The purpose of this project was to fabricate biodegradable ophthalmic inserts for controlled delivery of pilocarpine and evaluate them by both in-vitro and in-vivo studies. Emphasis was placed on the use of an inexpensive material as a drug carrier and on the ease of fabrication of the device. Based on these criteria, absorbable gelatin was selected to fabricate a matrix system. Absorbable gelatin can be obtained by either thermal treatment or chemical crosslinking of gelatin. In the first part of this project, we fabricated an insert using Gelfoamᴿ, an absorbable gelatin sponge obtained by thermal treatment. A prolonged in-vitro release of pilocarpine from the device was achieved through pharmaceutical modification by embedding a retardant in the pores. The devices impregnated with polyethylene glycol monostearate (PMS) and cetyl esters wax (CEW) were found to be most effective. The in-vivo evaluation of the devices indicated that pharmaceutical modification of Gelfoamᴿ is an effective means of improving the biological activity of pilocarpine without altering the biodegradability of the biopolymer backbone. The CEW device produces a substantial improvement in drug bioavailability and an increase in the duration of biological effect over that from the two commercial formulations, the eyedrop and the gel. In the second part of the project, we fabricated absorbable gelatin inserts through chemical crosslinking of gelatin. The effect of selected fabrication variables on profiles of the in-vitro release of pilocarpine and the dynamic water uptake by the crosslinked gelatin devices was investigated. These results were further substantiated by the measurement of the degree of crosslinking of gelatin. The in-vivo study indicated that the modification of the structure of gelatin by crosslinking is another simple and effective way of improving bioavailability and extending the duration of effect of pilocarpine incorporated in the biopolymeric device. In addition, altering the degree of crosslinking of gelatin allows a variation of the biodegradation time of the polymer.

A epilepsia do lobo temporal (ELT) é o tipo mais comum de epilepsia em adultos. Estudos experimentais têm descrito aumento da geração de espécies reativas de oxigênio (EROs) na morte neuronal relacionada à excitotoxicidade, presente em muitas doenças neurodegenerativas, incluindo a epilepsia. O objetivo deste estudo foi avaliar a participação das EROs e da NADPH oxidase na morte neuronal no hipocampo de ratos submetidos ao modelo de ELT induzido pela pilocarpina (PILO). Os métodos utilizados foram a dihidroetidina (DHE) para determinar a geração de EROs, Fluoro-Jade B (detecta a degeneração de neurônios) e o tratamento com apocinina (APO), um antioxidante e inibidor da NADPH oxidase durante 7 dias prévios à injeção de PILO. Ratos machos Wistar adultos (n=5/grupo) foram submetidos à indução do status epilepticus (SE) e sacrificados após diferentes períodos (3, 6, 12 e 24 horas do início do SE). O giro denteado (GD) apresentou morte neuronal e aumento da geração de EROs em todos os períodos avaliados após indução de SE. Na região CA1, foi observada morte neuronal após 24 horas e aumento da geração em 6 e 24 horas. Na região CA3 morte neuronal e geração de EROs foram observadas após 24 horas do início do SE. O tratamento com APO diminuiu os níveis de EROs e morte neuronal em todas as regiões avaliadas. Nossos resultados indicam que o estresse oxidativo contribui para a morte neuronal durante o SE induzido por PILO. Além disso, pode-se sugerir que a NADPH oxidase está envolvida nesse processo, uma vez que o tratamento com APO diminuiu a neurodegeneração presente neste modelo de epilepsia / Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most frequent form of epilepsy in adults. Experimental data have described an increase of reactive species oxygen (ROS) generation in relation to the neuronal death related to excitotoxicity, which occurs in many neurodegenerative diseases, including epilepsy. The aim of this study was to evaluate the participation of ROS generated by NADPH oxidase in the cell death observed in the hippocampus of rats submitted to the pilocarpine (PILO) model of TLE. Dihydroethidium (DHE) oxidation and Fluoro-Jade B assays were peformed in order to detect ROS generation and neurodegeneration, respectively. Moreover, treatment of rats with apocynin (APO), an antioxidant and NADPH oxidase inhibitor, was also performed for 7 days prior to induction of status epilepticus (SE). Male Wistar rats (n=5/group) were submitted to PILO injection for SE induction and sacrificed after different periods (3, 6, 12 and 24 hours after SE establishment). The dentate gyrus (DG) present clear neurodegeneration, as well as an increase of ROS generation, in all analysed periods. In the CA1 area neuronal death was observed at 24h and ROS generation after 6h and 24h after SE establishment. In the CA3 area neuronal death and ROS generation were detected 24h after SE induction. APO treatment was effective in decreasing both ROS production and neurodegeneration in all three hipocampal areas. These results reinforce the idea that oxidative stress contributes to the neuronal death ensuing after SE induced by pilocarpine. In addition, as the APO treatment decreased neurodegeneration present in this epilepsy model, we suggest an involvement of ROS generated by NADPH oxidase in TLE

