Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Agronomia, 2015. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2015-10-08T18:20:55Z No. of bitstreams: 1 2014_ClaudiaPatríciaBravoChaucanés_Parcial.pdf: 1879341 bytes, checksum: c8fbb407d6733d5dcdf63c5ba3fe3cff (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-10-08T18:21:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_ClaudiaPatríciaBravoChaucanés_Parcial.pdf: 1879341 bytes, checksum: c8fbb407d6733d5dcdf63c5ba3fe3cff (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-08T18:21:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_ClaudiaPatríciaBravoChaucanés_Parcial.pdf: 1879341 bytes, checksum: c8fbb407d6733d5dcdf63c5ba3fe3cff (MD5) / Meloidogyne enterolobii vem sendo detectado parasitando goiabeiras e hortaliças. O impacto negativo dos agrotóxicos tem levado ao uso restrito de alguns nematicidas. O potencial de fungos nematófagos vem sendo avaliado como estratégia complementar de controle dessa doença. O objetivo do presente estudo foi avaliar a patogenicidade de isolados de Pochonia chlamydosporia e Purpureocillium lilacinum (=Paecilomyces lilacinus) em ovos de Meloidogyne enterolobii em ensaios in vitro e em casa de vegetação. Foram avaliados 19 isolados de P. chlamydosporia e 17 isolados de Paecilomyces-like pertencentes à Coleção de Fungos de Invertebrados (CFI) da Embrapa Cenargen. Foram conduzidos três experimentos em placas de Elisa com o objetivo de: 1) avaliar a ação patogênica dos isolados sobre ovos do nematoide 2) avaliar os quatro melhores isolados de cada gênero quanto a patogenicidade sobre massas de ovos; 3) avaliar os dois melhores isolados de cada gênero quanto a patogenicidade sobre ovos quando aplicados em conjunto. Foram selecionados os isolados: CG1006, CG1044 (P. chlamydosporia), CG179 (P. lilacinum) e o produto Rizotec® (P. chlamydosporia) para avaliação do controle exercido por esses fungos, sobre a reprodução de M. enterolobii, em cultura de ciclo curto (tomate) e longo (banana), em condições de casa de vegetação. Na avaliação in vitro os isolados CG1006, CG1044, CG1042 e CG1101 (P. chlamydosporia) e CG179, CG1038, CG348 e CG959 (Paecilomyces-like) proporcionaram reduções superiores a 66%, quando aplicados sobre ovos. Na avaliação sobre massas de ovos, os mesmos apresentaram um resultado inferior. A aplicação em conjunto, não alterou a eclosão dos juvenis de segundo estádio (J2) de M. enterolobii. Nos experimentos em casa de vegetação se observou uma alta suscetibilidade da bananeira ao nematoide, embora a cultivar Terra tenha apresentado tolerância ao parasita. O isolado CG1006 proporcionou uma redução de 33% no número de ovos nessa cultura. No experimento com tomateiros, o isolado CG179 apresentou redução de 44,2% no número de ovos no tratamento sob baixa densidade populacional do nematoide; o isolado CG1006 causou uma redução de 33,6%. Não houve controle do nematoide em tomateiros em altas infestações de M. enterolobii, em condições de casa de vegetação. Essa pesquisa sugere que os agentes de controle biológico não podem substituir outros métodos de controle, mas podem ser integrados a outras estratégias de manejo que visem o re-estabelecimento do equilíbrio biológico do solo. / Meloidogyne enterolobii has been detected parasitizing guava and vegetables. The negative impact of pesticides has led to restricted use of some nematicides. The potential of nematophagous fungi has been evaluated as a complementary strategy to control this disease. The aim of this study was to evaluate the pathogenicity of Pochonia chlamydosporia and Purpureocillium lilacinum (=Paecilomyces lilacinus) on Meloidogyne enterolobii eggs in vitro and in greenhouse conditions. Were evaluated 19 isolates of P. chlamydosporia and 17 isolates of P. lilacinum belonging to the Fungi Invertebrates Collection (CFI) of Embrapa Genetic Resources and Biotechnology. Three experiments were conducted in Elisa plates in order to: 1) evaluate the pathogenic action of these isolates on nematode eggs; 2) select the best four isolates of