CpG islands (CGIs) are short GC rich sequences with a high frequency of CpGs that are associated with the active chromatin mark H3K4me3. Most occur at gene promoters and are often free of cytosine methylation. Recent work has begun to clarify the functional significance of CGIs with respect to chromatin structure and transcription. In particular, proteins associated with histone-modifying activities, such as Cfp1 and Kdm2a, bind specifically to non-methylated CGIs via their CxxC domains. For example, artificial promoterless CpG-rich sequences integrated at the 3’ UTR of genes recruit Cfp1 and generate novel peaks of H3K4me3 in mouse ES cells without apparent RNA polymerase recruitment. There is also evidence that G+C-rich DNA recruits H3K27me3, a gene silencing mark. In this thesis I am exploring the constraints on DNA sequence and genomic location that are required to impose both H3K4me3 and H3K27me3 at CGI sequences. Showing that the generation of novel peaks of H3K4me3 and H3K27me3 over a promoter-less CpG rich sequence in a gene desert region is independent of it’s location in the genome extends earlier findings. These findings suggest that shared features of the primary DNA sequence at CGIs directly influence chromatin modification. Thus CGIs are not passive footprints of other cellular mechanisms, but play an active role in setting up local chromatin structure. However, the relative contribution of CpG frequency versus G+C content remains unclear. Therefore a sequence was generated that contains low levels of CpGs, comparable to the bulk genome, but has a G+C content similar to that of CGIs (Low CpG / High G+C). When this sequence was inserted into a gene desert neither marks of H3K4me3 or H3K27me3 were formed, indicating the importance of CpGs. Surprisingly, the reverse sequence with a high CpG frequency similar to that of CGIs and a low G+C content similar to that of the bulk genome (High CpG / Low G+C) did not establish H3K4me3 or H3K27me3 either. However, it was found that this sequence becomes heavily methylated in contrast to CGI-like sequences that remained unmethylated when introduced into a gene desert. This finding suggests that a high G+C content is important for keeping CGI-like sequences methylation free. Upon insertion of this High CpG / Low G+C sequence into mouse ES cells that were devoid of the de-novo DNA methyltransferases 3a and 3b (Dnmt3a/3b -/-) both H3K4me3 and H3K27me3 marks were established at the inserted sequence. This discovery confirms the importance of CpGs for setting up local chromatin structure.

The Polycomb group (Pc-G) and trithorax group (trx-G) genes play crucial roles in development by regulating expression of homeotic and other genes that control cell fate. Both groups catalyse modifications in chromatin, including histone methylation, leading to epigenetic changes in gene activity. The trx-G antagonises the function of Pc-G genes by activating Pc-G target genes, and consequently trx-G mutants suppress Pc-G mutants. The trx-G genes are relatively poorly characterised in plants. We identified a novel trx-G candidate SUPRESSOR OF POLYCOMB 12 (SOP12) by a genetic screen for suppressors of mutants for the Arabidopsis Pc-G gene CURLY LEAF (CLF). Thus sop12 mutations have no discernible phenotype in wild type backgrounds but partially suppress the leaf curling and early flowering phenotypes of clf mutants. Molecular cloning shows that SOP12 encodes a Harbinger transposase nuclease-like protein which is conserved in green plants, although key residues required for the catalytic activity of the nuclease domain are not conserved. In sop12 clf double mutants, many CLF target genes are down-regulated relative to clf mutant, which suggests SOP12 is a general activator of Pc-G target genes instead of a target of CLF or a late flowering suppressor. The CLF gene encodes an H3K27me3 histone methyltransferase, however chromatin immunoprecipitation (ChIP) analysis indicates that SOP12 does not antagonise Pc-G by removing H3K27me3 methylation, which is consistent with the fact that sop12 suppresses mutants for another Pc-G gene, LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN 1 (LHP1), which is not involved in H3K27me3 deposition. . Rather, genetic analysis shows that sop12 enhances the phenotype of mutants of EARLY FLOWERING IN SHORT DAYS (EFS), a trx-G gene involved in deposition of H3K36me3, and of ULTRAPETALA 1 (ULT1), a plant specific trx-G gene. The enhancement indicates SOP12 may act together with ULT or EFS proteins, or at least regulate the same targets in synergistic ways. For example, SOP12 activates AP3 expression, a role which overlaps with EFS. Yeast two hybrid screening and imunoprecipitation followed by Mass spectrometry were performed to identify numerous potential SOP12 interacting proteins but await further validation. One protein (SUP1) identified through yeast two hybrid screens was independently identified by another group as a Pc-G suppressor, suggesting that SOP12 and SUP1 may act in a common complex to regulate Pc-G targets. Collectively, my data suggests that SOP12 represents a domestic transposase that has acquired a role as a novel, plant specific trx-G members.

