Contribution de U2AF1, NCBP1 et eIF4A3 dans le contrôle du maintien de la pluripotence et le devenir cellulaire.Les mécanismes de maturation du transcrit primaire peuvent profondément affecter la diversité et la fonction des protéines produites à partir d’un gène unique dans le but de mettre en place un programme complexe impliqué dans le maintien de pluripotence et/ou l’initiation de la différenciation des cellules souches humaines. Les réseaux transcriptionnels régulant la pluripotence et la différenciation ont été intensément étudiés contrairement au rôle de l’épissage alternatif dans ces mécanismes, rôle qui pour le moment reste mal compris et pour lequel il n’existe que très peux d’exemples de groupes de gènes subissant un changement général de variant d’épissage aboutissant à la modification du devenir cellulaire. Notre objectif est d’identifier les composés essentiels du spliceosome qui sont impliqués dans le maintien de la pluripotence et la différenciation précoce dans les trois feuillets embryonnaires et d’explorer leurs rôles dans ces processus. Via l’analyse de données de séquençage d’ARN nous avons identifié plusieurs facteurs d’épissage différentiellement exprimés entre les cellules souches et les trois feuillets embryonnaires. Parmi ces facteurs nous focaliserons notre étude sur les facteurs préférentiellement surexprimés dans les cellules souches, qui par conséquent devraient y jouer un rôle primordial. Les candidats sélectionnés, U2AF1, NCBP1 et eIF4A3 ont été déplétés dans des cellules souches en utilisant un système shRNA inductible puis une analyse de séquençage ARN à haut débit a été effectuée pour comprendre les changements du transcriptome induits par ces déplétions. La déplétion d’U2AF1 entraine un changement majeur de l’expression de gènes impliqués dans le développement alors que la déplétion de NCBP1 et eIF4A3 entraine un changement d’expression de gènes impliqués dans le métabolisme, le remodelage de la chromatine et le développement. Des analyses complémentaires ont permis de mettre en lumière une régulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle des gènes différentiellement exprimés dans les conditions étudiées. L’épissage alternatif a pour ça part été modifié par les trois déplétions de manière individuelle. Un programme d’épissage tissu spécifique a été associé à chaque candidat et les conséquences de chaque programme seront décrites au niveau du contrôle qualité de l’ARNm et de la synthèse protéique.Nos résultats construisent une nouvelle vision concernant le rôle des composés essentiels du spliceosome dans le contrôle du devenir cellulaire à travers la modulation de l’épissage alternatif. Cet apport ajoute une nouvelle variable au contrôle de l’expression des gènes et permettra de mieux comprendre les mécanismes du développement précoce et de la diversité tissulaire. / Contribution of U2AF1, NCBP1 and eIF4A3 to the control of pluripotency maintenance and cell fate determination.Alternative pathways for processing the primary transcript can profoundly affect the diversity and function of the protein products that are generated from a single gene to set up complex programs involved in pluripotency and/or differentiation of human Embryonic Stem Cells (hESCs). While transcriptional networks regulating pluripotency and differentiation has been intensively studied, the role of Alternative Splicing (AS) in this process is not yet completely understood and clear examples of concerted switching of multiple genes from one isoform to another have not been demonstrated. Our goal is to identify Core Spliceosomal Factors (CSF), involved in the control of pluripotency maintenance, early differentiation into the three germ layers, and to explore their role in these processes. By RNA-Seq data analysis, we have identified several splicing factors that are differentially expressed between pluripotent stem cells and the three of the germ layers. Among these identified candidates, we focused on the factors that are more highly expressed in pluripotent stem cells, thereby they play a specific role in pluripotency maintenance. The selected candidates, U2AF1, NCBP1 and eIF4A3 were depleted in pluripotent stem cells using inducible shRNA system and RNA-Seq analyzes have been performed to understand transcriptomic changes induced by these depletions. U2AF1 depletion causes a major switch of developmental genes expression, while NCBP1 and eIF4A3 depletions regulate the expression of genes involved in metabolism, chromatin remodeling and development. Further analysis highlighted a transcriptional and post-transcriptional regulation of differentially expressed genes. Alternative Splicing (AS) were shown to be affected by both depletions. A tissue specific AS program was associated to each of the candidates and the consequences of these changes on mRNA quality control and protein synthesis will be described.Our results build a new idea regarding the role of Core Spliceosomal Factors in cell fate control trough the modulation of AS. This knowledge adds a new layer of gene expression control and will allow a better understanding of early development mechanisms and tissue diversity.

