L'acide ascorbique (AA) a longtemps été décrit comme un agent antiprolifératif, mais la molécule doit être utilisée à très fortes doses, nécessitant des injections intraveineuses. La régulation stricte et complexe des concentrations sanguines et cellulaires rendent impossible le maintien des concentrations élevées sur une longue période.Avec la société KaïronKem, nous avons créé une chimiothèque de dérivés de l'AA. Le but de ce travail thèse était d'identifier des molécules dérivées dont l'action antiproliférative est supérieure à celle de l'AA. Parmi elles, nous avons sélectionné la plus prometteuse, K873, qui a montré des effets cytotoxiques et antiprolifératifs sur différentes cellules tumorales humaines à une dizaine de micromolaires, tout en étant non-toxique pour les cellules saines. Nous avons ensuite testé son efficacité in vivo grâce à des injections quotidiennes chez des souris immunodéficientes xénogreffées avec des cellules cancéreuses humaines. K873 a montré une action antiproliférative sur la progression tumorale équivalente à l'AA à des doses 100 à 200 fois inférieures.Nous avons étudié le mécanisme d'action de K873. Tout comme l'AA, il diminue l'expression de deux familles de gènes impliqués dans la progression du cycle cellulaire : facteurs d'initiation de la traduction et ARNt synthétases. Nos résultats montrent que le transporteur intracellulaire de l'AA (SVCT2) n'est pas utilisé pour l'entrée de K873 dans la cellule, bypassant ainsi sa saturation. De la même façon que l'AA, K873 diminue le niveau intracellulaire d'AMPc mais en n'ayant aucune activité antioxydante. Les dérivés de l'AA pourraient être une nouvelle classe de médicaments anticancéreux. / Ascorbic acid (AA) was long described as an antiproliferative agent. However, the molecule has to be used at very high concentrations, which necessitates intravenous injections. In addition, the tight regulation of in-blood and in-cell AA concentrations makes it impossible to hold very high concentrations for any substantial length of time.In collaboration with KaironKem, we undertook the creation of a focused chemical library of AA derivatives. The aim of this work was therefore to identify derivatives molecules with antiproliferative action higher than AA. Among these new molecules, we selected K873 that has cytotoxic and antiproliferative effects on different human tumor cells at tenth micromolar concentration, without being toxic for normal cells. We then tested in vivo the effect of treatment with K873's daily injections in xenografted immunodeficient mice with human cancer cells. K873 showed an antiproliferative effect on tumor growth similar to AA but at doses 100 to 200 times lower.Finally we studied the mechanism of action of K873. As AA, it decreases the expression of two genes families involved in cell cycle progression, i.e. initiation factor of translation and tRNA synthetases. Our results also showed that the specific intracellular transporter of AA (SVCT2) is not used for K873 entry in cells, thus bypassing saturation. Finally, as AA, K873 reduced cAMP intracellular level but without antioxidant activity. Our findings suggest that AA derivatives could be a promising new class of anti-cancer drugs.

Les travaux réalisés au cours de cette Thèse avaient pour but de caractériser au niveau fonctionnel la protéine FAM110B, identifiée au laboratoire il y a plusieurs années par une méthode de sélection d’éléments génétiques suppresseurs destinée à rechercher de nouveaux gènes impliqués dans la sensibilité à un inhibiteur de Topoisomérase II, la 9-hydroxyéllipticine. Localisée au niveau cytoplasmique et très conservée chez les mammifères, FAM110B est essentielle à la survie comme le montre le blocage en phase S des cellules dans lesquelles son expression est transitoirement diminuée. Sa répression conduit d’ailleurs à l’inhibition de plusieurs voies impliquées dans la prolifération cellulaire comme les voies Wnt, Notch ou TGF-. Les résultats que nous avons obtenus suggèrent que ce rôle dans la prolifération peut être régulé par l’interaction de FAM110B avec la β-caténine. Cette interaction régule le niveau d’expression de la β-caténine et/ou sa localisation, ce qui a pour conséquence directe de moduler l’expression de ses gènes cibles impliqués dans la prolifération cellulaire. Nous avons également démontré que FAM110B intervient dans les processus de migration cellulaire en régulant directement ou indirectement l’expression de la E-cadhérine par la modulation sélective de l’expression d’un de ses répresseurs, Slug. L’augmentation de l’expression de la E-cadhérine dans des cellules sousexprimant FAM110B est accompagnée d’une diminution de l’expression de la N-cadhérine, un phénomène qui est fréquemment observé lors de la reverse EMT, passage d’un stade mésenchymateux à un stade épithélial au cours duquel, des cellules à caractère invasif et métastatique acquièrent des propriétés adhésives associées à une perte de leur propriétés de migration et d’invasion. Enfin, nous avons pu démontrer que FAM110B est également impliquée dans la sensibilité cellulaire à divers agents anticancéreux. Sa répression induit une sensibilisation à la camptothécine et au cisplatine alors qu’elle confère une résistance aux poisons