La thérapie antirétrovirale (TAR) réduit drastiquement la transmission verticale du VIH. Cependant, des études récentes démontrent une association entre l'utilisation de la TAR pendant la grossesse, particulièrement à base d’inhibiteurs de protéases (IP), et les issues adverses, notamment l’accouchement prématuré. Les objectifs principaux de mon mémoire étaient de caractériser le profil immunitaire/inflammatoire au niveau placentaire et systémique chez les personnes enceintes vivant avec le VIH (PEVVIH) et les comparer en fonction du statut VIH et de la classe de TAR. Au niveau placentaire, l'immunotypage des cellules Hofbauer a révélé que les placentas des PEVVIH contenaient un niveau significativement plus élevé de leucocytes CD45+ attribuable à une augmentation du nombre de cellules Hofbauer que le groupe contrôle. Les analyses multivariables ont révélé que cette augmentation des cellules immunitaires était associée à un profil prédominant CD163+ dans tous les sous-groupes de TAR par rapport au groupe de contrôle. Au niveau systémique, la quantification de 12 médiateurs inflammatoires dans le plasma périphérique a révélé que la TAR à base d'IP est associée à une libération de cytokines pro-inflammatoires et antivirales significativement plus élevée par rapport à la TAR à base d'InSTI aux deux trimestres étudiés, en plus d’être associée à l’accouchement prématuré et une charge virale plus élevée au deuxième trimestre. Ces résultats suggèrent que la classe de TAR n'affecte pas intrinsèquement la sélection des cellules Hofbauer CD163+ et CD68+ au niveau placentaire, mais que la TAR à base d'IP est associée à une réponse immunologique distincte qui augmente le risque d'accouchement prématuré. / Antiretroviral therapy (ART) drastically reduces vertical transmission of HIV. However, recent studies demonstrate an association between the use of ART during pregnancy, particularly protease inhibitor (PI)-based ART, and adverse outcomes, including preterm delivery. The main objectives of my dissertation were to characterize the inflammatory profile at the placental and systemic levels in pregnant people living with HIV (PPLWH) and compare them according to HIV status and ART class. At the placental level, Hofbauer cell immunotyping revealed that placentas of PPLWH contained a significantly higher number of CD45+ leukocytes due to an increase in Hofbauer cells compared to controls. Multivariate analyses revealed that this increase in immune cells was associated with a predominantly CD163+ profile in all ART subgroups compared with the control group. At the systemic level, the quantification of 12 inflammatory mediators in peripheral plasma revealed that PI-based ART was associated with significantly higher pro-inflammatory and antiviral cytokine release compared to InSTI-based ART in both trimesters studied, in addition to being associated with preterm delivery and higher viral load. These results suggest that the class of ART does not intrinsically affect the selection of CD163+ and CD68+ Hofbauer cells in the placenta, but that PI-based ART is associated with a distinct immunological response which may increase the risk of preterm delivery.

Problématique : Le cancer du sein est un des types du cancer les plus diagnostiqués au Canada et il est une cause majeure de mortalité liée au cancer chez la femme. Le cancer du sein triple négatif (CSTN) a un mauvais pronostic dû à son agressivité clinique et à l’absence de réponse aux traitements habituels du cancer du sein tels que l’hormonothérapie et l’inhibition de HER2. En ce moment, les avancées pour le CSTN restent très négligeables. Il y a un besoin urgent d’identifier une nouvelle thérapie qui ciblerait les voies signalétiques pro-métastatiques du cancer du sein triple négatif et ainsi, bloquer idéalement la prolifération et la dissémination métastatique des cellules cancéreuses. Cadre conceptuel : Dernièrement le laboratoire de Sylvain Meloche à l’IRIC a montré qu’une déplétion génétique de ERK3 (Extracellular Regulated Kinase 3) inhibe la croissance des tumeurs mammaires dans un modèle de souris de CSTN et bloque la progression métastatique. Ainsi, suite à ces résultats, nous avons émis l’hypothèse que l’inhibition de ERK3 à l’aide de molécules engendrerait une diminution de la prolifération cellulaire au niveau du cancer du sein triple négatif. L’objectif principal du projet est de développer des molécules ayant des propriétés inhibitrices de ERK3 in vitro. Les deux objectifs secondaires sont d’évaluer leur potentiel d’inhibition vis-à-vis ERK3 dans des modèles in cellulo et de confirmer, parallèlement à la relation structure-activité (SAR), leur mode de liaison par des méthodes computationnelles. Méthodologie : Des composés tête de série ont été identifiés à la suite d’un criblage à haut débit d’une librairie d’inhibiteurs de kinases. Quelques composés intéressants démontrent une activité dont les IC50 (concentration inhibant 50% de l’activité de la kinase) sont inférieurs à 300 nM. Une molécule en particulier a été retenue compte tenu de son niveau d’activité et de sélectivité par rapport aux autres kinases. Une modification systématique des groupements fonctionnels lors de la synthèse d’analogues nous permet d’établir de façon claire le mode de liaison et ainsi, établir la SAR de notre composé tête de série et le site de liaison de ERK3. Les tests d’inhibition compétitifs in vitro seront effectués à l’IRIC à partir de la protéine ERK3 purifiée. Grâce à la SAR établie, on poursuit l’optimisation avec l’intégration de groupements moléculaires solubilisants qui vont permettre d’augmenter les propriétés pharmacocinétiques et ainsi, augmenter l’activité cellulaire de notre composé tête de série. En dernier lieu, à l’aide de la modélisation computationnelle, le mode de liaison de la molécule à ERK3 sera élucidé de façon à confirmer la SAR et aussi, permettre le développement de nouvelles structures (ex : bioisotères) pouvant avoir aussi une activité inhibitrice sur ERK3. Résultats : Une SAR étendue basée sur l’inhibiteur sélectionné a été obtenue. Un inhibiteur de ERK3 possédant une puissance cellulaire (IC50) de 2 μM a été synthétisé. Retombée scientifique : Les travaux effectués dans le cadre de ma maîtrise pourraient conduire au développement de nouveaux traitements pour le cancer du sein triple négatif en ciblant les voies de signalisation prométastatiques à l’aide de molécules inhibitrices. / Problem: Breast cancer is one of the most diagnosed type of cancer in Canada and it is a major cause of mortality linked to cancer for women. Triple-negative breast cancer (TNBC) is the form with the worse prognostic compared to the other forms of breast cancer due to clinical aggressiveness and the absence of response to conventional hormonal therapy and HER2 inhibition therapy. At this time, therapeutic advances for TNBC remain very negligible, which testifies to a need for a new therapy that would target the prometastatic signaling pathways of triple negative breast cancer and thus, ideally block the proliferation and the metastatic dissemination of cancer cells. Conceptual Basis: Recently, Sylvain Meloche's laboratory at IRIC showed that genetic depletion of ERK3 (Extracellular Regulated Kinase 3) inhibits the growth of mammary tumors in a TBNC mouse model and blocks metastatic progression. Thus, in view of these results, our hypothesis is that the inhibition of ERK3 using a specific inhibitor would cause a decrease in cell proliferation in triple negative breast cancer. The main objective of my project is to develop small molecules with inhibitory properties of ERK3 in vitro. The two secondary objectives are to evaluate their inhibitory potential toward ERK3 in cellulo models and to confirm, alongside the structure-activity relationship (SAR), the binding mode of inhibitors to ERK3 by computational methods. Methodology: Lead compounds have been identified following a high-throughput screening of a kinase inhibitor library. A few interesting compounds emerged with activities below 300 nM (IC50). One molecule in particular was chosen given its good selectivity as well as an acceptable inhibitory activity. Systematic modification of functional groups for analogs synthesis allows us to clearly establish the binding mode and thus, establish the SAR of our lead compound. The competitive inhibition tests in vitro have been carried out at IRIC using purified ERK3. With the established SAR, optimization is continued with the integration of solubilizing molecular groups which will increase the pharmacokinetic properties and thus increase the cellular activity of our lead compound.7 Finally, with the help of computational modeling, the binding mode of the molecule to ERK3 will be elucidated to confirm the SAR and also, allow the development of new structures (i.e. bioisosters) that can have an inhibitory activity on ERK3. Results: An extensive SAR of the inhibitor is obtained. A compound with 2 μM activity (IC50) on ERK3 in cell has been synthesized. Scientific outlook: The work done as part of my master's degree could lead to the development of a new treatment for triple-negative breast cancer by targeting prometastatic signaling pathways using small inhibitory molecules.