INTRODUÇÃO: apesar da identificação de mais de 1500 mutações para o gene CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), o teste do suor ainda é o teste diagnóstico para Fibrose Cística (FC). O teste quantitativo de iontoforese por pilocarpina (TQIP) é o padrão-ouro para coleta do suor e análise do cloro, mas está sujeito a erros se não for realizado por técnicos qualificados. Embora a técnica de coleta do suor pelo sistema macroduct® e análise pela condutividade seja simples e tenha boa correlação com os níveis de cloro em estudos prévios, a mesma ainda é considerada como um teste de triagem para FC. O melhor ponto de corte para confirmar ou afastar a FC pelo método da condutividade deve ser ainda estabelecido. OBJETIVOS: comparar os valores de cloro no suor obtidos pelo teste quantitativo da iontoforese pela pilocarpina (teste clássico) com os valores de condutividade do suor obtido pelo sistema de coleta por macroduct® (teste simplificado) em pacientes com e sem FC e em uma amostra aleatória de pacientes em investigação para FC. O custo e o tempo despendidos na execução de cada teste foram também analisados na fase inicial do estudo. MÉTODOS: o teste do suor, pelas duas técnicas, foi realizado simultaneamente em pacientes com e sem FC e posteriormente em pacientes em investigação diagnóstica da doença no período de fevereiro/2006 a outubro/2008. Os pontos de corte para a condutividade para excluir ou diagnosticar FC foram < 75 e ? 90 mmol/L, respectivamente, e para o teste clássico cloro ? 60 e > 60 mmol/L. Na fase inicial da pesquisa (casos com e sem FC) foram utilizadas tabelas de contingência para os cálculos de sensibilidade (S), especificidade (E), valor preditivo positivo (VPP) e negativo (VPN), além do teste exato de Fisher para avaliar a associação entre os testes e a presença ou ausência de FC. Na amostra aleatória de pacientes usou-se a curva ROC também para os cálculos de S, E, VPP e VPN e também para calcular a área sob a curva entre os testes, e, em ambas as fases da pesquisa, para avaliar sua acurácia. Os respectivos intervalos de confiança de 95% (IC95%) também foram analisados. Para avaliação da concordância entre os testes, na amostra aleatória de pacientes, utilizou-se o coeficiente de kappa e o teste de McNemar. Aplicou-se o teste de Wilcoxon para se comparar os tempos na execução de cada teste, sendo considerados significativos quando p<0,05. RESULTADOS: 52 pacientes com FC (29M/23F; 1,5 a 18,2 anos) realizaram o teste do suor pelas duas técnicas, apresentando valores medianos de cloro e condutividade no suor de 114 e 122 mmol/L, respectivamente. A condutividade foi ? 95 mmol/L em todos os pacientes, conferindo ao teste 100% de sensibilidade (IC95%: 93,1 a 100%). Cinquenta pacientes sem FC (24M/26F; 0,5 a 12,5 anos) apresentaram valores medianos de cloro e condutividade no suor de 15,5 e 30 mmol/L, respectivamente. Em todos os casos a condutividade foi < 70 mmol/L, conferindo ao teste 100% de especificidade (IC95%: 92,9 a 100%). Foram então realizados 918 testes nos pacientes em investigação para FC, mas, em 180, as amostras foram inadequadas. Dos 738 testes realizados pelas duas técnicas, em 714 pacientes se afastou a FC, encontrando-se mediana de cloro de 11 mmol/L (variação: 3 a 137 mmol/L) e de condutividade de 25 mmol/L (variação: 14 a 138 mmol/L). Foram confirmados 24 pacientes com FC, encontrando-se uma mediana de cloro de 87 mmol/L (variação: 54 a 132 mmol/L) e de condutividade de 103 mmol/L (variação: 50 a 126 mmol/L). Pela curva ROC, com valores de condutividade > 90 mmol/L, obteve-se S= 83,3%, E= 99,7%, VPP= 90,9% e VPN= 99,4% para o diagnóstico de FC. Com valores de condutividade < 75 mmol/L praticamente se pôde excluir o diagnóstico de FC (VPN=99,7%; IC95%:99,0-100%). Houve excelente concordância entre o teste clássico e o simplificado, tanto pelo valor de kappa (0,934; IC95% 0,86 a 1,009), quanto pelo teste de McNemar (p=1,0000). O tempo despendido na execução dos testes foi significativamente menor com o teste simplificado (p<0,0001) e o custo do método simplificado foi discretamente inferior. CONCLUSÕES: o teste da condutividade do suor, seja em pacientes com diagnóstico previamente conhecido (com ou sem FC) ou quando realizado aleatoriamente, mostrou resultados superponíveis ao teste clássico e foi capaz de diferenciar pacientes com e sem FC. O teste simplificado apresentou alta sensibilidade e especificidade e houve excelente concordância entre os testes. O tempo de execução foi mais rápido e o custo inferior ao teste clássico. / INTRODUCTION: despite the identification of over 1500 CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) gene mutations, the sweat test is still the diagnostic test for cystic fibrosis (CF). The quantitative pilocarpine iontophoresis test (QPIT) is the gold-standard method for collection of sweat and chloride analyses, but is subjected to errors if not performed by qualified technicians. Although the technique using the macroduct system for sweat collection and the conductivity analysis is simpler and has good correlation with chloride levels in previous studies, it is still considered a screening test for CF. The best cut-off point of sweat conductivity to confirm or rule out CF must yet be established. OBJECTIVES: to compare the sweat chloride values obtained by the quantitative pilocarpine iontophoresis test (classic test) with sweat conductivity analysis obtained by the macroduct (simplified test) in patients with a confirmed CF diagnosis, in patients without CF and in a random sample of patients being investigated for CF. The cost and time spent to perform each test were also analysed in the initial phase of the study. METHODS: both techniques of sweat test were simultaneously performed initially in patients with CF, afterwards in patients in whom CF had been ruled out and finally in patients referred for a sweat test between February 2006 and October 2008. The cut-off values for sweat conductivity to exclude or diagnose CF were = 90 mmol/L and for the QPIT were sweat chloride ? 