Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-07-25T15:23:31Z No. of bitstreams: 1 Rafael Soares dos Anjos.pdf: 731600 bytes, checksum: 7d6737e5dd35933a588f91ac8e29789d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-25T15:23:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rafael Soares dos Anjos.pdf: 731600 bytes, checksum: 7d6737e5dd35933a588f91ac8e29789d (MD5) Previous issue date: 2014-02-26 / In vitro production of bovine embryos (IVP) is a tool that serves to increase reproductive potential of females considered exceptional, especially, as an instrument to accelerate the progress of animal selection programs. In order to improve results, exogenous synthetic hormones are being used routinely in the animal reproduction industry. Currently there is a research using recombinant bovine somatotropin (rbST), as a substance that causes the increase in receptors for insulin-like growth factor (IGF). Both IGFs type I and type II and its receptors (IGF-IR and IGF-IIR) are expressed in in vitro produced bovine and ovine oocytes and embryos from which one can prove the close relation of IGF system with the IVP. Researches have proven a trend in oocyte quality improvement in animals treated with rbST, as well as increased fertilization rate and embryo quality improvement. This experiment aimed to study the effect of rbST on quantity and quality of in vivo aspirated oocytes, embryo production and gene expression of IGF-I and IGF-II in vitro produced embryos of bovine females of Nelore breed. Five cows were treated with two administrations of 2mL of saline solution as a placebo, with an interval of 14 days between them, being the first administration performed 19 and the second 5 days before follicular aspirations; 30 days after these aspirations, in crossover system, same protocol was used in these five animals being, in this case, the saline solution replaced by 500mg of rbST in order to compare treatments. It was held to IVP of oocytes recovered from this research, being all the steps that involve this process evaluated with subsequent achievement of polymerase chain reactions in real time (qPCRs) for gene expression of IGF-I and IGF-II in the blastocysts produced in the experiment. No difference was observed on quantity and quality of aspirated oocytes in vivo, embryo production and gene expression of IGF-I and IGF-II in vitro produced embryos of bovine females of Nelore breed under the influence of rbST. / A produção in vitro de embriões (PIVE) bovinos constitui-se em uma ferramenta que serve para aumentar o potencial reprodutivo de fêmeas consideradas excepcionais, principalmente, como instrumento para acelerar o progresso dos programas de seleção animal. Com o intuito de melhorar taxas e índices, sintéticos exógenos vêm sendo utilizados corriqueiramente na área da reprodução animal. Pesquisa-se atualmente a utilização da somatotropina recombinante bovina (rbST), tida como substância que acarreta o aumento de receptores para o fator de crescimento semelhante à insulina (IGF). Tanto os IGFs tipos I e II como seus receptores (IGF-IR e IGF-IIR) são expressos em oócitos e embriões bovinos e ovinos produzidos in vitro - o que pode comprovar a relação do sistema IGF com a PIVE. Estudos tem comprovado tendência em melhora da qualidade oocitária nos animais tratados com rbST, bem como aumento da taxa de fecundação e melhoria na qualidade de embriões. Este experimento objetivou estudar a influência da rbST sobre a quantidade e qualidade de oócitos aspirados in vivo, produção embrionária e expressão gênica de IGF-I e IGF-II em embriões produzidos in vitro de fêmeas bovinas da raça Nelore. Cinco vacas foram tratadas com duas administrações de 2mL de solução salina como placebo, com intervalo de catorze dias entre elas, sendo a primeira administração realizada dezenove e a segunda cinco dias antes das aspirações foliculares; decorridos trintas dias após estas aspirações, em sistema crossover, o mesmo protocolo foi utilizado nesses cinco animais sendo, neste caso, a solução salina substituída por 500mg de rbST, com o intuito de efetuar-se comparações entre os tratamentos. Realizou-se a PIVE a partir dos oócitos recuperados nesta pesquisa, sendo todas as etapas que envolvem este processo analisadas e com posterior realização de reações em cadeia da polimerase em tempo real (qPCRs) para expressões gênicas de IGF-I e IGF-II nos blastocistos produzidos. Observou-se que a rbST não exerceu influência significativa sobre a quantidade e qualidade de oócitos aspirados in vivo, produção embrionária e expressão gênica de IGF-I e IGF-II em embriões produzidos in vitro de fêmeas bovinas da raça Nelore.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-02-15T16:26:17Z No. of bitstreams: 1 joaogabrielvianadegrazia.pdf: 1482516 bytes, checksum: cb92ddb43d93af9c01680b364e327797 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-02-26T12:26:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 joaogabrielvianadegrazia.pdf: 1482516 bytes, checksum: cb92ddb43d93af9c01680b364e327797 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-26T12:26:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 joaogabrielvianadegrazia.pdf: 1482516 bytes, checksum: cb92ddb43d93af9c01680b364e327797 (MD5) Previous issue date: 2014-02-26 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Na última década a produção in vitro de embriões tornou-se uma técnica de grande importância na reprodução de bovinos. No gado de leite, ela tem sido bastante utilizada com destaque para as raças Gir e Holandesa. Dentre outras características, essas duas raças apresentam diferenças relacionadas à fisiologia reprodutiva, com reflexo no potencial de produção de embriões no sistema in vitro. Sabendo da importância de ambas as raças para o rebanho brasileiro, é primordial entender as bases fisiológicas destas diferenças e buscar ferramentas para avaliação da qualidade e viabilidade de oócitos e embriões. O objetivo desse trabalho foi caracterizar o fenótipo “doadora” com base na produção de embriões e avaliar alguns genes como possíveis marcadores de produção nestas raças. Para isso, inicialmente foram