each genus for pathogenicity on egg masses; 3) evaluate the best two isolates of each genus for pathogenicity on eggs when applied together. In vitro evaluation isolates CG1006, CG1044, CG1042 and CG1101 (P. chlamydosporia) and CG179, CG1038, CG348 and CG959 (P. lilacinum) provided reductions of more than 66% when applied on eggs. When applied on egg masses, they show a lower result. The application together, did not alter the hatching of second stage juveniles (J2) of M. enterolobii . The experiments in greenhouse showed a high susceptibility of banana cv. Terra to M. enterolobii, although this plant had shown tolerance to the parasite. The isolated CG1006 provided a 33% of reduction in the number of eggs on this culture. On the experiment with tomato, isolated CG179 decreased 44.2% the number of eggs in the treatment under low nematode; population density; the isolate CG1006 caused a reduction of 33.6%. No control was observed on high infestations of M. enterolobii on tomato, under greenhouse conditions. This research suggests that biological control agents cannot replace other methods of control, but can be integrated with other management strategies to re-establish the biological balance of the soil.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-04-19T12:33:37Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2096061 bytes, checksum: bc307da4c22fbfa9e0230bdede6f8c29 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-19T12:33:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2096061 bytes, checksum: bc307da4c22fbfa9e0230bdede6f8c29 (MD5) Previous issue date: 2018-03-02 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Fungos e plantas produzem enzimas que possuem as mais diversas aplicações biotecnológicas. Uma possível e promissora aplicação dessas enzimas é o controle de nematoides, em substituição aos nematicidas químicos prejudiciais à saúde humana e animal, ao meio ambiente e à microbiota do solo. Outra possível aplicação das enzimas de fungos é o uso da dextranase na redução de dextrana na indústria sucroalcooleira. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo investigar a produção de enzimas pelo fungo Pleurotus eryngii e pelas plantas Euphorbia milii e E. trigona, purificar e caracterizar as enzimas de E. milii, E. trigona e Pochonia chlamydosporia, e testar a atividade nematicida das enzimas das plantas E. milii, E. trigona e do fungo P. eryngii. O fungo P. eryngii e seu extrato reduziram significativamente (p<0,01) o número de larvas intactas de Panagrellus sp. após 24 horas de tratamento em 60 e 90%, respectivamente. Este efeito não está relacionado à atividade enzimática, mas sim à presença de outros metabólitos. Os ovos de Meloidogyne javanica, quando tratados com o extrato de P. eryngii, mostraram redução de 53% (p<0,01) no número de ovos intactos. A redução de ovos intactos de M. javanica é atribuída à atividade enzimática, uma vez que o extrato apresentou atividade quitinolítica e proteolítica de, respectivamente, 32,74 e 3,57 U/mL. A purificação do látex de E. trigona por cromatografia de exclusão molecular permitiu a purificação de três proteases distintas. O peso molecular das proteases foi estimado em aproximadamente: 36, 31 e 29 kDa, para a trigonina 1, 2 e 3, respectivamente. O pH e a temperatura que proporcionaram maior atividade de protease foram 4,0, 6,0 e 9,0, e temperatura de 70 °C. As proteases foram inibidas por fluoreto de fenilmetilsulfonila e iodoacetamida. O pool das três proteases presentes no látex de E. trigona reduziram significativamente (p<0,01) o número de J 2 vivas de M. incognita em 96% após 24 horas de tratamento. A purificação parcial das proteases presentes no látex de E. milii indicou que estas proteases correspondem à milina e miliina. Estas enzimas reduziram em 65,59% e 96,46% o número de larvas de Panagrellus redivivus após 24 e 48 h, respectivamente (p<0,01). A dextranase produzida pelo fungo P. chlamydosporia foi purificada à homogeneidade em duas etapas, com rendimento de 152%, fator de purificação de 6,84 e atividade