L'insuffisance cardiaque (IC) est l'une des principales causes de décès dans le monde. Les maladies cardiovasculaires sont devenues une préoccupation majeure de santé publique et le resteront probablement à l'avenir avec le vieillissement de la population et l'augmentation du taux de survie des patients atteints de maladies cardiovasculaires. L'infarctus du myocarde (IM) est le principal facteur de risque favorisant le développement de l’IC. L'une des principales caractéristiques de l'IC est une dérégulation du fonctionnement du système nerveux autonome (SNA), en particulier une hyperactivité du système nerveux sympathique (SNS) qui contribue largement à la progression de la maladie et à l'augmentation de la morbidité. Le mécanisme de l'hyperactivité du SNS n'est que partiellement connu. En ce qui concerne la progression de l'IM à l'IC, des études suggèrent un engagement concerté du cerveau (médulla), du nerf vague et des nerfs sympathiques, en plus du tissu cardiaque qui serait à l'origine de la maladie systémique. En plus des altérations du SNA, des exemples de comorbidités de l'IC comprennent des troubles cognitifs tel que l’anxiété et la dépression ainsi que des modifications atrophiques des régions cérébrales chez les patients atteints d'IC. L’ensemble, de ces données montrent l'importance du système nerveux central et périphérique dans l'IC. En plus du système nerveux cardiaque intrinsèque, qui comprend un réseau de ganglions intracardiaques et de neurones interconnectés, le coeur, en particulier l'épicarde, possède des milliers de neurones intégrés, dont beaucoup expriment le récepteur vanilloïde 1 (TRPV1). Au cours des dernières années, des études scientifiques ont montré que l'application épicardique de résinifératoxine (RTX), un agoniste spécifique de TRPV1, au moment de l'IM induit, conduit à une réduction de la fibrose cardiaque, prévient l'hyperactivation du SNS et améliore la fonction cardiaque dans plusieurs modèles. La thèse visait à mieux caractériser la fonction de ces fibres exprimant TRPV1 dans l'IM et l'IC qui en découle. Les principaux objectifs de présente étude sont les suivants : 1) Identifier si les fibres épicardiques exprimant TRPV1 entraînent des modifications des fonctions cérébrales. 2) Élucider les mécanismes moléculaires sous-jacents dans les tissus du système nerveux en aval des traitements IM et RTX en utilisant la protéomique ; et 3) Déterminer si les stimuli nociceptifs dans un modèle alternatif, C. elegans, via la modulation des récepteurs vanilloïdes orthologues par RTX, peuvent entraîner une modification du comportement et des mécanismes moléculaires associés aux effets induits par l'exposition à RTX. Pour répondre à ces 4 objectifs, nous avons combiné la dénervation des afférences sympathiques cardiaques, via l'application épicardique de RTX, avec un modèle IM validé. Des études comportementales ont été menées pour évaluer la dépression et l'anxiété des animaux après le début de l’IC. L'analyse protéomique a été réalisée sur plusieurs tissus dont le cortex frontal, le ventricule gauche, le bulbe rachidien (médulla), la moelle épinière et le nerf vague. Les principaux résultats de cette thèse ont montré que la dénervation afférente cardiaque sympathique par RTX atténue le remodelage cardiaque et restaure la fonction cardiaque lors d’un IM dans un modèle murin. L'analyse comportementale a démontré que les souris IM sont déprimées et anxieuses et que le traitement RTX réduit significativement l'expression du phénotype anxieux. La protéomique réalisée sur des cortex frontaux isolés a identifié des signatures protéiques uniques pour chacun des groupes (IM, RTX et IM/RTX), indiquant des voies partagées et uniques attribuées par IM et RTX. Les analyses bio-informatiques ont montré un enrichissement significatif des voies métaboliques dans tous les tissus et traitements, et à tout moment, suggérant un rôle central de la fonction mitochondriale après les traitements IM et RTX. Des voies fonctionnelles enrichies dans ces tissus, y compris le cytosquelette, les vésicules et la transduction du signal, peuvent être en aval des réponses initiées par les mitochondries en raison de modifications du taux d'impulsion neuronale après un IM ou d'une altération de la communication coeur-cerveau après l'application de RTX. Certaines voies et molécules communes ont aussi été observées chez C. elegans, comme la voie de signalisation de Wnt, ce qui suggère des effets semblable de RTX. La thèse contribue à une meilleure compréhension des mécanismes physiologiques des nerfs exprimant TRPV1 et offre des informations clés pour comprendre les mécanismes sous-jacents aux troubles neurologiques d'origine cardiaque. Le modèle de C. elegans peut servir de futur modèle pour tester des molécules pharmacologiquement actives pour de futures thérapeutiques. / Heart failure (HF) is one of the leading causes of death worldwide. Cardiovascular diseases are therefore becoming a major health problem and will probably continue to be so in the future with the aging of the population and the increase in the survival rate of patients with cardiovascular disease. Myocardial infarction (MI) is the main risk factor for developing HF. One of the prominent features of HF is a dysregulation in the functioning of the autonomic nervous system (ANS), in particular a sympathetic nervous system (SNS) hyperactivity that largely contributes to disease progression and increased morbidity. The mechanism for the SNS hyperactivity is only partially known. Regarding the progression from MI to HF, studies suggest a concerted engagement of the brain (medulla oblongata), the vagus nerve and the sympathetic nerves, in addition to cardiac tissue that are thought to instigate systemic disease. In addition to the alterations in the ANS, examples of HF comorbidities include cognitive impairment and atrophic changes in brain regions in HF patients. Together these data show the importance of the central and peripheral nervous system in HF. In addition to the intrinsic cardiac nervous system, which includes a network of intracardiac ganglia and interconnecting neurons, the heart, especially the epicardium, has thousands of embedded neurons, many of which express the transient receptor potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1). Over recent years studies have shown that the epicardial application of resiniferatoxin (RTX), a specific agonist of TRPV1, at the time of induced MI, leads to a reduction of cardiac fibrosis, prevents hyperactivation of the SNS and improves the heart function in several model systems. The thesis was aimed to better characterize the function of these TRPV1-positive fibers in MI and resulting HF. The main objectives of the current study were : 1) To identify whether the TRPV1 expressing epicardial fibers lead to changes in brain activity and function. 2) To elucidate the underlying molecular mechanisms in nervous system tissue downstream from MI and RTX treatments using proteomics; and 3) To determine if nociceptive stimuli in an alternate model, C. elegans, via the modulation of orthologous vanilloid receptors by RTX, can lead to altered behavior and molecular mechanisms associated with RTX exposureinduced effects. To meet these objectives, we combined denervation of cardiac sympathetic afferents, via epicardial application of RTX, with a validated MI model. Behavioral studies were carried out to evaluate the depression and anxiety of the animals after the onset of HFt. Proteomic 6 analysis was carried out on several tissues including the frontal cortex, left ventricle, medulla oblangata, spinal cord, and vagus nerve. The major findings of this thesis are that sympathetic cardiac afferent denervation by RTX attenuates cardiac remodeling and restores cardiac function during MI in a mouse model. Behavioral analysis demonstrated that MI mice are depressed and anxious and that RTX treatment significantly reduced the expression of the anxious phenotype. Proteomics performed on isolated frontal cortices identified unique protein signatures for each of the groups (MI, RTX and MI/RTX), indicating shared and unique pathways attributed by MI and RTX. Bioinformatic analyses showed a significant enrichment for metabolic pathways in all tissues and treatments, and at all time points, suggesting a central role of mitochondria function following MI and RTX treatments. Enriched functional pathways in these tissues, including cytoskeleton, vesicles, and signal transduction, may be downstream of mitochondria-initiated responses due to changes in neural impulse rate after MI or altered heart-brain communication following RTX application. Some common pathways and molecules were observed in C. elegans, such as the Wnt signaling pathway, suggesting similar effects of RTX. The current thesis contributes to a better understanding of the physiological mechanisms of the TRPV1 expressing nerves and offers key information to understand the mechanisms underlying neurological disorders of cardiac origin. The C. elegans model may serve as a future model for testing pharmacologically active molecules for future therapeutics.