Long non-coding RNAs (lncRNAs) are increasingly recognized as important regulators of genomic processes and cellular specification. Many lncRNAs regulate chromatin by functionally impacting the epigenetic state through direct interactions with chromatin-modifying proteins. We developed a protocol to enrich for chromatin-lncRNA interactions and used this technique to identify several candidate lncRNAs that interact with the Polycomb group (PcG) proteins. Our immunoprecipitation protocol uses a crosslinked chromatin fraction as the input and employs stringent washes and cross-validation techniques to dramatically decrease mRNA signal (as a metric of transient interactions or false positives), and increase the dynamic range of conventional RNA immunoprecipitation protocols. Applying this protocol to the PRC1 component Bmi1, we have identified 11 PcG-interacting lncRNA candidates whose expression impacts the transcription of many other chromatin factors and PcG targets. We focus on knockdown of one lncRNA candidate, CAT7, which increases expression of several homeobox-containing transcription factors as well as chromatin interacting proteins, including Trithorax group proteins, Jumanji-domain containing proteins, and PcG-like proteins in HeLa cells. Consistent with the observed increase in gene expression, knockdown of CAT7 decreases PcG binding (Suz12, H3K27me3 and Bmi1) at the promoter of the homeodomain protein Mnx1, located at the boundary of an adjacent gene desert. During early motor neuron differentiation from embryonic stem cells, knockdown of CAT7 is accompanied by changes in expression of master regulators of neuronal specification: increased upregulation Mnx1, upregulation of Isl1, and downregulation of Irx3, as well as changes in expression to several other PcG-regulated targets. Overall, this protocol is the first of its kind to efficiently identify de novo interactions between the PcG proteins and lncRNAs which impact PcG binding or PcG target gene expression.

Les complexes du groupe Polycomb (PcG) sont des répresseurs transcriptionnels capables de maintenir un état inactivé de la chromatine au niveau de leurs gènes cibles via des modifications post-traductionnelles des histones. Historiquement définis comme des répresseurs des gènes homéotiques, les protéines du PcG sont maintenant reconnues comme des répresseurs de gènes contrôlant le cycle cellulaire. Dans cette étude nous avons appréhendé l'implication des gènes du PcG E(z), Su(z)12, Pc, ph, Sce, Scm et Psc-Su(z)2 dans le contrôle de l'état prolifératif des cellules épithéliales des disques imaginaux in vivo. En utilisant des mutations nulles de ces gènes, nous avons étudié l'implication de ces protéines dans des processus biologiques tels que la prolifération, la croissance cellulaire, la différentiation et l'apoptose dont la dérégulation est associée à la tumorigénèse. Au cours de ce travail, nous avons constaté que les complexes du PcG ne se comportent absolument pas comme attendu : non seulement les différentes protéines composants le complexe PRC1 n'assument pas les mêmes fonctions, mais, par ailleurs, les complexes PRC1 et PRC2 ne collaborent pas et présentent même des effets antagonistes. Ainsi, nous avons répartit ces protéines dans deux sous-groupes : Le premier contient PH et Psc-Su(z)2 et agit comme suppresseur de tumeurs. Le deuxième groupe contient E(z), Su(z)12 et PC, des protéines qui favorisent la prolifération cellulaire plutôt que de l'inhiber. Enfin, nous avons recherché les cibles dont la dérégulation pourrait corréler avec les phénotypes associés à ces mutants. Nous avons identifié que certaines voies de signalisations impliquées dans le développement de l'œil de la Drosophile sont régulées de façon opposés par les protéines de ces deux sous-groupes. / Polycomb group (PcG) proteins are transcriptional repressors that were historically identified as regulators of homeotic genes. However, PcG proteins are now recognized as repressors of genes controlling the cell cycle. In this study we analyzed the role of the PcG genes E(z), Su(z)12, Pc, ph, Sce, Scm, and Psc-Su(z)2 in control of proliferation of epithelial cells in imaginal discs in vivo. Using null mutations of these genes, we investigated the involvement of these proteins in growth, differentiation and cell polarity. Surprisingly, we found that mutation of specific PcG proteins induce differential effects on the overall growth of the eye-antennal imaginal disc. In particular, we investigated the involvement of these proteins in biological processes such as proliferation, cell growth, differentiation and apoptosis, whose deregulation is associated with tumorigenesis. In this work, we found that PcG complexes do not behave as expected: different PRC1 proteins components do not assume the same functions, and PRC1 and PRC2 complexes may actually induce antagonistic effects. Thus, we have divided these proteins into two subgroups: The first contains PH and Psc-Su(z)2 and acts as tumor suppressors. The second group contains E(z), Su(z)12 and PC, and these proteins appear to favor cell proliferation. Finally, we looked for targets whose deregulation may correlate with the mutant phenotypes. We have identified several signaling pathways involved in Drosophila eye development that are regulated in an opposing manner in mutants of these two subgroups.