Le LIF (Leukemia Inhibitory factor), une cytokine de la famille de l’Interleukine 6, permet le maintien de la pluripotence des cellules souches embryonnaires murines (CSEm) in vitro. Dans le but de comprendre les mécanismes d’action du LIF dans ce modèle d’étude, une analyse sur puces à ADN a été réalisée et a permis d’identifier trois « signatures LIF » : les gènes « Pluri » (pour Pluripotence), dont le niveau d’expression relatif chute suite au retrait de cette cytokine, et deux catégories de gènes « Lifind » (pour LIF induit) dont le niveau d’expression relatif augmente suite à un ajout de LIF après une culture de 24 ou 48 heures sans cette cytokine. Nous avons mis au point des tests fonctionnels permettant d’étudier la fonction des gènes cibles du LIF dans notre modèle d’étude. Ainsi, nous avons mis en évidence le rôle d’un gène « Pluri », Mras/Rras3, une petite GTPase de la famille Ras, dans la régulation de l’expression d’une part de marqueurs de pluripotence, tels que Oct4 et Nanog et d’autre part de marqueurs de différenciation, tels que Lef1 et Fgf5. / LIF (Leukemia Inhibitory factor), a cytokine Interleukin 6 family, allows maintaining the pluripotency of murine embryonic stem cells (mESC) in vitro. To understand the mechanisms of action of the LIF in this model, a microarray analysis was conducted and identified three « signatures LIF » : the « Pluri » (for Pluripotency) genes, whose the relative level of expression falls following the withdrawal of this cytokine, and two classes of « Lifind » (for LIF induced) genes, whose the relative expression level increases as a result of LIF addition after a culture of 24 or 48 hours without this cytokine. We have developed functional tests to study the function of the target genes of LIF in our study model. Thus, we have investigated the role of a « Pluri » gene, Mras/Rras3, a small GTPase of the Ras family, in the regulation of the expression on the one hand of markers of pluripotency, such as Oct4 and Nanog, and on the other hand of differentiation markers, such as Lef1 and Fgf5.

No description available.

La pluripotence est la capacité d'une cellule à s'auto-renouveler et à donner toutes les cellules somatiques ainsi que les cellules germinales. Les cellules pluripotentes peuvent être aussi reprogrammées à partir de cellules somatiques, ouvrant ainsi de nouvelles opportunités pour l'utilisation thérapeutique des cellules souches dans le traitement des maladies dégénératives. La connaissance des mécanismes moléculaires, en particulier des voix de signalisation qui contrôlent la pluripotence, est cruciale pour l'amélioration de notre compréhension de l'embryogenèse précoce et l'utilisation des iPSC (cellules souches pluripotentes induites) dans la médicine régénérative. Ici, je donne la première description de la Nétrine-1 en tant que régulateur de la reprogrammation et de la pluripotence. La Nétrine-1 et ses récepteurs ont été initialement caractérisés dans le système neuronal, mais il a aussi été montré qu'ils étaient exprimés dans différents types cellulaires et impliqués dans divers processus. Dans la première partie, j'ai contribué à explorer comment Nétrine-1 empêche l'apoptose médiée par son récepteur à dépendance DCC (Deleted in Colon Carcinoma) pendant la reprogrammation. Dans la deuxième partie, j'ai disséqué les fonctions et la régulation de cette voie dans le maintien de la pluripotence et dans l'engagement des lignages / Pluripotency is the ability of embryonic epiblast cells to self-renew and to give rise to all somatic cells as well as germ cells. Somatic cells can also be reprogrammed toward pluripotency, opening new avenues for stem cell based therapies in the treatment of degenerative diseases. Deciphering the molecular mechanisms, and in particular signaling pathways that control pluripotency is crucial to improve our understanding of early embryogenesis and the use of iPSC (inducible Pluripotent Stem Cell) in regenerative medicine.Herein, I provide the first description of Netrin-1 as a regulator of reprogramming and pluripotency. Netrin-1 and its receptors are present in many cell types and are engaged in a variety of cellular processes beyond its initial characterization in the neuronal system. In the first part, I contributed to explore how Netrin-1 prevents apoptosis mediated by its dependence receptor DCC (Deleted in Colon Carcinoma) during reprogramming. In the second part, I dissected the functions and regulation of this pathway in pluripotency maintenance and in lineage commitment

