les cellules saines. Dans le but d'atténuer cet impact myélosuppresseur, on administre aux patients un facteur de stimulation des colonies de granulocytes recombinant humain (rhG-CSF), une forme exogène du G-CSF, l'hormone responsable de la stimulation de la production des neutrophiles et de leurs libération dans la circulation sanguine. Bien que les bienfaits d'un traitement prophylactique avec le G-CSF pendant la chimiothérapie soient bien établis, les protocoles d'administration demeurent mal définis et sont fréquemment déterminés ad libitum par les cliniciens. Avec l'optique d'améliorer le dosage thérapeutique et rationaliser l'utilisation du rhG-CSF pendant le traitement chimiothérapeutique, nous avons développé un modèle physiologique du processus de granulopoïèse, qui incorpore les connaissances actuelles de pointe relatives à la production des neutrophiles des cellules souches hématopoïétiques dans la moelle osseuse. À ce modèle physiologique, nous avons intégré des modèles pharmacocinétiques/pharmacodynamiques (PK/PD) de deux médicaments: le PM00104 (Zalypsis®), un médicament anti-cancéreux, et le rhG-CSF (filgrastim). En se servant des principes fondamentaux sous-jacents à la physiologie, nous avons estimé les paramètres de manière exhaustive sans devoir recourir à l'ajustement des données, ce qui nous a permis de prédire des données cliniques provenant de 172 patients soumis au protocol CHOP14 (6 cycles de chimiothérapie avec une période de 14 jours où l'administration du rhG-CSF se fait du jour 4 au jour 13 post-chimiothérapie). En utilisant ce modèle physio-PK/PD, nous avons démontré que le nombre d'administrations du rhG-CSF pourrait être réduit de dix (pratique actuelle) à quatre ou même trois administrations, à condition de retarder le début du traitement prophylactique par le rhG-CSF. Dans un souci d'applicabilité clinique de notre approche de modélisation, nous avons investigué l'impact de la variabilité PK présente dans une population de patients, sur les prédictions du modèle, en intégrant des modèles PK de population (Pop-PK) des deux médicaments. En considérant des cohortes de 500 patients in silico pour chacun des cinq scénarios de variabilité plausibles et en utilisant trois marqueurs cliniques, soient le temps au nadir des neutrophiles, la valeur du nadir, ainsi que l'aire sous la courbe concentration-effet, nous avons établi qu'il n'y avait aucune différence significative dans les prédictions du modèle entre le patient-type et la population. Ceci démontre la robustesse de l'approche que nous avons développée et qui s'apparente à une approche de pharmacologie quantitative des systèmes (QSP). Motivés par l'utilisation du rhG-CSF dans le traitement d'autres maladies, comme des pathologies périodiques telles que la neutropénie cyclique, nous avons ensuite soumis l'étude du modèle au contexte des maladies dynamiques. En mettant en évidence la non validité du paradigme de la rétroaction des cytokines pour l'administration exogène des mimétiques du G-CSF, nous avons développé un modèle physiologique PK/PD novateur comprenant les concentrations libres et liées du G-CSF. Ce nouveau modèle PK a aussi nécessité des changements dans le modèle PD puisqu’il nous a permis de retracer les concentrations du G-CSF lié aux neutrophiles. Nous avons démontré que l'hypothèse sous-jacente de l'équilibre entre la concentration libre et liée, selon la loi d'action de masse, n'est plus valide pour le G-CSF aux concentrations endogènes et mènerait en fait à la surestimation de la clairance rénale du médicament. En procédant ainsi, nous avons réussi à reproduire des données cliniques obtenues dans diverses conditions (l'administration exogène du G-CSF, l'administration du PM00104, CHOP14). Nous avons aussi fourni une explication logique des mécanismes responsables de la réponse physiologique aux deux médicaments. Finalement, afin de mettre en exergue l’approche intégrative en pharmacologie adoptée dans cette thèse, nous avons démontré sa valeur inestimable pour la mise en lumière et la reconstruction des systèmes vivants complexes, en faisant le parallèle avec d’autres disciplines scientifiques telles que la paléontologie et la forensique, où une approche semblable a largement fait ses preuves. Nous avons aussi discuté du potentiel de la pharmacologie quantitative des systèmes appliquées au développement du médicament et à la médecine translationnelle, en se servant du modèle physio-PK/PD que nous avons mis au point. / Dose-limitation or interruption of chemotherapeutic treatment is most often prompted by a decrease in circulating neutrophils, the most abundant white blood cell in the human body. Myelosuppression, or a reduction in absolute neutrophil counts (ANCs) by anti-cancer treatments, is precipitated by the nonspecific killing effect of chemotherapeutic drugs which have toxic effects on noncancerous cells. To mitigate this myelosuppressive effect, patients are frequently administered recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (rhG-CSF), an