60 e > 60 mmol/L, respectively. Contingency tables were used in the initial phase of the study (cases with or without CF) for calculation of sensitivity (Se), specificity (Sp), positive (PPV) and negative predictive value (NPV) and Fisher\'s exact test was used to assess the association between the tests and the presence or absence of CF. ROC curve was used in the random sample of patients also for calculation of Se, Sp, PPV and NPV and also to calculate the area under the curve between both tests in both phases of the study to assess their accuracy. The respective 95% confidence intervals (95%CI) were also analysed. Kappa coefficient and McNemar tests were used for evaluation of agreement between the tests in the random sample of patients. Wilcoxon test was used to compare the time spent to perform each test, with the significant difference set at p < 0.05. RESULTS: in 52 CF patients (29M/23F, age range 1.5 to 18.2y) the median value of sweat Cl and conductivity were 114 and 122 mmol/L, respectively. All patients had sweat conductivity values above 95 mmol/L (100% sensitivity; 95%CI: 93.1 to 100%). In 50 patients without CF (24M/26F, age range 6m to 12.5y) the median value of sweat Cl and conductivity were 15.5 and 30 mmol/L, respectively. All patients had conductivity values bellow 70 mmol/L (100% specificity; 95%CI: 92.9 to 100%). Nine hundred and eighteen tests were then performed in patients being investigated for CF but 180 had inadequate samples. Of the 738 tests performed with both techniques in 714 CF was ruled out, with median values of sweat Cl of 11 mmol/L (range: 3 to 137 mmol/L) and of conductivity of 25 mmol/L (range: 14 to 138 mmol/L). Twenty four patients had a diagnosis of CF presenting a median sweat Cl of 87 mmol/L (range: 54 to 132 mmol/L) and a median conductivity value of 103 mmol/L (range: 50 to 126 mmol/L). The ROC curve showed that with a conductivity value > 90 mmol/L sensitivity of 83.3%, specificity of 99.7%, PPV of 90.9% and NPV of 99.4% was obtained to diagnose CF. The best conductivity cut-off value to exclude CF was < 75 mmol/L (NPV=99.7%; IC95%:99.0-100%). Good agreement were observed between the tests (kappa: 0.934; IC95% 0.86 a 1.009; McNemar test: p=1.0000). The time spent to perform the tests was significantly lower with the simplified test (p<0.0001) and the cost was slightly lower with the conductivity test. CONCLUSIONS: sweat conductivity performed in patients with a known CF or non-CF diagnosis or randomly applied in subjects referred for a sweat test showed similar results as the classic test and could differentiate patients with or without CF. Conductivity test had a high sensitivity and specificity and good agreement was observed between the techniques. The time spent to perform the tests was lower with the simplified test, as well as the cost.

O objetivo deste estudo foi avaliar a efetividade de uma formulação farmacêutica experimental (solução com 1,54% de pilocarpina em spray) sobre o fluxo salivar (FS), experiência de boca seca e qualidade de vida (QV), comparado com placebo, em pacientes tratados com radioterapia (RTx) para câncer de cabeça e pescoço (CCP). Este ensaio clínico randomizado, controlado, duplo-cego e crossover foi realizado em pacientes com xerostomia (n=28). O FS foi medido pela sialometria estimulada (técnica do hálito fresco), a experiência de boca seca pelo Xerostomia Inventory (XI) e a QV pelo Oral Health Impact Profile (OHIP-14). As avaliações foram feitas antes do início da terapêutica - baseline (T0), um (T1), dois (T2) e três (T3) meses após iniciar o uso do spray, além da mensuração do FS uma hora após o baseline (T0+), seguido de período washout de 01 mês e após crossover, os mesmos períodos foram avaliados. O FS apresentou maior após uma hora (p=0,003 - teste de Wilcoxon) e dois meses (p=0,002 - teste de Friedman) de uso do spray com pilocarpina; melhoria na experiência de xerostomia, verificado pela diminuição significante (p<0,05 - teste de Friedman) dos escores em cinco itens do XI; melhoria na QV, verificado pela diminuição significante (p<0,05 - teste de Friedman) dos escores em três itens do OHIP-14, com o passar de alguns dos períodos de avaliação. A aplicação tópica da formulação de pilocarpina em spray melhoraram significantemente o FS, experiência de xerostomia e QV para os pacientes tratados com RTx para CCP. / The aim of this study was to evaluate the effectiveness of an experimental pharmaceutical formulation (1.54% pilocarpine spray solution) on salivary flow (SF), dry mouth experience and quality of life (QoL), compared to placebo, in patients treated with radiotherapy (RTx) for head and neck cancer (HNC). This randomized, controlled, double-blind, crossover clinical trial was performed in patients with xerostomia (n = 28). SF was measured by stimulated sialometry (fresh breath technique), dry mouth experience by Xerostomia Inventory (XI) and QoL by the Oral Health Impact Profile (OHIP-14). The