La leucémie aiguë lymphoblastique (LAL) est le cancer pédiatrique le plus fréquent. Elle est la cause principale de mortalité liée au cancer chez les enfants due à un groupe de patient ne répondant pas au traitement. Les patients peuvent aussi souffrir de plusieurs toxicités associées à un traitement intensif de chimiothérapie. Les études en pharmacogénétique de notre groupe ont montré une corrélation tant individuelle que combinée entre les variants génétiques particuliers d’enzymes dépendantes du folate, particulièrement la dihydrofolate réductase (DHFR) ainsi que la thymidylate synthase (TS), principales cibles du méthotrexate (MTX) et le risque élevé de rechute chez les patients atteints de la LAL. En outre, des variations dans le gène ATF5 impliqué dans la régulation de l’asparagine synthetase (ASNS) sont associées à un risque plus élevé de rechute ou à une toxicité ASNase dépendante chez les patients ayant reçu de l’asparaginase d’E.coli (ASNase). Le but principal de mon projet de thèse est de comprendre davantage d’un point de vue fonctionnel, le rôle de variations génétiques dans la réponse thérapeutique chez les patients atteints de la LAL, en se concentrant sur deux composants majeurs du traitement de la LAL soit le MTX ainsi que l’ASNase. Mon objectif spécifique était d’analyser une association trouvée dans des paramètres cliniques par le biais d’essais de prolifération cellulaire de lignées cellulaires lymphoblastoïdes (LCLs, n=93) et d’un modèle murin de xénogreffe de la LAL. Une variation génétique dans le polymorphisme TS (homozygosité de l’allèle de la répétition triple 3R) ainsi que l’haplotype *1b de DHFR (défini par une combinaison particulière d’allèle dérivé de six sites polymorphiques dans le promoteur majeur et mineur de DHFR) et de leurs effets sur la sensibilité au MTX ont été évalués par le biais d’essais de prolifération cellulaire. Des essais in vitro similaires sur la réponse à l’ASNase de E. Coli ont permis d’évaluer l’effet de la variation T1562C de la région 5’UTR de ATF5 ainsi que des haplotypes particuliers du gène ASNS (définis par deux variations génétiques et arbitrairement appelés haplotype *1). Le modèle murin de xénogreffe ont été utilisé pour évaluer l’effet du génotype 3R3R du gène TS. L’analyse de polymorphismes additionnels dans le gène ASNS a révélé une diversification de l’haplotype *1 en 5 sous-types définis par deux polymorphismes (rs10486009 et rs6971012,) et corrélé avec la sensibilité in vitro à l’ASNase et l’un d’eux (rs10486009) semble particulièrement important dans la réduction de la sensibilité in vitro à l’ASNase, pouvant expliquer une sensibilité réduite de l’haplotype *1 dans des paramètres cliniques. Aucune association entre ATF5 T1562C et des essais de prolifération cellulaire en réponse à ASNase de E.Coli n’a été détectée. Nous n’avons pas détecté une association liée au génotype lors d’analyse in vitro de sensibilité au MTX. Par contre, des résultats in vivo issus de modèle murin de xénogreffe ont montré une relation entre le génotype TS 3R/3R et la résistance de manière dose-dépendante au traitement par MTX. Les résultats obtenus ont permis de fournir une explication concernant un haut risque significatif de rechute rencontré chez les patients au génotype TS 3R/3R et suggèrent que ces patients pourraient recevoir une augmentation de leur dose de MTX. À travers ces expériences, nous avons aussi démontré que les modèles murins de xénogreffe peuvent servir comme outil préclinique afin d’explorer l’option d’un traitement individualisé. En conclusion, la connaissance acquise à travers mon projet de thèse a permis de confirmer et/ou d’identifier quelques variants dans la voix d’action du MTX et de l’ASNase qui pourraient faciliter la mise en place de stratégies d’individualisation de la dose, permettant la sélection d’un traitement optimum ou moduler la thérapie basé sur la génétique individuelle. / Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most frequent malignancy of childhood. It is the principal cause of cancer–related mortality in children due to a persistent group of patients who does not respond to standard anti-cancer treatment. Susceptible patients may also suffer from number of toxicities associated with intensive chemotherapy treatment. Pharmacogenetic studies of our group, showed that particular genetic variants of the folate dependent enzymes, particularly, dihydrofolate reductase (DHFR) and thymidylate synthase (TS), major targets of methotrexate (MTX), correlate both individually and combined with increased risk of relapse in patients with childhood ALL. Furthermore, variations of ATF5 gene involved in asparagine synthetase (ASNS) regulation and of ASNS gene were associated with higher risk of ALL relapse or with ASNase related toxicity in patients who received E.coli asparaginase (ASNase). The major goal of my doctoral research project was to further understand from the functional point of view the role of genetic variations underlying therapeutic responses of childhood ALL, by focusing on two major components of ALL treatment, MTX and ASNase. My specific goal was to analyze associations found in clinical setting using cellular proliferation assay in lymphoblastoid cell lines (LCLs, n=93) and xenograft mice model of ALL. Genetic variation in TS polymorphism (homozygosity for triple repeat allele, 3R) and of DFHR haplotype *1b (defined by particular allelic combination derived from six polymorphic sites in the major and minor promoter of DHFR), on MTX sensitivity was assessed using cellular proliferation assay. Similar in vitro assay in response to E.coli ASNase was used to access the T1562C variation in the ATF5 5’UTR and particular haplotypes of ASNS gene (defined by two genetic variation and arbitrarily named haplotype *1). Xenograft mouse model was used to access the effect of TS 3R3R genotype. Analysis of additional polymorphisms in ASNS gene revealed diversification of haplotype *1 of ASNS gene in 5 subtypes, two polymorphisms (rs10486009 and rs6971012,) defining particular subtypes correlated with in vitro sensitivity to ASNase and one of them (rs10486009) seems particularly important for reducing sensitivity to ASNase in vitro, possibly providing mechanistic explanation for lower sensitivity of haplotype *1 observed in clinical setting. No association between ATF5 T1562C variation and cellular proliferation assay in response to E.coli ASNase was found. We did not observe genotype-related association when in vitro sensitivity to MTX in LCLs was analyzed. In contrast, in vivo results using xenograft mouse model demonstrated the relationship between the TS 3R/3R genotype and the resistance to MTX treatment in dose-dependent manner. Obtained results provided function explanation for the significantly higher risk of relapse seen in 3R/3R ALL patients and suggest that these patients might benefit from increase dose of MTX. Through these experiments we also showed that xenogeneic mice model can serve as a preclinical tool to explore individualized treatment options. In conclusion, the knowledge acquired through my doctoral work confirmed and/or identified some functional variants in MTX and ASNase action pathway which may facilitate dose individualization strategies, allowing for optimal treatment selection or tailoring childhood ALL therapy based on individual genetics.