L’héritage épigénétique transgénérationnelle est un phénomène très controversé, selon lequel un phénotype non-génétiquement déterminé peut être transmis à la génération suivante. Jusqu'à présent, ce mode de transmission a été décrit dans quelques cas et il a été suggéré que les composants de la chromatine peuvent être impliqués, y compris des protéines du groupe Polycomb, qui agissent comme des répresseurs de gènes clés du développement et coordonnent la différenciation cellulaire et la prolifération. Les mécanismes moléculaires à la base du rôle de la répression génique Polycomb-dépendante à hérédité épigénétique transgénérationnelle sont loin d'être compris. Par conséquent, j’ai développé un système expérimental chez Drosophila melanogaster pour induire un héritage épigénétique transgénérationnelle stable, dans lequel des états d'expression génique alternatifs peuvent être transmis en présence de la même séquence d'ADN. A partir de ces « épilignes » stables, j’ai pu disséquer certaines des propriétés génétiques des épiallèles induits, tels que leur héritage quantitatif et leur capacité à communiquer à longue distance. En outre, les épiallèles montrent une synergie dans leur expression et transmission héréditaire. L'une des signatures moléculaires des épiallèles est une différence de répression médiée par les complexes Polycomb et par leur marque d’histone caractéristique. Cette distribution différente est indépendante de l’activité transcriptionnelles des gènes en aval, au moins dans un stade de développement précoce, et pourrait influer l'organisation tridimensionnelle du locus impliqué. Curieusement Ago2, un composant de la voie ARNi, a été montré interagir avec les épiallèles génétiquement et la protéine Ago2 se fixe directement à leur chromatine, ce qui indique un rôle possible pour le ncRNAs dans l'expression des épiallèles et éventuellement dans leur transmission. Ces résultats plaident en faveur e l’existence d’une hérédité épigénétique transgénérationnelle stable chez les métazoaires et fournissent un modèle qui se prête à une dissection moléculaire de ce phénomène. / Transgenerational epigenetic inheritance is a hotly debated phenomenon whereby a non-genetically determined phenotype can be transmitted to the next generation. So far, this mode of inheritance has been described in few cases and it was suggested that chromatin components might be involved, including Polycomb group proteins, which act as repressors of key developmental genes and coordinate cell differentiation and proliferation. The molecular mechanisms linking Polycomb-mediated silencing to transgenerational epigenetic inheritance are far from being understood. Therefore, I developed an experimental system in Drosophila melanogaster to induce stable transgenerational epigenetic inheritance, in which alternative gene expression states can be transmitted in the presence of the same DNA sequence. Starting from these highly stable “epilines”, I could dissect some of the genetic properties of the induced epialleles, such as their quantitative inheritance and their ability to trans-communicate. Moreover, the epialleles displayed synergy in their expression and transmission. One of the molecular signatures of the epialleles is the differential presence of the Polycomb repressive complexes and their related epigenetic marks. This different distribution is independent of the transcriptional activity of the downstream genes, at least in an early developmental stage, and could influence the three-dimensional organization of the locus involved. Intriguingly Ago2, an RNAi pathway component, has been found to genetically interact with the epialleles and to be directly bound on their chromatin, indicating a possible role for the ncRNAs in the expression of the epialleles and possibly in their transmission. These results make a case for strong and stable transgenerational epigenetic inheritance in metazoan and provide a model that is amenable for the molecular dissection of this phenomenon.