evaluations were done before - baseline (T0), one (T1), two (T2) and three (T3) months after starting the spray, besides the measurement of FS one hour after the baseline (T0+), followed by a washout period of 1 month and after crossover, the same periods were evaluated. The SF presented higher after one hour (p=0.003 - Wilcoxon test) and two months (p=0.002 - Friedman test) of the use of the pilocarpine spray; improvement in the xerostomia experience, verified by the significant decrease (p<0.05 - Friedman test) of the scores in five items of XI; improvement in the QoL, verified by the significant decrease (p<0.05 - Friedman\'s test) of the scores on three items of the OHIP-14, with the passing of the evaluation of some periods. Topical application of the pilocarpine spray formulation significantly improved SF, xerostomia experience and QoL for patients treated with RTx for HNC.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / O Gengibre (Zingiber officinale Roscoe) à uma planta bastante apreciada em todo o mundo, nÃo apenas como um condimento, mas tambÃm por suas importantes propriedades medicinais. Os efeitos comportamentais e neuroquÃmicos do Ãleo essencial do gengibre - OEG foram estudados em camundongos tratados diariamente com o Ãleo essencial de gengibre (OEG 25, 50 e 100 mg/Kg, i.p. e v.o.). No sÃtimo dia de tratamento foram realizados os testes do labirinto em cruz elevado (LCE), campo aberto (CA), rota rod (RR), esquiva-passiva (EP) e teste dos tremores induzidos por oxotremorina. No oitavo dia do protocolo, os animais que receberam OEG (100 mg/Kg, i.p.) foram sacrificados para o estudo dos efeitos neuroquÃmicos do OEG em hipocampo e corpo estriado. Os efeitos tÃxicos do OEG foram estudados em camundongos (tratados com Ãnica administraÃÃo de OEG 200, 400 e 800 mg/Kg, i.p.) e ratos (nos quais foi induzida lesÃo hepÃtica por CCl4, e tratados com OEG 50, 100 e 200 mg/Kg, i.p. em Ãnica administraÃÃo). Os resultados mostraram que o OEG nÃo possui efeito ansiolÃtico de acordo com o modelo do LCE; no CA, o OEG (50 e 100 mg/Kg, i.p.) apresentou efeito sedativo ao reduzir o NC, o NG e NR em 37%, 28% e 75%, respectivamente. Foi observada, tambÃm, a ocorrÃncia de efeito dose-dependente da droga, cujo efeito mÃximo parece ser obtido com a dose de 100 mg/Kg (i.p.). A administraÃÃo oral do OEG tambÃm produziu sedaÃÃo, porÃm o efeito sà foi observado no grupo tratado com a dose maior do Ãleo essencial. No modelo do RR, o OEG nÃo produziu alteraÃÃo significativa na coordenaÃÃo motora dos animais tratados. No modelo da EP, o OEG produziu um dano cognitivo nos animais tratados com a dose de 100 mg/Kg, i.p. e v.o. Mesmo apÃs 24 horas da administraÃÃo da droga, o dano ainda era evidente. Quando associado à escopolamina, o OEG (50 e 100 mg/Kg, i.p. e v.o.) potencializou o efeito amnÃsico da droga. O efeito anticolinÃrgico do OEG (100 mg/Kg, i.p.) foi comprovado ao reverter os tremores induzidos por oxotremorina em camundongos. Em relaÃÃo aos efeitos neuroquÃmicos do OEG em corpo estriado, a droga diminuiu a concentraÃÃo de DA, aumentou NE, DOPAC e 5HT em 40%, 22%, 15% e 81%, respectivamente. No hipocampo observou-se que houve uma diminuiÃÃo de DA, DOPAC e um aumento de 5HT em 75%, 64% e 81%, respectivamente. A diminuiÃÃo de DA no corpo estriado explicaria o efeito sedativo da droga, e o conjunto de alteraÃÃes observadas no hipocampo parece contribuir tambÃm para o efeito amÃsico do OEG. O estudo dos efeitos tÃxicos do OEG revelou que a droga à relativamente segura e destituÃda de efeitos tÃxicos significativos nos protocolos utilizados no presente estudo. A administraÃÃo aguda do Ãleo essencial (200, 400 e 800 mg/Kg, i.p.) nÃo produziu outro efeito sobre os animais, a nÃo ser a sedaÃÃo, efeito jà observado com doses menores do Ãleo essencial. A administraÃÃo diÃria do OEG tambÃm nÃo produziu efeitos tÃxicos alÃm de diarrÃia observada nos animais tratados com a droga nas doses de 50 e 100 mg/Kg, i.p. e v.o. O OEG (200 mg/Kg, i.p.) mostrou-se efetivo ao reverter a lesÃo hepÃtica induzida por CCl4 em ratos. O tratamento com o Ãleo essencial na dose de 200 mg/Kg, i.p. reduziu em 35% e 23% a atividade das enzimas ALT e AST, respectivamente. O OEG parece exercer a aÃÃo hepatoprotetora ao combater a peroxidaÃÃo lipÃdica gerada pelo metabolismo hepÃtico do CCl4 que produz radicais livres, altamente lesivos / Ginger (Zingiber officinale Roscoe) is a plant largely used around the world, not just as a spice, but also for its medicinal properties. The behavioral and neurochemical effects were studied in mice daily administered with the essential oil of Ginger (EOG 25, 50 e 100 mg/Kg, i.p. and p.o.). In the 7th day of treatment, it was assessed the elevated-plus maze (EPM), open field (OF) rota rod (RR), passive avoidance (PA) and oxotremorine-induce tremor tests, to evaluate the behavioral effects of the drug. In the 8th day of the protocol, mice that received EOG (100 mg/Kg, i.p.) were killed to study the neurochemical effects of EOG on hipoccampus and striatum. Toxic effects of EOG were studied in mice (that received a single administration of EOG 200, 400 e 800 mg/Kg, i.p.), and rats (with hepatic injury induced by CCl4, and treated with EOG 50, 100 e 200 mg/Kg, i.p. in a single administration). Results showed that OEG does not have anxiolytic effects on EPM test; in OF test, EOG (50 e 100 mg/Kg, i.p.) showed a sedative effect, decreasing the number of crossings, grooming and rearing in 37%, 28% and 