específica de 358,63 U/mg. Seu peso molecular foi estimado por SDS-PAGE em 64 kDa. A enzima apresentou maior atividade a 50 °C e pH 5,0, usando tampão citrato-fosfato 100 mM, foi inibida por Ag 1+ , Hg 2+ , Cu 2+ , Mg 2+ , e apresentou K M de 1,77 g/L. A dextranase madura é composta por 585 resíduos de aminoácidos, com peso molecular predito de 64,38 kDa e pI 5,96. Esta dextranase demonstrou forte semelhança filogenética em comparação à dextranase de Trichoderma harzianum. Sua estrutura consiste de dois domínios: o primeiro composto por 15 cadeias beta, e o segundo composto por uma β-hélice paralela. Esses resultados evidenciam o potencial biotecnológico desses fungos, plantas e suas enzimas extracelulares informações acerca no da controle dextranase de nematoides, produzida pelo e fornecem fungo P. chlamydosporia, que podem ser utilizadas para futuras aplicações industriais desta enzima. / Fungi and plants produce enzymes that have several biotechnological applications. A possible and promising application of these enzymes is the control of nematodes, replacing chemical nematicides harmful to human and animal health, to the environment and to the soil microbiota. Another possible application of fungi enzymes is the use of dextranase to reduce dextran content in sugar industry. The objective of this work was to investigate the production of enzymes by Pleurotus eryngii, Euphorbia milii and E. trigona, to purify and characterize the enzymes from E. milii, E. trigona and Pochonia chlamydosporia, and to test the nematicidal activity of E. milii, E. trigona and P. eryngii. P. eryngii fungus and its extract significantly reduced (p<0.01) the number of intact Panagrellus sp. larvae after 24 hours treatment in 60 and 90%, respectively. This effect is not related to enzymatic activity, but to the presence of other metabolites. M. javanica eggs, when treated with P. eryngii extract, showed a 53% reduction (p<0.01) in the number of intact eggs. The M. javanica intact eggs reduction is attributed to enzymatic activity, once the extract showed proteolytic and chitinolytic activities of, respectively, 32.74 and 3.57 U/mL. The purification of E. trigona latex with size-exclusion chromatography allowed partially purification of three distinct proteases. The molecular weight of proteases was estimated at approximately: 36, 31 and 29 kDa, for trigonin 1, 2 and 3, respectively. The pH and temperature that provided highest protease activity were 4.0, 6.0 and 9.0, and temperature of 70 °C. The proteases were inhibited by phenylmethylsulfonyl fluoride and iodoacetamide. The pool of three proteases present in E. trigona latex reduced significantly (p<0.01) the number of live M. incognita J 2 in 96% after 24 hours treatment. The partial purification of the proteases present in E. milii latex indicated that these proteases are milin and miliin. These enzymes reduced the Panagrallus redivivus larvae number by 65.59 % and 96.46 % after 24 and 48 hours, respectively (p<0.01). Dextranase produced by the fungus P. chlamydosporia was purified to homogeneity in two steps, with a yield of 152 %, purification factor of 6.84 and specific activity of 358.63 U/mg. Its molecular weight was estimated by SDS-PAGE at 64 kDa. The enzyme presented higher activity at 50 °C and pH 5.0, using 100 mM citrate-phosphate buffer, was inhibited by Ag 1+ , Hg 2+ , Cu 2+ , Mg 2+ , and presented K M of 1.77 g/L. Mature dextranase is composed of 585 amino acids residues, with a predicted molecular weight of 64.38 kDa and pI 5.96. This dextranase showed a strong phylogenetic similarity when compared to Trichoderma harzianum dextranase. Its structure consists of two domains: the first composed by 15 β strands, and the second composed by a right-handed parallel β-helix. These results evidence the biotechnological potential of these fungi, plants and their extracellular enzymes to nematodes control, and provide information about the dextranase produced by P. chlamydosporia fungus, which can be used for future industrial applications of this enzyme.

