La pharmacopée Cris est riche en plantes médicinales et plusieurs d’entre elles sont étudiées par notre laboratoire pour leur potentiel antidiabétique. Certaines espèces ont démontré leur capacité à stimuler la protéine kinase activée par l’AMP (AMPK), une enzyme qui favorise la translocation de transporteurs de glucose à la membrane (effet hypoglycémiant). L’AMPK stimule également d’autres fonctions, telle l’oxydation des graisses, dans le but de rétablir l’énergie cellulaire. Ce projet a comme objectifs d’évaluer, premièrement, le stress métabolique induit par huit des extraits dans des cellules musculaires et des hépatocytes, effet qui serait responsable de l’activation de l’AMPK. Ce stress peut être déterminé en mesurant l’acidification du milieu extracellulaire ainsi que la déplétion du contenu en ATP des cellules suite aux traitements. Le deuxième objectif est de mesurer l’efficacité des extraits à réduire le contenu en gras (oxydation des graisses) et à ainsi normaliser la résistance à l’insuline dans des hépatocytes rendus insulino-résistants. Les hépatocytes sont rendus résistants à l’insuline (condition fortement lié à l’obésité) via traitement avec un acide gras saturé, le palmitate. Les résultats montrent que la majorité des extraits semble induire un stress métabolique de courte durée dans les cellules. Parmi les extraits, seul un a réussi à faire diminuer significativement le taux de triglycérides intracellulaire suite au traitement au palmitate sans toutefois améliorer la sensibilité à l’insuline. En conclusion, le potentiel hypoglycémiant des extraits serait du à leur capacité à affecter la respiration mitochondriale (stress métabolique). Toutefois, leur capacité à améliorer la sensibilité à l’insuline n’a pu être établie. / Cree pharmacopeia is rich in medicinal plants and many of them are studied by our laboratory for their antidiabetic potential. Some of the species tested have shown to activate the AMP-activated protein kinase (AMPK), an enzyme responsible for the translocation of glucose transporters to the cell membrane (hypoglycaemic activity). AMPK is also known to activate other cellular functions, like fat oxidation, in order to restore cell energy loss. The objectives of this study are, first, to measure the metabolic stress induced by eight of the species in muscular and liver cells, an effect believed to be responsible for the AMPK activation. Metabolic stress is evaluated by measuring extracellular medium acidification and cellular ATP depletion. The second objective is to assess the capacity of the extracts to clear intracellular fat (fat oxidation) and, by doing this, restore insulin sensitivity in insulin-resistant driven hepatocytes. To become insulin-resistant (a condition strongly linked to obesity), the hepatocytes are treated with a saturated fatty acid, palmitate. The results show that most of the extracts seem to increase the metabolic stress in muscular cells and hepatocytes for a short period of time. Among all extracts, only one has significantly reduced intracellular triglycerides in palmitate treated hepatocytes, an effect not followed by an increase in insulin sensitivity. In conclusion, the species tested in this study seem to exert their hypoglycaemic potential by affecting mitochondrial respiration (metabolic stress). However, the experimentations have not clearly shown the capacity of the species to restore insulin sensitivity in insulin-resistant liver cells.

Une mort cellulaire par apoptose impliquant un processus inflammatoire est observée dans le système limbique, suite à un infarctus du myocarde. Les oméga-3 et ses métabolites, en plus de leurs propriétés bénéfiques pour le système cardiovasculaire, réduisent l’inflammation, contrairement aux oméga-6 qui sont plus pro-inflammatoires. Comme le métabolisme de ces deux acides gras essentiels impliquent les mêmes enzymes, le ratio alimentaire oméga-3/6 aurait donc des impacts importants sur l'état inflammatoire et ainsi indirectement sur l'apoptose. Conséquemment, cette étude a pour but d'évaluer l'effet de différents ratios oméga-3/6 sur la taille de l’infarctus, l’inflammation et l’apoptose dans le système limbique suite à un infarctus du myocarde. Des rats Sprague-Dawley ont été aléatoirement distribués dans trois groupes contenant des ratios 1:1, 1:5 et 5:1 oméga-3/6. Ils ont été nourris pendant 2 semaines, suivie d’une occlusion de l’artère coronaire gauche descendante pendant 40 minutes et d’une période de reperfusion (15 min et 24 h). De hauts ratios d’oméga-3 (5:1 et 1:1) diminuent significativement la taille de l’infarctus de 32 % et augmentent l’activité d’Akt, impliquée dans la voie cardioprotectrice RISK, comparativement au ratio 1:5. Ils diminuent aussi la concentration plasmatique de TNF-D. Dans le système limbique, l’activité de la caspase-3 est augmentée dans la région CA1, après 15 min, et dans les régions du CA1 et du gyrus dentelé (Gd), après 24 h, avec la diète 1:5 en comparaison aux diètes 1:1 et 5:1. L’activité enzymatique de la caspase-8 est augmentée dans le Gd, alors que dans le CA1, il y a une activité plus importante de la caspase-9 aux temps de reperfusion étudiés. Conclusion: Les diètes élevées en oméga-3/oméga-6 réduisent la taille de l'infarctus, l’inflammation et diminuent l’apoptose dans le système limbique après un infarctus du myocarde. / Apoptosis occurs in the limbic system by a mechanism involving inflammation after a myocardial infarction. Omega-3 are essential fatty acids known for their benefits in cardiovascular health and to reduce inflammation, whereas, omega-6 and their metabolites are more inflammatory. Since these two essential fatty acids are metabolized by the same group of enzymes, the resulting competition would affect the inflammation and thus indirectly the apoptosis. Therefore, the aim of this study is to evaluate the effect of