75%, respectively, with OEG 100 mg/Kg. It was also observed a dose-dependent effect of the drug, which maximum effect observed with 100 mg/Kg (i.p.) of the drug. The oral administration of EOG also induced a sedative effect, occuring only in the group treated with the highest dose of the essential oil. In RR test, EOG did not induce any significant alteration on motor coordination of the animals. In PA test, EOG produced a cognitive impairment in animals treated with EOG100 mg/Kg, i.p. and p.o. Even 24h after the drug administration, the cognitive impairment was still evident. When associated with scopolamine, EOG (50 e 100 mg/Kg, i.p. and p.o.) potentiated the amnesic effect of scopolamine. The anticholinergic effect of EOG (100 mg/Kg, i.p.) was proved to reverse the tremors induced by oxotremorine in mice. EOG, in striatum decreased DA and increased the concentrations of DOPAC, NE and 5HT in 40%, 15%, 22% and 81%, respectively. In hippocampus, OEG decreased DA, DOPAC and increased 5HT in 75%, 64% e 81%, respectively. The decrease of DA in striatum justifies the sedative effect of the drug and the aterations observed on hipoccampus seem to contribute to the amnesic effect of EOG. The study of toxic effects of EOG showed that the drug is relatively safe and it does not have any toxic effects, according to the protocols established in the present work. The acute administration of the essential oil (200, 400 and 800 mg/Kg, i.p.) did not induce any other toxic effect besides sedation. The daily administration of EOG did not produce any toxic effect, besides the diarrhea, observed in animals that received EOG 50 and 100 mg/Kg, i.p. and p.o. EOG (200 mg/Kg, i.p.) was effective in reversing the hepatic injury induced by CCl4 in rats. The treatment with the essential oil (200 mg/Kg, i.p.) reduced in 35% and 23% the activity of the enzymes ALT and AST, respectively. EOG seems to exert its hepatoprotective action by decreasing lipid peroxidation generated by the hepatic metabolism of CCl4, wich produces extremely danous free radicals

INTRODUÇÃO: apesar da identificação de mais de 1500 mutações para o gene CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), o teste do suor ainda é o teste diagnóstico para Fibrose Cística (FC). O teste quantitativo de iontoforese por pilocarpina (TQIP) é o padrão-ouro para coleta do suor e análise do cloro, mas está sujeito a erros se não for realizado por técnicos qualificados. Embora a técnica de coleta do suor pelo sistema macroduct® e análise pela condutividade seja simples e tenha boa correlação com os níveis de cloro em estudos prévios, a mesma ainda é considerada como um teste de triagem para FC. O melhor ponto de corte para confirmar ou afastar a FC pelo método da condutividade deve ser ainda estabelecido. OBJETIVOS: comparar os valores de cloro no suor obtidos pelo teste quantitativo da iontoforese pela pilocarpina (teste clássico) com os valores de condutividade do suor obtido pelo sistema de coleta por macroduct® (teste simplificado) em pacientes com e sem FC e em uma amostra aleatória de pacientes em investigação para FC. O custo e o tempo despendidos na execução de cada teste foram também analisados na fase inicial do estudo. MÉTODOS: o teste do suor, pelas duas técnicas, foi realizado simultaneamente em pacientes com e sem FC e posteriormente em pacientes em investigação diagnóstica da doença no período de fevereiro/2006 a outubro/2008. Os pontos de corte para a condutividade para excluir ou diagnosticar FC foram < 75 e ? 90 mmol/L, respectivamente, e para o teste clássico cloro ? 60 e > 60 mmol/L. Na fase inicial da pesquisa (casos com e sem FC) foram utilizadas tabelas de contingência para os cálculos de sensibilidade (S), especificidade (E), valor preditivo positivo (VPP) e negativo (VPN), além do teste exato de Fisher para avaliar a associação entre os testes e a presença ou ausência de FC. Na amostra aleatória de pacientes usou-se a curva ROC também para os cálculos de S, E, VPP e VPN e também para calcular a área sob a curva entre os testes, e, em ambas as fases da pesquisa, para avaliar sua acurácia. Os respectivos intervalos de confiança de 95% (IC95%) também foram analisados. Para avaliação da concordância entre os testes, na amostra aleatória de pacientes, utilizou-se o coeficiente de kappa e o teste de McNemar. Aplicou-se o teste de Wilcoxon para se comparar os tempos na execução de cada teste, sendo considerados significativos quando p<0,05. RESULTADOS: 52 pacientes com FC (29M/23F; 1,5 a 18,2 anos) realizaram o teste do suor pelas duas técnicas, apresentando valores medianos de cloro e condutividade no suor de 114 e 122 mmol/L, respectivamente. A condutividade foi ? 