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Made available in DSpace on 2015-03-26T13:37:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 243315 bytes, checksum: 054bf30c4a50c22bf027493817fb918f (MD5) Previous issue date: 2008-03-10 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Besides increasing production fees, the indiscriminate used of nematicidal chemicals may threaten farmers and consumers health, as well as contaminate the environment. Consequently, alternative methods for management of nematodes are preferred, such as the use of nematophagous fungi allied to organic matter incorporation to the soil. The objectives of this work were: 1- to evaluate the minimum effective dose of papaw seed's flour (FSM) with and without biofumigation, for the control of M. javanica; 2- to evaluate the effect of Pochonia chlamydosporia, applied in the form of chlamydospore or colonized coconut fiber, together with different doses of FMS against M. javanica and 3- to evaluate the effect of fungi and bacteria, isolated from soils treated with FSM, over M. javanica. The collective and accumulative effect of the toxic gasses released during the FSM decomposition, together with the high temperatures, conferred a considerable reduction in the quantity of FSM to be incorporated to the soil, especially if the soil was immediately covered after incorporation. Evaluating the applying of P. chlamydosporia fungi, it was determined that colonized coconut fiber was not efficient as a method for the introduction of this microorganism. Soil application of P. chlamydosporia must be done on infested soil and a period of more than seven days has to be held before planting, in order to allow fungi establishment and its activity over the initial nematode inoculum, with a consequent reduction in penetration, number of root knots and number of eggs at end of the nematode's life cycle. No antagonistic activity against nematodes was observed in bacteria isolated from soils where FSM was incorporated. Only one isolate of the fungi Trichoderma sp. resulted in nematode control, and only when introduced in the soil together with the host planting, 15 days before nematode eggs introduction. This period of exposition was not proportioned in the experiment from where the fungi was isolated, thus it was impossible to determine the role of such isolate in the control of the nematode. / O uso indiscriminado de nematicidas, além de onerar o custo de produção, pode colocar em risco a saúde dos aplicadores, dos consumidores e contaminar o meio ambiente. Desta forma, métodos alternativos para o manejo de nematóides são cada vez mais desejáveis, tais como o uso de fungos nematófagos aliado à incorporação de matéria orgânica. Os objetivos do presente trabalho foram avaliar a dose mínima efetiva de farinha de sementes de mamão (FSM) em biofumigação ou não, para o controle de M. javanica; testar o efeito de Pochonia chlamydosporia, aplicado na forma de clamidósporos ou de fibra de coco colonizada, juntamente com diferentes doses de FSM sobre M. javanica e verificar o efeito de fungos e bactérias, isolados de solos tratados com FSM sobre M. javanica. O efeito conjunto e cumulativo dos gases tóxicos liberados durante a decomposição da FSM, aliado às elevadas temperaturas proporcionou uma considerável redução da quantidade de FSM a ser incorporada no solo, principalmente se o solo for coberto imediatamente após a incorporação desse material. Ao se avaliar a forma de aplicação do fungo P. chlamydosporia constatou-se que a fibra de coco colonizada não foi efetiva como método de introdução deste microrganismo. A aplicação de P. chlamydosporia deve ser feita em solo infestado e deve-se aguardar um período maior do que uma semana antes do plantio para que o fungo possa se estabelecer e atuar sobre o inóculo inicial do nematóide, o que reduz a penetração e os números de galhas e ovos no final do ciclo de vida do nematóide. Bactérias isoladas de solo onde havia sido incorporado FSM não apresentaram atividade antagônica ao nematóide. Somente um isolado do fungo Trichoderma sp. resultou em controle do nematóide e apenas quando introduzido no solo no plantio com o hospedeiro, isto é, 15 dias antes da introdução dos ovos do nematóide. Este período de exposição não foi proporcionado noexperimento de onde este fungo foi isolado, portanto não é possível determinar o papel desse isolado no controle do nematóide.