different omega-3/6 ratios on the infarct size, inflammation and apoptosis in the limbic system after myocardial infarction. Male Sprague-Dawley rats were divided randomly between three diet groups containing 1:5, 1:1 and 5:1 omega-3/6 ratios. Rats were fed for two weeks followed by a left anterior descending coronary occlusion for 40 min and by reperfusion time (15 min or 24 h). Infarct size was significantly reduced by 32% and Akt activity, implicated in RISK cardioprotection pathway, enhanced by the 5:1 and 1:1 in comparison to the 1:5 diet ratios. They also reduced TNF-D plasma concentration. In the limbic system, caspase-3 enzymatic activity was doubled in CA1 after 15 min and in CA1 and dentate gyrus (Dg), after 24 h, in the 1:5 compared to 1:1 and 5:1 groups. Caspase-8 enzymatic activity was increased in Dg and capase-9 was enhanced in the CA1 at both reperfusion time in the 1:5 against the 1:1 and 5:1 groups. Conclusion: High omega-3 dietary ratio helps to reduce infarct size, inflammation and to prevent apoptosis in the limbic system.

L’hypertrophie du ventricule gauche (HVG) est un processus adaptif et compensatoire qui se développe conséquemment à l’hypertension artérielle pour s’opposer à l’élévation chronique de la pression artérielle. L’HVG est caractérisée par une hypertrophie des cardiomyocytes suite à l’augmentation de la synthèse d’ADN, une prolifération des fibroblastes, une augmentation du dépôt de collagène et une altération de la matrice extracellulaire (MEC). Ces changements génèrent des troubles de relaxation et mènent au dysfonctionnement diastolique, ce qui diminue la performance cardiaque. La suractivité du système nerveux sympathique (SNS) joue un rôle essentiel dans le développement de l’hypertension artérielle et de l’HVG à cause de la libération excessive des catécholamines et de leurs effets sur la sécrétion des cytokines pro-inflammatoires et sur les différentes voies de signalisation hypertrophiques et prolifératives. Le traitement antihypertenseur avec de la moxonidine, un composé sympatholytique d’action centrale, permet une régression de l’HVG suite à une réduction soutenue de la synthèse d'ADN et d’une stimulation transitoire de la fragmentation de l'ADN qui se produit au début du traitement. En raison de l’interaction entre l’HVG, les cytokines inflammatoires, le SNS et leurs effets sur les protéines de signalisation hypertrophiques, l’objectif de cette étude est de détecter dans un modèle animal d’hypertension artérielle et d’HVG, les différentes voies de signalisation associées à la régression de l’HVG et à la performance cardiaque. Des rats spontanément hypertendus (SHR, 12 semaines) ont reçu de la moxonidine à 0, 100 et 400 µg/kg/h, pour une période de 1 et 4 semaines, via des mini-pompes osmotiques implantées d’une façon sous-cutanée. Après 4 semaines de traitement, la performance cardiaque a été mesurée par écho-doppler. Les rats ont ensuite été euthanasiés, le sang a été recueilli pour mesurer les concentrations des cytokines plasmatiques et les cœurs ont été prélevés pour la détermination histologique du dépôt de collagène et de l'expression des protéines de signalisation dans le ventricule gauche. Le traitement de 4 semaines n’a eu aucun effet sur les paramètres systoliques mais a permis d’améliorer les paramètres diastoliques ainsi que la performance cardiaque globale. Par rapport au véhicule, la moxonidine (400 µg/kg/h) a permis d’augmenter transitoirement la concentration plasmatique de l’IL-1β après une semaine et de réduire la masse ventriculaire gauche. De même, on a observé une diminution du dépôt de collagène et des concentrations plasmatiques des cytokines IL-6 et TNF-α, ainsi qu’une diminution de la phosphorylation de p38 et d’Akt dans le ventricule gauche après 1 et 4 semaines de traitement, et cela avec une réduction de la pression artérielle et de la fréquence cardiaque. Fait intéressant, les effets anti-hypertrophiques, anti-fibrotiques et anti-inflammatoires de la moxonidine ont pu être observés avec la dose sous-hypotensive (100 µg/kg/h). Ces résultats suggèrent des effets cardiovasculaires bénéfiques de la moxonidine associés à une amélioration de la performance cardiaque, une régulation de l'inflammation en diminuant les niveaux plasmatiques des cytokines pro-inflammatoires ainsi qu’en inhibant la MAPK p38 et Akt, et nous permettent de suggérer que, outre l'inhibition du SNS, moxonidine peut agir sur des sites périphériques. / Left ventricular hypertrophy (LVH) is an adaptive and compensatory process that develops in hypertension to oppose the chronic elevation of blood pressure. LVH is characterized by hypertrophy of cardiomyocytes following the increase in DNA synthesis, proliferation of fibroblasts, increased collagen deposition and alteration of the extracellular matrix (ECM). These changes generate relaxation and diastolic dysfunction which reduced cardiac performance. The overactivity of the sympathetic nervous system plays an essential role in the development of hypertension and left ventricular hypertrophy pathogenesis due to the excessive release of catecholamines and norepinephrine spillover and their effects on the secretion of pro-inflammatory cytokines and hypertrophic signaling pathways. Antihypertensive treatment with moxonidine, a centrally acting sympatholytic imidazoline compound, results in prevention of left ventricular hypertrophy, resulting from a sustained reduction of DNA synthesis and transient stimulation of DNA fragmentation that occur early after treatment. Due to the interaction between LVH, inflammatory cytokines, the SNS and their effects on hypertrophic signaling proteins, the objective of this study is to detect in an animal model of hypertension and LVH, the different signaling pathways associated with regression of LVH and cardiac performance. Spontaneously hypertensive rats (SHR, 