Les lignées de cellules souches embryonnaires humaines (hES) et maintenant de cellules souches induites à la pluripotence (hiPS) sont des cellules qui présentent deux caractéristiques uniques : elles sont d'une part capables de s'auto-renouveler de manière continue en culture ce qui permet de générer de grande quantité de cellules et d'autre part, elles présentent la capacité de se différencier en n'importe quelle cellule de l'organisme lorsqu'elles sont soumises à un environnement permissif adéquat. Ces deux propriétés permettent d'envisager de nombreuses applications médicales comme la thérapie cellulaire mais aussi des applications dans le domaine de l'industrie pharmaceutique grâce au développement de modèles cellulaires innovants. Ce mémoire de thèse a pour objectif de présenter les caractéristiques biologiques principales de ces cellules et les enjeux médicaux et pharmaceutiques qu'elles représentent pour le futur, notamment pour le pharmacien.

Les cellules souches cancéreuses (CSC) sont à l’origine de la progression tumorale, des métastases et rechutes tardives. Elles ont été identifiées dans de nombreux cancers, comme le cancer du sein triple négatif (TNBC) et cancers de grade III-IV. Elles sont résistantes aux chimiothérapies et radiothérapie et résident dans une niche immuno-répressive. Cette étude vise à évaluer une stratégie d’immunothérapie qui cible sélectivement les CSC dans le modèle murin 4T1-GFP-Luc mimant le TNBC. Le phénotype/ génotype des mamosphères a été initialement caractérisé. Basée sur l’analyse génomique des CSC, nous avons développé une immunothérapie active associée à des agents immuno-modulateurs. Nous avons mesuré la taille des tumeurs et suivi l’apparition des métastases par bioluminescence. Une étude immunologique et analyse génomique de la tumeur a été réalisée. La combinaison thérapeutique provoque le recrutement dans la tumeur de lymphocytes T (CD4 +, CD8 +) et lymphocytes B par augmentation de CXCL13, une réduction des lymphocytes T reg et cellules myéloïdes suppressives. Cette induction de réponse immunitaire provoque la diminution de la taille de la tumeur et des métastases. Cette nouvelle immunothérapie active de type vaccinale pourra être utilisée en association avec les traitements actuels pour des mesures prophylactiques et curatives dans une grande variété de cancers. / Cancer stem cells (CSCs) are responsible for tumor progression, metastases, and late relapses. They have been identified in many cancers, such as triple negative breast cancer (TNBC) and grade III to IV cancers. They are resistant to chemotherapy and radiotherapy and reside in an immuno-repressive niche.This study aims to evaluate a immunotherapy strategy that selectively targets CSCs in the mouse model 4T1-GFP-Luc mimicking TNBC. The phenotype / genotype of mammosphere was initially characterized. Based on genomic analysis of CSC, we have developed an active immunotherapy associated with immunomodulatory agents. We measured the size of tumors and monitored the appearance of metastases by bioluminescence. We performed an immunological study and genomic tumor analysis. The therapeutic combination causes the recruitment of CD4 + and CD8 + T lymphocytes and B lymphocytes with increased CXCL13, the reduction of T reg cells and suppressive myeloid cells in the tumor. This induction of intra-tumor immune response leads to a decrease in tumor size and metastases.This new active immunotherapy can be used in combination with current treatments for prophylactic and curative measures in a wide variety of cancers.

Pluripotence je schopnost buňky diferencovat do jakéhokoliv buněčného typu. Formuje se během časného embryonálního vývoje u savců a její vznik je spojen s reprogramací genové exprese na globální úrovni. Proces přirozeného vzniku pluripotence není stále zcela pochopen. Pro získání nového pohledu na události, které vedou ke vzniku pluripotence u savců, studovali jsme změny v genové expresi během oocyt-zygotického přechodu u myši. V tomto modelovém systému, oplodněné vajíčko podstoupí reprogramaci, která vede k vytvoření pluripotentních blastomer. Tyto blastomery zakládají samotné embryo. Cílem mé diplomové práce bylo analyzovat aktivaci transkripce během časného vývoje a vyvinout metodu pro monitorování exprese genů v oocytech, časných embryích a embryonálních kmenových buňkách. Metoda využívá kvantitativní PCR a umožnuje změřit expresi až 48 vybraných genů, které slouží jako markery pro maternální degradaci, aktivaci pluripotentního programu a diferenciaci do zárodečných linií. Dále ukazujeme, že náš systém monitoruje dynamiku transkriptomu během oocyt-zygotického přechodu, a získané výsledky jsou srovnatelné s daty naměřenými pomocí jiných metod. Díky našemu bioinformatickému přístupu jsme navíc identifikovali nové oocyt-specifické a zygotické nekódující RNA. Klíčová slova: pluripotence,...