Répression des genes par le dépôt de la marque H3K27me3. Divers cofacteurs contrôlent sa fonction dans des cellules de différentes origines, comme les gametes. Au cours de ma thèse, j'ai utilisé des modèles murins ou un tag a été introduit dans les gènes Ezh2 et Ezh1, j'ai isolé des extraits nucléaires de testicules adultes entiers et identifié un nouveau polypeptide interagissant avec PRC2. Ce dernier est spécifiquement exprimé dans les gonades et sa fonction est inconnue. J'ai confirmé son interaction avec PRC2 et montré qu'il pourrait recruter PRC2 à la chromatine. Grâce à un modèle de souris knock-out, j'ai démontré que la protéine est nécessaire pour la fertilité féminine, alors que son ablation apporte une augmentation globale de la marque associée à PRC2, dans les cellules germinales masculines avec peu de conséquences sur la fertilité. J'ai également contribué à la caractérisation de l'interaction entre le long ARN non-codant HOTAIR et PRC2. Nombreux ARNnc ont été proposés pour moduler l'action des complexes modifiant la chromatine. Avec l'aide d'un nouveau système de recrutement artificiel d'ARN, l'expression induite par HOTAIR provoque une répression transgénique indépendamment de PRC2. La surexpression forcée de HOTAIR a également peu d'impact sur le transcriptome dans des cellules cancéreuses. En conclusion, la liaison PRC2 à l'ARN n'est pas requise pour le ciblage de la chromatine. / The Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) plays an essential role in development by maintaining gene repression through the deposition of H3K27me3. A variety of cofactors have been shown to control its function in cells of various origins however little is known about PRC2 regulation during gametogenesis. During my PhD, I took advantage of murine models where Ezh2 and Ezh1 were knocked-in, I isolated nuclear extracts from whole adult testis and, identified a new polypeptide interacting with PRC2. This protein is specifically expressed in gonads, is of unknown function and does not contain any conserved domain. I have confirmed its interaction with PRC2, identified the domain of interaction with PRC2 and shown that it could tether PRC2 to chromatin. Thanks to a knockout mouse model, I demonstrated that the protein is required for female fertility, whereas its ablation brings to a global increase of H3K27me3 PRC2-associated mark in male germ cells with little consequences on male fertility. I also contributed to the characterization of the interplay between the long non-coding RNA (lncRNA) HOTAIR and PRC2 complex. Many lncRNAs have been proposed to modulate chromatin-modifying complexes action on chromatin. With the help of novel RNA-tethering system, HOTAIR inducible expression causes transgene repression independently from PRC2. Forced overexpression of HOTAIR also has little impact on transcriptome in breast cancer cells. Generally, PRC2 binding to RNA is not required for chromatin targeting. Taken together these results shed light to the mechanism of a new-identified cofactor regulating PRC2 in the gonads and contribute to dissect PRC2-RNA relationship at molecular level.

Les protéines du groupe Polycomb (PcG) sont évolutivement conservées et sont des régulateurs chromatiniens responsables du maintien de la répression transcriptionnelle des gènes homéotiques (HOX) au cours du développement. Elles assurent ainsi une mémoire cellulaire. Cependant, ces protéines peuvent aussi cibler des gènes contrôlant le cycle cellulaire et la détermination du destin cellulaire. Au laboratoire, il a été montré que dans le disque imaginal d'œil de drosophile, plusieurs gènes de la voie de signalisation Notch sont réprimés par les protéines du PcG. La perte de fonction de ces dernières résulte en l'activation ectopique de Notch et en la formation de tumeurs néoplasiques. De manière intéressante, Notch n'est pas une cible des protéines du PcG dans les embryons. Ceci suggère qu'au cours du développement, les protéines du PcG pourraient être impliquées dans un contrôle dynamique de l'expression génique.L'objectif de ma thèse a été d'étudier le ciblage dynamique des protéines du PcG au cours du développement et de la différentiation tissulaire. Pour cela, j'ai effectué des expériences de ChIP dirigées contre des protéines du complexe PRC1 et pour la marque répressive H3K27me3 (typique du complexe PRC2) à partir de tissus larvaires : les disques imaginaux d'œil et d'aile. En comparant ces données aux données embryonnaires, nous avons découvert un néo-recrutement du système Polycomb spécifique du stade larvaire. Etonnamment, il existe plusieurs catégories de gènes cibles qui se distinguent sur la base de leurs profils de ChIP, ce qui suggère de nouveaux mécanismes de régulation par les protéines du PcG. En effet, certains gènes sont fixés uniquement par les protéines du PRC1 en l'absence de la marque H3K27me3 et inversement. Les 2 complexes PRCs pourraient donc agir indépendamment dans la régulation de l'expression génique. / Polycomb group (PcG) proteins are an evolutionarily conserved set of chromatin regulators implicated in