exogenous form of the cytokine G-CSF, which stimulates neutrophil production and release into the blood stream. While the benefits of adjuvant treatment rhG-CSF during chemotherapy are well recognised, the protocols with which it is administered are not well defined and are frequently determined ad libitum by clinicians. To quantify and address the optimisation of the administration of rhG-CSF during chemotherapeutic treatment, we developed a physiological model of granulopoiesis which incorporates the contemporary understanding of the production of neutrophils from the hematopoietic stem cells in the bone marrow. To this physiological model, we incorporated mechanistic pharmacokinetic/pharmacodynamic (PK/PD) models of two drugs, PM00104 (Zalypsis), a chemotherapeutic drug, and rhG-CSF (filgrastim). Through exhaustive parameter estimation using first principles and no data fitting, we successfully predicted clinical data from 172 patients for an average patient undergoing the CHOP14 protocol (6 cycles of 14-day periodic chemotherapy with rhG-CSF administered on days 4-13 post-chemotherapy). We then demonstrated that delaying the administration of rhG-CSF to 6 or 7 days post-chemotherapy allowed for a reduction in the number of filgrastim administrations from ten to four or even three while maintaining or improving the neutrophil nadir. We also investigated the effects of PK variability on the model's predictions by incorporating population PK (PopPK) models of both drugs. Using five different variability scenarios and cohorts of 500 in silico patients per scenario, we established that there are no statistically significant differences between a typical patient and the population in the model's predictions with respect to three crucial clinical endpoints, namely the time to ANC nadir, the ANC nadir, and the area under the concentration-effect curve. The model's robustness to PK variability allows for the scaling up from the individual to population level. Motivated by the use of rhG-CSF in other disease-states, namely periodic pathologies like cyclical neutropenia, we next endeavoured to contextualise the model within dynamic diseases. By bringing to light that the cytokine paradigm is broken when exogenous cytokine mimetics are administered, we developed a novel physiological PK model for G-CSF incorporating both unbound and bound concentrations. The updated PK model prompted changes to the PD model since we could now track the concentrations of bound G-CSF. We showed that the mass-action equilibrium hypopthesis for bound and unbound drugs is not valid and led to overestimations of the renal clearance of G-CSF. We also successfully reproduced clinical data in a variety of settings (exogenous G-CSF alone, PM00104 alone, CHOP14 protocol) and clarified the mechanisms underlying the body's response to both drugs. Lastly, we discussed the potential of quantitative systems pharmacology in both drug development and translational medicine by using the physiological PK/PD model we developed.

Nous avons investigué la relation entre les polymorphismes de nucléotides simples (SNPs) chez trois gènes/loci candidats : DARC, CXCL2 et le loci ORMDL3-GSDMA-CSF3 situés sur le chromosome 17q21 et les complications neutropéniques et infectieuses qui en résultent durant la chimiothérapie chez les patients atteints de la leucémie lymphoblastique aigue. Ces loci codent pour certaines composantes du système immunitaire altérant la concentration de chémokines et leur distribution (DARC), stimulant le relâchement et la migration des neutophiles de la moelle épinière (CXCL2) et régulant la prolifération et la survie des granulocytes (G-CSF). Il est possible que des polymorphismes dans ces loci lorsqu’associés à de la chimiothérapie puissent mettre des individus suceptibles à un risque plus élevé de complication reliées à la chimiothérapie. Une sélection des marqueurs SNPs dans ces gènes ont été génotypés chez des enfants traités au CHU Ste-Justine pour une ALL entre 1989 et 2005. Après correction pour tests multiples, un polymorphisme DARC rs3027012 situé dans le 5’UTR a été associé à un compte phagocytaire peu élevé (APC<500 et <1000 cellules/µL, p=0.001 and p=0.0005, respectivement) ainsi qu’une hospitalisation due à une neutropénie (p=0.007) ou due à une infection et/ou neutropénie (p=0.007). Un effet protecteur a été identifié pour la mutation non sense Gly42Asp variant rs12075 (p=0.006). Des polymorphismes sur le chromosome 17q2 étaient associés à une hospitalisation due à une infection (rs3859192, p= 0.004) et à une neutropénie (rs17609240, p=0.006) L’infection était aussi modulée par CXCL2 (rs16850408, p=0.008) Cette étude identifie pour la première fois que les loci modulant le décompte des leucocytes et des neutrophiles pourraient jouer un rôle dans de déclenchement de complications dues à la chimiothérapie et pourraient ainsi servir de marqueurs pour un ajustement et un suivi du traitement. / We investigated the relationship between single nucleotide polymorphisms (SNPs) in 3 candidate