Introdução: A glândula prostática depende de hormônios esteróides para ter um adequado desenvolvimento e funcionalidade secretora. Com o avanço da idade, surgem alterações no tecido prostático junto com outras doenças da próstata. As duas formas, clinicamente, mais importantes e prevalentes do crescimento anormal da próstata são hiperplasia prostática benigna (HPB) e câncer de próstata (CaP). Estas doenças são o resultado de alterações do ciclo celular que é regulado por dois processos: a proliferação e a apoptose. Estes processos são regulados pela expressão do produto de genes, tais como o p53, MDM2, p21, Bcl2 e Bax. Objetivos: Avaliar a proliferação celular em cultura primária de células prostáticas tratadas com diferentes concentrações de diidrotestosterona (DHT); verificar os níveis do mRNA do Bcl2, Bax, p53, MDM2 e p21 em cultura primária de células prostáticas tratadas com diferentes concentrações de DHT; determinar os níveis do mRNA do Bcl2, Bax, p53, MDM2 e p21 em tecido proveniente de HPB e CaP e avaliar a razão de chance de ter CaP. Métodos: Para realização das culturas primárias foram utilizados amostras de tecido com diagnóstico de HPB. As células prostáticas epiteliais e estromais foram semeadas separadamente para a análise de proliferação celular e para a expressão gênica. Os grupos referentes ao tratamento foram divididos em subgrupos tratados com diferentes doses de DHT e com o antiandrogênio hidroxiflutamida (OH-FLU): grupo controle (meio de cultivo suplementado com 5% de SBF desteroidado), grupo DHT 10-8 M, grupo DHT 10-13 M, grupo OH-FLU 10-6 M, grupo DHT 10-8 M associado com OH-FLU 10-6 M e o grupo DHT 10-13 M associado com OH-FLU 10-6 M. Para a avaliação da proliferação celular as células em cultura foram avaliadas por MTT. Para a avaliação da expressão gênica foi realizada a extração total do RNA das células em cultura seguido por PCR em tempo real. Para avaliar a expressão gênica de tecido, as amostras com HPB e com CaP foram submetidas ao protocolo da extração do RNA total seguido pela técnica da PCR em tempo real. Resultados: A avaliação da proliferação celular das células prostáticas epiteliais, tratadas com DHT 10-13M, apresentou um aumento de 33% na proliferação celular e as células tratadas com DHT 10-8M, OH-FLU 10-6M, DHT 10-13M associada com OH-FLU 10-6M e DHT 10-8M associada com OH-FLU 10-6M apresentaram um aumento na proliferação de 24%, 31%, 25% e 21% respectivamente, quando comparadas com o grupo controle. As células prostáticas estromais, em cultura, tratadas com diferentes doses do hormônio apresentaram uma variação na proliferação celular menor que 10% quando comparadas com o grupo controle. A expressão gênica do MDM2, p53, p21, Bcl2 e Bax das células prostáticas epiteliais e estromais, tratadas com diferentes concentrações de DHT, não mostrou diferença estatisticamente significativa. A expressão do RNAm, no tecido prostático, dos genes MDM2, p53, p21, Bcl2 mostrou um aumento estatisticamente significativo em CaP quando comparado com o grupo HPB. O gene Bax que não mostrou diferença significativa quando comparado com o grupo HPB. A partir da escolha do melhor ponto de corte da curva ROC, nossos resultados mostraram que indivíduos que apresentam a expressão de MDM2 acima de 2,89 a razão de chance de o indivíduo ter CaP aumentada 69 vezes. Para a expressão dos genes p53, p21, Bcl2 e Bax, quando apresentarem uma expressão mais alta que o valor do ponto de corte a chance de ter CaP aumentam 15, 31, 17 e 4 vezes respectivamente. As expressões dos genes MDM2 e p21 apresentaram boa sensibilidade e ótima especificidade quando comparado ao PSA. Já os genes p53 e Bcl2 apresentaram boa sensibilidade e especificidade e Bax mostrou uma boa sensibilidade, mas uma baixa especificidade quando comparado ao PSA. Baseado nos dados de especificidade e sensibilidade foram avaliados os testes em paralelo e em série, em que a análise em paralelo apresentou melhor sensibilidade do que especificidade e a análise em série se mostrou mais específica do que