stable long-term homeotic gene silencing. PcG proteins additionally bind and regulate genes implicated in cell cycle control or cellular fate determination, suggesting that PcG proteins can be involved in more dynamic regulation of target genes. Recent studies in Drosophila eye imaginal discs showed that PcG proteins can control cellular proliferation by repression of signalling genes, and that abrogation of this process promotes tumours. Interestingly, one of the regulated genes was not found to be a PcG target in embryonic tissues, suggesting that PcG-mediated gene regulation is dynamic throughout development. To gain a comprehensive view of the targeting of PcG proteins throughout development and to understand its role during tissue differentiation, we performed ChIP experiments in eye and wing imaginal discs for components of the PcG complex, PRC1, and the repressive histone mark H3K27me3 (deposited by the PcG complex, PRC2). Compared to embryo datasets, we find many novel PcG target genes, several with tissue-specific recruitment in eye or wing discs. Furthermore, we report new classes of PcG target genes based on their ChIP profiles, which may have implications for their modes of regulation. For example, some genes are bound only by PRC1 components (Pc, Ph), without the presence of H3K27me3, or vice versa, indicating that these complexes may play more independent roles in gene regulation than previously appreciated.

Dans le noyau de nos cellules l’ADN est enroulé autour de petites protéines que l’on appelle les histones et forme ainsi ce que l’on nomme la chromatine. L’activation des gènes permet la production de protéines qui sont nécessaires au bon fonctionnement des différentes cellules de notre organisme. Notre corps est composé de différentes cellules dont l’identité est définie par un patron de gènes actifs et inactifs bien spécifique. Au cours de la mitose (division des cellules) il est crucial que les cellules conservent leur identité, faute de quoi des structures non adaptées peuvent apparaître et dans certains cas conduire à l’apparition de cancers. Les protéines du groupe Polycomb (PcG) constituent un important système de mémoire cellulaire qui permet de maintenir un gène inactif au cours du développement d’un organisme. Ces protéines sont ciblées sur des gènes spécifiques où elles modifient la nature chimique des histones, rendant la chromatine compacte, difficile d’accès et donc empêchant l’activation de ces gènes. Lors de la mitose, la chromatine va se compacter drastiquement pour faciliter la ségrégation des chromosomes. Les mécanismes par lesquels les protéines du PcG s’adaptent à cette restructuration massive du génome ne sont pas connus. Mon projet est d’étudier le comportement des protéines du PcG au niveau de la chromatine à travers la mitose et ainsi de comprendre comment est préservée l’identité des cellules. Historiquement, les protéines du PcG ont été découvertes chez la drosophile et leurs mutations entrainent des anomalies au niveau du plan corporel. Ces protéines existent également chez l’homme et jouent un rôle essentiel dans le contrôle du développement. Ainsi mes travaux effectués chez la drosophile pourront être repris pour l’étude de ces protéines chez l’homme. Par l’utilisation de techniques de microscopie à fluorescence, il est possible de détecter la fixation des protéines du PcG au niveau de la chromatine au cours de la mitose. Il a été observé que durant la mitose l’une des protéines du PcG est dissociée de la chromatine alors que deux autres protéines de ce groupe sont quant à elles maintenues. L’ancrage des protéines du PcG à la chromatine se fait par le dépôt d’une modification chimique spécifique sur une histone, la triméthylation de la lysine 27 de l’histone 3 (H3K27me3). Pendant la mitose le résidu adjacent, la serine 28, va être phosphorylé (H3S28ph), et cette seconde modification perturbe la fixation des protéines du PcG. Pour mieux comprendre comment ces deux modifications (H3K27me3 et H3S28ph) définissent la fixation des protéines du PcG le long du chromosome lors de la mitose, j’analyserai la distribution de ces protéines le long du génome dans des cellules en mitose. D’autre part, j’étudierai les défauts développementaux provoques par l’absence de ces deux modifications chimiques à partir de drosophiles mutantes. La dérégulation des protéines du PcG entraine des défauts développementaux et est à l’origine de nombreux cancers chez l’homme. Des avancées dans le domaine pharmacologique ont permis d’élaborer des inhibiteurs de certaines des protéines du PcG qui pourraient constituer de nouvelles thérapies anti-cancer. Il est donc important de comprendre parfaitement les mécanismes d’actions de ces protéines, tout particulièrement au cours de processus biologiques cruciaux tel que la mitose. / Polycomb group (PcG) proteins maintain repression on key developmental genes to preserve cell fates. It is unknown on how PcG-mediated repressive chromatin is inherited across cell cycles. This project aims to study the chromatin-binding profile of PcG proteins and their cognate histone mark (H3K27me3) in mitosis. We observed that Polycomb (Pc) were dissociated from chromosomes during mitosis and reassociation begins from late anaphase onwards. In contrary, Ph, PSC and high level of H3K27me3 were detected on mitotic chromosomes. Importantly, drug-inhibition of Aurora B and hence depletion of H3S28ph retained Pc on mitotic chromosomes. To further understand how mitotic H3S28ph affects PcG proteins binding profile, a FACS-sorting protocol was optimized to isolate mitotic cells for ChIP-seq analyses. In parallel, Drosophila model of histone mutants (H3K27R and H3S28A) were established to assess the importance of these modifications on PcG-mediated epigenetics inheritance across mitoses.