genes/chromosomal loci: DARC, CXCL2 and ORMDL3-GSDMA-CSF3 locus on chromosome 17q21, and neutropenic and infectious complications during chemotherapy in pediatric acute lymphoblastic leukemia (ALL) patients. These loci encode the components of immune system altering chemokine concentration and distribution (DARC), stimulating neutrophil release from bone marrow and migration (CXCL2) and regulating granulocyte proliferation and survival (G-CSF). It is possible that polymorphisms of these loci when associated with chemotherapy may put susceptible individuals at higher risk of chemotherapy complications. Selected tag SNPs in these genes are genotyped in children treated at the CHU Sainte-Justine for (ALL) between 1989 and 2005. After correction for multiple testing, DARC polymorphism rs3027012 in 5’UTR was associated with low absolute phagocyte count (APC<500 and <1000 cells/µL, p=0.001 and p=0.0005, respectively) and hospitalisation due to febrile neutropenia (p=0.007) or due to infection and/or febrile neutropenia (p=0.007). A protective effect was instead noted for missense Gly42Asp variant rs12075 (p=0.006). The polymorphisms on chromosome 17q2 were associated with hospitalisation due to infection (rs3859192, p= 0.004) and neutropenia (rs17609240, p=0.006). Infection was also modulated by CXCL2 (rs16850408, p=0.008) This study identifies for the first time that the loci modulating white blood cell and neutrophil count may play a role in the onset of chemotherapy complications and may thus serve as markers for adjustment or follow-up of the treatment.

Les trois projets que j’ai développés au cours de ma thèse s’inscrivent dans un même contexte, celui de l’étude de l’acétylcholinestérase (AChE) et des molécules apparentées à l’AChE au plan structural ou fonctionnel. Existence, identification et caractérisation du fonctionnement d’une « porte arrière » dans l’AChE. Caractérisation de la « protéine X », un récepteur non AChE de la fasciculine. Recherche d’un partenaire protéique endogène de l’AChE dans le cerveau de rat. / The three projects I developed during my thesis are related to the study of acetylcholinesterase (AChE) and of molecules related to AChE in their function or structure. Existence, identification and characterization of the functioning of a back door in AChE. Characterization of “protein X”, a non-AChE receptor for fasciculin. Search for an endogenous proteic partner of AChE in rat brain.

La gestion de la douleur neuropathique reste un challenge en médecine, malgré le nombre de traitements actuellement disponible. L'expérimentation animale a généré beaucoup d'informations concernant la douleur, mais ces connaissances demeurent insuffisantes pour développer de nouveaux analgésiques plus efficaces tout en restant sécuritaires. La douleur est un symptôme clinique complexe avec de multiples origines, et les mécanismes de douleur centraux et périphériques dépendent de l'évolution de la pathologie. Il est donc essentiel d'investiguer plus profondément les mécanismes moléculaires responsables de l'initiation et du maintien de la douleur, afin de cibler de nouvelles voies de transmission de la nociception plus prometteuses pour soulager la neuropathie et développer de meilleures stratégies thérapeutiques. Ce projet s'est donc intéressé plus particulièrement à la famille des tachykinines issues du gène TAC1 (substance P, ses précurseurs et métabolites, et neurokinine A sont les peptides ciblés pour ce projet de recherche), une famille de neuropeptides qui joue un rôle critique dans la transmission nociceptive. Pour réaliser cette étude, nous avons d'abord développé une stratégie de quantification afin de quantifier les expressions des différents neuropeptides bioactifs cibles, par HPLCMS/ MS. Puisqu'il existe différentes stratégies de quantification des peptides par HPLCMS/ MS, une méthode analytique fiable et robuste était nécessaire pour répondre aux objectifs de recherche. Nous avons développé une méthode utilisant la quantification relative avec un étalon interne stable marqué isotopiquement. En effet, pour quantifier les neuropeptides d'intérêt de l'étude, c'est la stratégie qui s'est avérée la plus reproductible et précise. Suite à la mise au point de la stratégie de quantification, nous avons utilisé des modèles animaux, souvent nécessaires pour faire progresser la recherche scientifique sur la compréhension de la douleur / The management of neuropathic pain remains a challenge in medicine, despite the availability of numerous drugs. Animal experimentation has generated a tremendous amount of information about pain, but this knowledge is still insufficient for new more efficient and safe analgesics. Pain is a complex clinical symptom with multiple origins, and peripheral and central pain mechanisms depend on the pathology evolution. Thus, it is essential to further investigate the mechanisms responsible for the initiation and maintenance of pain in order to develop better effective therapies. This project is particularly focused on the tachykinin