Contexte: L’insuffisance cardiaque (IC) est un syndrome clinique complexe regroupant un large spectre de mécanismes pathologiques qui peuvent altérer le fonctionnement de multiples organes, affectant ainsi la pharmacocinétique (PK) des médicaments. La modélisation pharmacocinétique de population (Pop-PK) consiste à appliquer des modèles non linéaires à effets mixtes dans le but de décrire l’exposition au traitement et quantifier la variabilité au niveau des paramètres PK. Objectif: Ce travail vise à évaluer par approche populationnelle la PK du candesartan en IC et à déterminer les covariables décrivant d’une façon statistiquement et cliniquement significative la variabilité au niveau de la clairance. Méthodes: Les données d’une étude pharmacogénomique ouverte, multicentrique et prospective ont été récupérées pour amorcer notre analyse. Le processus de modélisation et les simulations nécessaires sont réalisés à l’aide du logiciel NONMEM (Nonlinear Mixed Effects Modeling). Les covariables préliminaires ont été sélectionnées par des tests statistiques tels que la régression linéaire et l’ANOVA. Enfin, l’élaboration du modèle final est effectuée en utilisant le processus de sélection séquentielle « forward/backward ». Résultats: Un total de 281 patients caucasiens ont été inclus pour développer le modèle Pop-PK. Les données du candesartan ont été caractérisées par un modèle à un compartiment avec absorption de premier ordre et temps de latence. Le poids, l'âge, la fraction N-terminale du pro-peptide natriurétique de type b (NT_proBNP), le débit de filtration glomérulaire (DFG), le diabète, l'utilisation du furosémide et le sexe étaient les covariables sélectionnées préliminairement pour la clairance apparente (CL/F). Le modèle final développé pour la clairance apparente est représenté par l'équation suivante : CL/F (L/h) = 8.63*(Poids/82.45)0.963 * (DFG/74)0.56 * (0.682) Diabète * EXP0.138 Les simulations ont révélé qu'une diminution importante de la clairance orale (diminution de plus que 25 %) est obtenue en combinant les facteurs significatifs retenus dans le modèle final (patients ayant un faible poids corporel avec une insuffisance rénale modérée à sévère et patients diabétiques avec une insuffisance rénale faible à modérée). Nous avons constaté que les patients ayant ces combinaisons dans notre base de données présentaient des concentrations comparables à celles des autres patients malgré qu’ils aient toléré de plus faibles doses pendant la titration. Conclusion: La modélisation PK de population a servi comme une approche efficace pour caractériser la PK du candesartan en IC et pour identifier une sous-population à risque d’une exposition élevée. Le poids, le DFG et le diabète sont des prédicteurs indépendants de la clairance du candesartan en IC. Considérant ces facteurs, une approche plus individualisée de l'administration du candesartan est nécessaire chez les patients atteints d’IC. / Context: Heart failure (HF) is a clinical condition that causes pathological changes all over the body affecting hence the pharmacokinetic of drugs. Population pharmacokinetic modeling (Pop-PK) consists in applying non-linear mixed-effects models to characterize treatment exposure and quantify PK parameters variability. Objective: The aim of this study was to investigate the pharmacokinetic (PK) of candesartan in HF patients while examining statistically and clinically significant covariates on estimated clearance using population pharmacokinetics (Pop-PK) modeling approach. Methods: Data from a prospective, multicenter, open label, pharmacogenomic study were available for this analysis. Modeling and simulations were conducted using Nonlinear Mixed-Effect Modeling software NONMEM. Preliminary selection of covariates was accomplished with statistical tests (linear regression and ANOVA). Final model development was performed using forward/backward selection approach on the preliminarily selected covariates. Results: A total of 281 Caucasian patients were included to develop the Pop-PK model. Candesartan data were characterized by a 1 compartment model with first order absorption and lag time. Weight, age, N-terminal pro b-type natriuretic peptide (NT_proBNP), estimated glomerular filtration rate (eGFR), diabetes, use of furosemide and sex were the preliminarily selected covariates for apparent clearance (CL/F). The final model developed for apparent clearance is represented by the following equation: CL/F (L/h) = 8.63*(Weight/82.45)0.963 * (eGFR/74)0.56 * (0.682) Diabetes * EXP0.138 Simulations revealed that an important decrease in oral clearance (decrease of more than 25%) is obtained with the combination of the significant factors retained in the final model (patients having low weight with moderately to severely impaired renal function and diabetic with mildly to moderately impaired renal function). Patients having these combinations in our database were found to achieve comparable concentrations to the rest of patients despite tolerating only lower doses. Conclusion: Population pharmacokinetic modeling provided an effective approach to characterize the PK of candesartan in HF and to identify a subpopulation at potential risk of high exposure. Weight, eGFR and diabetes are independent predictors of candesartan clearance in patients with HF. Considering these factors, a more individualized approach of candesartan dosing is needed in HF patients.

Plusieurs types cancéreux prolifèrent par leur capacité à exprimer les marqueurs de régulation négative du système immunitaire, tels que les récepteurs PD-L1 et CD80/86 qui inhibent l’activation et la prolifération des lymphocytes T. L’inhibition de ces voies par des anticorps peut ainsi réactiver la réponse immunitaire chez certains patients. D’autres voies de signalisations sont aujourd’hui explorées, incluant la signalisation purinergique (ATP/adénosine) dans la modulation du microenvironnement tumoral. L’adénosine triphosphate extracellulaire (ATPe) est classifiée parmi les molécules de danger extracellulaire et joue un rôle crucial dans l’activation de l’inflammasome NLRP3, un médiateur important de l’activation des réactions pro-inflammatoires. Les ultrasons sont des ondes mécaniques de haute pression capable d’engendrer la cavitation inertielle des microbulles. Il a été démontré que les microbulles (MB) stimulées par ultrasons (US) libèrent de l’ATP dans le muscle squelettique et dans le muscle cardiaque. Nous posons l’hypothèse selon laquelle le traitement US+MB appliqué sur une tumeur de cancer du sein murin (4T1) in vivo peut libérer de l’ATPe localement dans le but d’activer des réactions pro-inflammatoires pour l’immunothérapie du cancer. Dans ce mémoire, nous présentons la quantification du signal d’ATPe d’une culture de cellules 4T1, puis in vivo dans le muscle et dans une tumeur solide sous-cutanée chez la souris à la suite d’une stimulation par US+MB. Nos études démontrent que la thérapie US+MB libère de l’ATP in vitro et in vivo. En comparant le signal découlant de l’injection IM d’ATP avec celui du muscle et des tumeurs post-US+MB, nous pouvons conclure que le traitement US+MB libère une quantité d’ATPe supérieure à 250 µM, ce qui est supérieur à la quantité d’ATPe dans un microenvironnement tumoral et qui persiste pour une durée d’au moins 60 min dans le muscle et 45 min dans la tumeur. La transfection stable de cellules MC38 (carcinome colorectal) à travers le gène PLenti-PmeLUC, codant la synthèse de luciférase sur la face externe de la membrane cellulaire, est explorée afin d’augmenter le rapport signal sur bruit en bioluminescence (annexe A). L’utilisation de POM-1 (inhibiteur pharmacologique de CD39) et l’utilisation de souris knockout du gène CD39 sont discutées pour la suite du projet afin d’inhiber la dégradation de l’ATP extracellulaire (Annexe B). / Several cancer types proliferate due to their ability to express the negative regulatory markers of the immune system (PD-L1 and CD80/86) which inhibit the activation and proliferation of T cells. Inhibition of these pathways by antibodies (anti-PDL-1, anti-PD-1, anti-CTLA-4) can thus reactivate the immune system in some patients. Other signaling pathways are currently being explored, including purinergic signaling (ATP/adenosine) in the modulation of the tumor microenvironment. Extracellular Adenosine triphosphate (eATP) is classified as danger signal plays a critical role in the activation of the NLRP3 inflammasome, an important mediator of the innate immune response. Ultrasound (US) and microbubbles (MB) have been shown to release ATP in skeletal and cardiac muscle. Thus, we hypothesized that US+MB treatment in 4T1 breast cancer cells could locally activate pro-inflammatory responses by releasing an eATP in tumors for cancer immunotherapy. In this thesis, I present the quantification of the eATP signal after US+MB stimulation in vitro (4T1 cell culture), then in muscle and subcutaneous solid tumors in the mouse. Our studies demonstrate that US+MB treatment releases ATP both in vitro and in vivo. In comparison with the IM injection of ATP, we can conclude that US+MB released a large amount of ATP (>250 µM), which is more than the eATP concentration in the untreated tumor microenvironment, and which persisted for at least 60 min in muscle and 45 min in tumor. The stable transfection of MC38 cells (colorectal carcinoma) through the Plenti-PmeLUC gene, encoding the synthesis of luciferase on the external surface of cell membrane is explored to increase the signal to noise ratio in bioluminescence (see appendix A). The use of POM-1 (pharmacological inhibitor of CD39) and CD39 gene knockout mice to inhibit the degradation of eATP signal are discussed for the continuation of the project.