95 mmol/L em todos os pacientes, conferindo ao teste 100% de sensibilidade (IC95%: 93,1 a 100%). Cinquenta pacientes sem FC (24M/26F; 0,5 a 12,5 anos) apresentaram valores medianos de cloro e condutividade no suor de 15,5 e 30 mmol/L, respectivamente. Em todos os casos a condutividade foi < 70 mmol/L, conferindo ao teste 100% de especificidade (IC95%: 92,9 a 100%). Foram então realizados 918 testes nos pacientes em investigação para FC, mas, em 180, as amostras foram inadequadas. Dos 738 testes realizados pelas duas técnicas, em 714 pacientes se afastou a FC, encontrando-se mediana de cloro de 11 mmol/L (variação: 3 a 137 mmol/L) e de condutividade de 25 mmol/L (variação: 14 a 138 mmol/L). Foram confirmados 24 pacientes com FC, encontrando-se uma mediana de cloro de 87 mmol/L (variação: 54 a 132 mmol/L) e de condutividade de 103 mmol/L (variação: 50 a 126 mmol/L). Pela curva ROC, com valores de condutividade > 90 mmol/L, obteve-se S= 83,3%, E= 99,7%, VPP= 90,9% e VPN= 99,4% para o diagnóstico de FC. Com valores de condutividade < 75 mmol/L praticamente se pôde excluir o diagnóstico de FC (VPN=99,7%; IC95%:99,0-100%). Houve excelente concordância entre o teste clássico e o simplificado, tanto pelo valor de kappa (0,934; IC95% 0,86 a 1,009), quanto pelo teste de McNemar (p=1,0000). O tempo despendido na execução dos testes foi significativamente menor com o teste simplificado (p<0,0001) e o custo do método simplificado foi discretamente inferior. CONCLUSÕES: o teste da condutividade do suor, seja em pacientes com diagnóstico previamente conhecido (com ou sem FC) ou quando realizado aleatoriamente, mostrou resultados superponíveis ao teste clássico e foi capaz de diferenciar pacientes com e sem FC. O teste simplificado apresentou alta sensibilidade e especificidade e houve excelente concordância entre os testes. O tempo de execução foi mais rápido e o custo inferior ao teste clássico. / INTRODUCTION: despite the identification of over 1500 CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) gene mutations, the sweat test is still the diagnostic test for cystic fibrosis (CF). The quantitative pilocarpine iontophoresis test (QPIT) is the gold-standard method for collection of sweat and chloride analyses, but is subjected to errors if not performed by qualified technicians. Although the technique using the macroduct system for sweat collection and the conductivity analysis is simpler and has good correlation with chloride levels in previous studies, it is still considered a screening test for CF. The best cut-off point of sweat conductivity to confirm or rule out CF must yet be established. OBJECTIVES: to compare the sweat chloride values obtained by the quantitative pilocarpine iontophoresis test (classic test) with sweat conductivity analysis obtained by the macroduct (simplified test) in patients with a confirmed CF diagnosis, in patients without CF and in a random sample of patients being investigated for CF. The cost and time spent to perform each test were also analysed in the initial phase of the study. METHODS: both techniques of sweat test were simultaneously performed initially in patients with CF, afterwards in patients in whom CF had been ruled out and finally in patients referred for a sweat test between February 2006 and October 2008. The cut-off values for sweat conductivity to exclude or diagnose CF were = 90 mmol/L and for the QPIT were sweat chloride ? 60 e > 60 mmol/L, respectively. Contingency tables were used in the initial phase of the study (cases with or without CF) for calculation of sensitivity (Se), specificity (Sp), positive (PPV) and negative predictive value (NPV) and Fisher\'s exact test was used to assess the association between the tests and the presence or absence of CF. ROC curve was used in the random sample of patients also for calculation of Se, Sp, PPV and NPV and also to calculate the area under the curve between both tests in both phases of the study to assess their accuracy. The respective 95% confidence intervals (95%CI) were also analysed. Kappa coefficient and McNemar tests were used for evaluation of agreement between the tests in the random sample of patients. Wilcoxon test was used to compare the time spent to perform each test, with the significant difference set at p < 0.05. RESULTS: in 52 CF patients (29M/23F, age range 1.5 to 18.2y) the median value of sweat Cl and conductivity were 114 and 122 mmol/L, respectively. All patients had sweat conductivity values above 95 mmol/L (100% sensitivity; 95%CI: 93.1 to 100%). In 50 patients without CF (24M/26F, age range 6m to 12.5y) the median value of sweat Cl and conductivity were 15.5 and 30 mmol/L, respectively. All patients had conductivity values bellow 70 mmol/L (100% specificity; 95%CI: 92.9 to 100%). Nine hundred and eighteen tests were then performed in patients being investigated for CF but 180 had inadequate samples. Of the 738 tests performed with both techniques in 714 CF was ruled out, with median values of sweat Cl of 11 mmol/L (range: 3 to 137 mmol/L) and of conductivity of 25 mmol/L (range: 14 to 138 mmol/L). Twenty four patients had a diagnosis of CF presenting a median sweat Cl of 87 mmol/L (range: 54 to 132 mmol/L) and a median conductivity value of 103 mmol/L (range: 50 to 126 mmol/L). The ROC curve showed that with a conductivity value > 90 mmol/L sensitivity of 83.3%, specificity of 99.7%, PPV of 90.9% and NPV of 99.4% was obtained to diagnose CF. The best conductivity cut-off value to exclude CF was < 75 mmol/L (NPV=99.7%; IC95%:99.0-100%). Good agreement were observed between the tests (kappa: 0.934; IC95% 0.86 a 1.009; McNemar test: p=1.0000). The time spent to perform the tests was significantly lower with the simplified test (p<0.0001) and the cost was slightly lower with the conductivity test. CONCLUSIONS: sweat conductivity performed in patients with a known CF or non-CF diagnosis or randomly applied in subjects referred for a sweat test showed similar results as the classic test and could differentiate patients with or without CF. Conductivity test had a high sensitivity and specificity and good agreement was observed between the techniques. The time spent to perform the tests was lower with the simplified test, as well as the cost.