analisados dados de um laboratório comercial de produção in vitro de embriões. Posteriormente, foi realizada a caracterização molecular e avaliação da expressão relativa de genes candidatos, utilizando-se a técnica de PCR em Tempo-Real, em amostras de células da granulosa cultivadas provenientes de animais com diferentes perfis de produção de embriões. Uma maior produção de complexos cumulus-oócito (COC) total e viáveis foi observado em doadoras da raça Gir. Da mesma forma, animais da raça Gir apresentavam maior taxa de conversão e maior produção total de embriões, independente da raça do touro utilizado para fertilização. Entretanto, nas duas raças não houve diferença na produção de COC entre animais com diferentes taxas de conversão COC/embrião. Não houve diferença nas expressão dos genes (BAX, INHA, IGFIR, LHR, STAR) entre animais com alta ou baixa produção de embriões, assim como entre raças. No entanto, o gene PRDX1 estava sobre-expresso em doadoras da raça Holandesa caracterizadas como de alta produção de embriões. Esses resultados confirmam a maior produção de COC em animais da raça Gir, quando comparados aos animais da raça Holandesa, assim como, a maior produção total de embriões no sistema in vitro, mas sugerem que nas duas raças a eficiência na produção de embriões não é determinada pela produção total de COC. A avaliação da expressão gênica de células da granulosa obtidas de cultivos para a produção in vitro de embriões não possibilitou a caracterização de marcadores com potencial para predição da produção de embriões das doadoras. / In the last years the in vitro production of embryos became a technique of great importance in the reproduction of cattle. In the dairy cattle, it has been widely used with spotlight for the Gyr and Holstein breeds. Among other features, this two breeds exhibit differences related to reproductive physiology and reflects on the potential of production of embryos in the system in vitro. Knowing the importance of both breed for the Brazilian herd, it is critical to understand the physiological basis of these differences and search tools to evaluate the quality and viability of oocytes and embryos. The aim of this study was to characterize the phenotype "donor" based on embryo production and evaluate some genes as potential markers for production in these breeds. To do this initially, data from in vitro production of embryos from a commercial laboratory were analyzed. Subsequently, the molecular characterization and evaluation of the relative expression of candidate genes was performed in samples of granulosa cells from culture of animals with different profiles of production embryos using the Real-time PCR. A higher production of total and viable oocyte-cumulus complexes (COC) was observed in donor Gyr. Likewise, animals Gyr had a higher conversion rate and higher total production of embryos, independent of breed of sire used for fertilization. However, in the two breeds there was no difference in the production of COC between animals with different conversion rates COC / embryo. There was no differences in the expression of genes (BAX, INHA, IGFIR, LHR, STAR) between animals with high or low production of embryos, as well as between breeds. However, the PRDX1 gene was overexpressed in donor Holstein characterized as high production of embryos. These datas confirm the higher production of COC in Gyr breed animals when compared to Holstein cows, as well as the highest total production of embryos in vitro system, but suggest that the two breeds efficiency in the production of embryos is not determined by the total production of COC. The assessment of gene expression of granulosa cells obtained from cultures for in vitro production of embryos did not allow the characterization of potential markers for predicting embryo production of donors.

Submitted by Amauri Alves (amauri.alves@ufv.br) on 2015-11-05T08:39:43Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 832338 bytes, checksum: d7be8073d4a572eea4ce99bab35dfe6b (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-05T08:39:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 832338 bytes, checksum: d7be8073d4a572eea4ce99bab35dfe6b (MD5) Previous issue date: 2015-02-03 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O presente estudo teve como objetivo a produção de proteína específica do oviduto de porcas para uso em meios de maturação in vitro (MIV). Avaliou-se o aumento da eficiência dos meios de MIV, para ovócitos de suíno, quando adicionados a melatonina ao meio, durante todo o processo de MIV, e a proteína específica do oviduto (pOSP), nas últimas quatro horas de maturação. Para aquisição da proteína, foram realizadas técnicas de transgenia, indução da expressão, purificação e dosagem da proteína. As características avaliadas foram: a expansão das células do cumulus compacto ooforus (CCOs), as concentrações intracelulares de espécies reativas de oxigênio (ROS) e desenvolvimento embrionário nos diferentes grupos experimentais (C = controle; T1 = somente com melatonina; T2 = com melatonina e proteína e T3 somente com proteína). As taxas de expansão do CCOs e de desenvolvimento embrionário foram analisadas pelo qui-quadrado (χ2) e a dosagem de ROS foi analisada pela ANOVA e teste de Duncan pelo programa estatístico SAEG 9.1 (SAEG-UFV, 2007) com probabilidade de erro de 5 %. A avaliação da produção de proteína recombinante foi feito por eletroforese e a dosagem, pelo método de Bradford. Em relação à expansão do CCOs, houve diferença (p<0,05) dos valores obtidos no grupo controle em relação aos valores médios dos grupos experimentais 1, 2 e 3, com os grupos experimentais mostrando resultados satisfatórios em relação ao controle, porém não houve diferença entre os valores dos grupos tratados (p>0,05). Na dosagem de ROS não houve diferença (p>0,05) entre os valores médios obtidos no grupo controle (26,4±10,9) e o valor médio verificado no grupo do tratamento 1 (23,4±7,8), porém no grupo do tratamento 2 (21,3±9,7) o valor médio mostrou-se satisfatório em relação ao valor médio do grupo controle. No entanto, o valor médio do tratamento 3 (16,6±10,5) foi