de tubuline (taxol et vincritine) et aux inhibiteurs de Topoisomérases II par diminution du nombre de complexes de clivage ADN-enzyme associée à une réduction du niveau de Topo2 dont on ne connait pas encore l’origine. L’ensemble de nos résultats confirment l’importance de FAM110B dans la migration et la prolifération cellulaire ainsi que dans la réponse aux stress induits par diverses classes d’agents anticancéreux. De ce fait, FAM110B peut être considérée comme une nouvelle cible potentielle en cancérologie et son inhibition être utilisée pour potentialiser l’action de thérapeutiques existantes tels que les dérivés de la camptothécine ou les dérivés du platine qui sont largement utilisés en clinique. / FAM110B is a new protein that was identified several years ago in our laboratory by a functional screen, the selection of genetic suppressor elements (GSEs), which goal was to identify new genes involved in the cellular sensitivity to the topoisomerase II inhibitor 9-hydroxyellipticine. FAM110B is localized in the cytoplasm and is extremely conserved across mammals. We found that FAM110B is essential for cell survival, as its transient repression induces a blockage in the S phase of the cell cycle. Its repression also induces the inhibition of various pathways involved in the regulation of cell proliferation, such as Wnt, Notch or TGF-. Our results suggest that its role in cell proliferation relies on FAM110B interaction with β-catenin. This interaction regulates β-catenin expression and its subcellular localization, which directly impacts on the expression of its target genes involved in cell proliferation. We have also demonstrated that FAM110B is involved in cell migration by regulating the expression of E-cadherin via the specific modulation of one of its repressors, Slug. Increase in E-cadherin expression in cells with downregulated FAM110B is accompanied by a decrease in N-cadherin expression, a phenomenon which is reminiscent of a reverse EMT i.e. a mesenchymal to epithelial transition which is characterized by a loss of invasiveness and metastatic potential. Finally, we also showed that FAM110B is involved in the regulation of the cellular sensitivity to various anticancer agents. Transient repression of FAM110B sensitizes cells to camptothecin and cisplatin, whereas it confers a resistant phenotype to tubuline poisons (taxol and vincristine) and Top2 inhibitors. This latter effect is accompanied by a reduction in DNA-Topo2 cleavage complexes due to a reduction in Topo2 levels by a mechanism which is not fully elucidated. Together, our results confirm the importance of FAM110B in essential processes such as migration, cell proliferation, and cell response to various stresses induced by chemotherapeutic agents. Therefore, FAM110B can be considered as a new potential target for cancer treatment and its inhibition can also be used to potentiate existing treatments such as camptothecin derivatives and platinum compounds that are widely used in the clinic.

La protéine cIAP1 (cellular Inhibitor of Apoptosis Protein-1) de la famille des IAP (Inhibitor of Apoptosis Protein) est une E3 ubiquitine ligase qui présente des propriétés oncogéniques. Notre équipe s’intéresse aux processus permettant la différenciation des monocytes en macrophages. Au cours de la différenciation de nombreux modèles cellulaires (macrophages, cellules dendritiques, cellules épithéliales du colon, cellules souches hématopoïetiques, cardiomyocytes), cIAP1 sort du noyau pour se relocaliser dans le cytoplasme. La plupart des fonctions connues de cIAP1 sont liées à sa localisation cytoplasmique où elle est un régulateur important des voies de signalisation des récepteurs du TNFα et de NF-κB. Lors de la différenciation macrophagique, nous avons montré que cIAP1, une fois dans le cytoplasme, induit la dégradation de TRAF-2, un adaptateur moléculaire impliqué dans la transduction du signal des voies des récepteurs du TNFα et de NF-κB. Cette dégradation bloque la voie canonique de NF-κB et est essentielle à la différenciation terminale des monocytes en macrophages qui nécessite une activation transitoire de cette voie de signalisation. Cependant, cIAP1 est principalement exprimée dans le noyau de différents types cellulaires ce qui n’est pas en accord avec son rôle dans la signalisation cellulaire. Mon objectif a donc consisté à identifier les fonctions nucléaires de cIAP1 dans des cellules prolifératives ou lors de la différenciation macrophagique. Mon travail de thèse a permis d’identifier un rôle de cIAP1 dans la prolifération cellulaire. cIAP1 interagit avec le facteur de transcription E2F1 et favorise son recrutement sur les promoteurs des Cycline E et A impliquées dans les transitions G1/S et G2 du cycle cellulaire, ce qui augmente l’expression des transcrits et des protéines de ces deux cibles. Il semblerait que par cette activité, cIAP1 régule la prolifération des cellules et soit important dans l’équilibre entre la prolifération et la différenciation, deux mécanismes cellulaires étroitement liés. / The inhibitor of apoptosis protein cIAP1 (cellular inhibitor of apoptosis protein-1) from the IAP family (Inhibitor of Apoptosis Protein) is an E3 ubiquitin ligase that displays oncogenic properties. Our team is