sensível. Conclusões: O modelo de cultura primária de células para avaliar a proliferação celular é viável. As células prostáticas epiteliais e estromais, tratadas com DHT, não apresentaram diferença significativa na expressão gênica entre os grupos. O aumento da expressão gênica nas amostras de CaP indicam que os genes MDM2, p53, p21 e Bcl2 podem estar envolvidos no desenvolvimento do câncer de próstata. De acordo com as análises em série estes genes podem ter uma grande importância na clínica quando avaliados em série com o PSA para confirmar o diagnóstico de CaP em pacientes com níveis de PSA elevados, exame de toque retal alterado e biópsia negativa. / Introduction: The prostate gland depends on the steroid hormones to have. an adequate development and secretory functionality With the advancing age, changes occurs in prostate tissue with other prostate diseases. The two forms clinically most important and prevalent of abnormal growth of the prostate gland are benign prostate hyperplasia (BPH) and prostate cancer (PCa). These diseases are the result of changes in cell cycle which is maintained by two processes: proliferation and apoptosis. These processes are regulated by expression of gene product, such as the p53, MDM2, p21, Bcl2 and Bax. Aims: To evaluate the cell proliferation in primary cultures of prostatic cells treated with different concentrations of dihydrotestosterone (DHT), to verify the levels of RNAm of Bcl2, Bax, p53, MDM2 and p21 in primary culture of prostatic cells treated with different concentrations of DHT; to determine levels of mRNA of the Bcl2, Bax, p53, MDM2 and p21 in tissue from BPH and PCa and to evaluate the odds ratio for PCa. Methods: To perform the primary cultures were used tissue samples with the diagnosis of BPH. The epithelial and stromal prostatic cells were plated separately for the analysis of the cell proliferation and for gene expression. The groups regarding to the treatment were divided into subgroups treated with different doses of DHT and the antiandrogen hidroxiflutamide (OH-FLU): control group (culture medium supplemented with 5% of charcoal -treated FBS), group DHT 10-8 M, group DHT 10-13 M, group OHFLU 10-6 M, group DHT 10-8 M associated with OH-FLU 10-6 M and the group DHT 10-13 M associated with OH-FLU 10-6 M. For the evaluation of cellular proliferation cells in culture was evaluated by MTT. For the evaluation of gene expression, was performed the total RNA extraction for the cells in culture and real time PCR. To evaluate the gene expression of tissue, the samples with BPH and with PCa were submitted to the extraction of total RNA followed by the technique of real time PCR. Results: The evaluation cell proliferation for the prostatic epithelial cells, treated with DHT 10-13M, presented an increase of 33% in the cell proliferation and the cells treated with DHT 10-8M, OH-FLU 10-6M, DHT 10-13M associated with OH-FLU 10-6M and DHT 10-8M associated with OH-FLU 10-6M showed an increase in the proliferation of 24%, 31%, 25% e 21% respectively, when compared with the control group. Prostatic stroma cells, in culture, treated with different doses of hormone showed a variation in cell proliferation of less than 10% when compared with the control group. The gene expression of MDM2, p53, p21, Bcl2 and Bax of prostatic epithelial and stroma cells, treated with different concentrations of DHT, do not show statistically significant difference. The expression of mRNA into the prostatic tissue of the genes MDM2, p53, p21, Bcl2 showed an increase statistically significant in PCa when compared with the group BPH. The Bax gene did not show significant difference when compared with the group BPH. From the choice of best cut point of the ROC curve, our results showed that person that presented the expression of MDM2 above 2.89, the chance of the individual to have PCa is increased 69 fold. For expression of the genes p53, p21, Bcl2 and Bax, when they presenting an expression higher than the value of the cut point, the chance to have PCa increased 