o que mostrou o resultado mais satisfatório quando comparado aos demais tratamentos (p<0,05). A produção de embriões foi avaliada por meio da taxa de clivagem, não houve diferença (p>0,05) entre os valores obtidos no grupo controle (48,9 %) e os valores verificados nos grupos de tratamento 1 (51,5 %), tratamento 2 (50 %), tratamento 3 (57,7 %), e nem destes entre si. Conclui-se que a proteína específica do ixoviduto recombinante (pOSP) e a melatonina foram eficientes em melhorar a expansão das células do CCOs. Além disso, as células tratadas com pOSP mostraram-se com menor quantidade de ROS, podendo a pOSP ser considerada um antioxidante proteico. / The present study aimed the production of oviduct specific protein (pOSP) for its use on in vitro maturation (IVM). The increase on the efficiency of IVM was evaluated, for porcine oocytes, when melatonin is added to the environment, during the entire IVM process, and when the pOSP is added in the last four hours of maturation. In order to acquire the protein, transgenic techniques, induction of the expression, purification and determination of protein were used. The expansion of cumulus compact oophorus (CCOs), intracellular concentrations of reactive oxygen species (ROS) and embryonic development in the different experimental groups were evaluated (C = control; T1 = melatonin only; T2 = melatonin and pOSP and T3 = pOSP only). The CCOs growth rates and embryonic development were analyzed by the chi-squared test (χ2) and the ROS dosage was analyzed by ANOVA and by the Duncan Test, using the statistical program SAEG 9.1 (SAEG-UFV, 2007) with a 5% probability of error. The evaluation of the production of recombinant protein was done through electrophoresis, and the dosage was done by using the Bradford Method. Regarding the expansion of CCOs, there was a difference (p<0.05) on the values obtained in the control group in relation to the average values of the treatment group 1, 2 and 3, with the experimental groups showing satisfactory results compared with the control, however, there was no difference between treatments (p>0,05). In the ROS dosage, there was no difference between the mean values obtained in the control group (26.4 ± 10.9) and the average value observed in the treatment group 1 (23.4 ± 7.8). However, in the treatment group 2 (21.3 ± 9.7), the average value was found to be satisfactory in relation the average of the control group. Despite that, the average value of treatment 3 (16.6 ± 10.5) was found that the most satisfactory result compared to the other treatments (p <0.05). The production of embryos was evaluated by cleavage rate and there was no difference (p> 0.05) between the values obtained in the control group (48.9%) and the values that were verified in treatment groups of numbers 1 (51.5%), 2 (50%), 3 (57.7%), and neither of these with each other. This study showed that the pOSP and the melatonin xiwere effective in the improvement of the expansion of CCOs. In addition, the cells that were treated with pOSP presented less amount of ROS, allowing the pOSP to be considered a proteic antioxidant.

Os programas de melhoramento genético objetivam a seleção de animais geneticamente e fenotipicamente superiores. Dentre as características selecionadas para aumentar o ganho genético do rebanho, o perímetro escrotal destaca-se por sua alta herdabilidade e correlação com precocidade sexual, peso do animal e morfologia espermática. A seleção fenotípica para perímetro escrotal pode ser auxiliada pela junção da DEP PE 365 (diferença esperada na progênie para perímetro escrotal aos 365 dias) com a biotecnologia reprodutiva PIVE (produção in vitro de embriões), e tecnologias moleculares como o uso de marcadores do tipo SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) e marcadores bioquímicos (proteínas). Desta forma, o presente trabalho teve por objetivo: verificar se os SNPs presentes nos genes atuantes na maturação sexual B4GALT1 (Beta 1,4- galactosyltransferase), FSHR (Follicle-stimulating hormone), LHR (Luteinizing hormone receptor) e IGF2 (Insulin-like growth factor 2) podem estar associados a maiores valores de DEP PE 365 em touros da raça Nelore; fazer o estudo global de proteínas no sêmen de touros da raça Nelore que possam ser indicativas de maior DEP PE 365 e verificar se a DEP PE 365 interfere negativamente ou positivamente nos resultados da PIVE. Para as análises de SNP, 178 touros foram divididos em dois grupos, sendo um com 104 animais de DEP PE 365 negativa e outro com 74 animais com DEP positiva. O DNA foi extraído do sangue destes animais e a região genômica de interesse foi amplificada e analisada por RFLP (restriction fragment lengh polymorphism). No caso da proteômica, dois pools de sêmen foram comparados entre si quanto aos seus perfis protéicos por LCMS (Liquid chromatographymass spectrometry): um proveninete de três touros que produzem em média 17,6% de embriões/oócito in vitro e DEP PE 365 média de -0,3 (inferiores) e outro pool proveniente de três touros que produzem em média 34,25% de embriões/oócito, com DEP PE 365 média de 1,07 (superiores). Para verificar se a DEP PE 365 de touros utilizados na PIVE influencia na quantidade e cinética de embriões produzidos, 48 touros foram divididos em três grupos (superior, neutro e inferior) por meio da amplitude total de suas DEPs PE 365 e então utilizados na PIVE. Então, observou-se a quantidade e os tipos de blastocistos gerados por cada um dos grupos. Os resultados do presente trabalho mostraram: o genótipo CC no SNP analisado no gene LHR, e o genótipo TT no SNP analisado no gene IGF2 podem estar relacionados a animais de maiores DEP PE 365 (p 0.05); proteínas envolvidas em vias metabólicas foram predominantes no grupo dos touros superiores e portanto podem ser prováveis marcadores bioquímicos de reprodutores com maiores DEP PE 365; touros com maiores DEPs PE 365 resultam na maior PIV de embriões favoráveis para serem transferidos para vacas receptoras (Bl e Bx; blastocisto e blastocisto expandido; p 0.05). Tais resultados apresentam informações que podem auxiliar na seleção de animais com melhores dados fenotípicos de DEP PE 