interested in the mecanisms that allow macrophagic differentiation from monocytes. cIAP1 is relocalised from the nucleus to the cytoplasm during the differentiation of many kind of cellular models (macrophages, dendritic cells, colon epithelial cells, hematopoietic stem cells, cardiomyocytes). The well-known functions of cIAP1 are associated with its cytoplasmic localisation, where it regulates the TNFα receptors and NF-κB signalling pathways. During macrophage differentiation, we show that cIAP1, once it is in cytoplasm, induces TRAF-2 degradation, a molecular adaptator of the TNFα receptors family and NF-κB signalling pathways. This degradation blocks the canonical pathway of NF-κB and is essential for the terminal differentiation into macrophages that needs a transitory activation of this pathway. However, cIAP1 is mainly expressed in the nucleus on many cell types which is not in accordance with its cell signalling activity. My objective was to investigate the nuclear function of cIAP1 in proliferative cells or during macrophage differentiation. My work identifies a function of cIAP1 in proliferation regulation. cIAP1 interacts with E2F1 transcription factor and favors its recruitment on Cyclins E and A promoters, both involved in G1/S and G2 phases of the cell cycle, which leads to high level of transcript and protein expression of these two targets. It seems that cIAP1 regulates the cellular proliferation and is important for the balance between proliferation and differentiation, two mechanisms tightly connected in cells.

L'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie rare caractérisée par une augmentation de la pression artérielle pulmonaire moyenne liée à un important remodelage de la paroi vasculaire obstruant progressivement les petites artères pulmonaires. Le récepteur NMDA (NMDAR) est un récepteur au glutamate jouant un rôle crucial dans la transmission synaptique neuronale. Il est aussi présent dans des cellules périphériques, notamment les cellules vasculaires aortiques et cérébrales, et participe à leur prolifération. De plus, le NMDAR contribue à la prolifération des cellules cancéreuses. Puisque dans l'HTAP, les cellules vasculaires pulmonaires présentent un phénotype cancer-like, hyperprolifératif et résistant à l'apoptose, nous avons émis l'hypothèse selon laquelle les NMDARs vasculaires pulmonaires pourraient contribuer au remodelage vasculaire et conduire à l'HTAP. Nous avons montré que les cellules vasculaires pulmonaires expriment physiologiquement les principaux éléments d'une communication glutamatergique fonctionnelle via le NMDAR. Dans l'HTAP, le glutamate s'accumule dans les vaisseaux remodelés et l'endothéline-1, un acteur majeur du remodelage vasculaire, induit la libération du glutamate par les cellules musculaires lisses. Le NMDAR est mobilisé dans les cellules vasculaires et sa fonction pourrait être altérée en raison d'un déséquilibre dans le ratio d'expression de ses sous-unités. L'activation du NMDAR contribue à la prolifération des cellules vasculaires pulmonaires et à l'angiogenèse, éléments clés de la physiopathologie de l'HTAP. Des études réalisées sur des souris n'exprimant pas les NMDARs vasculaires ou utilisant des antagonistes du NMDAR mettent en évidence le rôle du NMDAR dans l'hypertension pulmonaire expérimentale. Ces résultats suggèrent que le NMDAR est un nouvel acteur du remodelage vasculaire et qu'il représente une nouvelle cible thérapeutique de l'HTAP. Ils apportent également de nouveaux éléments alimentant l'analogie entre le système vasculaire et le système nerveux. / Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a rare disease characterized by an increase in the mean pulmonary arterial pressure, due to a deep vascular remodeling leading to the progressive obstruction of the small pulmonary arteries. The NMDA receptor (NMDAR) is a glutamate receptor playing a crucial role in the neuronal synaptic communication. It is also present in peripheral cells, including aortic and cerebral vascular cells, and promotes their proliferation. Moreover, NMDAR contributes to proliferation of cancer cells. As pulmonary vascular cells exhibit a cancer-like hyperproliferative and apoptotic-resistant phenotype in PAH, we hypothesized that the activation of pulmonary vascular NMDARs may contribute to the vascular remodeling leading to PAH. We found that pulmonary vascular cells express the main features of a functional synaptic-like glutamatergic communication through NMDARs. In PAH, glutamate accumulates in pulmonary arteries, and endothelin-1, a major actor of the PAH-associated vascular remodeling, triggers glutamate release from smooth muscle cells. Furthermore, the NMDAR is mobilized and its function may be altered due to an unbalanced expression ratio of the NMDAR subunits. Moreover, NMDAR activation contributes to vascular cell proliferation and angiogenesis, key features of PAH pathophysiology. Finally, studies with NMDAR antagonists and vascular NMDAR-knockout mice showed that vascular NMDARs are involved in pulmonary hypertension. These results suggest that NMDAR is a new actor of the vascular remodeling and could represent a new therapeutic target in PAH. They also bring new pieces to the vascular/nervous parallels.