15, 31, 17 and 4 folds respectively. The expressions of the genes MDM2 and p21 showed a good sensibility and optimal specificity when compared to the PSA. Since the genes p53 and Bcl2 showed a good sensibility and specificity, and Bax showed a good sensibility, but a low specificity when compared to the PSA. Based on sensibility and specificity data, were evaluated the tests in parallel and in series, in which the analysis in parallel showed better sensibility than specificity, and the serial analysis was more specific than sensitive. Conclusions: The model of the primary culture of cells for assessment of cell proliferation is viable. The prostatic epithelial and stromal cells, treated with DHT, not show significant difference in gene expression between groups. The increase of the gene expression in the samples of PCa indicate that the genes MDM2, p53, p21 and Bcl2 may be implicated into the development of prostate cancer. In accordance with the analyzes in series, these genes may have an great importance in the clinical when evaluated in series with the PSA to confirm the diagnosis of PCa in patients with elevated levels of PSA, digital rectal examination altered and biopsy negative.

A endometriose caracteriza-se pela presença de tecido endometriótico – glândulas e estroma – fora da cavidade uterina. A doença acomete superfícies peritoniais da pélvis, ovários e septo rectovaginal, sendo mais comum a endometriose pélvica. Embora os dados sobre a prevalência exata de endometriose sejam incertos, as evidências indicam uma prevalência em torno de 5 a 10% das mulheres em idade reprodutiva. Dor, dismenorréia, dispareunia e infertilidade são sintomas freqüentes da doença. Além de apresentar dependência aos hormônios sexuais, a endometriose está associada a um conjunto de desordens de diferentes etiologias, sendo considerada uma doença multifatorial de caráter genético e imune. Neste sentido, a carência de respostas imunológicas adequadas, aliada a um provável desequilíbrio entre os processos de proliferação e apoptose celular, pode ter um papel importante na instalação e manutenção das lesões endometrióticas. O objetivo deste trabalho foi caracterizar a expressão de genes relacionados aos processos de proliferação e diferenciação celular em implantes endometrióticos e endométrio eutópico de mulheres inférteis sem e com endometriose, através da análise semiquantitativa por RT-PCR. Foram estudadas 34 pacientes consultando por infertilidade e submetidas à laparoscopia diagnóstica. Quinze pacientes (31,7 ± 1,5 anos) apresentavam endometriose e 19 (32,9 ± 0,9 anos) foram consideradas controles inférteis sem endometriose. Os dois grupos apresentaram IMC e SHBG similares. As biópsias de endométrio foram realizadas, em fase folicular, nas pacientes do grupo controle (C) e nas pacientes com endometriose (endométrio eutópico (EUT) e ectópico (ECT)). A presença do mRNA para os receptores de estrogênio e progesterona detectada nos 3 grupos estudados, sustenta a existência de sensibilidade tecidual local aos hormônios sexuais. Nas condições experimentais do presente estudo não foi observada diferença estatística na expressão gênica de bcl2 entre os grupos. A expressão do gene do ER endometrial também foi similar entre os grupos controle, eutópico e ectópico. Contudo, o endométrio ectópico apresentou níveis de mRNA mais elevados para PR-A (0,84  0,02 UA) em relação aos grupos controle e eutópico (0,60  0,04 UA e 0,63  0,04 UA; p < 0,05). A expressão gênica do PR-B não foi estatisticamente diferente entre os grupos do presente trabalho. Porém, houve forte correlação negativa entre a expressão dos genes bcl2 e PR-B nas amostras de endométrio sem e com endometriose (r = - 0,795 e p = 0,018), sugerindo que um papel anti-proliferativo do PR-B possa ser operativo neste modelo de estudo. / Endometriosis is characterized as the presence of endometrial glands and stroma outside of the uterine cavity. The disorder attacks the surfaces on the pelvic peritoneum, ovaries and rectovaginal septum, been commonly