365 e, portanto, melhores reprodutores. / The breeding programs aim the selection of phenotypically and genetically superior animals . Among the selected characteristics to increase genetic gain in the herd, scrotal circumference stands out for its high heritability and correlation with sexual precocity, animal weight and morphology . Phenotypic selection for scrotal circumference may be aided by the addition of EPD SC 365 (expected progeny difference for scrotal circumference at 365 days ) to IVPE (in vitro production of embryos) reproductive biotechnology and molecular technologies such as the use of molecular markers like SNPs (Single Nucleotide Polymorphism ) and biochemical markers (proteins). Thus, this study aimed to: determine whether the SNPs present in genes B4GALT1 (Beta 1,4 - galactosyltransferase), FSHR (Follicle - stimulating hormone), LHR (Luteinizing hormone receptor) and IGF2 (Insulin- like growth factor 2) may be associated with higher values of EPD SC 365 in Nelore bulls; make global study of proteins in semen from Nelore bulls that may be indicative of greater EPD SC 365 and check if EPD SC 365 interferes negatively or positively on the results of IVPE. For the analysis of SNP, 178 bulls were divided into two groups, one with 104 animals of 365 negative EPD SC 365 and another with 74 animals with positive EPD SC 365. DNA was extracted from blood of these animals and genomic region of interest was amplified and analyzed by RFLP (restriction fragment polymorphism lengh). In the case of proteomics, two pools of semen were compared in respect to their protein profiles by LCMS (Liquid chromatography - mass spectrometry): One from three bulls that produce on average 17.6 % of in vitro embryo/oocyte and with EPD SC 365 average -0.3 (lower) and another pool from three bulls that produce on average 34.25% of in vitro embryo/oocyte with EPD SC 365 average of 1.07 (upper). To check if EPD SC 365 bulls used in IVPE influences the amount and kinetics of embryos, 48 bulls were divided into three groups (upper, lower and neutral ) through the full range of their EPDs SC 365 and then used in IVPE. Then, it was observed the amount and types of blastocysts generated by each group. The results of this study showed: the CC genotype at SNP analyzed in LHR gene, and the TT genotype at SNP analyzed in the IGF2 gene may be related to larger EPD SC 365 animals (p 0.05); proteins involved in metabolic pathways were predominant in group of senior bulls and can therefore be likely biochemical markers of breeding with larger EPD SC 365; bulls with larger EPD SC 365 used in IVPE result in greater favor of embryos to be transferred to recipient cows (Bl and Bx; blastocyst and expanded blastocyst, p 0:05). These results provide information that can assist in the selection of animals with improved phenotypic data EPS SC 365 and, therefore, the best breeders.

Os resultados da produção in vitro de embriões (PIVE) sofrem variações que podem ser decorrentes do efeito do touro utilizado. Fatores paternos afetam o desenvolvimento embrionário desde as primeiras clivagens até após a ativação do genoma embrionário (AGE). Pouco se sabe sobre os mecanismos que promovem a diferença de fertilidade in vitro entre touros, muito menos as consequências no desenvolvimento do embrião. Por tanto, o objetivo do presente trabalho foi identificar o momento em que ocorre divergência entre embriões oriundos de touros com diferença de fertilidade e as causas para tal divergência. Para isto, 10 touros (Alta fertilidade, AF, n=5, Baixa fertilidade, BF n=5) foram retrospectivamente selecionados a partir de um banco de dados de 3 anos de um laboratório comercial de PIVE, com aproximadamente 140 touros, baseados nas taxas de desenvolvimento embrionário (taxa de blastocistos/taxa de clivagem). Embriões produzidos com o sêmen de cada um dos touros foram avaliados e classificados de acordo com o estágio de desenvolvimento (não clivados, 2 células, 3-4 células, 6 células, 8 células) às 24, 36, 48, 60, 72 horas pós inseminação (hpi) para estabelecer a cinética de desenvolvimento embrionário. A avaliação da taxa de fecundação foi feita a partir da contagem dos pronucleos, a taxa de clivagem foi realizada no dia 3 (D3) de cultivo in vitro, e as taxas de desenvolvimento embrionário e a taxa de blastocisto (Grau I e Grau II, GI e GII respectivamente) foram avaliadas no dia 7 (D7). Embriões no estágio de 8 células e blastocistos foram coletados de cada touro e manipulação para avaliação da abundância de 96 transcritos. Além disso, blastocistos foram avaliados quanto a contagem total de células e a fragmentação de DNA (TUNEL). Não foram encontradas diferenças em relação à cinética de desenvolvimento nos momentos observados (p&gt;0,05), nem na taxa de clivagem (AF=86,7%; BF= 84,9%; p= 0,25), entretanto, o grupo de alta fertilidade apresentou maior taxa de fecundação (72%) do grupo de baixa (62%) e também menor taxa de poliespermia (AF=16,2% BF=29,2%). Como esperado, a taxa de blastocisto (AF=29,4%; BF= 16,0%; p&lt;0,0001), e a taxa de desenvolvimento embrionário (AF=33,9 % BF= 18,9%; p&lt;0,0001) foram maiores no grupo de alta fertilidade. No estágio de oito células, 30 transcritos foram diferencialmente representados entre os grupos experimentais (p&lt;0,10). Apenas PGK1, PPIA e TFAM tiveram maior representação no grupo de alta fertilidade. Genes relacionados a estresse embrionário (9/27, 33%), proliferação celular (8/27, 30 %), metabolismo lipídico (6/27, 22%), e outras funções celulares (4/27, 15%) foram mais representados no grupo de baixa fertilidade. Blastocistos apresentaram apenas 12 genes diferencialmente representados (p&lt;0,10), sendo apenas ACSL3, ELOV1, IFNT mais representados no grupo de alta fertilidade. Não foram encontradas diferenças entre os grupos na contagem de células totais, fragmentação de DNA ou porcentagem de blastocistos GI (p&lt;0,05). Os resultados demonstraram que mesmo não sendo observados efeitos paternos na cinética embrionária inicial, a fertilidade in vitro dos touros influencia a abundância de transcritos no estágio de oito células e blastocisto, sendo desde último, em