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:47:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 522894 bytes, checksum: 671c96196d8b0b7e8b4f7498d0e04248 (MD5) Previous issue date: 2014-02-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Echinostoma paraensei is a trematode of the genus Echinostoma that can cause echinostomiasis in humans. The aims of this study were to evaluate the ovicidal activity of the isolates VC1 and VC4 of the nematophagous fungus Pochonia chlamydosporia on solid medium containing 2% water-agar(2% WA) on eggs of E. paraensei, selecting the most efficient isolate (assay A), evaluate the ovicidal effect (destruction of eggs) of most effective isolate on supplemented agar culture media (assay B), and to evaluate the ovicidal capacity of crude enzymatic extract of most effective isolate on E. paraensei eggs (assay C). One thousand eggs of E. paraensei (assay A) were placed in Petri dishes containing 2% WA with one isolate of fungus P. chlamydosporia (VC1 or VC4) grown for 10 days, and without fungus as control. Both the treated and control group consisted of six replicates. After 15 days, approximately one hundred eggs were removed from each dish and classified according to the following parameters: type 1 effect, physiological effect without morphological damage to eggshell, where hyphae are observed attached to the shell; type 2 effect, lytic effect with morphological alteration of embryo and egg shell with hyphal penetration through the shell; and type 3 effect, lytic effect with morphological alteration of embryo and eggshell, in addition to hyphal penetration and internal egg colonization. In assay B, E. paraensei eggs were placed in Petri dishes with different supplemented agar culture media: 2% chitin- agar (2% AC), 2% corn-meal-agar (2% CMA), 2% WA and 2% starch- agar (2% SSA) with isolate VC4 (the most effective); in control group were not used fungus. Each treatment consisted of six replicates. After 25 days, one hundred eggs were removed from each dish and the ovicidal effect was evaluated according to the parameters already mentioned. In assay C, one thousand E. paraensei eggs were poured into Petri dishes with 5 ml of isolate VC4 crude extract constituting the treated group. The control group contained one thousand eggs in 10 ml of distilled water in Petri dishes. Each treatment consisted of six replicates. After 7 days, the total number of E. paraensei eggs present on each dish of the treated and control groups were counted according to the methodology described by Mukhtar and Pervaz. In assay A, there was no difference (p > 0.05) in ovicidal activity among the tested isolates; however, the highest percentage for ovicidal activity (type 3 effect) was demonstrated by the isolate VC4. In assay B, the culture medium starch agar showed the best results for the destruction of the eggs at the end of 25 days of interaction, with a percentage of 46.6%. In assay C, the crude extract of VC4 was effective in the destruction of E. paraensei eggs at the end of 7 days, with a percentage reduction of 53%. Results of in vitro experimental assay A, B and C have shown that P. chlamydosporia (VC1 and VC4) had negative influence on the E. paraensei eggs, and thus can be considered as a potential candidate for the biological control of this helminth. / Echinostoma paraensei é um trematóide do gênero Echinostoma que pode causar a equinostomíase em humanos. Os objetivos desse trabalho foram avaliar a atividade ovicida dos isolados VC1 e VC4 do fungo nematófago Pochonia chlamydosporia em meio sólido ágar- água 2% sobre ovos de Echinostoma paraensei, selecionando o isolado mais eficaz (ensaio A); avaliar o efeito ovicida (destruição dos ovos) do isolado mais eficaz em meios de cultura ágar suplementados (ensaio B) e avaliar a capacidade ovicida do extrato bruto enzimático do melhor isolado sobre ovos de E. paraensei (ensaio C). Mil