La naissance prématurée (PTB), soit une naissance se produisant avant la 37e semaine de grossesse chez l’humain, est encore à ce jour l’une des principales causes de mortalité et de morbidité néonatales. En accord avec les études actuelles, la gravité des issues à la naissance est fortement liée à une perte de la fine régulation physiologique de facteurs inflammatoires durant la grossesse. Notamment, plusieurs données ont identifié qu’une fluctuation à la hausse des taux d'interleukine(IL)-6 dans les tissus gestationnels, liquide amniotique et le sang fœtal augmentait grandement le pronostic de naissance prématurée et de ses comorbidités associées. En plus de créer un environnement inflammatoire défavorable durant la gestation, IL-6 augmente aussi les protéines d’activation utérine (UAP), ayant pour effet de diminuer le temps de gestation. À ce jour, les traitements disponibles consistent principalement à arrêter les contractions à l’aide de tocolytiques. Conséquemment, ils ne s'attaquent pas directement à l'inflammation maternelle en amont sur le développement du fœtus. C’est dans cette optique que notre laboratoire a développé un peptidomimétique, nommé HSJ633 (633), inhibant sélectivement le récepteur d’IL-6 (IL-6R). Brièvement, la liaison d’IL-6 à IL-6R permet l’activation de la protéine accessoire du récepteur, gp130, générant la phosphorylation des protéines STAT3, Akt et de Erk1/2. En se liant de manière allostérique, 633 a l’avantage d’inhiber sélectivement la voie de STAT3, celle-ci affectant principalement la production de protéines de la phase aiguë. Ainsi, nous émettons l'hypothèse qu’IL-6 peut causer des dommages aux tissus fœtaux et que l'inhibition d’IL-6R à l'aide de 633 améliorera les conditions à la naissance tout en maintenant l'intégrité du tissu fœtal. Durant tout ce travail, nous avons confirmé notre hypothèse en utilisant un modèle d’inflammation anténatal en administrant du lipopolysaccharide (LPS) sur des souris gestantes vers la fin de leur période de gestation. Les résultats ont montré que le LPS raccourcissait le temps de gestation, réduisaient le poids à la naissance et la survie des souriceaux. Nous avons confirmé qu’IL-6 est un acteur important dans l’induction de la PTB et que son inhibition sélective est suffisante pour diminuer les effets délétères de l’inflammation. De plus, nous avons caractérisé l’effet protecteur de 633 en analysant la transcription de gènes et la synthèse de protéines clés dans les tissus maternels et gestationnels. Nous avons poursuivi davantage la caractérisation en révélant la présence de 633 au niveau du placenta, mais pas dans le fœtus. Ces résultats permettent de clarifier que 633 diminue l’inflammation directement au niveau placentaire et qu’il empêche les dommages subséquents de se répercuter dans le fœtus. En outre, nous avons établi que 633 réduit la morphologie anormale des poumons et des intestins de la progéniture induite par l'inflammation. Ensemble, nos données montrent que 633 a rétabli avec succès les issues à la naissance en augmentant le temps de gestation, la survie à la naissance et en préservant l'intégrité des organes du fœtus dans un modèle de PTB induite par le LPS. Ces découvertes soulignent l’importance d’IL-6 et révèlent l’efficacité́ pharmacologique in vivo d’un nouveau modulateur de l’IL-6R. Le 633 est un nouveau prototype thérapeutique prometteur pour la prévention de la PTB chez l’humain. / Preterm birth (PTB), which occurs before the 37th week of pregnancy in humans, is still one of the leading causes of neonatal mortality and morbidity. In agreement with current studies, the severity of birth outcomes is strongly associated with the loss of fine physiological regulation of inflammatory factors during pregnancy. Notably, several data have identified that upward fluctuation of interleukin (IL)-6 levels in gestational tissue, amniotic fluid, and fetal blood greatly increase the prognosis of preterm birth and its comorbidities. In addition to creating an adverse inflammatory environment during gestation, IL-6 also increases uterine activating protein (UAP), which results in decreased gestation time. To date, available treatments mainly consist of attempts to stop contractions with tocolytics. Consequently, they do not directly address the upstream maternal inflammation on the development of the fetus. To that end, our laboratory has developed a peptidomimetic, named HSJ633 (633), that selectively inhibits the IL-6 receptor (IL-6R). Briefly, binding of IL-6 to IL-6R allows activation of the receptor accessory protein, gp130, resulting in phosphorylation of STAT3, Akt and Erk1/2. By binding allosterically, 633 has the advantage of selectively inhibiting the STAT3 pathway, the latter mainly affecting the production of acute phase proteins. Thus, we hypothesize that IL-6 can cause fetal tissue damage and that inhibition of IL-6R with 633 will improve birth outcomes while also preserving the integritý of fetal tissue. Throughout this work, we confirmed our hypothesis using a model of antenatal inflammation by injecting lipopolysaccharide (LPS) into pregnant mice towards the end of their gestation period. The results showed that LPS shortened gestation time and reduced pup weight and survival. We confirmed that IL-6 is an important player in the induction of PTB and that its selective inhibition is sufficient to decrease the deleterious effects of inflammation. In addition, we characterized the protective effect of 633 by investigating gene transcription and key protein synthesis in maternal and gestational tissues. We further characterized the effect by revealing the presence of 633 in the placenta, but not in the fetus. These results clarify that 633 decrease inflammation directly in the placenta and prevents subsequent injury in the fetus. In addition, we found that 633 reduces inflammation-induced abnormal morphology of the lungs and intestines of the offspring. Taken together, our data show that 633 successfully restored birth outcomes by increasing gestation time, survival at birth, and preserving fetal organ integrity in an LPS-induced PTB model. These findings underscore the importance of IL-6 and unveil the in vivo pharmacological efficacy of a novel modulator of IL-6R. 633 is a promising new therapeutic prototype for the prevention of PTB in humans.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Le cancer du poumon est la première cause de mortalité parmi les cancers en Amérique du Nord; le tabagisme en est la principale cause. La chimiothérapie conventionnelle n'est pas très efficace chez les patients avec une maladie métastatique ( stage IV). Les nouveaux agents antinéoplasiques investigués n'augmentent la survie.que modestement. II y a donc un besoin urgent d'élaborer de nouvelles approches thérapeutiques pour ce cancer. Pendant la tumorigénèse, le nombre de lésions génétiques augmente, principalement dans les oncogènes et les gènes suppresseurs de tumeur. Pour abolir la fonction d'un gène suppresseur de tumeur, il faut deux événements: une mutation dans une allèle et la perte d'hétérozygosité dans l'autre allèle. De récents résultats ont démontré que l'hyperméthylation, une altération épigénétique, est un mécanisme alternatif qui peut inactiver les gènes suppresseurs de tumeur. L'hyperméthylation joue un rôle important dans l'initiation et la progression d'une tumeur. Plusieurs gènes suppresseurs de tumeur sont hyperméthylés dans leur région promotrice. Cette hyperméthylation de la région promotrice est associée à la répression transcriptionnelle de ces gènes. De plus, la 5-Aza-2' -déoxycytidine (5-AZA-CdR), un médicament expérimental, peut activer l'expression de gènes suppresseurs de tumeur en inhibant la méthylation de l' ADN. L'efficacité de ce médicament chez les patients atteints de leucémie aiguë, en rechute suite à un traitement conventionnel, a déjà été démontrée. Son efficacité a aussi été observée chez les patients ayant un syndrome myélodysplasique qui est un syndrome préleucémique. Notre laboratoire a obtenu de bons résultats avec la 5-AZA-CdR dans une étude de phase I chez les patients atteints du cancer pulmonaire métastatique. Dans ce projet, nous avons étudié l'activité antinéoplasique de la 5-AZA-CdR et l'état de méthylation du récepteur f3 de l'acide rétinoique (RARf3 ), qui est un gène suppresseur de tumeur. Dans le cancer pulmonaire non à petites cellules (NSCLC), la délétion chromosomique affectant la région 3p24, où le gène RARP est situé, est fréquente. La mutation du gène RARP est cependant rare. Le gène RARP n'est pas exprimé dans la majorité des lignées cellulaires tumorales NSCLC et dans des tumeurs pulmonaires primaires. L 'hyperméthylation de la région promotrice du gène RARP pourrait être un mécanisme alternatif aux délétions et aux mutations dans l'inactivation de ce gène suppresseur de tumeur. Le premier objectif de ce projet était d'évaluer l'activité antinéoplasique in vitro de la 5-AZA-CdR et de l'acide rétinoique (RA) dans deux lignées cellulaires tumorales NSCLC, soient Calu-1 et A549. La 5-AZA-CdR est un agent cytotoxique puissant pour ces lignées cellulaires tumorales. Une concentration de 5-AZA-CdR de 100 ng/ml administrée pendant 48 h a produit plus de 90% de mort cellulaire ( ou de perte de clonogénicité). Cette perte de clonogénicité a augmenté avec la dose et la durée du traitement. Dans