12 weeks old) received moxonidine at 0, 100 and 400 µg/kg/h, for 1 and 4 weeks, via subcutaneously implanted osmotic minipumps. After 4 weeks of treatment, cardiac performance was measured by echo-Doppler. Then the rats were euthanized, blood was collected for measurement of plasma cytokines and hearts for histologic determination of collagen deposition and for measurement of left ventricular expression of downstream signaling proteins. Treatment for 4 weeks had no effect on systolic parameters but improved diastolic parameters and global cardiac performance. Compared to vehicle, moxonidine (400 µg/kg/h) transiently increased plasma IL-1β after 1 week and reduced left ventricular mass. Similarly, there was a decrease in collagen deposition and plasma concentrations of IL-6 and TNF-α, and decreased phosphorylation of p38 and Akt in the left ventricle after 1 and 4 weeks treatment, in association with reduced blood pressure and heart rate. Interestingly, the anti-hypertrophic, anti-fibrotic, and anti-inflammatory effects of moxonidine were observed with a sub-hypotensive dose (100µg/kg/h). These results suggest the beneficial cardiovascular effects of moxonidine associated with improved cardiac performance, regulation of inflammation by decreasing pro-inflammatory plasma levels, inhibition of p38 MAPK and Akt, and allow us to suggest that besides inhibiting the SNS, moxonidine may act on peripheral sites.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Beaucoup de personnes consomment des drogues d’abus de façon récréative ou expérimentale dans leur vie, mais peu d’entre elles développent une toxicomanie. Nous avons exploré, chez le rat, deux facteurs impliqués dans la transition vers la toxicomanie, soit la vitesse à laquelle la drogue parvient au cerveau et le fait d’être sous traitement antipsychotique. Dans une première étude, notre objectif était de déterminer si augmenter la vitesse de livraison de la cocaïne (0.5 mg/kg) par auto-administration intraveineuse (i.v.; livrée en 5 secondes dans un groupe versus 90 secondes dans l’autre) mènerait à une plus grande consommation de celle-ci lors d’un accès prolongé (6 h/j versus 1 h/j), et à une plus grande motivation à obtenir la drogue telle que mesurée sous un ratio de renforcement progressif à une vitesse différente (10 secondes). Nous avons trouvé que le groupe 5 s consommait plus de cocaïne que le groupe 90 s en accès prolongé, mais aussi en accès limité. Cependant, la motivation des deux groupes était la même à la vitesse de 10 s, ainsi qu’à leurs vitesses initiales. Nous pensons que ceci peut être dû à une forme de plasticité du système méso-cortico-limbique survenue suite à l’auto-administration en accès prolongé en conjonction avec l’augmentation de consommation, chez les deux groupes, rendant impossible une distinction de leur motivation. Dans une deuxième série d’études nous avons émis l’hypothèse que l’antipsychotique typique, halopéridol (HAL, 0.5 mg/kg/j), et non l’atypique, aripiprazole (ARI, 1 mg/kg/j), un modulateur dopaminergique, induirait une augmentation de la poursuite de récompense conditionnée (RC) et de la locomotion (LOCO) en réponse à l’amphétamine (AMPH). Cependant, nous avons trouvé une augmentation chez le groupe HAL, mais non ARI, de la réponse RC, trois semaines, mais non une semaine post traitement, ainsi qu’une augmentation de la LOCO, chez le groupe HAL, mais non ARI, une semaine mais non trois semaines post traitement. L’incohérence des résultats entre les deux tests (RC et LOCO) rend leur interprétation difficile. Ces études restent à être explorées d’avantage afin de pouvoir en tirer des conclusions plus éclairées quant à l’impact de la vitesse d’administration de la cocaïne et du traitement antipsychotique sur le développement d’une toxicomanie. / Many people take drugs of abuse on a recreational or experimental basis in their lifetime, but few develop an addiction. We explored, in the rat, two factors involved in the transition to addiction: the speed at which the drug reaches the brain, and antipsychotic treatment. In the first study, our objective was to determine if increasing the speed of intra-venous (i.v.) delivery of cocaine (0.5 mg/kg) through i.v. self administration (delivered in 5 seconds in one group versus 90 seconds in the other) would lead to greater consumption with long access to the drug (6 hours/ day versus 1hr/day) and if the motivation to obtain the drug, as measured by a progressive ratio schedule would also be greater at a different speed (10 seconds). We have found that the 5 s group had a greater consumption than the 90 s group, in long access, but also in short access. However, the motivation of the two groups did not differ at the speed of 10 s, nor at their initial speeds. We suggest that this might be due to a form of plasticity of the mesocorticolimbic system, following the extended self-administration access, in both groups, in conjunction with the escalation in consumption, thus making it impossible to distinguish their motivation. In a second study series, we hypothesised that the typical antipsychotic, haloperidol (HAL, 0.5mg/kg/d), but not the atypical, aripiprazole (ARI, 1mg/kg/d), would increase the pursuit of conditioned reward (CR; here sound and tone) and locomotion (LOCO) in response to amphetamine (AMPH). We found an increase in the CR response, in the HAL group, but not the ARI group, three weeks, but not one week, post treatment, as well as an increase in the LOCO, in the HAL group, but not in the ARI group, one week but not three weeks post treatment. The incoherence of the results from the two tests (CR and LOCO) renders their interpretation difficult. These studies remain to be explored more thoroughly so as to obtain more enlightened conclusions as to the influence of speed of administration and antipsychotic treatment on addiction development.