ovos de E. paraensei (ensaio A) foram colocados em placas de Petri contendo ágar-água 2% (AA 2%) com um isolado do fungo P. chlamydosporia crescido (VC1 ou VC4) durante 10 dias, e sem fungo como controle. Seis repetições foram feitas para ambos o grupo tratado e controle. Após 15 dias, cerca de cem ovos foram retirados de cada placa e classificados de acordo com os seguintes parâmetros: tipo 1, efeito fisiológico sem prejuízo morfológico à casca do ovo, onde hifas são observadas aderidas à casca; tipo 2, efeito lítico com alteração morfológica da casca e embrião do ovo, com penetração de hifas através da casca; e tipo 3 efeito lítico com alteração morfológica do embrião e da casca, além de penetração de hifas e colonização interna do ovo. No ensaio B, ovos de E. paraensei foram colocados em placas de Petri com diferentes meios de cultura ágar suplementados: ágar-quitina 2% (AQ 2%), corn-meal-ágar 2% (CMA 2%), ágar-água 2% (AA 2%) e ágar- amido 2% (SSA 2%) com o isolado VC4 (o mais eficaz), no grupo controle não foram utilizados fungos. Seis repetições foram feitas para cada tratamento. Depois de 25 dias, cem ovos foram retirados de cada placa e o efeito ovicida foi avaliado de acordo com os parâmetros já citados. No ensaio C, mil ovos de E. paraensei foram vertidos para placas de Petri com 5ml de extrato bruto do isolado VC4 constituindo o grupo tratado. O grupo controle tinha 1.000 ovos em 10 ml de água destilada nas placas de Petri. Cada tratamento foi constituído por seis repetições. Após 7 dias, foram contados o número total de ovos de E. paraensei presentes em cada placa dos grupos tratado e controle de acordo com a metodologia descrita por Mukhtar e Pervaz. No ensaio A, foi observado que não houve diferença (p>0,05) na atividade ovicida entre os isolados testados, contudo, o maior percentual para a atividade ovicida (efeito do tipo 3) foi demonstrado pelo isolado VC4. No ensaio B, o meio de cultura ágar- amido 2% (SSA 2%) apresentou os melhores resultados para a destruição dos ovos ao final de 25 dias de interação, com um percentual de 46.6%. No ensaio C, o extrato bruto de VC4 demonstrou ser eficaz na destruição dos ovos de E. paraensei ao final de 7 dias com um percentual de redução de 53%. Os resultados dos ensaios experimentais in vitro A, B e C demonstraram que P. chlamydosporia (VC1 e VC4) influenciou de forma negativa sobre os ovos de E. paraensei, e assim pode ser considerado como um potencial candidato a controlador biológico desse helminto.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-06-20T13:25:16Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 845125 bytes, checksum: 4c94c1bbafe8070618ea88db66608e84 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-20T13:25:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 845125 bytes, checksum: 4c94c1bbafe8070618ea88db66608e84 (MD5) Previous issue date: 2016-07-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A banana (Musa spp.) é uma das frutas mais consumidas no mundo. O Brasil ocupa a 5a colocação na produção mundial dessa cultura, mostrando relevância no cenário agrícola. Os nematoides do gênero Meloidogyne se destacam por sua ampla distribuição mundial e pela magnitude das perdas que causam à cultura, diretamente e pela predisposição ao parasitismo por fungos de solo. O controle biológico de fitonematoides tem sido estudado para essa cultura como uma ferramenta possível de ser usada em manejo integrado. Nesse estudo foram avaliados o controle biológico de Meloidogyne javanicaem mudas micropropagadas de bananeira ‘Prata-Anã’ por sete isolados de Pochonia chlamydosporia(Pc-10; Pc-18; Pc-20; Pc- 42; Pc-54; Pc-64 e Pc-123) e a redução do stress causado pelo nematoide nas mudas de bananeira pela aplicação do isolado Pc-10, medida pela atividade das enzimas polifenoloxidase (PFO)e fenilalanina amônia liase (FAL). Os isolados Pc- 10, Pc-64, Pc-123 e Pc-18 reduziram significativamente o número de ovos do nematoide. Pc-42, Pc-54 e Pc-20 não reduziram o número de ovos. O número de galhas nas raízes foi reduzido apenas pelo isolado Pc-10 em comparação com os outros tratamentos. Existe variação na promoção de crescimento de mudas entre os