la lignée cellulaire Calu-1, où le RARP est méthylé, la combinaison de la 5-AZA-CdR à 10 ng/ml et de l'acide rétinoique à 0.1 et 1 µM a permis d'obtenir une interaction antinéoplasique synergique au niveau du potentiel clonogénique des cellules tumorales pulmonaires Calu-1. Cette combinaison a aussi permis d'obtenir une interaction antinéoplasique additive au niveau du potentiel clonogénique chez les cellules tumorales A549, une lignée cellulaire où le gène RARP n'est pas méthylé. Le deuxième objectif était de déterminer l'état de méthylation du gène RARP dans les biopsies de cancer pulmonaire humain et dans les tissus normaux adjacents. La méthode employée était le PCR spécifique à la méthylation (MSP), avec des amorces spécifiques pour la méthylation et pour la non-méthylation du gène RARP. Les résultats ont montré que la région promotrice du gène RARP était hyperméthylée dans 28% des biopsies de cancer pulmonaire. La plupart des tissus normaux adjacents n'étaient pas méthylés dans la région promotrice du RARf3. Le troisième objectif était de cloner et de séquencer la région promotrice du RARP des cellules d'adénocarcinome du colon DLD-1 et d'une biopsie tumorale pulmonaire afin chromosomique affectant la région 3p24, où le gène RARP est situé, est fréquente. La mutation du gène RARP est cependant rare. Le gène RARP n'est pas exprimé dans la majorité des lignées cellulaires tumorales NSCLC et dans des tumeurs pulmonaires primaires. L 'hyperméthylation de la région promotrice du gène RARP pourrait être un mécanisme alternatif aux délétions et aux mutations dans l'inactivation de ce gène suppresseur de tumeur. Le premier objectif de ce projet était d'évaluer l'activité antinéoplasique in vitro de la 5-AZA-CdR et de l'acide rétinoique (RA) dans deux lignées cellulaires tumorales NSCLC, soient Calu-1 et A549. La 5-AZA-CdR est un agent cytotoxique puissant pour ces lignées cellulaires tumorales. Une concentration de 5-AZA-CdR de 100 ng/ml administrée pendant 48 h a produit plus de 90% de mort cellulaire ( ou de perte de clonogénicité). Cette perte de clonogénicité a augmenté avec la dose et la durée du traitement. Dans la lignée cellulaire Calu-1, où le RARP est méthylé, la combinaison de la 5-AZA-CdR à 10 ng/ml et de l'acide rétinoique à 0.1 et 1 µM a permis d'obtenir une interaction antinéoplasique synergique au niveau du potentiel clonogénique des cellules tumorales pulmonaires Calu-1. Cette combinaison a aussi permis d'obtenir une interaction antinéoplasique additive au niveau du potentiel clonogénique chez les cellules tumorales A549, une lignée cellulaire où le gène RARP n'est pas méthylé. Le deuxième objectif était de déterminer l'état de méthylation du gène RARP dans les biopsies de cancer pulmonaire humain et dans les tissus normaux adjacents. La méthode employée était le PCR spécifique à la méthylation (MSP), avec des amorces spécifiques pour la méthylation et pour la non-méthylation du gène RARP. Les résultats ont montré que la région promotrice du gène RARP était hyperméthylée dans 28% des biopsies de cancer pulmonaire. La plupart des tissus normaux adjacents n'étaient pas méthylés dans la région promotrice du RARf3. Le troisième objectif était de cloner et de séquencer la région promotrice du RARP des cellules d'adénocarcinome du colon DLD-1 et d'une biopsie tumorale pulmonaire afin chromosomique affectant la région 3p24, où le gène RARP est situé, est fréquente. La mutation du gène RARP est cependant rare. Le gène RARP n'est pas exprimé dans la majorité des lignées cellulaires tumorales NSCLC et dans des tumeurs pulmonaires primaires. L 'hyperméthylation de la région promotrice du gène RARP pourrait être un mécanisme alternatif aux délétions et aux mutations dans l'inactivation de ce gène suppresseur de tumeur. Le premier objectif de ce projet était d'évaluer l'activité antinéoplasique in vitro de la 5-AZA-CdR et de l'acide rétinoique (RA) dans deux lignées cellulaires tumorales NSCLC, soient Calu-1 et A549. La 5-AZA-CdR est un agent cytotoxique puissant pour ces lignées cellulaires tumorales. Une concentration de 5-AZA-CdR de 100 ng/ml administrée pendant 48 h a produit plus de 90% de mort cellulaire ( ou de perte de clonogénicité). Cette perte de clonogénicité a augmenté avec la dose et la durée du traitement. Dans la lignée cellulaire Calu-1, où le RARP est méthylé, la combinaison de la 5-AZA-CdR à 10 ng/ml et de l'acide rétinoique à 0.1 et 1 µM a permis d'obtenir une interaction antinéoplasique synergique au niveau du potentiel clonogénique des cellules tumorales pulmonaires Calu-1. Cette combinaison a aussi permis d'obtenir une interaction antinéoplasique additive au niveau du potentiel clonogénique chez les cellules tumorales A549, une lignée cellulaire où le gène RARP n'est pas méthylé. Le deuxième objectif était de déterminer l'état de méthylation du gène RARP dans les biopsies de cancer pulmonaire humain et dans les tissus normaux adjacents. La méthode employée était le PCR spécifique à la méthylation (MSP), avec des amorces spécifiques pour la méthylation et pour la non-méthylation du gène RARP. Les résultats ont montré que la région promotrice du gène RARP était hyperméthylée dans 28% des biopsies de cancer pulmonaire. La plupart des tissus normaux adjacents n'étaient pas méthylés dans la région promotrice du RARf3. Le troisième objectif était de cloner et de séquencer la région promotrice du RARP des cellules d'adénocarcinome du colon DLD-1 et d'une biopsie tumorale pulmonaire afin d'identifier les sites de cytosines méthylés (5-MeC). Nous avons utilisé la méthode du séquençage génomique de l 'ADN traité au bisulphite. L'analyse du séquençage de I 'ADN a montré que les sites 5-MeC dans la région promotrice du RARP de la biopsie du cancer pulmonaire étaient les mêmes que ceux identifiés auparavant chez les cellules tumorales du colon DLD-1. D'autres résultats du séquençage de l'ADN sur des biopsies de cancer du sein ont confirmé que les sites 5-MeC sont conservés dans trois différentes types de tumeur: colon, poumon et sein. Le dernier objectif était d'étudier la pharmacocinétique de la 5-AZA-CdR chez deux patients atteints du cancer du sein métastatique. Le médicament 5-AZA-CdR a été donné par la voie i. v. pendant 8 h à une dose de 400 mg/m2 Les concentrations plasmatiques de la 5-AZA-CdR ont été estimées en utilisant un bio-essai basé sur l'inhibition de croissance des cellules leucémiques L1210 in vitro. À une vitesse d'infusion de 50 mg/m2/h, la concentration plasmatique à l'état d'équilibre était de 1.10 µg/ml chez la patiente M.R. et de 0.66 µg/ml chez la patiente G.H. Après la fin de l'infusion i.v., une disparition rapide de la 5-AZA-CdR dans le plasma a été observée chez les deux patientes, avec une demie-vie ( t Y:? ) respective de 11 min et de 13 minutes. On suggère que l'élimination totale de la 5-AZA-CdR chez ces deux patientes est due à la déamination par l'enzyme cytidine déaminase dans le foie ou dans d'autres organes. La conclusion est que le gène suppresseur de tumeur RARP peut être méthylé dans des biopsies tumorales de poumon. L 'hyperméthylation peut être un mécanisme alternatif qui résulte en une perte d'expression du RARp. Les résultats ont aussi montré que la 5-AZA­CdR est un agent cytotoxique puissant pour les lignées cellulaires tumorales pulmonaires. La 5-AZA-CdR peut être un médicament intéressant à être investigué dans les études cliniques du cancer du poumon, puisque d'autres gènes suppresseurs de tumeur sont méthylés dans le cancer pulmonaire. La méthode MSP pour le RARP pourrait être utilisée comme un test diagnostique pour dépister chez les patients avec un cancer du poumon, ceux chez qui le gène RARf3 est méthylé. Le rôle de RA comme thérapie dans le cancer du poumon n'est pas encore clair mais la combinaison de la 5-AZA-CdR et de RA pourrait améliorer le taux de réponse. Cette combinaison devrait être étudiée chez les animaux afin de vérifier son efficacité thérapeutique in vivo. / Lung cancer is the leading cause of cancer-related death in men and women in North America. Tobacco consumption is the principal cause of this disease. In advanced metastatic disease (stage IV), conventional chemotherapy is not very effective in improving the survival. Most current investigational drugs produèe only a modest increase in survival time. There is an urgent need for new therapeutic approaches for lung cancer. During the tumorigenesis of Iung cancer, there is an accumulation of a number of genetic lesions, predominantly in oncogenes and in tumor suppressor genes. It is thought that these latter genes require two inactivating events: loss of heterozygosity (LOH) of one allele and mutation of the other allele, to lose their fonction. Recent results have shown that DNA methylation, an epigenetic alteration, is another pathway that can inactivate tumor suppressor genes. Methylation plays a key role in tumor initiation and progression. Many tumor suppressor genes are hypermethylated in their promoter regions resulting in a silencing of their expression. Furthermore, 5-Aza-2 ' -deoxycytidine (5-AZA-CdR), an experimental drug, can activate the expression of these tumor suppressor genes by inhibiting DNA methylation. This drug has been shown to be effective in patients with acute leukemia who relapsed after conventional therapy, and in patients with myelodysplastic syndrome, a preleukemic