the pelvic endometriosis. Although the exact prevalence remains uncertain, 5 to 10% of women of reproductive age are estimated to have endometriosis. Pain, dysmenorrhea, dyspareunia and infertility are frequent symptoms of the disorder. Endometriosis is a hormonal-dependent disease and has been considered as a multifactorial disorder with genetic and immune characteristics. Thus, changes on immunologic responses associated to a potential disequilibrium between proliferative and apoptotic process, seems to play a main role in the development and maintenance of the endometriotic lesions. The aim of this study was to characterize the expression of genes related to cellular proliferation and differentiation in endometriotic lesions and eutopic endometrium from infertile women with and without endometriosis by RT-PCR semiquantitative analysis. Thirty four patients consulting for infertility and submitted to diagnostic laparoscopy were studied. Fifteen patients (31.7 ± 1.5 years old) presented endometriosis and 19 (32.9 ± 0.9 years old) were considered as control, free from the disease. Both groups presented similar BMI and SHBG. Endometrial biopsies were collected during the follicular phase, from patients of the control group (C) and those from the endometriosis group (eutopic (EUT) and ectopic (ECT) endometrium). Estrogen and progesterone receptor gene expression was detected in the 3 groups, supporting the existence of a local sensitivity to sexual hormones. No statistical differences were observed in bcl2 gene expression between the groups. The gene expression of ERα was also similar among control, eutopic and ectopic groups. In turn, ectopic endometrium showed higher PR-A gene expression (0.84 ± 0.02 AU) than control and eutopic groups (0.60 ± 0.04 AU e 0.63 ± 0.04 AU; p < 0.05). The PR-B gene expression did not differ among the groups. However, a strong and significant negative correlation between bcl2 and PR-B levels was demonstrated in the endometrial samples from patients presenting or not endometriosis (r = - 0.795 and p = 0.018), suggesting that an anti-proliferative role of PR-B could be operating trough this model of study.

Hiperplasia Prostática Benigna (HPB) é uma condição patológica que acomete os homens na senescência e está presente em 50% da população masculina, com cerca de 85 anos de idade. Os hormônios androgênicos atuam na próstata provendo sua diferenciação, crescimento e funcionalidade, sendo este efeito mediado pela ligação do hormônio com o receptor de androgênios (AR) e pela a ativação de genesalvo. O equilíbrio entre apoptose e proliferação celular é mantido por uma série de genes modulados pelos androgênios que estão implicados no controle do ciclo celular. Este trabalho teve como objetivo investigar os mecanismos moleculares mediados por androgênio que possam estar envolvidos no descontrole proliferativo do epitélio prostático que ocorre durante a senescência. As células epiteliais prostáticas humanas não- transformadas derivadas de HPB (HNTEP) foram cultivadas e incubadas com diferentes concentrações de diidrotestosterona (DHT) e com o antiandrogênio hidroxiflutamida (OH-FLU). Uma baixa concentração de DHT (10-13M) provocou um aumento significativo na proliferação destas células em relação ao controle e às doses mais altas de androgênio (10-10 e 10-8 M ). Este efeito foi abolido pela adição de OHFLU. A expressão do gene do AR foi avaliada por RT-PCR em tempo real com diferentes tempos e condições de tratamento, sendo que os níveis de RNAm do AR permaneceram inalterados bem como sua proteína. Buscando compreender fatores que possam interferir na ativação transcricional do AR, avaliou-se a expressão dos coreguladores FHL-2 e shp-1. No grupo tratado com DHT.10-13 M houve um aumento significativo na expressão do co-ativador FHL-2 em relação aos outros grupos tratados (C5%, OH-FLU, DHT.10-8, DHT.10-8 + OH-FLU e DHT.10-13 +OH-FLU) enquanto que a expressão do co-repressor shp-1 foi diminuída com esta dose, mas aumentada com a dose de DHT.10-8. Genes