Les protéines du groupe Polycomb sont des régulateurs épigénétiques impliqués dans divers processus développementaux et cellulaires. Le complexe Polycomb Répressif 1 (PRC1) est bien caractérisé chez les animaux, cependant sa composition et sa fonction restent énigmatiques dans les plantes. Sur base d'homologie de séquences trois homologues de la sous-unité de base BMI1 du complexe PRC1 animal ont été identifiés dans Arabidopsis: AtBMI1a, AtBMI1b et AtBMI1c. L'interaction de ces trois protéines avec les composantes PRC1 connues (i.e. AtRING1ab, et LHP1) a été démontrée. Des analyses génétiques et moléculaires ont permis d'attribuer aux protéines AtBMI1ab et AtRING1ab un rôle essentiel dans la répression des caractères embryonnaire lors de la croissance végétative. Un nouvel interactant d'AtRING1a, une protéine à domaine PHD de la famille AL (Alfine-Like) a été identifiée dans criblage d'une banque de ADNc. Par différentes techniques l'association entre les protéines de la famille AL et les membres de bases du complexe PRC1 (i.e. AtBMI1ab, AtRING1ab et LHP1) a été démontrée. Les protéines AL sont nucléaires et se lient in vitro à H3k4me3, une marque active de la chromatine. Des analyses génétiques ont révélé que les protéines AL et AtBMI1ab régulent la germination en réprimant l'expression de gènes impliqués dans le développement de la graine. Au niveau chromatinien, les protéines PRC1 interviennent dans la transition d'une chromatine active, marquée par du H3K4me3 vers une chromatine répressive enrichie en H3K27me3. Nous proposons que les protéines AL reconnaissent la marque active et recrutent la fonction répressive des protéines à domaine RING du complexe PRC1 afin d'induire la répression transcriptionelle. / Polycomb group (PcG) proteins are critical epigenetic repressors implicated in various developmental and cellular processes. While the Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) is evolutionary conserved and its functions extensively studied in Arabidopsis, the PRC1 complex composition and function remain still enigmatic in plants. Our work focuses on several Arabidopsis RING-domain proteins to unravel PRC1-like functions in the regulation of various processes during plant development. Based on sequence similarity we identified three homologues of the animal PRC1 core subunit BMI1: AtBMI1a, AtBMI1b and AtBMI1c. These proteins were found to interact with other PRC1-like components, AtRING1a, AtRING1b and LHP1. Genetic and molecular analyses demonstrated that AtBMI1a/b and AtRING1a/b play crucial roles in stable repression of embryonic traits to allow proper somatic growth. Comparative transcriptome analyses were performed to uncover genetic networks underlying seedling growth and the flower development defects of several different PRC1-like and PRC2 Arabidopsis mutants. Our data revealed overlapping and non-overlapping gene categories of misregulated genes in Atring1a/b, Atbmi1a/b and lhp1 mutants. The Atring1a/b mutant showed particular disturbed expression of flower developmental genes. Accordingly, phenotypic and molecular analyses of the mutant flowers confirmed that AtRING1a/b play a critical role in cell fate determination and in different aspects of flower development. To better understand the broad function of AtRING1a/b, we performed yeast two-hybrid screen and identified PHD-domain proteins of the ALFIN-LIKE (AL) family as binding partners. In vitro AL proteins bind the active mark for gene transcription, H3K4me3. By various methods, both in vitro and in planta, we provided strong evidence for the physical interaction between AL and PRC1 RING-domain proteins. We uncovered that al6/7 similar to Atbmi1a/b mutants exhibit seed germination defects, which are associated with the derepression of several seed related genes. Consistently on the corresponding chromatin a delay of the remodeling from active H3K4me3 labeled to a repressive H3K27me3 marked chromatin could be detected. We propose that through binding to H3K4me3 AL6/7 function as scaffold proteins to target PRC1 RING-domain proteins to active chromatin in order to establish gene silencing. Taken together, the presented work contributes significantly to the knowledge of PRC1 complex(es) in Arabidopsis at both biological function and complex composition levels. It opens several exciting perspectives for future research in the field.