Nombreux individus vont expérimenter avec les drogues d’abus, mais peu vont devenir toxicomanes. Plusieurs facteurs sont impliqués dans la transition d’un usage récréatif à l’addiction. Les drogues, les conditionnements et les voies d’administration qui mènent à l’augmentation rapide du taux drogue dans le cerveau favorisent cette évolution. La raison est méconnue. Nous avons émis l’hypothèse que l’injection rapide de drogue promeut des changements dans le cerveau qui mènent à l’augmentation de la consommation et de la motivation à obtenir la drogue. Nous avons comparé la consommation lors de conditions à ratio fixe (FR) et à ratio progressif (PR) chez des rats s’auto-administrant la cocaïne administrée par voie intraveineuse (i.v.) en 5 ou 90 secondes (s). Tous les rats ont été entrainés à peser sur un levier afin de s’auto administrer des injections de cocaïne de 0.25 ou 0.5 mg/kg par voie intraveineuse injectée en 5 s sous FR avant d’être divisés en groupes s’auto administrant la cocaïne injectée en 5 ou 90 s pendant 1 heure (h)/session. Pour étudier les différences potentielles en consommation, l’accès à la cocaïne à été augmenté à 6 h/session. Les différences en motivation ont été détectées par l’auto administration de la cocaïne sous PR en fonction de la dose et de la vitesse d’infusion. L’accès à la drogue pendant 1 h/session n’a pas influencé la consommation. Lorsque l’accès a été prolongé à 6 h, tous les animaux ont augmenté leur consommation, mais l’augmentation était plus prononcée chez les rats s’injectant la cocaïne en 5 s. De plus, la vitesse d’injection a influencé la motivation pour obtenir la drogue. Lors de conditions à PR, la courbe dose-réponse pour le nombre d’infusions prises a été déplacée vers le haut pour les rats s’auto administrant des injections de cocaïne en 5 s versus 90 s. De plus, des différences qualitatives on été observées en PR. La consommation de cocaïne des rats s’injectant des infusions en 5 s était dépendante de la dose, tandis que les rats s’auto administrant la drogue en 90 s ont pris la même quantité de drogue, peu importe la dose. Finalement, les rats s’auto administrant des infusions de cocaïne 0.5 mg/kg en 5 s ont consommé plus de cocaïne que les rats prenant des infusions en 90 s, peu importe si elle était injectée en 5 ou 90 s le jour du test. Ainsi, nos résultats montrent que l’injection rapide de drogue dans le cerveau mène à l’augmentation de la consommation et de la motivation pour obtenir la cocaïne, deux symptômes qui caractérisent la toxicomanie. / While many people will experiment with drugs of abuse, few will become addicts. Many factors have been implicated in the transition from recreational drug use to addiction. Drugs, formulations and routes of administration that lead to the rapid rise of drug levels in the brain are thought to facilitate this evolution. The reason for this remains unknown. We hypothesized that the rapid delivery of drugs might promote certain changes in the brain leading to increased drug intake and greater motivation to obtain the drug. In order to assess the effects of the speed of administration, we compared drug intake under fixed (FR) and progressive (PR) ratio conditions in rats self-administering intravenous (i.v.) cocaine injections delivered over either 5 or 90 seconds (s). Rats were trained to press a lever for 0.25 or 0.5 mg/kg cocaine injections delivered over 5 s under a FR schedule of reinforcement, before being divided into groups self-administering cocaine delivered over either 5 or 90 s for 1 hour (h)/session. To assess potential differences in drug consumption, access to cocaine was increased to 6 h/session. To assess differences in motivation for cocaine, drug self-administration was determined under a PR schedule of reinforcement both as a function of dose and infusion rate. When animals were given access to i.v. cocaine for 1 h/session, the infusion speed did not influence drug consumption. However, when access to the drug was prolonged to 6 h/session, all animals augmented their drug intake, though the increase was greater in animals self-administering the drug delivered more rapidly (over 5 vs. 90 s). The speed of drug delivery also influenced the motivation for cocaine. Under PR conditions, the dose response curve for the number of self-administered infusions was shifted upward in the 5-s animals relative to those in the 90-s group. Moreover, qualitative differences were observed in cocaine intake under PR conditions. Whereas the intake of rats self-administering cocaine delivered over 5 s was dose-dependent, drug consumption in rats injecting the drug over 90 s did not vary with the dose. Finally, rats self-administering 0.5 mg/kg cocaine infusions delivered over 5 s took more cocaine than the rats receiving it over 90 s, regardless of whether cocaine was delivered over 5 or 90 s during PR testing. Thus, our results show that increasing the speed at which cocaine is delivered to the brain leads to greater drug intake and increased willingness to expend effort to obtain the drug, two important symptoms of addiction.