L’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie mortelle caractérisée par un important remodelage vasculaire, principalement dû à l’hyperprolifération et à la résistance à l’apoptose des cellules du muscle lisse de l’artère pulmonaire (CML-AP). Récemment il a été montré que les CML-AP présentent un remodelage du métabolisme énergétique, avec une régulation négative de l’oxidation phosphorylante associée à une activation de la voie glycolytique, qui semble contribuer à leur phénotype particulier. La désacétylase sirtuine1 (SIRT1) est un important modulateur du métabolisme énergétique, notamment via son activation de peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1 alpha (PGC-1α), régulateur clé de la biogenèse mitochondriale. Dans cette étude, nous montrons pour la première fois que la prolifération des CML-AP de rat et humaines est caractérisée par une réduction de l’activité de SIRT1, et est augmentée suite à l’inhibition pharmacologique ou la sous-expression spécifique de SIRT1. De plus, suite à hypoxie chronique, des souris génétiquement déficientes en SIRT1 présentent un remodelage vasculaire plus important que celui observé chez les souris contrôles, ce qui est associé à une augmentation accentuée de l’hypertrophie et de la pression systolique du ventricule droit. Au contraire, l’activation pharmacologique de SIRT1 inhibe fortement la prolifération des CML-AP, et est associée à l’activation de la biogenèse mitochondriale. L’ensemble de ces résultats suggère que l'inactivation de SIRT1 joue un rôle causal dans l’hyperprolifération des CML-AP et cette enzyme pourrait être une nouvelle cible thérapeutique prometteuse pour le traitement de l’HTAP. / Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a lethal disease characterized by an intensive vascular remodelling, mainly due to hyper-proliferation and resistance to apoptosis of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMCs). Recently it has been found that PASMCs, similarly to cancer cells, demonstrate a shift in energy metabolism from oxidative phosphorylation towards glycolysis thus contributing to their particular phenotype. The deacetylase sirtuin1 (SIRT1) is an important modulator of energy metabolism, particularly via its activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1 alpha (PGC-1α), the master regulator of mitochondrial biogenesis. Here we show for the first time that rat and human PASMC proliferation is characterised by a diminution of SIRT1 activity, and is potentiated by SIRT1 pharmacological inhibition or specific downregulation. Moreover, after chronic hypoxia exposure, SIRT1 KO mice display a more intense vascular remodelling compared to their control littermates and this is associated with an exacerbated increase in right ventricle systolic pressure and hypertrophy. Conversely, pharmacological SIRT1 activation strongly inhibits PASMC proliferation, and is associated with the activation of mitochondrial biogenesis. In general, the data obtained show that SIRT1 inactivation plays a causative role in PASMC proliferation and this enzyme could be a promising therapeutic target for PAH treatment.