envolvidos na proliferação celular e que podem ser modulados pela ação androgênica, também foram avaliados em células HNTEP por RT-PCR em tempo real. O gene anti-apoptótico bcl-2 teve sua expressão aumentada sob o tratamento com DHT.10-13 M em relação ao tratamento com DHT.10-8 . Entretanto, o gene supressor de tumor p53 apresentou um aumento na sua expressão mediante o tratamento com a alta dose de androgênio (DHT.10-8M) em relação ao grupo controle, OH-FLU, DHT.10-13M e DHT.10-8 + OH-FLU. A análise da expressão do gene p21, alvo direto do gene p53, apresentou resultados semelhantes, com uma maior expressão com DHT.10-8M. Para averiguar alterações pós-transcrionais avaliou-se também os níveis protéicos do AR que não apresentaram alteração siginificativa e do p21, que apresentou uma maior marcação da proteína quando tratado com DHT10-8 M. Os dados obtidos neste trabalho indicam que pode ocorrer uma modulação da expressão destes genes mediante o tratamento com diidrotestosterona. Baixas doses de androgênio desencadeiam uma via estimulatória da proliferação enquanto que altas doses promovem a ativação de uma via inibitória nas células HNTEP. / Benign prostatic hyperplasia (BPH) is a pathologic condition that affects older men and is present in 50% of the male population at 85 years of age. The androgenic hormones act on the prostate gland promoting its differentiation, growth and function, this effect being mediated by the hormone's binding to the androgen receptor (AR) and the activation of target genes. The balance between apoptosis and cell proliferation is maintained by a series of genes modulated by the androgens that are implicated in the cell cycle control. This research aimed to investigate the androgen-mediated molecular mechanisms that may be involved in the proliferative imbalance of the prostatic epithelium in older men. Human non-transformed epithelial prostate (HNTEP) cells derived from BPH were incubated in different concentrations of dihydrotestosterone (DHT) and of antiandrogen hydroxylutamide (OH-FLU). A low concentration of DHT (10- 13M) led to a significant increase in the proliferation of these cells as compared to the control condition and to higher concentrations (10-10 and 10-8 M). This effect was abolished by the addition of OH-FLU. AR gene expression was evaluated by real-time RT-PCR in different times and conditions of treatment, and no differences in the AR mRNA and its protein were found. In an attempt to understand the factors that can change the AR transcriptional activation, the expression of co-regulators FHL-2 and shp 1 were also evaluated. There was a significantly increased expression of co-activator FHL-2 in the group treated with DHT.10-13 M as compared to all other groups (C5%, OHFLU, DHT.10-8, DHT.10-8 + OH-FLU and DHT.10-13 +OH-FLU). On the other hand shp-1 expression was low at this concentration but high when cells were treated with DHT.10-8 M. Genes participating in cell proliferation and that can be modulated by androgens were also evaluated in HNTEP cells by real-time RT-PCR. The anti-apoptotic bcl-2 gene had its expression increased by the treatment with DHT.10-13 M as compared to the treatment with DHT.10-8 M. However, the expression of tumor-suppressing p53 gene showed an increase in its expression by the treatment with a high level of androgen (DHT.10-8 M) as compared to control, OH-FLU, DHT.10-13M and DHT.10-8 + OH-FLU. The analysis of gene p21 expression, direct target of p53 gene, presented similar results (higher expression with DHT.10-8M). Post-transcriptional alterations were studied by evaluating the proteins levels of AR and p21; there were no significant differences, but the latter showed greater protein labeling when treated with DHT.10-8 M. The data obtained here indicate that the expression of these genes may be modulated by dihydrotestosterone (DHT). Low concentrations of androgens trigger a stimulatory pathway of proliferation, while high concentrations promote the activation of an inhibitory pathway in HNTEP cells.