syndrome. Our laboratory has obtained some good responses with 5-AZA-CdR in phase I study with patients with advanced metastatic lung cancer. This project was focused principally on the in vitro antineoplastic action of 5-AZA-CdR in Jung cancer and the possible role of the retinoic acid receptor J3 (RARJ3), a putative tumor suppressor gene in this disease. In non-small cell Jung cancer (NSCLC), allelic deletion of 3p24, location of the RARJ3 gene, occurs frequently, but mutations are rare. RARJ3 is poorly expressed in most NSCLC cell lines and primary tumors. Methylation of RARJ3 can be an alternative mechanism to cause loss of expression of RARJ3. The first objective of this project was to evaluate the in vitro antineoplastic activity of 5-AZA-CdR and retinoic acid (RA) against two human NSCLC cell lines, Calu-1 and A549. Using a colony assay, we found that 5-AZA-CdR is a potent cytotoxic agent against these cell Iines. Significant cytotoxic effects (>90% loss of clonogenicity) are produced by concentration as low as 100 ng/ml given as 48 h exposure. Loss of clonogenicity increased with dose and time of exposure. Moreover, combination treatment of 5-AZA-CdR at 10 ng/ml and RA at 0.1 and 1 µM, respectively, produced a moderate synergistic anti-neoplastic effect on colony formation of Calu-1 tumor cells, a cell line that shows signs of methylation of RARf3. This drug combination also produced an additive antineoplastic effect on A549 tumor cells, a cell line in which RARf3 is not methylated. The second objective was to determine the methylation status of RARJ3 in human lung tumor biopsies and in their corresponding adjacent normal tissues. The method used was methylation-specific PCR (MSP) with specific primers for methylation and unmethylation of RARf3. The results showed that in 28% of lung tumor biopsies the promoter region of RARf3 were hypermethylated. Most of the adjacent normal tissues showed no methylation of RARJ3 promoter region. The third objective was to clone and sequence the RARJ3 promoter in DLD-1 colon cells and Jung tumor biopsy to identify the positions of 5-methylcytosine. We used the bisulphite genomic sequencing protocol with minor modifications. DNA sequence analysis showed that the positions of 5-methylcytosine in the RARJ32 promoter region of the lung tumor biopsy were identical to that reported previously for DLD-1 colon carcinoma cells. Other results on DNA sequencing of breast tumor biopsies from our laboratory confirm the conserved pattern of methylation of cytosine residues in three different types of tumors: colon, lung and breast. The fourth objective was to study pharmacokinetics of 5-AZA-CdR in 2 patients with advanced breast cancer. The drug was given as one 8-h infusion at 400 mglm2. Plasma concentrations of 5-AZA-CdR were measured using a bioassay based on the in vitro growth inhibition of L 1210 leukemia cells. At a rate of infusion of 50 mg/m2 /hr the mean steady-state plasma concentrations were 1.10 µg/ml in patient M.R. and 0.66 µg/ml in patient G.H. After cessation of the infusion, rapid disappearance of 5-AZA-CdR from plasma was observed with elimination half-life (t112) of 11 min and 13 min, respectively, in these 2 patients. Total clearance values of 5-AZA-CdR suggest that this analogue was eliminated principally by cytidine deaminase in the liver in patient M.R., and by cytidine deaminase in the liver and other organs in patient G.H. In conclusion the results shown that 5-AZA-CdR is a potent cytotoxic agent to lung cancer cell Iines. They also indicate that the tumor suppressor gene RARf3 can be methylated in lung tumor biopsies. Methylation can be an alternative mechanism resulting in the loss of expression ofRARf3. Since other tumor suppressor genes have been reported to be methylated in Iung cancer, 5-AZA-CdR may be an interesting drug to investigate in future clinical trials in lung cancer. The MSP method for RARf3 has the potential to be used as a diagnostic test to screen patients in which Iung tumor biopsies show methylated RARf3. The role of RA in the therapy of lung cancer is not clear but, combination treatment of 5-AZA-CdR and RA may increase response rate. This combination treatment should be studied in animal tumor model to verify its therapeutical effects in vivo.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / L'échec de la transplantation est dû en partie aux dormnages causés par la préservation à froid et la réperfiision à chaud lors de l'intervention. Parmi les hypothèses retenues pour expliquer ces dommages, on retient la formation des radicaux libres et les perturbations du pH, du calcium et du volume cellulaire. L'ajout de certaines substances dans le milieu de préservation a permis de prolonger de 6h à 24h la survie de l'organe. Malgré le développement de solutions de préservation qui diminuent le gonflement cellulaire des foies à transplanter, les dommages de la reperfusion chaude ne sont pas abolis. Il se peut donc, que l'hypothermie anoxique altère les mécanismes de régulation du volume cellulaire et que ces perturbations contribuent aux dommages observés lors de la reperfusion du greffon chez le receveur. Afin de vérifier cette hypothèse, nous avons vérifié dans le premier chapitre si les conditions de la préservation à froid suivie du réchauffement entravaient la diminution ou l'augmentation compensatrice de volume observé respectivement après un choc hypotonique (retrait de 50 mmol de NaC1). Notre étude démontre que les hépatocytes préservés dans la solution de l'Université de Wisconsin (UM.) ont été moins résistants aux stress osmotiques, ce qui peut rendre les cellules moins aptes à répondre aux stimulations physiologiques comme l'accumulation des acides aminés, spécialement lors des demandes métaboliques et l'alimentation parentérale riche en acides aminés. Ceci devrait être confirmé dans les conditions in vivo. Cependant, nos résultats supportent la notion que la perturbation du volume cellulaire homéostasique peut correspondre au dysfonctionnement primaire observé dans 15% des cas lors de la transplantation hépatique. Subséquemment, nous avons étudié l'impact de la préservation et la réperfusion à chaud sur le transport hépatique d'acides aminés couplés au Na ( 1 0 mM). Nous avons mesuré par la technique de vidéoplanimétrie les changements initiaux de volume qui reflètent l'accumulation des acides aminés. Nous avons constaté qu'en fonction du temps de préservation les transporteurs sont affectés différemment. Le gonflement induit par la proline, substrat spécifique du système ASC est très sensible à la préservation à froid dans la solution U.W. chutant de 50 % après 24h de préservation comparée avec le contrôle sans préservation, en opposition à la glutamine ou à l'analogue de l'alanine. Ceci nous a conduit à proposer que le gonflement induit par la proline représente un index fonctionnel sensible de l'intégrité des cellules du foie. Dans le second chapitre, nous avons comparé l'efficacité de la solution U.W. et la solution Sodium-Lactobionate-Sucrose (SLS) dans leurs capacités à maintenir la viabilité cellulaire et une fonction différenciée des cellules du foie (gonflement induit par l'addition de 10 mM de Proline, substrat spécifique du système ASC). Enfin, dans le troisième chapitre, nous avons comparé l'effet de ces deux solutions (U.W./SLS) sur le métabolisme des médicaments et l'activité catalytique du cytochrome P-450 au niveau des cellules isolées de foie de rat. Cette activité catalytique est calculée par la mesure de la concentration totale du cytochrome P-450 et des métabolites de la théophylline générés après 4h d'incubation. La théophylline est utilisée car elle est métabolisée par plusieurs isoformes du cytochrome P-450: cytochrome P-450 1A2, 2D6, 2E1 et 3A4 dont l'aboutissement est le 1,3-DMU qui est son métabolite majeur. Nous avons noté que la majorité de perturbations observées dans notre modèle in vitro est entre 10 et 24 h de préservation à froid des hépatocytes dans les deux solutions (U.W./SLS). Ceci correspond à la période 12 h de préservation à froid des foies humains dans la solution U.W., qui représente un facteur de risque relatif pour un mauvais pronostic, responsable de dysfonctionnement primaire observé dans 15% des cas lors de la transplantation hépatique. Nos données démontrent clairement que la préservation à froid des hépatocytes dans la solution SLS, préparée au laboratoire à coût très réduit, donne des résultats équivalent à ceux de la solution U.W. (commercialisée par Dupont) quant à sa capacité à maintenir la viabilité cellulaire, l'intégrité fonctionnelle des cellules du foie et le métabolisme des médicaments. Ceci suggère que la solution SLS, qui n'est qu'une variante de la solution U.W., est suffisante pour obtenir les effets bénéfiques de préservation de la solution élaborée expérimentalement (Belzer et Southard, 1988). Donc certains composants de la solution U.W. ne peuvent apporter aucun impact bénéfique comparé à la solution SLS à composition beaucoup plus simple. Une approche intéressante pourrait être établie sur une solution aussi simple que la SLS à laquelle des agents pharmacologiques et cytoprotecteurs peuvent être ajoutés. Ceci permettra de maintenir l'efficacité des fonctions hépatiques et d'améliorer la survie des greffes du foie, menant ainsi à un meilleur pronostic de la transplantation du foie.