menor proporção. Um aumento da representação de genes relacionados a estresse oxidativo e apoptose no momento de AGE sugere que o desenvolvimento do embrião é prejudicado no grupo de baixa fertilidade, consequentemente resultando em uma menor taxa de blastocistos. / The use of different sires influences in vitro embryo production (IVP) outcome. Paternal effects are observed from the first cleavages until after embryonic genome activation (EGA). Little is known about the mechanisms that promote in vitro fertility differences, even less about the consequences on embryo development. Therefore, the objective of the present work was to identify divergence moment between embryos from high and low fertility bulls and identify the causes for this divergency. For that, ten bulls were retrospectively selected in high (HF; n=5) and low (LF; n=5) in vitro fertility from a database of approximately 140 bulls used in commercial IVP ranked based on embryo development rate (blastocyst/cleaved rate). IVP embryos from 5 manipulations were classified by their stage of development (2 cell, 3-4 cell, 6 cell, 8 cell), at 24, 36, 48, 60, 72 hpi, to evaluate embryo kinetics. Pronuclei were evaluated 24 hpi, cleavage rate was assessed on day 3 (D3) of in vitro culture, development rate and blastocyst rate (Grade I and II) were assessed on day 7 (D7). Abundance of 96 transcripts was analyzed in embryos at 8-cell stage and blastocysts from each bull and each manipulation. Total cell counting, and DNA fragmentation were assessed on blastocysts as well. There was no difference in early embryo kinetics (p&gt;0.05), and cleavage rate (HF=86.7%; LF= 84.9%; p= 0.25). However, fertilization rate was higher on high fertility group (72%) than low fertility (62%) and polyspermy rate was lower on high fertility compared to low fertility group (HF:16,2% LF:29,2%). As expected, blastocyst rate (HF=29.4%; LF= 16.0%; p&lt;0.0001) and development rate (HF=33.9 % LF= 18.9%; p&lt;0.0001) were higher in the high fertility group than in the low fertility. At 8 cell stage, 30 transcripts were differentially represented (p&lt;0.10) between the two groups. Only PGK1, PPIA and TFAM levels were higher in high fertility group. Stress related genes (9/27, 33%), cell proliferation (8/27, 30 %), lipid metabolism genes (6/27, 22%), and other cellular functions (4/27, 15%) were highly expressed on low fertility embryos. Blastocysts had only 12 differentially represented transcripts (plt;0.10); only ACSL3, ELOV1 and IFNT were higher in high fertility. Lipid metabolism genes (3/9, 33%) and other cellular functions (6/9, 67%) were higher in low fertility group. Results demonstrate that although there was no paternal effect on early in vitro embryo kinetics, sire in vitro fertility influences the content of transcripts at 8-cell stage and at blastocyst stage, but at a lower extent. An increase in apoptotic and oxidative stress genes at EGA stage suggest that embryo development is impaired in LF group causing reduction of blastocyst rate.

Dentre as tecnologias de reprodução assistida (TRAs), a produção in vitro de embriões (PIVE) bovinos é a mais amplamente estudada, além de possuir um grande interesse econômico. Entretanto, existem fatores que influenciam negativamente a taxa de produção embrionária e o sucesso da gestação. Sabe-se que embriões provenientes das TRAs apresentam frequentemente alterações epigenéticas, relacionadas principalmente ao microambiente no qual os gametas e embriões se desenvolvem. A suplementação com ácido fólico parece prevenir tais erros epigenéticos, visto que além de ser um importante composto vitamínico, ele pode atuar como doador de grupamentos metil e possui ação antioxidante. A adição de ácido fólico durante a maturação oocitária parece influenciar positivamente a PIVE, além de existir evidências de que ele possa alterar os níveis de metilação do DNA e a expressão de genes importantes ao desenvolvimento embrionário. Sendo assim, este trabalho teve como objetivo, avaliar a influência de diferentes concentrações de ácido fólico durante a maturação in vitro (MIV) de oócitos de diferentes qualidades (graus I e III) na produção embrionária e na expressão dos genes IGF2 e LIT1 em blastocistos bovinos. Para tanto, três diferentes concentrações de ácido fólico (10, 30 e 100µM) foram avaliadas durante a MIV, em que 2159 oócitos (1087 oócitos grau I e 1072 oócitos grau III) foram maturados, fertilizados e cultivados por sete dias. Os blastocistos foram avaliados quanto à (1) taxa de produção nos diferentes tratamentos e origem dos oócitos e (2) a expressão dos genes IGF2 e LIT1 foi investigada utilizando a transcrição reversa associada a PCR quantitativa. A análise estatística foi realizada através do teste t de Student. A avaliação da produção embrionária mostrou que a adição de 10µM de ácido fólico influencia positivamente a produção de embriões provenientes de oócitos grau III (p=0,017), enquanto em embriões provenientes de oócitos grau III não foi observada influência. O segundo tratamento mostrou que a adição de 30µM de ácido fólico parece não influenciar tanto embriões provenientes de oócitos grau I quanto grau III. Por outro lado, a adição de 100µM de ácido fólico prejudica o desenvolvimento de embriões provenientes de oócitos grau I (p=0,043), mas parece não influenciar os embriões provenientes de oócitos grau III. Quando avaliada a expressão gênica, o gene IGF2 foi expresso em 25% das amostras, sendo que, com exceção de uma amostra, todas eram provenientes de oócitos grau I. Apesar do gene LIT1 ser expresso em todas as amostras analisadas, não foram observadas diferenças entre os embriões cujos oócitos foram maturados na ausência ou na presença de ácido fólico, independente da concentração adicionada ou origem oocitária (graus I ou III). A adição de ácido fólico durante a maturação de oócitos bovinos parece ser interessante para a PIVE. No entanto, a concentração e a qualidade oocitária parecem ser fatores importantes para a produção embrionária, visto que menores concentrações favorecem oócitos de baixa qualidade enquanto que maiores concentrações prejudicam oócitos de maior