Les antidépresseurs actuels sont très similaires au niveau de leur mécanisme d’action et sont plus ou moins efficaces. Un des problèmes majeurs est leur long temps de latence à fournir une action thérapeutique dû aux adaptations des sites pré et post synaptiques. Dans un modèle animal, nous avons récemment découvert que l’agoniste RS67333 des récepteurs 5-HT4 était en mesure de produire en trois jours les mêmes effets antidépresseurs qui normalement prennent de deux à trois semaines à apparaître avec les antidépresseurs actuellement disponibles. De plus, nous avons constaté que les effets antidépresseurs de cet agoniste possédaient une résistance à la tolérance. Il y a d’autres agonistes du même récepteur, tel que le prucalopride qui ne produit pas d’effets antidépresseurs comme RS67333. Étant donné que l’efficacité du Prucalopride à stimuler les 5-HT4Rs est similaire sinon plus grande que celle de RS67333, nous avons énoncé l’hypothèse que le récepteur 5-HT4 pourrait adopter différentes conformations actives suite à son activation par différents agonistes. Nous avons ainsi décidé d’explorer les principales réponses fonctionnelles des récepteurs 5-HT4B en observant leurs propriétés de régulation et de signalisation. Nous avons montré que l’isoforme B du récepteur 5-HT4, étant hautement exprimé dans le système limbique, détient une signalisation et une régulation différentes dépendant du ligand activateur. Nos résultats indiquent que chacun des agonistes testés (5-HT, RS67333, ML10302, Zacopride, Prucalopride) modulent distinctivement la production d’AMPc et l’internalisation du récepteur. Les résultats nous ont clairement permis de déterminer que les agonistes possèdent une efficacité et ou puissance différentes les uns par rapport aux autres. De plus, l’ordre d’efficacité des agonistes à moduler la voie de l’AMPc était (Prucalopride > Zacopride = ML10302 = 5-HT > RS67333) et est différente de leur ordre d’efficacité à induire la régulation du récepteur par internalisation (5-HT > Zacopride > Prucalopride > ML10302 = RS67333). Ainsi, nous avons montré que les 5-HT4Rs adoptent des conformations qui sont ligand-spécifiques. Cela implique que la sélectivité fonctionnelle serait un facteur important à considérer dans les mécanismes d’action antidépresseur des agonistes de ce récepteur. / Antidepressants currently available are very similar toward their mechanism of action and are more or less effective. One major problem is their long latency to provide a therapeutic effect due to adaptations of pre and post synaptic locations. In an animal model, we recently discovered that the agonist RS67333 of the 5-HT4 receptors was able to produce in three days the same antidepressant effects that normally take two to three weeks to appear with the currently available antidepressants. In addition, we found that the antidepressant effects of this agonist had a resistance to tolerance. There are others agonists of the same receptor such as prucalopride, which does not produce antidepressant effects as RS67333. Since the effectiveness of prucalopride to stimulate 5-HT4Rs is similar if not greater than RS67333, we stated the hypothesis that the 5-HT4 receptor could adopt different active conformations following its activation by various agonists. We decided to explore the major functional responses of 5-HT4B by observing their regulatory and signaling properties. We showed that the B isoform of the 5-HT4, being highly expressed in the limbic system, has a different signaling and regulation depending on the ligand. Our results indicate that each of the agonists tested (5-HT, RS67333, ML10302, Zacopride, Prucalopride) distinctively modulate cAMP production and receptor internalization. The results have clearly identified that agonists differed in potency and efficacy. Moreover, the order of effectiveness of agonists to modulate the cAMP pathway was (prucalopride> zacopride = 5-HT = ML10302> RS67333) different from their order of effectiveness in inducing receptor regulation by internalization (5-HT> Zacopride> Prucalopride> RS67333 = ML10302). Thus, we have shown that 5-HT4Rs adopt conformations that are ligand-specific. This implies that functional selectivity is an important factor in the mechanisms of antidepressant action of this receptor agonists.