Les gliomes sont des tumeurs qui seforment par prolifération anormale de cellules dansle tissu cérébral. La dangerosité de ces tumeursréside dans le fait que la plupart des gliomes sontinvasifs : les cellules tumorales migrent dans le tissusain autour de la tumeur. Ces cellules tumoralesisolées provoquent des récidives quasi systématiquesaprès traitement (chirurgie, chimiothérapie,radiothérapie), rendant ces tumeurs incurablesactuellement et conduisant au décès du patient. Il estimportant d'associer des études fondamentales pourmieux comprendre leur évolution dès l'origine et desétudes plus appliquées en développant de nouveauxsubstrats pour reproduire in vitro leur évolution. Lescellules progénitrices des oligodendrocytes (OPC)représentent la plus grande population de cellules enprolifération et la plus largement distribuée dans lecerveau adulte, ce qui en fait un suspect idéal del’origine des gliomes. A partir de donnéesexpérimentales de la littérature sur la dynamique invivo de ces cellules, un modèle mathématiquereproduisant cette dynamique dans un tissu sain a étédéveloppé.Ce modèle montre également que les OPC pourraientêtre à l’origine de toutes les formes de gliomerencontrées aussi bien de bas grade que de hautgrade. Par ailleurs, l’approche expérimentale utiliséevisait à développer un substrat de culture cellulaireadapté à l’étude des gliomes in vitro. Ainsi, unhydrogel biocompatible, minimaliste et contrôlable aété élaboré. Celui-ci mime l’élasticité de la matriceextracellulaire (MEC) cérébrale avec une rigidité del’ordre de 200 Pa et l’effet adhésif des molécules dela MEC impliqué dans l’adhésion et la proliférationdes cellules tumorales. Grâce à ses propriétés,l’hydrogel favorise la survie de près de 90% desmodèles cellulaires de gliome utilisés dans notreétude et supporte la croissance en trois dimensionsd’agrégats multicellulaires semblables à lamorphologie de micro-tumeurs in vivo. Le modèled’hydrogel est donc validé pour favoriser la viabilitéet la prolifération cellulaires. Les perspectives detravail futures porteront sur l'optimisation de sacomposition pour mimer de manière encore plusréaliste la croissance tumorale in vivo. / Gliomas are brain tumors arising fromanomalous cell proliferation into the brain tissue.The hazard of these tumors resides in their invasiveability : tumor cells migrate into the healthy tissuesurrounding the tumor. These isolated cells causequasi systematic recurrences after treatment(surgery, chemotherapy, radiotherapy) making thesetumors currently incurable and leading to patientdeath. Hence, it is important to associatefundamental studies for better understanding of theirevolution from their origin with more appliedstudies developing new substrates for reproducingtheir evolution in vitro. Oligodendrocyte progenitorcells (OPC) are the most widely spread proliferatingpopulation in the adult brain, which makes them themain suspect of causing gliomas origin. Fromexperimental data in the literature about in vivodynamic of OPC, a mathematical model that depictsthis dynamic into a healthy tissue has beendeveloped.This model also shows that OPC could be at theorigin of all glioma forms from low to high grade.Furthermore, the experimental approach used aimedat designing a cell culture substrate adapted toglioma studies in vitro. Thus, a biocompatible,minimalistic and controllable hydrogel has beenperformed. It mimics brain extracellular matrix(ECM) elasticity around 200 Pa and the adhesiveeffect of ECM molecules involved in tumor celladhesion and proliferation. Due to these properties,the hydrogel contributes to around 90% of gliomacell models survival used in our study and promotesmulticellular aggregates growth in three dimensionsthat look like in vivo microtumors morphology. Thishydrogel model is thus validated for cell viabilityand proliferation. Future works will be devoted tothe optimization of its composition for bettermimicking of tumor growth in vivo in a morerealistic manner.

Les médulloblastomes (MB) sont les tumeurs cérébrales les plus fréquentes en pédiatrie. Ils apparaissent le plus souvent au niveau du cervelet. Ils peuvent être stratifiés en quatre groupes : les groupes WNT et SHH, où ces voies de signalisation sont altérées, et les groupes 3 et 4, présentant des anomalies chromosomiques et amplifications multiples, dont c-Myc (groupe 3) et N-Myc (groupe 4). L’une des altérations génétiques les plus retrouvées dans les MB est la surexpression du facteur de transcription OTX2. Ce facteur est exprimé dans les précurseurs des cellules granulaires (GCP) du cervelet, cellules d’origine de la majorité des MB. Pendant la période périnatale, les GCP subissent une phase de prolifération très intense en réponse au mitogène Sonic Hedgehog (SHH), ce qui les rendrait particulièrement sensibles à la tumorigenèse. Au cours de cette thèse, nous nous sommes intéressé à la fonction d’Otx2 dans ces GCP. Nous avons montré que l’ablation conditionnelle d’Otx2 conduit à un défaut de prolifération des ces cellules. L’analyse approfondie de ce phénotype a permis de révéler qu’Otx2 stimule la prolifération des GCP parallèlement à la voie de signalisation Shh. Par ailleurs, l’ablation d’Otx2 dans un modèle murin mimant la formation de MB Shh-dépendants a montré qu’Otx2 s’avère indispensable pour leur maintien à long terme. En parallèle, nous avons tenté de créer un nouveau modèle murin mimant la formation de MB de groupe 3 en induisant l’expression, pendant la période postnatale, d’un dominant actif de c-Myc dans les cellules exprimant Otx2. Cette approche a donné des résultats inattendus : des carcinomes de plexus choroïdes, et non des MB, ont été obtenus. / Medulloblastomas (MB) are the most common brain tumors in paediatrics. They appear during development in the posterior part of the brain, mainly in cerebellum. MB can be stratified in four groups: the WNT and SHH groups, where these signalling pathways are aberrantly activated, and the groups 3 and 4, which display chromosomal abnormalities and multiple amplifications, including c-Myc (group 3) and N-Myc (group 4). One of the most frequent genetic alterations in MB is the overexpression of the Otx2 transcription factor (in 75% of cases). This factor, which is essential for central nervous system development, is expressed in granule cell precursors (GCP) of the cerebellum, which represent the cell of origin of the majority of MB. During the perinatal period, GCPs undergo intense proliferation in response to Sonic Hedgegog (SHH), making them particularly susceptible to tumorigenesis. During this thesis, we were interested in examining the function of Otx2 in GCPs. We have shown that conditional ablation of Otx2 leads to a GCP proliferation defect and that Otx2 stimulates the proliferation of these cells independently of the Shh signaling pathway. Moreover, ablation of Otx2 in a mice model of Shh-dependent medulloblastomas yielded very interesting results: while Otx2 does not seem to be required for the initiation of these tumors, it is essential for their long-term maintenance. In parallel, we tried to create a new murine model for the MB group 3 by inducing the expression, during the postnatal period, of an active dominant of c-Myc in cells expressing Otx2. This approach yielded unexpected results: choroid plexus carcinomas, instead of MB, were obtained.