isolados de P. chlamydosporia. O isolado Pc-42 apresentou a maior concentração no solo (UFC) após os experimentos de controle biológico e de promoção de crescimento. O isolado Pc-10 reduziu o stress em mudas de bananeira inoculadas com M. javanica. / The banana (Musa spp.) is one of the most consumed fruits in the world. Brazil occupies the 5th place in the world production of this crop, showing relevance in the agricultural scenario. The nematodes of the genus Meloidogyne stand out for their worldwide distribution and the magnitude of losses that cause to the culture directly and the predisposition to parasitism by soilborne fungi. Biological control of nematodes has been studied for this crop as a possible sustainable tool to be used in integrated pest management. In this study we assessed the biological control of Meloidogyne javanica in plantlets of banana 'Prata Ana’ by seven isolates Pochonia chlamydosporia (PC-10, PC-18, PC-20, PC-42, PC-54, PC-64 and P-123) and the stress reduction caused by the nematode in banana seedlings by applying the isolate Pc-10, measured by the activity of the enzymes polyphenoloxidase (PPO) and phenylalanine ammonia lyase (PAL). The isolates PC-10, PC-64, PC-123 and PC- 18 reduced the number of nematode eggs significantly. PC-42, PC-54 and PC-20 did not cause reduction in the number of eggs. The number of galls on the roots was only reduced by PC-10 in comparison with other treatments. There was variation in the seedling growth promotion by the isolates of P. chlamydosporia. The isolate Pc-42 showed the highest concentration in the soil (CFU) after the biocontrol and growth promotion experiments. The isolate Pc-10 reduced the stress on plants inoculated with M. javanica.

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The work developed in this thesis aimed to increase understanding about the variability and stability in eleven biotypes of Pochonia chlamydosporia, a facultative parasitic fungus with potential as a biological control agent against root-knot (Meloidogyne spp.), false root-knot (Naccobus spp.) and cyst nematodes (Heterodera and Globodera, spp.). Differences in performance were assessed by measuring saprophytic and parasitic growth using in vitro bioassays. Information on virulence (in vitro) was collected for a range of biotypes with the objective to relate in vitro parasitic growth with rhizosphere colonisation ability and secretion of extracellular enzymes. Results showed differences between biotypes in their ability to colonise the rhizosphere of plants, parasitise nematode eggs and to produce a range of extracellular enzymes but no significant relationships were found between saprophytic or parasitic growth and enzyme production. For the first time, the specific activity of protease, chitinase, esterase and lipase enzyme production by eleven biotypes of the fungus was examined. Enzymatic activity was shown to vary with the biotype and type of enzyme assayed and biotypes could be ranked according to their similarities in enzyme production A novel bioassay to estimate egg parasitism using liquid media highlighted the importance of nutrition in infection processes and suggested that all biotypes are able to infect large numbers of eggs rapidly if the conditions are favourable. The assay reliably detected fungal infection in nematode eggs within 48 hours and provided a simple, rapid assay to test the effect of specific nutrients at controlled concentrations on the infection process. Differences in infection rates between biotypes observed in previous tests on agar were not detected in the new assay in which nematode eggs and fungal conidia were added in suspension. Internal colonisation of individual whole Meloidogyne spp. eggs by P. chlamydosporia was observed using microscopy studies. The destruction of nematode eggs infected with the fungus within seven days, was confirmed. The in vitro formation of appressoria was studied in a range of P. chlamydosporia biotypes. for the first time. Biotypes were found to differ in their ability to produce appressoria but this ability was not related to differences in virulence (in vitro) against nematode eggs. Cont/d.