Dans un contexte où la forte prévalence du cancer du sein chez les femmes demeure depuis plusieurs années un enjeu de société majeur, les nouvelles stratégies visant à réduire la mortalité associée à cette maladie sont le sujet de nombreuses recherches scientifiques. Les facteurs d’ADP-ribosylation sont des petites protéines G monomériques importantes pour la réorganisation du cytosquelette d’actine, le remodelage des lipides membranaires et la formation de vésicules. Notre laboratoire a précédemment montré qu’ARF1 est surexprimée dans les cellules hautement invasives du cancer du sein et contribue à leur phénotype migratoire accru. Dans le cadre de ce mémoire, nous avons défini le rôle de cette GTPase dans la migration de telles lignées cellulaires. Pour ce faire, nous avons étudié le rôle d’ARF1 dans l’activation de Rac1, un membre de la famille des GTPases Rho connu pour son implication dans la formation de lamellipodes ainsi que dans la migration cellulaire. Globalement, nous avons déterminé que l’activation d’ARF1 permet l’activation subséquente de Rac1 ainsi que de la voie de signalisation nécessaire au processus de migration. Par une approche d’interférence à l’ARN dans les cellules MDA-MB-231, nous avons d’abord montré la contribution essentielle de Rac1 la migration dépendante d’ARF1. Puis, de façon à établir le mécanisme derrière cette régulation, nous avons montré que l’inhibition de l’expression endogène d’ARF1 altère l’activation de Rac1 dépendante de l’EGF. Nous avons ensuite examiné les conséquences d’une telle inhibition sur les partenaires d’interaction de Rac1. Nous avons découvert qu’ARF1 et Rac1 forment un complexe constitutif, puis qu’ARF1est nécessaire à l’association de Rac1 à IRSp53, une protéine importante dans la formation de lamellipodes. La translocation dépendante de l’EGF du complexe Rac1/IRSp53 à la membrane plasmique est également sous le contrôle d’ARF1. En conclusion, cette étude fournit un nouveau mécanisme par lequel ARF1 régule la migration cellulaire et identifie cette GTPase en tant que cible pharmacologique prometteuse pour freiner le développement des métastases chez les patients atteints du cancer du sein. / ADP-ribosylation factors (ARFs) are monomeric G proteins important for actin cytoskeleton reorganization, lipid membrane remodeling, and vesicule formation. Our laboratory has previously shown that ARF1 is overexpressed in highly invasive breast cancer cells and contribute to their enhanced proliferation and migration phenotype. In this study, we propose to define the role of ARF1 on the activation of Rac1, an important member of the Rho family of GTPases implicated in the formation of lamellipodia and in the migration process. Globally, we evaluated whether ARF1 activation could affect Rac1 activation and the signaling pathway necessary for cell migration. Using an RNAi approach in MDA-MB-231 breast cancer cells, we first determined the essential contribution of Rac1 in ARF1-dependant migration. Mechanistically, endogenous inhibition of ARF1 expression altered EGF-dependent Rac1 activation. We next investigated the consequences of such effect on Rac1 interaction partners. We showed that ARF1 and Rac1 are constitutively complexed but that ARF1 is necessary for EGF-dependent Rac1 association with IRSp53, an essential protein for lamellipodia formation. When unable to interact, Rac1/IRSp53 complex translocation to plasma membrane was considerably inhibited. In conclusion, this study provides a new mechanism by which ARF1 regulates cell migration and identifies this GTPase as a promising pharmacological target to reduce metastasis formation in breast cancer patients.

Introduction & Objectifs : Pour assurer l’analgésie postopératoire, l’anesthésiste dispose, en plus des différentes classes de médicaments administrés par voie orale ou intraveineuse, de diverses techniques pour bloquer l’influx nerveux douloureux en administrant les anesthésiques locaux (AL) de manière centrale ou périphérique. La ropivacaïne (ROP), un AL à longue durée d’action, est un médicament de première intention partout dans le monde, en raison de sa grande efficacité et de son faible risque de toxicité. Contrairement à certains pays, la ROP n'est toujours pas indiquée au Canada pour la rachianesthésie (bloc central) en raison d'un manque de données probantes. Jusqu'à présent, les efforts de recherche ont essentiellement porté sur la sécurité ainsi que sur la durée d’action du médicament lorsqu’administré par voie spinale. De plus, les doses optimales de ROP pour l’anesthésie régionale périphérique ne sont pas encore précisément connues. La posologie devrait être adaptée au site d’administration ainsi qu’à l’intensité et la durée du stimulus produit par la chirurgie. Ultimement, cela permettrait aux cliniciens d’identifier le régime optimal en fonction des facteurs démographiques qui pourraient affecter la pharmacocinétique (PK) et la pharmacodynamie (PD) de l’AL (objectif global de ces travaux). Validation de la Méthode Analytique Manuscrit 1 : Une méthode analytique spécifique et sensible permettant de déterminer les concentrations plasmatiques de ROP a d’abord été optimisée et validée. Validation du Biomarqueur Manuscrit 2 : Nous avons ensuite mis au point et évalué la fiabilité d’une méthode quantitative basée sur la mesure du seuil de perception sensorielle (CPT) chez le volontaire sain. Ce test nécessite l’application d’un courant électrique transcutané qui augmente graduellement et qui, selon la fréquence choisie, est capable de stimuler spécifiquement les fibres nerveuses impliquées dans le cheminement de l’influx nerveux douloureux. Les résultats obtenus chez les volontaires sains indiquent que la mesure CPT est fiable, reproductible et permet de suivre l’évolution temporelle du bloc sensitif. Études cliniques Manuscrit 3 : Nous avons ensuite caractérisé, pendant plus de 72 h, l’absorption systémique de la ROP lorsqu’administrée pour un bloc du nerf fémoral chez 19 patients subissant une chirurgie du genou. Le