Les modifications de surface par du chitosane ont été effectuées dans cette thèse de deux façons : physisorption de chitosane de différents paramètres moléculaires (« spin coating » de solutions acides homogènes) et greffage de chaînes de chitooligosaccharides dérivées propargyl (« grafting to ») sur les surfaces de silicium. Le premier cas d'étude vise à apporter une compréhension sur le lien existant entre les propriétés physicochimiques des films et les paramètres moléculaires du chitosane et l'impact de ses propriétés physicochimiques et paramètres moléculaires sur les réponses biologiques. A cette fin, les propriétés de mouillabilité, morphologiques, structurales des films d'une part et d'autre part les réponses d'adhésion et de prolifération de bactéries sur les films de chitosane ont été caractérisées. Dans cette étude, nous avons également pris en compte l'effet du type d'acide utilisé lors de la préparation des solutions ainsi que le vieillissement des films sur leurs propriétés physicochimiques. A l'issue de cette étude, les tests biologiques, notamment l'adhésion et la prolifération de bactéries sur les films de chitosane, ont montré des résultats plutôt liés aux paramètres moléculaires des films qu'à leurs propriétés physicochimiques. Le deuxième cas de modification de surface vise à fonctionnaliser chimiquement les surfaces de silicium par des chitooligosaccharides par la méthode « grafting to ». Cette modification a été réalisée en trois étapes : silanisation, azidation et greffage des chitooligosaccharides. Toutes ces étapes ont été validées par différentes caractérisations de la surface après chaque étape de greffage par ellipsométrie, tensiométrie, AFM, spectroscopie infrarouge et spectrométrie TOF-SIMS / The surface modifications have been carried out in this thesis by two different routes: by physisorption of chitosan chains with different molecular parameters onto silicon surfaces (spin coating of homogeneous acidic solutions) and grafting of propargyl- terminated chito-oligosaccharides chains onto silicon surfaces (grafting to). The first study case was to understand the relationship between the physicochemical properties of chitosan films and the molecular parameters, and to find the impact of these physicochemical properties and molecular parameters on the biological responses. To this end, the physicochemical properties such as the wettability, morphology, chemical and physical structure of chitosan films on the one hand, and the bacteria adhesion and spreading on chitosan films on the other hand, have been characterized. In this study, we have also considered the effect of the type of acid used when solubilizing the chitosan on the films neutralization as well as the film ageing effects on the physicochemical properties. At the end of the study, the biological response of the chitosan films showed more sensitivity towards the chitosan molecular parameters than towards the physicochemical properties of the films. The aim in the second case of surface modification was to functionalize the silicon surfaces with chito-oligosaccharides by the “grafting to” method. It was conducted in three steps: silanisation, azidation and grafting of chito-oligosaccharides. All these steps were validated one by one by carrying out various characterizations using ellipsometry, tensiometry, AFM, infrared spectroscopy and TOF-SIMS spectrometry

Les bifidobactéries sont des bactéries probiotiques exerçant différents effets bénéfiques sur la santé de l’hôte. Parmi les effets revendiqués, la modulation des différentes fonctions immunitaires demeure l’un des effets les plus intéressants. Plusieurs travaux sont rapportés dans la littérature sur les effets immunomodulateurs de certaines souches probiotiques. Cependant, les résultats sont parfois controversés et les mécanismes impliqués dans cet effet immunomodulateur sont encore très peu élucidés. Le but de ce projet est d’évaluer le potentiel immunomodulateur de certaines souches de bifidobactéries isolées à partir de fèces de bébé, et d’identifier les mécanismes moléculaires par lesquels ces bifidobactéries exercent leurs effets sur les différentes fonctions immunitaires. Trois souches de bifidobactéries d’origine fécale productrices d’exopolysaccharides (B. thermoacidophilum RBL81, RBL82 et RBL64), une souche de Bifidobacterium lactis Bb12 et des souches ATCC (B. animalis, B. breve, B. longum, B. infantis, B. bifidum