Les réservoirs de Borrelia burgdorferi jouent un rôle clé pour assurer sa transmission dans l’environnement. Récemment, de nouveaux acaricides, comme le fluralaner, présentant une efficacité élevée contre les tiques et une longue durée d’action, ont été commercialisés sur le marché des médicaments vétérinaires. Cibler les réservoirs de B. burgdorferi, comme les souris du genre Peromyscus, avec le fluralaner permettrait : d’abord, d’en altérer le cycle endémique; ensuite, de réduire la densité de tiques infectées dans l’environnement ; et, ultimement, de réduire le risque de transmission de la maladie de Lyme (ML). En premier lieu, l’efficacité du fluralaner à tuer des larves de l’espèce Ixodes scapularis infestant des souris du genre Peromyscus a été démontrée en laboratoire. Lors d’infestations expérimentales, des doses de 12,5 et 50 mg/kg ont tué > 90 % des larves d’I. scapularis dans les 4 jours suivant l’administration du traitement. Cependant, cette efficacité a été réduite à moins de 5 % dans les 30 premiers jours. En second lieu, dans le cadre d’une étude controllée non randomisée, des appâts de fluralaner ont été administrés répétitivement à une population de micromammifères sauvages à des densités de 2,1 ou 4,4 appâts/1000 m2 pendant 3 à 4 ans. L’efficacité du traitement à réduire l’infestation des micromammifères a, au préalable, été évaluée. Les densités de 2,1 et 4,4 ont respectivement réduit de 68 % et 86 % le nombre de larves infestant les souris du genre Peromyscus. Seule la densité de 4,4 a réduit significativement le nombre de nymphes de 72 %. Après quoi, l’effet des deux densités d’appâts sur le cycle endémique de B. burgdorferi a été évalué par le biais de 3 paramètres : 1- la prévalence de Peromyscus spp. infectées (PIM), 2- la densité de nymphes en quête (DON), 3- la prévalence de nymphes infectées par B. burgdorferi (NIP). La prévalence d’infection des souris par B. burgdorferi a chuté de 60 à 37 % après deux années de déploiements du traitement. Le traitement a provoqué une réduction de la DON de 45 à 63 % dans les zones traitées. Aucun effet n’a été observé sur le dernier paramètre. En troisième lieu, la pharmacologie du fluralaner a été caractérisée chez des souris du genre Peromycus dans une étude réalisée en laboratoire. Les données recueillies ont été utilisées pour simuler et interpréter différents scénarios de traitement de souris Peromyscus spp. pour une durée équivalente aux pics d’activités des larves et des nymphes d’I. scapularis. Les simulations ont permis d’identifier un jeu de scénarios qui conféreraient une protection contre les tiques pendant toute la saison d’activité des stades immatures d’I. scapularis. L’étude de la pharmacologie des acaricides chez les espèces ciblées et la modélisation de la pharmacocinétique représentent des étapes cruciales pour développer ce type d’intervention. Cette thèse a permis d’entreprendre le développement d’une approche ciblant les réservoirs de B. burgdorferi en utilisant une molécule de la famille des isoxazolines. L’approche décrite a montré le potentiel d’altérer le cycle endémique de B. burgdorferi et de réduire la densité de nymphes infectées dans l’environnement. Plus généralement, en intégrant des études sur la pharmacologie du fluralaner en laboratoire et des études terrains, elle permet d’initier la réflexion quant à l’importance d’avoir un cadre de développement commun pour structurer la recherche autour de ce type d’approches. / Reservoirs of Borrelia burgdorferi play a key role in ensuring its transmission in the environment. Recently, new acaricides, such as fluralaner, with high efficacy against ticks and a long duration of action have been commercialized in the veterinary drug market. Targeting B. burgdorferi reservoirs, such as Peromyscus spp. mice, with fluralaner would yield the following benefits: first, alter its transmission in the environment; second, reduce the density of B. burgdorferi-infected ticks in the environment; and, ultimately, reduce the risk of Lyme disease (LD). Firstly, the efficacy of fluralaner for killing Ixodes scapularis larvae infesting Peromyscus mice was demonstrated in a laboratory setting. Doses of 12.5 and 50 mg/kg showed > 90% efficacy at killing I. scapularis larvae infesting Peromyscus spp. mice within 4 days of treatment during experimental infestations. However, efficacy was reduced to less than 5% beyond 30 days. Secondly, in a non-randomized controlled study, fluralaner baits were repeatedly administered to a wild population of small mammals at densities of 2.1 or 4.4 baits/1000m2 over a period of 3 to 4 years. First, the treatment's efficacy at reducing small mammal infestation was evaluated. Densities of 2.1 and 4.4 baits/1000m2 reduced the number of larvae infesting Peromyscus mice by 68% and 86% respectively. Only the density of 4.4 baits/1000m2 significantly reduced the number of nymphs by 72%. Next, the effect of the both bait densities on the B. burgdorferi endemic cycle was evaluated through 3 parameters: i- the prevalence of B. burgdorferi-infected Peromyscus spp. mice (PIM), ii- the density of questing nymphs (DON), and iii- the prevalence of B. burgdorferi in questing nymphs (NIP). Mouse infection by B. burgdorferi decreased from 60 to 37% following two years of treatment deployment. The treatment reduced the DON by 45-63% in the treated areas but no effect was observed on B. burgdorferi prevalence in the NIP. Thirdly, fluralaner pharmacology was characterized in Peromycus mice in a laboratory setting. The data collected were used to simulate and interpret different treatment scenarios for Peromyscus mice over a period corresponding to the peak activities of I. scapularis larvae and nymphs. The simulations identified a set of treatment scenarios that confer protection against ticks for an entire season of I. scapularis activity. The results indicate that investigation of acaricide pharmacology in target species and pharmacokinetic modeling are critical steps in the development of this type of intervention. This thesis initiated the development of an approach targeting B. burgdorferi reservoirs using a molecule of the isoxazoline family. This approach showed potential for disrupting the endemic cycle of B. burgdorferi and reducing the density of B. burgdorferi-infected nymphs in the environment. More broadly, by integrating studies on fluralaner pharmacology in laboratory and field settings, this work has initiated a reflection on the importance of establishing a general development framework to structure research around this type of approach.