A epilepsia do lobo temporal (ELT) é a um dos casos mais frequente epilepsia em humanos e de maior refratariedade nos pacientes. A maioria dos fármacos antiepilépticos são moduladores da atividade neuronal e atuam sobre canais iônicos do receptor GABAA. Estudos vêm demonstrando o papel das células gliais e da neuroinflamação na epileptogênese e a modulação desta resposta pode ser um alvo potencial para drogas adjuvantes aos fármacos anti-epilépticos. Astrócitos são células gliais participantes da sinapse tripartite, moduladores da atividade neuronal. Os astrócitos são capazes de promover a homeostase de íons e de neurotransmissores, são responsáveis pelo metabolismo energético e da produção de fatores neurotróficos, glutationa, glutamina, S100B e citocinas. Neste trabalho, induzimos status epilepticus (SE) em ratos jovens (PN28) através do modelo lítio-pilocarpina que mimetiza alterações neuronais, bioquímicas e morfológicas similares à ELT em humanos. Os animais foram divididos nos tempos 1, 14 e 56 dias após a indução de status epilepticus (SE). Estes períodos são caracterizados respectivamente como a fase aguda, latente e crônica da epilepsia. Inicialmente, analisamos as mudanças neuroquímicas e astrocitárias ao longo do tempo. Foi observada neuroinflamação inicial e transitória que promove morte neuronal e mudanças ao longo do tempo de astrogliose e disfunção astrocitária. Também foi observado que a proteína S100B, proteína ligante de cálcio, predominantemente astrocitária, pode ser considerado um marcador da disfunção neuronal e astrocitária promovida neste modelo de epilepsia. Em seguida, demonstramos que a modulação da secreção de S100B pelo anti-inflamatório dexametasona um dia após indução de SE reverte a neuroinflamação, astrogliose e disfunção astrocitária à curto e à longo prazo. Por conseguinte, observamos que a modulação do receptor GABAA através de agonistas e antagonistas GABAérgicos altera a secreção de S100B em fatias hipocampais agudas e em cultura de astrócitos. Portanto, pode-se sugerir que as alterações astrogliais e a neuroinflamação dependentes do tempo podem estar ligadas à excitabilidade neuronal e/ou à morte neuronal em ratos jovens em modelo de epilepsia; que a proteína S100B pode ser considerada um marcador deste modelo de epilepsia e que a modulação da sua secreção pode ser um possível alvo farmacológico no tratamento da epilepsia. / Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most frequent type of epilepsy in humans and is more associated to refractory to anti-epileptic drugs (AED) in patients. The most AEDs are modulators of neuronal activity and act on ion channels, such as GABAA receptor. Studies have been demonstrating the role of glial cells and neuroinflammation in epileptogenesis. The modulation of this response may be a potential target for adjunctive drugs to anti-epileptic drugs. Astrocytes are glial cells that participated in the tripartite synapse and modulated neuronal activity. Astrocytes are able to promote homeostasis of ions and neurotransmitters, are responsible for energy metabolism and the production of neurotrophic factors, glutathione, glutamine, S100B and cytokines. In this work, we induced status epilepticus (SE) in young rats (PN28) through the lithiumpilocarpine model that mimics neuronal, biochemical and morphological alterations similar to ELT in humans. The animals were divided at times 1, 14 and 56 days after the induction of SE. These periods are characterized respectively as the acute, latent and chronic phase of epilepsy. Initially, we analyzed neurochemical and astrocytic changes over time. Initial and transient neuroinflammation was observed and promoted over time neuronal death, astrogliosis and astrocytic dysfunction. It has also been observed that the protein S100B, a calcium-binding protein, predominantly astrocytic, can be considered a marker of neuronal and astrocytic dysfunction promoted by this model of epilepsy. Next, we demonstrate that the modulation of S100B secretion by the antiinflammatory dexamethasone one day after SE induction reverses neuroinflammation, astrogliosis and astrocytic dysfunction in the acute and chronic time. Therefore, we analyzed that modulation of the GABAA receptor through GABAergics agonists and antagonists alters the secretion of S100B in acute hippocampal slices and in astrocyte culture. Therefore, it may be suggested that astroglial changes and time dependent neuroinflammation may be related to neuronal excitability and/or neuronal death in young rats in this epilepsy model; that S100B protein can be considered a marker of this epilepsy model and that the modulation of its secretion may be a possible pharmacological target in the treatment of epilepsy.

Patients with epilepsy often suffer debilitating cognitive and psycho-affective disorders.In some cases, epilepsy is associated to neurodegenerative processes that are the targetof certain therapeutical agents. Today, erythropoietin is considered as one of the most promising neuroprotective agents. In addition, an increased body of studies provides evidence that enrichment (or complexity) of housing decreases the cerebral vulnerabilityin the context of diverse brain insults. In this thesis, we demonstrate: 1) in a model ofepilepsy with large neuronal lesions, that erythropoietin protects the most vulnerable neuronal populations to excitotoxic injury, at the only condition that neuronal expression of its receptor is optimized prior to the primary insult causing epilepsy; 2) in a model of epilepsy associated with faint neuronal lesions that: i) erythropoietin prevents anxietyand impaired spatial learning and memory, ii) enriched housing in Marlau™ cages is moreefficient than erythropoietin, and iii) erythropoietin treatment abolishes beneficial effectsof enriched housing. These results, obtained in animal models of epilepsies associatedwith cognitive disorders establish that beneficial effects of a potential therapeutic agentmay rely on quality of life