et B. pseudolongum) ont été utilisées. Les résultats obtenus montrent que la paroi cellulaire induit la plus forte stimulation de la prolifération cellulaire (splénocytes), accompagnée d’une forte production de IFN-γ et d’une augmentation de la sécrétion de IL-10. Une stimulation des fonctions immunitaires a également été observée avec le contenu cytoplasmique mais à un niveau moindre par rapport à la paroi. Par contre, les exopolysaccharides bruts ou fractionnés n’ont induit aucun effet. Une étude plus approfondie utilisant B. lactis Bb12 comme modèle a démontré que l’activité immunomodulatrice du contenu cytoplasmique est associée à la présence de peptides et/ou protéines acides, de poids moléculaire très variable et de faible hydrophobicité. Par ailleurs, le pouvoir immunogène de la paroi de bifidobactéries a été mise à profit pour produire des anticorps monoclonaux spécifiques capables de détecter les espèces du genre Bifidobacterium. Ces anticorps semblent être spécifiques à une protéine majeure d’environ 58 kDa de poids moléculaire (PM) commune à plusieurs bifidobactéries. Une fois purifiés, ces anticorps ont été utilisés pour développer un test d’immuno-culture original permettant la détection spécifique et sensible des bifidobactéries. / Bifidubaktiri d iprubyuteken (probiotiques) i yetwassnen atas assagi, yeεni ţ-ţibaktiryin mara twarnunt i tgulliyin ţţakent ayen yelhan i tdawsa. Tibaktiriyin agi zemrent ad snernint kra n tsuγnin yeţhuddun γef tfekka mgal atanan n uεebbud d izerman n bnadem. D acu kan, ar assa, ur nessin ara amek tibaktiriyin stanent tafekka. Iswi n usenfar agi d anelmud n unezmar n usnerni n ustan n bifidubaktiri. Ayagi i wakken a d-naf isemduyen n kra n tsegrin n tsiluliyin (cellules) am iferdisen (éléments) yellan daxel, s-ufella neγ i d-deggirent ar berra γef tririt n uhuddu. Krad (3) n ccetlat n bifidubaktiri id-yekkan seg izerman llufan ţwalmendent ţwasdemrent ar yiwet n ccetla tamselγut Bifidobacterium lactis Bb12. Agmuden i d-nessufeγ qqaren-d d akken asnerni yelhan n ufadi n tsiluliyin n udihan (rate) n amumad, i d- yettabaε unerni amuqran n IFN-γ yakw d usennerni n usufeγ (sécrétion) n IL-10, yefkaten-id ulesi n tsilulit (paroi cellulaire). Ayen yellan daxel n tsilulit d tazunin-ines (ipeptidiyen yak tiprutiniyin) snernayent drus γef ulesi. Ma d ayen yεenan EPS (exopolysaccharides) ulac asnnerni i d-yekkan segsen. Ma d tiprutiniyin n ulesi n bifidubakiri (B. animalis, B. breve, B. longum, B. infantis, B. bifidum et B. pseudolongum) banent-ed d timesnerniyin timuqranin n uhareb γef tfekka n umumad (Balb/c) ssutuyent afares amuqran n tfekkamgalin. Tifekkamgalin i d-yeffγen d yiwet n txellalt (IgG) mgal B. longum ţwafursent-ed s trennawet u sknent-ed tasedmirt tanmidagt (réaction croisée) yakw d ccetlat nniden n bifidubakiri. Anecta yekka-d seg yiwet n teprutint (protéine) tamsihart i yezzayen 58 kd. Tulmist n tfekkamgalin i d-yefursen yeţwasentem-ed s usadez (test) ibaw i d- yelummzen mi ţ-nerεed yakkw d cctali nniden n tbaktiriyin. Tufin n bifidubaktiri yeddren s tfekkamgalin i d-yedran yefursen yedra-d s usadez n immuno-culture. Tifekkamgalin tulmisin i-d yekkan seg yiwet n txellayt id-nessenfel zemrent ad ţwaqedcent i tifin n cctali n bfidobktiri di tgwellyin. / Probiotic bifidobacteria are known to have beneficial effects on host health. One of the interesting properties of these bacteria is their capacity to modulate the host immune function. However, the mechanisms by which the bifidobacteria influence the immune response are not well known. This project aimed to evaluate the immunodulatory potential of some bifidobacterial strains isolated from newborn feces. We tried to determine the cellular and molecular mechanisms involved in immune response induced by cytoplasmic content, cell wall and exopolysaccharides from bifidobacteria. Three exopolysaccharide-producing fecal strains of bifidobacteria (B. thermoacidophilum RBL81, RBL82, and RBL64) and a commercial available strain (Bifidobacterium lactis Bb12) were tested using mouse splenocytes. The results demonstrate that a high stimulation of cell proliferation and interferon-gamma (IFN-γ) production were induced by cell wall. In addition, a concomitant stimulation of interleukin-10 (IL-10) secretion was observed. The cytoplasmic content was also shown to be immunostimulating, but less than cell wall. However, the effects observed were dose or strain-species-dependent. B. lactis