family encoded by TAC1 gene (substance P, its precursors and metabolites, neurokinin A), a family of neuropeptides that plays a critical role in nociceptive transmission. We initially developed a quantification strategy in order to study the targeted bioactive neuropeptide expression modulation by HPLC-MS and HPLC-MS/MS. And it is critical to develop reliable and robust analytical methods to reach the objectives. So, we developed a method using relative quantification with stable isotopic labeled internal standards. In fact, in order to quantify target neuropeptides, this strategy was the most reproducible and accurate. Following the development of the relative quantification strategy, we used validated animal models, fundamental to better knowledges of painful molecular mechanisms

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La neurobiologie à l'origine d'un comportement social des consommateurs d'opiacés et des personnes dépendantes reste largement méconnue, entravant le développement de nouveaux traitements efficaces contre les troubles de l'utilisation des opiacés. Cependant, des preuves précliniques récentes suggèrent que le système du facteur de libération de la corticotrophine (CRF) pourrait être impliqué. Dans cette optique, nous avons utilisé la méthode des tâches à trois chambres (3-CH) ainsi qu'une méthode génétique et pharmacologique pour évaluer l’impact de l’administration de la morphine et du sevrage sur le comportement social des souris vis-à-vis de l'utilisation du système CRF. Dans une première série d'expériences, nous avons constaté que les sujets mâles manifestaient un intérêt pseudo-social accru suscité par l'hostilité pendant le sevrage des opiacés, ce qui indiquait les effets à long terme de l'administration chronique de médicaments sur le fonctionnement social normal. Par ailleurs, les femelles ont manifesté moins d’intérêt social lors du sevrage aux opiacés, un phénotype qui reproduit plus facilement ce qui a été observé chez l’homme. Notamment, le déficit en récepteurs CRF1 a complètement sauvé ce dernier déficit social, ajoutant ainsi aux preuves croissantes liant le système CRF aux dysfonctionnements comportementaux induits par la substance. Dans une deuxième série d'expériences, nous avons étudié plus largement les effets initiaux de la morphine sur les activités « naturellement » gratifiantes. Nous avons constaté qu'une seule et même administration aiguë d'une dose relativement faible du médicament suffisait à la fois à générer une récompense cérébrale et à induire de profonds déficits en intérêt social et en motivation liée à l'alimentation, fournissant ainsi des preuves expérimentales initiales du « détournement » du cerveau. Il est intéressant de noter que l'administration systémique d'antalarmine, antagoniste du récepteur de la CRF, a complètement inversé ce dernier déficit social, ce qui indique que le système CRF joue un rôle essentiel dans la médiation de la diminution de l'intérêt suscité par les substances pour des activités rémunératrices «naturellement» et renforce la notion de potentiel thérapeutique du ciblage de la CRF. / The neurobiology underlying poor social behavior of opiate users and dependent individuals remains largely unknown, hampering the development of noveleffective therapies for opiate use disorders. However, recent pre-clinical evidence suggests that the corticotropin-releasing factor (CRF) system might be involved.In this light, we employed the three-chamber (3-CH) task and genetic/pharmacological approaches to assess the impact of morphine administrationand withdrawal upon social behavior in mice with regard to the CRF system. In a first set of experiments, we found that male subjects displayed increasedhostility-driven pseudo-social interest during opiate withdrawal, indicative of longlasting effects of chronic drug administration upon normal social functioning. On theother hand, female subjects displayed lower social interest during opiate withdrawal, a phenotype that more straightforwardly replicates what observed in humans.Notably, CRF1 receptor-deficiency completely rescued the latter social deficit, adding to the growing evidence linking the CRF system to substance-induced behavioraldysfunctions. In a second set of experiments, we investigated the initial effects of morphine more widely on naturally” rewarding activities. We found that a single, acuteadministration of a relatively low dose of the drug was sufficient to produce brain reward and at the same time to induce profound deficits in social interest and fooddriven motivation, providing initial experimental evidence of “hijacking” of brain reward systems by substances of abuse. Interestingly, systemic administration of the CRF receptor antagonist antalarmin completely reversed the latter social deficit, indicating a critical role of the CRF system in mediating substance-induced decreased interest for “naturally” rewarding activities and strengthening the notion of a therapeutic potential for CRF-targeting pharmacological agents.