modèle PK populationnel utilisé pour analyser nos résultats comporte une absorption biphasique durant laquelle une fraction de la dose administrée pénètre rapidement (temps d’absorption moyen : 27 min, IC % 19 – 38 min) dans le flux sanguin systémique pendant que l’autre partie, en provenance du site de dépôt, est redistribuée beaucoup plus lentement (demi-vie (T1/2) : 2.6 h, IC % 1.6 – 4.3 h) vers la circulation systémique. Une relation statistiquement significative entre l’âge de nos patients et la redistribution de l’AL suggère que la perméabilité tissulaire est augmentée avec l’âge. Manuscrit 4 : Une analyse PK-PD du comportement sensitif du bloc fémoral (CPT) a été effectuée. Le modèle développé a estimé à 20.2 ± 10.1 mg la quantité de ROP nécessaire au site d’action pour produire 90 % de l’effet maximal (AE90). À 2 X la AE90, le modèle prédit un début d’action de 23.4 ± 12.5 min et une durée de 22.9 ± 5.3 h. Il s’agit de la première étude ayant caractérisé le comportement sensitif d’un bloc nerveux périphérique. Manuscrit 5 : La troisième et dernière étude clinique a été conduite chez les patients qui devaient subir une chirurgie du genou sous rachianesthésie. Tout comme pour le bloc du nerf fémoral, le modèle PK le plus approprié pour nos données suggère que l’absorption systémique de la ROP à partir du liquide céphalo-rachidien est biphasique; c.à.d. une phase initiale (T1/2 : 49 min, IC %: 24 – 77 min) suivie (délai: 18 ± 2 min) d'une phase légèrement plus lente (T1/2 : 66 min, IC %: 36 – 97 min). L’effet maximal a été observé beaucoup plus rapidement, soit aux environs de 12.6 ± 4.9 min, avant de revenir aux valeurs de base 210 ± 55 min suivant l’administration de l’agent. Ces données ont permis d’estimer une AE50 de 7.3 ± 2.3 mg pour l'administration spinale. Conclusion : En somme, ces modèles peuvent être utilisés pour prédire l’évolution temporelle du bloc sensitif de l’anesthésie rachidienne et périphérique (fémorale), et par conséquent, optimiser l’utilisation clinique de la ROP en fonction des besoins des cliniciens, notamment en ce qui a trait à l’âge du patient. / Background & Objectives: To provide postoperative analgesia, the anesthesiologist has at his disposal a panel of different medications and also regional techniques of neural blockade. Loco-regional analgesia (central or peripheral) blocks conduction of painful influx to the central nervous system by the use of local anesthetics (LA). Among these drugs, ropivacaine (ROP), has an enormous potential given is long-acting efficacy and low incidence of toxicity. Currently, ROP is not licensed for use in spinal anesthesia (central block) in all countries due to a lack of data from controlled clinical trials. So far, research efforts on this topic have mainly focused on safety and dose-finding issues. In addition, the most appropriate dose for a peripheral nerve block has never been estimated empirically. Dosing recommendation for LAs should be site-specific and adapted to the intensity of the stimuli produced by a surgery and to the duration of analgesia required. Ultimately, these should guide clinicians in identifying the most appropriate block for the individual patients by taking into account demographic factors that may affect the pharmacokinetics (PK) and pharmacodynamics (PD) of LA overall objective of the current research) Analytical Method Validation Manuscript 1: First, a specific and sensitive assay has been developed and validated for the determination of ROP in human plasma. Biomarker Validation Manuscript 2: Second, the reliability of a neurostimulator measuring current perception threshold (CPT) was assessed in healthy volunteers. The device uses a constant transcutaneous electrical sine wave stimulus at different frequencies specific to pain-conducting fibers. Our results suggest that CPT are reliable and can be applied to characterize, in a quantitative manner, the sensory onset of a peripheral nerve block in a clinical setting. Clinical Studies Manuscript 3: The systemic absorption of ROP after a femoral nerve block in orthopedic patients was then characterized using extended rich PK-sampling, i.e. up to 4 days post-dosing. Our model used for data analysis confirms that, in a similar manner to neuraxial sites of LAs injection, the systemic absorption of ROP from the femoral space is biphasic, i.e. a rapid initial phase (mean absorption time of 25 min, % CI: 19 – 38 min) followed by a much slower phase (half-life (T1/2) of 3.9 h, % CI: 2.9 – 6.0 h). A significant age-related increase in the permeability of the LA was also observed in our elderly patients (n = 19, age = 62.6 ± 7.1 yr). Manuscript 4: A population PK-PD analysis of the sensory anesthesia (CPT) of ROP using our PK model was also performed. The effect-site amount producing 90% of the maximum possible effect (AE90) was estimated as 20.2 ± 10.1 mg. At 2 x AE90, the sigmoid Emax model predicted an onset time of 23.4 ± 12.5 min and a duration of 22.9 ± 5.3 h. To the best of our knowledge, this is the first PK-PD model developed for a peripheral nerve block. Manuscript 5: In the third and last study, a similar approach was used to characterise the PK-PD relationship of intrathecally administered ROP in patients undergoing minor lower limb surgery. The biphasic release of the agent from the intrathecal space was modeled using a rapid initial absorption phase (T1/2 of 49 min, % CI: 24 – 77 min) followed (lag-time of ~ 18 ± 2 min) by a slightly slower input rate (T1/2 of 66 min, % CI: 36 – 97 min). ROP maximal response was observed within 12.6 ± 4.9 min of dosing, with a subsequent return to baseline 210 ± 55 min after the administration of the LA. The effect-site amount producing 50 % of the Emax (AE50) was estimated at 7.3 ± 2.3 mg. Conclusion: Altogether, the proposed models can be used to predict the time-course of sensory blockade after a femoral nerve block and spinal anesthesia using ROP and to optimize dosing regimen according to clinical needs with regard to important cofactors such as age.