BAP1 est un suppresseur de tumeurs dont le nombre de partenaires protéiques rend complexe l'appréhension de son rôle dans la cellule. Chez la Drosophile, BAP1 et ASX forment le complexe Polycomb PR-DUB, qui déubiquitine l'histone H2A sur la lysine 119 afin de maintenir une répression transcriptionnelle sur ses gènes cibles. Comprendre les mécanismes de régulation de BAP1 et définir son implication au sein de la machinerie Polycomb s'avèrent donc des enjeux cruciaux pour mieux appréhender son rôle au cours de la tumorigenèse. Par des approches biochimiques, nous avons montré l'existence de plusieurs complexes fonctionnellement distincts associés à BAP1. ASXL1 semble ainsi nécessaire à l'activité H2A deubiquitinase de BAP1, tandis qu'ASXL2 forme un complexe ternaire avec BAP1 et la déméthylase d'histones KDM1B. Par ailleurs, nous avons démontré le potentiel de répresseur transcriptionnel de BAP1, qui semble posséder différents domaines répresseurs. Afin d'étudier ces aspects à l'échelle du génome, des analyses du transcriptome et de différentes marques d'histone sont en cours, dans des cellules sauvages ou mutées pour différents membres de la famille Polycomb. Dans un deuxième temps, nous avons entrepris une recherche exhaustive des substrats de BAP1. Nos résultats préliminaires suggèrent que non seulement H2A mais également H2B sont des cibles de BAP1, de même qu'un complexe protéique responsable du contrôle de la prolifération cellulaire via la régulation post-transcriptionnelle de plusieurs cyclines. Ces observations ouvrent la voie à plusieurs projets qui pourraient contribuer à expliquer les conséquences des mutations de BAP1 dans le processus tumoral. / BAP1 is as a tumor suppressor that associates to a variety of protein partners, thereby limiting the comprehension of its cellular functions. In Drosophila, BAP1 binds ASX to form the Polycomb PR-DUB complex, which deubiquitinates histone H2A on lysine 119 in order to maintain transcriptional repression on its target genes. Describing BAP1 mechanisms of action and defining how BAP1 cooperates with the Polycomb machinery are prerequisites to understand its role during tumorigenesis. Using a biochemical approach, we described the existence of several distinct subcomplexes associated with BAP1. Therefore, ASXL1 seems required for H2A deubiquitination, while ASXL2 forms a ternary complex of unknown function with BAP1 and the histone demethylase KDM1B. In addition, we demonstrated the transcriptional repressor function of BAP1, which possess several repressive domains. In addition, we are currently performing transcriptomic analysis combined with genome-wide mapping of different histone marks. These last analyses are performed in wild type cells or deficient in PR-DUB or other Polycomb components, which will help us to understand how BAP1 fits within the Polycomb machinery. In parallel, we engaged a comprehensive study aiming at the identification of new BAP1 substrates. Our preliminary results suggest that not only H2A but also H2B may be direct substrates of BAP1. In addition, we identified as a potential substrate the HNRNPM-IMP3 complex, which controls cell proliferation via post-transcriptional regulation of several cyclins. These observations pave the way for new projects that may contribute to explain the consequences of BAP1 mutations in cancer development.