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Correction de la bradycardie et des troubles de conduction dans des modèles de dysfonction congénitale de l’automatisme cardiaque par l’inhibition pharmacologique du courant IKAChLa dysfonction du nœud sinusal (DNS) est l’une des principales pathologies de l’automatisme cardiaque. La DNS désigne une multitude de troubles caractérisées par l’incapacité du nœud sinusal (SAN) à générer ou à conduire l’impulsion cardiaque. La seule thérapie actuellement disponible pour la DNS est l’implantation d’un pacemaker électronique. Des études épidémiologiques prévoient un besoin croissant d’implantation de pacemaker électroniques au cours des 50 prochaines années à cause du vieillissement de la population. Le développement des thérapies innovantes pour la DNS est donc un enjeu médical et sociétal important. L’inhibition pharmacologique du courant potassique activé par l’acétylcholine (IKACh) pourrait constituer une nouvelle option thérapeutique pour traiter la DNS.Nous avons donc testé l’inhibition du courant IKACh par un peptide de venin d’abeille, la Tertiapine-Q, pour corriger le DNS et le dysfonctionnement de la conduction chez des souris modèle de pathologies cardiaque humaine en particulier les souris portant l’inactivation des canaux L Cav1.3 (Cav1.3-/-), les souris portant simultanément l’ablation de Cav1.3 et des canaux de type-T Cav3.1 (Cav1.3-/-/Cav3.1-/-), les souris porteuses de la perte de fonction des canaux f- (HCN4-CNBD) et les souris haplo-suffisantes Nav1.5 (Scn5a+/-).Nous avons enregistré par télémétrie, l’ECG, chez ces modèles murins avant et après l’administration de différentes doses de Tertiapine-Q.L’inhibition du courant IKACh par la Tertiapine-Q prévient des dysfonctions sinusales et améliore la conduction dans ces modèles de bradycardie congénitale suggérant la possibilité d’un développement d’un ciblage pharmacologique d’IKACh afin de parvenir à corriger la DNS et les troubles de la conduction. / Inhibition of KACh channels by the bee venom peptide tertiapin-Q rescues inherited cardiac conduction defects, sino-atrial bradycardia, and atrioventricular block in models of congenital dysfunctionSinus node dysfunction (SND) is a widespread disease of heart automaticity. SND refers to a multitude of sinus node (SAN) disorders characterized by failure to generate or conduct the cardiac impulse. The only currently available therapy for chronic SND is the implantation of an electronic pacemaker. Epidemiological studies forecast an increasing need for pacemaker implantation during the next 50 years, with the ageing of the population. It is thus an important medical and societal issue, to develop innovative therapies for SND. Pharmacologic inhibition of the G-protein activated K+ current (IKACh) could be a new therapeutic option to treat bradycardia and SND associated with other cardiac pathologies.We tested whether inhibition of IKAch by the peptide Tertiapin-Q could rescue SND and conduction dysfunction in Cav1.3-/- mice carrying concurrent ablation of L-type Cav1.3 and T-type Cav3.1 channels (Cav1.3-/-/Cav3.1-/-), mice carrying loss-of-function of f-channels (HCN4-CNBD) and Nav1.5 haploinsufficient (Scn5a+/-) mice.We employed telemetric ECG recordings of heart rate (HR), SAN pacemaking and AV dysfunction in mice before and after administration of different doses of Tertiapin-Q.Tertiapin-Q significantly improves the HR of Cav1.3-/-, Cav1.3-/-/Cav3.1-/-, and HCN4-CNBD from doses of 0.1 to 5 mg/kg. HRs of Tertiapin-Q-treated mice were similar to those recorded in untreated wild-type mice. Tertiapin-Q also improved cardiac conduction of Scn5a+/- mice by 24%.Pharmacological inhibition of IKAch by Tertiapin-Q prevents SAN dysfunction and improves conduction in three models of congenital bradycardia suggesting the possibility of pharmacologic development of IKACh targeting to manage SND and conduction disease, to delay or replace the implantation of an electronic pacemaker.

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