Objectif : Étudier les mécanismes apoptotiques impliqués dans la néphropathie diabétique en identifiant les gènes responsables de l’apoptose et activés par les espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans les cellules de tubules proximaux rénaux (RPTC) de différents modèles diabétiques. Méthodes : Une hybridation par puce à AND a été réalisée sur les ARN extraits à partir de RPTC de souris heterozygotes db/m+, db/db and db/db catalase (CAT)-transgénique (Tg) de 20 semaines. Des expériences de PCR en temps réel et d’immunohistochimie réalisées sur ces modèles et sur le modèle ou le diabète avait été induit par traitement au streptozotocin (STZ) ont permis de valider les gènes apoptotiques identifiés par puce à ADN. Des RPTC immortalisées de rat ont été utilisées pour montrer l’activité de ces gènes apoptotique et la régulation de leur expression. De plus, une étude additionnelle réalisée sur des sections rénales provenant de patients diabétiques et non diabétiques a démontré également une surexpression de ces gènes apoptotiques dans les IRPTC. Résultats: L’expression de Bcl-2-modifying factor (Bmf), une protéine apoptotique, semble augmentée dans les RPTC de souris db/db comparé aux souris contrôles db/m+, ou aux souris db/db CAT-tg. La surexpression de Bmf a également été identifiée dans les RPTC du modèle diabétique STZ. La normalisation de l’hyperglycémie chez ces souris par traitement à l’insuline semble normaliser également l’expression de Bmf. In vitro, la surexpression du cDNA de Bmf dans les RPTC promouvoit l’apoptose et augmente l’activité de caspase 3. La stimulation de RPTC de Rat avec le glucose élevé (25mM de D-glucose) semble augmenter l’expression de Bmf et le traitement de ces cellules avec la roténone, les Diphénylène iodonium, la catalase et l’apocynine semble renverser cette stimulation. L’inhibition de Bmf avec un siRNA semble réduire l’apoptose induite par le glucose élevé. L’expression de Bmf a également été démontrée dans les RPTC de patients diabétiques. Conclusion: Ces résultats ont démontré une surexpression de Bmf dans les RPTC de différents modèles diabétiques et suggèrent son potentiel rôle dans la régulation de l’apoptose et de l’atrophie tubulaire chez les diabétiques. / Objective: To investigate the mechanisms underlying tubular apoptosis in diabetes by identifying pro-apoptotic genes that are differentially upregulated by reactive oxygen species in renal proximal tubular cells (RPTCs) in models of diabetes. Research Design and Methods: Total RNAs isolated from renal proximal tubules (RPTs) of 20 week-old heterozygous db/m+, db/db and db/db catalase (CAT)-transgenic (Tg) mice were used for DNA chip microarray analysis. Real time-quantitative polymerase chain reaction assays, immunohistochemistry and mice rendered diabetic with streptozotocin were used to validate the pro-apoptotic gene expression in RPTs. Cultured rat RPTCs were used to confirm the apoptotic activity and regulation of pro-apoptotic gene expression. Additionally, studies in kidney tissues from patients with and without diabetes were employed to confirm enhanced pro-apoptotic gene expression in RPTs. Results: Bcl-2-modifying factor (Bmf) was differentially upregulated (p<0.01) in RPTs of db/db mice as compared to db/m+ and db/db CAT-Tg mice and in RPTs of streptozotocin-induced diabetic mice in which insulin reversed this finding. In vitro, Bmf cDNA overexpression in rat RPTCs co-immunoprecipated with Bcl-2, enhanced caspase-3 activity and promoted apoptosis. High glucose (HG, 25 mM) induced Bmf mRNA expression in RPTCs, while rotenone, catalase, diphénylèneiodonium and apocynin decreased it. Knockdown of Bmf with small interference RNA reduced HG-induced apoptosis in RPTCs. Importantly, enhanced Bmf expression was detected in RPTs of kidneys from patients with diabetes. Conclusion: These data demonstrate differential up-regulation of Bmf in diabetic RPTs and suggest a potential role for Bmf in regulating RPTC apoptosis and tubular atrophy in diabetes.