qualidade. Por fim, as alterações na produção embrionária devido à adição de ácido fólico parecem não estar relacionada com os níveis de expressão dos genes IGF2 e LIT1. / Among assisted reproductive Technologies (ARTs), in vitro production (IVP) of bovine embryos is the most studied, besides exist a great economic interest. However, there are many factors that negatively influences production rates and pregnancy success. It\'s know that embryos produced by ARTs frequently present epigenetics alterations, related, specially, to the microenvironment where occurs the development of gametes and embryos. Supplementation with folic acid seems to prevent these epigenetics damages, since it is an important component and may act like a methyl donor and has antioxidant action. Folic acid addition during oocitary maturation seems to positively influences embryos IVP, in addition there are evidences that it may alter DNA methylation levels and expression of important genes during embryo development. Thus, this paper had as objective; evaluate different concentrations of folic acid during in vitro maturation (IVM) of different bovine oocytes (Grade I and III) on the embryo production and expression of IGF2 and LIT1 gene in the bovine blastocyst. For this purpose, three different folic acid concentrations (10, 30, and 100µM) were evaluated during IVM, when 2159 oocytes (1087 grade I and 1072 grade III) were matured, fertilized and cultured during seven days. Blastocysts were evaluated for (1) production rates in different treatments and oocyte type and (2) expression of IGF2 and LIT1 was investigated using quantitative reverse transcription PCR. Statistical analysis was realized using student t test. Embryo production analysis revealed that addition of 10µM of folic acid positively influences production of embryos from oocytes grade III (p=0,017), whereas in embryos from oocytes grade I this influence wasn\'t observed. The second treatment showed that 30µM of folic acid didn\'t influence both embryos from oocytes grade I and embryos from oocytes grade III. On the other hand, addition of 100µM of folic acid damages the development of embryos provide from oocytes grade I (p=0,043), but this wasn\'t observed in embryos provide from oocytes grade III. When evaluated gene expression, IGF2 gene were expressed in 25% of all samples, being that, with exception of one sample, all of them were embryos from oocytes grade I. Despite LIT1 expression were detected in all samples, wasn\'t observed statistical difference between embryos whose oocytes were matured in the absence or presence of folic acid, independent of concentration added or oocytes types (grades I ou III). Folic acid addition during bovine oocytes maturation seems to be interesting to embryo IVP. However, folic acid concentration and oocyte quality seems to be important factors to embryo production, since lower concentration its beneficial for lower quality oocytes, while higher folic acid concentration damage better oocytes. Finally, embryos production rates alterations due folic acid addition appears to be unrelated with expression levels of IGF2 and LIT1.

Avaliou-se neste estudo o efeito do tratamento com somatotrofina recombinante bovina (bST) na população folicular, na taxa de recuperação e qualidade dos oócitos e na produção in vitro de embriões bubalinos. A hipótese foi de que o bST aumenta o número de folículos recrutados e a qualidade oocitária, melhorando a eficiência da técnica de aspiração folicular em fêmeas bubalinas. Foram utilizadas 10 novilhas bubalinas, sendo que o grupo bST (n=5) recebeu 500mg de bST em intervalos regulares, enquanto o grupo Controle (n=5) não recebeu tratamento adicional. Ambos os grupos foram submetidos a 10 sessões de aspiração duas vezes por semana. Foram quantificados o número total de folículos e o tamanho destes a cada sessão. Os oócitos recuperados foram quantificados e classificados de acordo com a sua qualidade (A, B, C, D, E), sendo os A+B+C considerados de boa qualidade. Os embriões produzidos foram vitrificados, e uma parte destes, transferidos em tempo fixo. Foram colhidas amostras de sangue para mensuração de IGF-I plasmático durante o estudo. O bST aumentou o número de folículos observados (12,2 vs. 8,7; p&lt;0,05) e o número de oócitos recuperados (5,2 vs. 4,1; p=0,07), no entanto não afetou a qualidade destes, bem como a sua capacidade de desenvolvimento (p&gt;0,05). Observou-se efeito significativo (p&lt;0,05) de sessão de aspiração no número de folículos observados, de folículos aspirados e de oócitos recuperados. As concentrações plasmáticas de IGF-I não apresentaram efeito de tratamento (p&gt;0,05), no entanto sofreram efeitos de sessão e também da interação entres sessão e tratamento (p&lt;0,05). Obteve-se taxa de concepção de 10,53 % (2/19) após a inovulação dos embriões, gerando o nascimento de dois bezerros normais. Os resultados são sugestivos de que o tratamento com bST aumenta o número de folículos recrutados por onda de crescimento folicular, demonstrando seu potencial em aumentar a eficiência da técnica de aspiração folicular na espécie bubalina / The aim of this experiment was evaluated the effect of recombinant bovine somatotropin (bST) on follicular population, oocyte recovery rates and quality, and on in vitro buffaloes embryo production. The hypothesis was that bST improves the number of follicles per follicular growth wave and oocyte quality, enhancing the results in buffalos females submitted to ovum pick-up programs. A total of ten heifers were assigned in two experimental groups (bST Group that received 500mg of bST in regular intervals and Control Group that did not received any additional treatment). Both groups were submitted to 10 OPU sessions twice weekly (every 3 or 4 days). The number of follicles and its diameters were recoded in all OPU. The oocytes harvest were counted and classified in five categories (A, B, C, D, E). The A+B+C categories were considered as good quality oocyte. The embryos produced were vitrified and some of these embryos were transferred of fixed time. Blood samples for IGF-I were obtained every once weekly. The bST improved the follicular population (12.2 vs. 8.7; p&lt;0.05) and the number of oocytes per session (5.2 vs. 4.1; p=0.07), however the treatment did not affect the oocyte quality and its in vitro development capacity (p&gt;0.05). A significant effect (p&lt;0.05) of OPU session was observed in follicular population, number of aspirated follicles and number of oocyte recovered. The plasma IGF-I was not affected (p&gt;0.05) by treatment, however presented a significant effect of OPU session and also of the treatment by OPU session interaction (p&lt;0.05). The conception rate was 10.5% (2/19) and two healthy and normal calves were born from transferred embryo. These results indicate the viability of bST treatment to improve the follicular recruitment and its potential application in buffaloes donors submitted to OPU programs