Les cellules souches embryonnaires et adultes sont strictement contrôlées et régulées par différents mécanismes comme l’auto-renouvellement, la différentiation et l’apoptose. Les enzymes impliquées dans la modification des histones et les différents statuts de la chromatine seraient responsables de la mise en place, du maintien et de la propagation des différents profils d’expression des gènes mais le mécanisme sous-jacent reste néanmoins mal compris. Dans nos études, nous avons identifié le rôle de Trrap, un cofacteur des histones acétyltransférases dans le maintien de l’auto-renouvellement des cellules souches embryonnaires et adultes. La perte de la moelle épinière et une mortalité croissante sont survenues suite à la délétion conditionnelle du gène Trrap chez la souris. Ceci est dû à la perte des cellules hématopoïétiques progénitrices ainsi que des cellules hématopoïétiques souches par un mécanisme cellulaire autonome. L’analyse des cellules progénitrices, purifiées, de la moelle épinière à permis de révéler que ces anomalies sont associées à l’induction de l’apoptose indépendante de p53 ainsi qu’à la dérégulation des facteurs de transcription Myc. De plus, la délétion conditionnelle de Trrap dans les cellules souches embryonnaires induit la différentiation due au rôle important que Trrap joue dans la régulation du couplage de la méthylation de l’histone H3 aux lysines K4 et K27 appelées « domaines bivalents », le maintien du statut hyperdynamique de la chromatine et la régulation des gènes spécifiques à l’auto-renouvellement. Ceci est cohérent avec l’essentiel rôle de Trrap impliqué dans le mécanisme qui restreint l’induction de l’apoptose ou de la différentiation, ceci selon le type de cellules souches, et favorise le maintien de l’auto-renouvellement. Ces études ont permis d’identifier les différents rôles essentiels que Trrap joue dans le mécanisme qui permet le maintien des cellules souches embryonnaires et adultes ce qui soulève la possibilité que Trrap et les modifications des histones qui contrôlent l’auto-renouvellement pourraient être importants pour le développement et le maintien des cellules souches cancéreuses. Une meilleure compréhension du mécanisme commun qui implique Trrap et les modifications des histones contrôlant les éléments essentiels des cellules souches normales et cancéreuses s’avèrerait essentiel et très bénéfique pour les stratégies de thérapies épigénétiques qui ont pour but d’éradiquer les cellules souches cancéreuses / Embryonic and adult stem cells are tightly controlled and regulated by self-renewal, differentiation and apoptosis. Histone modifiers and chromatin states are believed to govern establishment, maintenance, and propagation of distinct patterns of gene expression in stem cells, however the underlying mechanism remains poorly understood. In our studies, we identified a role for the histone acetyltransferase cofactor Trrap in the maintenance of embryonic stem cells and hematopoietic stem/progenitor cells. Conditional deletion of the Trrap gene in mice resulted in ablation of bone marrow and increased lethality. This was due to the depletion of early hematopoietic progenitors, including hematopoietic stem cells, via a cell-autonomous mechanism. Analysis of purified bone marrow progenitors revealed that these defects are associated with induction of p53-independent apoptosis and deregulation of Myc transcription factors. Moreover, conditional deletion of Trrap in embryonic stem cells was found to results in unscheduled differentiation. This was due to the essential role of Trrap in coupling of H3K4 and H3K27 methylation ("bivalent-domains"), the maintenance of hyperdynamic chromatin state and regulation of the stemness genes, consistent with the essential function of Trrap in the mechanism that restricts apoptosis or differentiation depending on stem cell type and promotes the maintenance of self-renewal. Together, these studies have identified critical roles for Trrap in the mechanism that maintains embryonic and hematopoietic stem cells and raise the possibility that Trrap and histone modifications controlling self-renewal may be important for the development and maintenance of cancer stem cells. Better understanding of a common molecular mechanism involving HATs and histone modifications that controls key features of normal and cancer stem cells may prove highly beneficial for epigenetics-based therapeutic strategies aiming to eradicate cancer stem cells