En esta tesis doctoral se estudia el modo de vida tritrófico del hongo nematófago Pochonia chlamydosporia utilizando técnicas "multiómicas". Pochonia chlamydosporia (= Metacordyceps chlamydosporia) (Goddard) Zare y Gams es un hongo nematófago usado para el control de nematodos agalladores de la raíz (Meloidogyne spp.) (Forghani and Hajihassani, 2020), entre otros. P. chlamydosporia se distribuye por todo el mundo y tiene un modo de vida tritrófico, pudiendo también adoptar estilos de vida endófito y saprófito. El mecanismo que utiliza P. clamydosporia para infectar huevos de nematodo comprende la desacetilación de la quitina de su pared celular a quitosano para facilitar su degradación por quitosanasas (Aranda-Martinez et al., 2016). El quitosano es un biopolímero derivado de la quitina que también se encuentra en el exoesqueleto de artrópodos y crustáceos. El genoma de P. chlamydosporia codifica un elevado número de quitosanasas, gracias a las cuales es resistente a quitosano y puede utilizarlo como fuente de nutrientes (Palma-Guerrero et al., 2010). Ambos pueden combinarse para el control de plagas. En este trabajo de tesis doctoral se pretende estudiar mediante metabolómica, transcriptómica y genómica el modo de vida tritrófico de P. chlamydosporia añadiendo quitosano, para determinar los mecanismos de interacción del hongo en ese entorno. En último término, se pretende sentar las bases para desarrollar un sistema para reducir plagas y enfermedades de forma sostenible.

El objetivo de esta Tesis Doctoral es estudiar diferentes herramientas para el manejo de plagas y enfermedades del cultivo de la platanera. Entre las herramientas que vamos a desarrollar, se van a analizar los compuestos orgánicos volátiles (COVs) fúngicos derivados de hongos entomopatógenos (HE) y nematófagos, como fuente de metabolitos con actividad antagónica contra el picudo negro (PN) de la platanera, Cosmopolites sordidus, para su control y manejo en el campo. Así mismo, vamos a estudiar las respuestas de cultivares de plataneras a quitosano, un polisacárido biodegradable, para evaluar su posible uso en el campo como estimulante y protector de las plantas frente a plagas y patógenos, como Fusarium oxysporum f. sp. cubense. El conjunto de capítulos de esta tesis pretende sentar las bases de una estrategia de manejo sostenible de plagas y enfermedades del cultivo de la platanera, basada en el uso de COVs derivados de hongos presentes de forma natural en los cultivos, en combinación con la suplementación de quitosano en el riego, para un efecto de protección y activación de las defensas de las plataneras antes de cualquier infección de plagas y/o enfermedades. El objetivo principal de esta Tesis Doctoral es encontrar nuevas fórmulas para la gestión integrada de plagas como Cosmopolites sordidus y enfermedades de la platanera en condiciones de campo. En esta Tesis Doctoral hemos ideado enfoques sostenibles para la gestión de las plagas y enfermedades de las plataneras. Nuestros objetivos son: a) Cosmopolites sordidus (picudo negro de la platanera, PN), la principal plaga de los cultivos de plátano y, b) el hongo del marchitamiento Fusarium oxysporum f. sp. cubense Raza Tropical 4 (FocTR4), agente causante de una nueva variante extremadamente virulenta de la enfermedad del “Mal de Panamá”, que se está extendiendo rápidamente por todo el mundo. Nuestras herramientas de gestión sostenible son: a) los hongos entomopatógenos (HE, conocidos por su uso como agentes de control biológico, ACBs) aislados de campos comerciales de plátanos, b) sus compuestos orgánicos volátiles (COVs) y, c) el quitosano, un compuesto biodegradable y elicitor de la inmunidad de las plantas con actividad antimicrobiana. Damos evidencia de que los COVs de los hongos agentes de control biológico son repelentes del PN. Pueden utilizarse en los cultivos de platanera mediante estrategias de push and pull para gestionar la plaga de forma sostenible. El quitosano puede utilizarse en el riego para prevenir las defensas de la platanera local y sistémicamente. Por lo tanto, este polímero, con probada actividad antimicrobiana frente a otros patógenos de marchitamiento de Fusarium spp., podría utilizarse contra la actual pandemia en las plataneras causada por FocTR4. La capacidad de inducir reguladores del crecimiento de las plantas sostiene también el papel fertilizante del quitosano. La inducción de compuestos relacionados con la respuesta sistémica adquirida (RSA) hace que el riego con quitosano sea una herramienta para manejar también las plagas de las plataneras sobre el suelo (PN) y las enfermedades (Sigatoka). De esta manera, los COVs y el quitosano podrían ayudar a reducir el uso de agroquímicos tóxicos en los cultivos de platanera en todo el mundo.