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:10Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-07-15Bitstream added on 2014-06-13T18:46:17Z : No. of bitstreams: 1 lucio_ac_dr_jabo.pdf: 8403632 bytes, checksum: 32d25390bda4a085595ac038827009d8 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O objetivo do presente estudo foi verificar se existem diferenças no desenvolvimento de embriões produzidos com sêmen sexado por centrifugação em gradiente de densidade e por citometria de fluxo e também quantificar a expressão relativa de genes importantes para o desenvolvimento embrionário. Após a sexagem os espermatozóides foram submetidos a produção de embriões in vitro. Foram avaliadas as taxas de clivagem e blastocisto para verificar a influência do método de sexagem no desenvolvimento in vitro de embriões. Os blastocistos foram coletados nos dias 7 e 8 de desenvolvimento, e submetidos a extração de RNA para a avaliação da expressão de genes relacionados a qualidade do embrião: AKR1B1, COX2, IGF2R, PLAC8 (desenvolvimento de placenta e reconhecimento da gestação), MnSOD e GPX1 (estresse oxidativo), SCL2A1 (metabolismo) e TP53 (apoptose). Os resultados não mostraram diferenças no desenvolvimento in vitro de embriões (taxas de clivagem e blastocisto) produzidos com sêmen sexado. Em relação ao padrão de expressão, a citometria de fluxo reduz os níveis de mRNA dos genes AKR1B1(P=0,023), COX2 (P=0,016). A centrifugação em gradiente de densidade aumentou os níveis de transcritos dos genes PLAC8 (P=0,007), MnSOD (P=0,013) e GLUT1 (P=0,028). Ambas as técnicas reduzem os níveis de expressão do gene TP53 (P<0,05). A técnica de sexagem por citometria de fluxo altera a expressão de genes envolvidos no processo de implantação, prejudicando o nascimento de uma cria viável. A sexagem produz embriões que não possuem alterações prejudiciais em genes envolvidos no reconhecimento da gestação e formação da placenta, os quais são muito importantes para o processo de implantação; aumenta o padrão de expressão dos genes envolvidos no processo de resposta da célula ao estresse... / The purpose of this work was evaluate differences on development of embryos produced in vitro using sorted semen by density gradient centrifugation and flow cytometry, and differences in relative abundance of important genes for embryo development. Cleavage and blastocyst rates were used to evaluate the influence of the sorting procedure on embryo development. Blastocysts of day 7 and 8 of development were collected, and expression levels quantification AKR1B1, COX2, IGF2R, PLAC8, MnSOD, GPX1, SCL2A1 and TP53, genes related to embryo quality were evaluated. The results showed no differences between the experimental groups in terms of embryo development (cleavage and blastocyst rates). In the expression pattern, flow citometry methodology reduced mRNA abundance of AKR1B1 (P=0.023) and COX2 (P=0.016). Density gradient centrifugation increased the transcripts levels of PLAC8 (P=0.007), MnSOD (P=0.013) and GLUT1 (P=0.028). Both sorting process reduced mRNA of TP53 (P<0.05). Flow citometry affects the expression pattern of genes involved in pregnancy recognition and placenta formation, resulting in poor quality embryo. Density gradient centrifugation methodology do not alter the expression of genes involved in embryo implantation, increases the expression pattern of genes related to oxidative response and metabolism, resulting in viable embryos. These results suggesting that density gradient centrifugation can be an alternative to flow citometry, for produce viable embryos

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA14MA159.pdf: 569478 bytes, checksum: ef21b44746ded4d4693eb2dc59f3084b (MD5) Previous issue date: 2014-12-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This study evaluated the relationship of nelore breed donor infected with bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1) and bovine viral diarrhea with in vitro and in vivo embryos and effects on conception rate of embryo recipients. The experiment was conducted in the municipality of Boca do Acre - AM (2013 to 2014). 150 cows were used as donors of embryos, which were mated with one of the same breed bull, Nelore, after aspiration of donors and subsequent in vitro production of embryos were transferred in to receptors, free of all pathogens in question. Follicular fluid samples from all donors were individually collected and evaluated for the presence of bovine herpesvirus type 1 and bovine viral diarrhea by PCR (polymerase chain reaction). Analyzing the data, there was a prevalence of 14% (&#61539;2 = 77.76; p<0,001) of donor infected with BoHV-1 virus compared to the evaluated cows (21/150). There was not found to be significant difference in the average production of oocytes (positive = 20,48 (430/21); negative = 19,38 (2500/129) (evaluation by the Kruskal-Wallis Test, k=0,0214, p=0,8837) and embryos (positive =7,67 (161/21), negative = 9,05 (1168/129) (k = 1,5238, p=0,217), between donor. Assessing the rate of conception between the receiver (N = 1329) in which embryos were transferred (n=161) derived from donors positive or not (n=1168), to bovine herpesvirus type 1. The receptors that received embryos from positive cows had a rate of pregnancy of 39,13% (63/161), while those who