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:05:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Programa de Apoio a Núcleos de Excelência (PRONEX) / Fundo de Auxílio aos docentes e Alunos (FADA) / 0 modelo experimental de epilepsia, induzido por pilocarpina, em fêmeas inicialmente descrito por Amado e cols., (1993). Após esses achados, vários estudos continuaram a ser efetuados na tentativa de se obter um conhecimento maior do envolvimento hormonal no fenômeno epileptogênico. Nesse sentido, este trabalho teve como objetivo, estudar a função dos hormônios sexuais no modelo de epilepsia induzido por pilocarpina, em ratas castradas. Utilizamos como grupo de estudos: (a) animais controles (estro, metaestro, diestro, proestro e castradas), (b) animais experimentais, que receberam pilocar pina e foram estudados na fase crônica do modelo (intacta crônica e castrada crônica) e (c) animais castrados, que na fase crônica do modelo foram submetidas à terapia de reposição hormonal (castrada crônica tratada com acetato de medroxiprogesterona, castrada crônica tratada com 17beta-estradiol e castrada crônica tratada com acetato de medroxiprogesterona + 17beta-estradiol. Pudemos verificar que todos os animais castrados tiveram atrofia genital após 4 dias do procedimento cirúrgico. Além disso, todos os animais que receberam pilocarpina apresentaram crises espontâneas e recorrentes na fase crônica. O estudo da distribuição hipocampal de parvalbumina mostrou que a marcação para esta proteína sofre flutuações durante as fases ao ciclo estral e apresenta maior marcação no grupo de ratas castradas que receberam acetato de medoxiprogesterona + 17beta-estradiol. Em relação à freqüência de crises o melhor tratamento após a castração foi aquele onde houve reposição de acetato de medoxiprogesterona + 17beta-estradiol. Entretanto, animais que receberam a reposição somente com acetato de medoxiprogesterona também tiveram redução do número de crises. Além disso, o tratamento hormonal também foi capaz de estabilizar o brotamento supragranular de fibras musgosas, mostrando a importância desses hormônios no desenvolvimento da epilepsia em fêmeas. / The epilepsy model, induced by pilocarpine, in females was described by Amado et al., (1993) and was been used to understand the effect of hormones in epileptogenesis. Therefore this work was as objective, to study the function of sexual hormones in the epilepsy model induced by pilocarpine in castrated rats. We use as groups: (a) controls animals (estrus, metaestrus, diestrus, proestrus and castrated), (b) experimental animals, that was received pilocarpine and it was studied in the chronic phase of the model (normal chronic and castrated chronic) and (c) castrated animals, that in the chronic phase it was submitted to the hormonal replace therapy (castrated chronic treated with medroxiprogesterone acetate, castrated chronic treated with 17β- estradiol and castrated chronic treated with medroxiprogesterone acetate + 17β-estradiol. We could verify that all the castrated animals were genital atrophy 4 days of the surgical procedure. Moreover, all the animals that were received pilocarpine presented spontaneous recurrent seizures in the chronic phase. The study of the hipocampal distribution of parvalbumine showed that the staining for this protein presents fluctuations during the phases from the estrous cycle and presents greater staining in the group of castrated rats that was received medoxiprogesterone acetate + 17β-estradiol. In the frequency of seizures the best treatment after the castration was that one where medoxiprogesterone acetate + 17β-estradiol. However, animals that received the replacement only medoxiprogesterone acetate also was reduction of the number of seizures. Moreover, the hormonal treatment also was capable os stabilize the sprouting mossy fibers, showing the importance of these hormones in the development of the epilepsy in females rats. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

O objetivo deste estudo foi avaliar a efetividade de uma formulação farmacêutica experimental (solução com 1,54% de pilocarpina em spray) sobre o fluxo salivar (FS), experiência de boca seca e qualidade de vida (QV), comparado com placebo, em pacientes tratados com radioterapia (RTx) para câncer de cabeça e pescoço (CCP). Este ensaio clínico randomizado, controlado, duplo-cego e crossover foi realizado em pacientes com xerostomia (n=28). O FS foi medido pela sialometria estimulada (técnica do hálito fresco), a experiência de boca seca pelo Xerostomia Inventory (XI) e a QV pelo Oral Health Impact Profile (OHIP-14). As avaliações foram feitas antes do início da terapêutica - baseline (T0), um (T1), dois (T2) e três (T3) meses após iniciar o uso do spray, além da mensuração do FS uma hora após o baseline (T0+), seguido de período washout de 01 mês e após crossover, os mesmos períodos foram avaliados. O FS apresentou maior após uma hora (p=0,003 - teste de Wilcoxon) e dois meses (p=0,002 - teste de Friedman) de uso do spray com pilocarpina; melhoria na experiência de xerostomia, verificado pela diminuição significante (p<0,05 - teste de Friedman) dos escores em cinco itens do XI; melhoria na QV, verificado pela diminuição significante (p<0,05 - teste de Friedman) dos escores em três itens do OHIP-14, com o passar de alguns dos períodos de avaliação. A aplicação tópica da formulação de pilocarpina em spray melhoraram significantemente o FS, experiência de xerostomia e QV para os pacientes tratados com RTx para CCP. / The aim of this study was to evaluate the effectiveness of an experimental pharmaceutical formulation (1.54% pilocarpine spray solution) on salivary flow (SF), dry mouth experience and quality of life (QoL), compared to placebo, in patients treated with radiotherapy (RTx) for head and neck cancer (HNC). This randomized, controlled, double-blind, crossover clinical trial was performed in patients with xerostomia (n = 28). SF was measured by stimulated sialometry (fresh breath technique), dry mouth experience by Xerostomia Inventory (XI) and QoL by the Oral Health Impact Profile (OHIP-14). The evaluations were done before - baseline (T0), one (T1), two (T2) and three (T3) months after starting the spray, besides the measurement of FS one hour after the baseline (T0+), followed by a washout period of 1 month and after crossover, the same periods were evaluated. The SF presented higher after one hour (p=0.003 - Wilcoxon test) and two months (p=0.002 - Friedman test) of the use of the pilocarpine spray; improvement in the xerostomia experience, verified by the significant decrease (p<0.05 - Friedman test) of the scores in five items of XI; improvement in the QoL, verified by the significant decrease (p<0.05 - Friedman\'s test) of the scores on three items of the OHIP-14, with the passing of the evaluation of some periods. Topical application of the pilocarpine spray formulation significantly improved SF, xerostomia experience and QoL for patients treated with RTx for HNC.