Les cellules souches embryonnaires (ESCs) sont issues de la masse cellulaire interne (ICM) de blastocystes préimplantatoires. Elles sont pluripotentes c'est-à-dire capables de se différencier dans les trois lignages embryonnaires (ectoderme, mésoderme et endoderme) et de s'autorenouveller, c'est-à-dire de se multiplier indéfiniment en culture. Chez la souris, ces cellules (mESCs) sont à la base des techniques de transgénèse permettant des modifications génétiques ciblées. Chez l'Homme ces cellules (hESCs) représentent un grand espoir en médecine régénérative pour traiter des maladies dégénératives comme les maladies de Parkinson ou de Huntington. Le modèle le plus pertinent de l'espèce humaine est le singe. Cependant l'expérimentation sur cette espèce est soumise à une réglementation très stricte. C'est pourquoi il est nécessaire de développer des modèles alternatifs. C'est dans ce cadre que s'inscrit le lapin, qui est phylogénétiquement plus proche de l'Homme que ne l'est la souris. Mon projet de thèse a eu pour but d'étudier la pluripotence dans les ESCs de lapin (rESCs), afin de pouvoir les utiliser en transgénèse et produire des animaux transgéniques, modèles de maladies humaines. La première partie de ces analyses est regroupée au sein de l'article que notre laboratoire a publié en 2013 dans Biology Open (Osteil et al. 2013). D'autres analyses ont abouti à la dérivation de nouvelles lignées stabilisées dans un état plus proche de celui des cellules de l'ICM. L'ensemble des résultats a permis d'établir des bases solides pour la compréhension de la pluripotence et pour la dérivation d'ESCs dites naïves chez un autre mammifère que la souris / Embryonic stem cells (ESCs) result from cultures of inner cell masses (ICMs) isolated at preimplantation blastocyst stage. ESCs are defined by their self-renewal capacity, characterized by robust proliferation while maintaining plutipotent potential, the ability to give rise to cells from all three germ layers mesoderm, endoderm and ectoderm. Mouse ESCs (mESCs) allow the production of transgenic models by site-specific mutagenesis. Human ESCs (hESCs) represent major hope for regenerative medicine in order to treat degenerative diseases like Parkinson or Huntington. The more relevant model of Human is monkey. However, working on this specie is subjected to extremely strict regulation. Consequently it is very important to develop alternative animal models. Rabbit appears to be a very good candidate, because he is phylogenetically closer to Human than the mouse. My thesis project aimed to study the pluripotency mechanism of rabbit ESCs (rESCs), in order to use these cells for the production of transgenic animal models for human diseases. First part of theses analyses is synthesized in a publication into Biology Open in 2013 (Osteil et al. 2013). Other analyses produced new rESCs lines stabilized in a closer state compared to ICM state. All these results led to obtain solid knowledge on pluripotency and derivation on so-called naïve ESCs in a non-rodent specie

Les cellules souches pluripotentes sont capables de donner naissance à tous les types cellulaires constituant un organisme, ce qui leur confère un fort intérêt thérapeutique. A partir de l’embryon de souris on peut en dériver deux types : les cellules souches embryonnaires (ES) au stade blastocyste et les cellules souches d’épiblaste (EpiSC) au stade œuf cylindre. Ces deux types de cellules partagent leurs propriétés pluripotentes mais se distinguent par de nombreux aspects comme leurs conditions de culture et les gènes qu’elles expriment. Nous avons montré que la reprogrammation par clonage par transfert de noyau permet d’obtenir des EpiSC présentant un méthylome et un transcriptome similaires à ceux des EpiSC issues d’embryons après fécondation. Nous avons également caractérisé le profil de méthylation de l’ADN des EpiSC, et montré une tendance à l’hyperméthylation des promoteurs des EpiSC par-rapport aux cellules ES et à l’épiblaste. De plus, l’absence de méthylation empêche la conversion des cellules ES en EpiSC. Les EpiSC semblent donc dépendre fortement de la méthylation de l’ADN pour réguler l’expression de leurs gènes, ce qui les distingue des cellules ES. / Pluripotent stem cells are of great therapeutic interest because of their capability to give rise to all the cells composing an organism. We can derive two types of these stem cells from the mouse embryo: embryonic stem cells (ESCs) from the blastocyst and epiblast stem cells (EpiSCs) from the egg cylinder stage. These two cell types share their pluripotent properties but are distinct on several features, like their culture conditions and gene expression. We showed that reprogramming using cloning by nuclear transfer allows the obtention of EpiSCs with a methylome and a transcriptome similar to those of EpiSCs derived from embryo after fertilisation. We also characterised the DNA methylation pattern of EpiSCs and showed their tendency to present a hypermethylation at their promoters compared to ESCs and epiblast. We also observed that the absence of DNA methylation blocks the conversion of ESCs into EpiSCs. As a conclusion, it seems that EpiSCs are strongly dependant of DNA methylation to regulate gene expression, which distinguishes them from ESCs.