received negative embryo donors, had a rate of 44,95% (525/1168) did not differ significantly from each other, (&#61539;2=1,417, p=0,1635). These results do not support the hypothesis that oocytes from donors infected with BoHV-1 present a minor in vitro embryo development and a lower pregnancy rate when transferred to the recipient embryo / Este estudo avaliou a relação de doadoras da raça nelore infectadas pelo herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) e vírus da diarreia viral bovina com a produção in vitro e in vivo de embriões e efeitos sobre a taxa de concepção de receptoras de embriões. O experimento foi realizado no município de Boca do Acre - AM (2013 - 2014). Foram utilizadas 150 vacas doadoras de embriões, as quais foram acasaladas com um único touro da mesma raça, Nelore, após a aspiração folicular das doadoras e posterior produção in vitro dos embriões, estes foram transferidos em receptoras, sabidamente livre do patógeno em questão. Foram coletadas amostras de líquido folicular de todas as doadoras individualmente e avaliadas quanto a presença de BoHV-1 via PCR (reação da polimerase em cadeia). Analisando os dados, observou-se uma prevalência de 14% (&#61539;2=77,76; p<0,001) de doadoras portadoras do vírus do BoHV-1 em ralação as vacas avaliadas (21/150). Não foi encontrado diferença significativa na produção média de oócitos, (positivas=20,48 (430/21); negativas=19,38 (2500/129), (avaliação realizada pelo teste de Kruskal-Wallis Test, k=0,0214; p=0,8837) e de embriões (positivas=7,67 (161/21); negativas=9,05 (1168/129), (k=1,5238; p=0,217), entre as doadoras. Avaliando a taxa de concepção entre as receptoras (N=1329) nas quais foram transferidos embriões (n=161) oriundos de doadoras positivas ou não (n=1168), para BoHV-1. As receptoras que receberam embriões das vacas positivas tiveram uma taxa de prenhes de 39,13% (63/161), já as que receberam embriões de doadoras negativas, apresentaram uma taxa de 44,95% (525/1168), não diferindo significativamente entre si, (&#61539;2=1,9417, p=0,1635). Estes resultados não corroboram com a hipótese de que oócitos provenientes de doadoras infectadas pelo BoHV-1 apresentariam um menor desenvolvimento embrionário in vitro e uma menor taxa de prenhez quando da sua transferência para as receptoras de embriões

Avaliou-se neste estudo o efeito do tratamento com somatotrofina recombinante bovina (bST) na população folicular, na taxa de recuperação e qualidade dos oócitos e na produção in vitro de embriões bubalinos. A hipótese foi de que o bST aumenta o número de folículos recrutados e a qualidade oocitária, melhorando a eficiência da técnica de aspiração folicular em fêmeas bubalinas. Foram utilizadas 10 novilhas bubalinas, sendo que o grupo bST (n=5) recebeu 500mg de bST em intervalos regulares, enquanto o grupo Controle (n=5) não recebeu tratamento adicional. Ambos os grupos foram submetidos a 10 sessões de aspiração duas vezes por semana. Foram quantificados o número total de folículos e o tamanho destes a cada sessão. Os oócitos recuperados foram quantificados e classificados de acordo com a sua qualidade (A, B, C, D, E), sendo os A+B+C considerados de boa qualidade. Os embriões produzidos foram vitrificados, e uma parte destes, transferidos em tempo fixo. Foram colhidas amostras de sangue para mensuração de IGF-I plasmático durante o estudo. O bST aumentou o número de folículos observados (12,2 vs. 8,7; p&lt;0,05) e o número de oócitos recuperados (5,2 vs. 4,1; p=0,07), no entanto não afetou a qualidade destes, bem como a sua capacidade de desenvolvimento (p&gt;0,05). Observou-se efeito significativo (p&lt;0,05) de sessão de aspiração no número de folículos observados, de folículos aspirados e de oócitos recuperados. As concentrações plasmáticas de IGF-I não apresentaram efeito de tratamento (p&gt;0,05), no entanto sofreram efeitos de sessão e também da interação entres sessão e tratamento (p&lt;0,05). Obteve-se taxa de concepção de 10,53 % (2/19) após a inovulação dos embriões, gerando o nascimento de dois bezerros normais. Os resultados são sugestivos de que o tratamento com bST aumenta o número de folículos recrutados por onda de crescimento folicular, demonstrando seu potencial em aumentar a eficiência da técnica de aspiração folicular na espécie bubalina / The aim of this experiment was evaluated the effect of recombinant bovine somatotropin (bST) on follicular population, oocyte recovery rates and quality, and on in vitro buffaloes embryo production. The hypothesis was that bST improves the number of follicles per follicular growth wave and oocyte quality, enhancing the results in buffalos females submitted to ovum pick-up programs. A total of ten heifers were assigned in two experimental groups (bST Group that received 500mg of bST in regular intervals and Control Group that did not received any additional treatment). Both groups were submitted to 10 OPU sessions twice weekly (every 3 or 4 days). The number of follicles and its diameters were recoded in all OPU. The oocytes harvest were counted and classified in five categories (A, B, C, D, E). The A+B+C categories were considered as good quality oocyte. The embryos produced were vitrified and some of these embryos were transferred of fixed time. Blood samples for IGF-I were obtained every once weekly. The bST improved the follicular population (12.2 vs. 8.7; p&lt;0.05) and the number of oocytes per session (5.2 vs. 4.1; p=0.07), however the treatment did not affect the oocyte quality and its in vitro development capacity (p&gt;0.05). A significant effect (p&lt;0.05) of OPU session was observed in follicular population, number of aspirated follicles and number of oocyte recovered. The plasma IGF-I was not affected (p&gt;0.05) by treatment, however presented a significant effect of OPU session and also of the treatment by OPU session interaction (p&lt;0.05). The conception rate was 10.5% (2/19) and two healthy and normal calves were born from transferred embryo. These results indicate the viability of bST treatment to improve the follicular recruitment and its potential application in buffaloes donors submitted to OPU programs