Bb12 was found to be significantly more immunostimulating than other bifidobacterial strains used. Partially fractionated peptides and acidic fraction from B. lactis Bb12 showed a low hydrophobicity and appeared heat stable and mitogenic. In contrast, no immunostimulating effects were induced by exopolysaccharides. The mitogenic properties of cell wall protein were then explored to develop specific monoclonal antibodies (Mab) able to detect bifidobacteria species in food. Common proteins were revealed in cell wall extracts from bifidobacteria (B. animalis, B. breve, B. longum, B. infantis, B. bifidum et B. pseudolongum). The proteins obtained were found to be immunonogenic in Balb/c mouse. Monoclonal antibodies (IgG) -anti-B. longum- produced cross-reacted with all bifidobacteria tested. The shared antigenicity shown by bifidobacteria was revealed by an epitope supported by a common protein of 58 kDa. This was confirmed by immune-transmission electron microscopy observation, which showed the specific interaction of these antibodies with bifidobacterial cell wall proteins. The Mab produced was also shown to be sensitive (105 cfu/ml) and specific to members of the bifidobacterial genus. The Mab developed allowed detection of viable cells of bifidobacteria using immuno-culture test.

Les maladies cardiovasculaires sont Lune des premières causes de mortalité en Amérique du Nord et est principalement due au vieillissement de la population. Il a été noté que 23 % de la population nord-américaine âgée de plus de 60 ans souffre d'une de ces maladies. Plusieurs remèdes permettant de remédier à ces maladies existent, dans un premier temps la prise de médicaments. Lorsque ces derniers ne sont plus efficaces, l'angioplastie ainsi que la pose de stents sont utilisées. Lorsque les fonctions de l'artère sont trop affectées, empêchant la circulation adéquate du sang, le remplacement de celleci par une prothèse est alors nécessaire. Malgré un taux de succès élevé pour les prothèses de plus de 6 mm de diamètre, le taux d'échec dans les 10 ans suivant l'implantation d'une prothèse en Téflon de moins de 6 mm de diamètre reste néanmoins de 66 %. Ce phénomène s'explique par la formation de thrombose et l'hyperplasie intimale. L'approche développée dans ce travail consistait donc à modifier la surface de ce polymère afin de favoriser la croissance des cellules endothéliales. En effet, sachant que ces cellules recouvrent naturellement la paroi des vaisseaux sanguins biologiques elles constituraient ainsi la surface hémocompatible par excellence. La stratégie développée au laboratoire était de conjuguer un peptide d'adhésion (RGD) et un peptide de prolifération (WQPPRARI) à la surface du polymère. Ces deux peptides ont été greffés suivant un modèle de patron en tirant profit des techniques d'impression et de pulvérisation développées au laboratoire. Dans le cadre de ce projet, le système de pulvérisation a été modifié, dans un premier temps, afin de traiter une plus grande superficie de surface car les tests biologiques nécessitaient des surfaces de 7 x 9 cm. La technologie consistait à pulvériser une solution de peptide RGD sous forme de gouttelettes de 10 um de diamètre avec un recouvrement de surface de 20 %, la surface non traitée était par la suite trempée dans la seconde solution peptidique soit : WQPPRARI. Une table x, y a été ajoutée au montage permettant ainsi de traiter uniformément de plus grandes surfaces. Les surfaces ainsi obtenues ont été évaluées quant à leur potentiel à promouvoir l'adhésion et la prolifération des cellules endothéliales humaines extraites de veines saphènes (HSVEC). Les expériences ont été effectuées in vitro autant en mode statique qu'en mode dynamique, afin de reproduire le plus possible les conditions d'un flux sanguin. Dans le cadre des études en mode statique, il a été observé que la présence de patron à la surface ne conduisait pas à une meilleure adhésion des cellules. Par contre, lors des tests en prolifération, il a clairement été démontré que le patron peptidique influençait la croissance cellulaire. Pour ce qui est des études en mode dynamique, l'attachement et la réorientation des cellules ont été observés. Une meilleure adhésion et une réorganisation cellulaire a été observée sur les surfaces patronnées. La micro structuration des surfaces de téflon avec les peptides RGD et WQPPRARI favorise donc une meilleure endothélialisation.