Introdução: leiomiomas uterinos são os tumores benignos mais prevalentes nas mulheres em idade fértil, ocorrem em cerca de 50% da população feminina e são a indicação mais frequente de histerectomia. A importância dos esteroides ovarianos na etiologia dos leiomiomas está bem estabelecida; contudo, as contribuições relativas dos estrógenos e da progesterona no crescimento dos leiomiomas ainda são controversas. Muitos estudos têm apresentado evidências de que a progesterona seria mais importante do que os estrógenos para o desenvolvimento destes tumores, e antiprogestágenos como a mifepristona podem tornar-se uma nova possibilidade de tratamento conservador. Ensaios clínicos têm sugerido que a mifepristona é efetiva no tratamento de leiomiomas, causando redução no tamanho dos tumores. Todavia, a recorrência da proliferação dos tumores após o fim do tratamento e os mecanismos de ação da mifepristona na regulação dos receptores de progesterona ainda não estão esclarecidos. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da mifepristona sobre a proliferação celular e a expressão gênica de receptores de progesterona A e B, em um modelo de cultura de células de miométrio e leiomioma, sob diferentes condições hormonais. Métodos: fragmentos de leiomioma e de miométrio adjacente foram obtidos de cinco pacientes submetidas à histerectomia. Foram padronizadas as culturas primárias de leiomioma e miométrio, e as células de cada tipo de tecido em cultura foram divididas em cinco grupos de tratamento: estradiol, estradiol e mifepristona, estradiol e progesterona, estradiol, progesterona e mifepristona e controle (etanol utilizado como veículo dos hormônios). Foi realizada análise imunocitoquímica para α-actina. A proliferação celular foi avaliada através de contagem em hemocitômetro e ensaio de MTT no tempo 7 (após o tratamento com mifepristona) e no tempo 9 (após a recuperação do tratamento). No dia 7, foi feita extração de RNA para avaliar a expressão de receptores de progesterona (PRs) A e B através de PCR em tempo real. Resultados: o estabelecimento do modelo de cultura de células foi confirmado através da coloração positiva para α-actina e pela observação de características morfológicas típicas de células musculares lisas. As técnicas de avaliação da proliferação celular, contagem e MTT, mostraram correlação positiva. O tratamento com estradiol aumentou a proliferação celular de ambos os tipos de tecido, em relação ao grupo controle. O tratamento com progesterona associada ao estradiol aumentou a proliferação das células de ambos tecidos, em relação ao tratamento com estradiol isoladamente e ao controle. Para os dois tratamentos, as células de leiomioma proliferaram mais do que as células de miométrio. No tempo 7, o tratamento com mifepristona associada ao estradiol inibiu a proliferação celular em leiomioma (42%) e no miométrio (23%), em comparação ao mesmo tecido tratado somente com estradiol. O tratamento com mifepristona em associação com estradiol e progesterona inibiu a proliferação celular em leiomioma (105%) e miométrio (56%), em comparação ao mesmo tecido tratado com estradiol e progesterona. No tempo 9, após a recuperação do tratamento com mifepristona, células de miométrio mostraram maior resposta proliferativa do que células de leiomioma. Todavia, o tratamento com mifepristona não foi capaz de inibir completamente a proliferação celular, visto que todos os grupos tratados mostraram aumento de proliferação do tempo 7 até o tempo 9. Foi demonstrada a expressão das duas isoformas de PRs, A e B, em miométrio e leiomioma in vitro; contudo, as comparações entre os grupos de tratamento não foram possíveis devido ao reduzido tamanho amostral. Conclusões: culturas primárias de células de miométrio e leiomioma são um modelo viável para avaliação da proliferação celular em diferentes condições hormonais, e o ensaio de MTT pode ser um bom método de avaliação. A mifepristona inibiu a proliferação celular em ambos os tipos de tecido, com o maior efeito quando associada ao estradiol e à progesterona e em células de leiomioma. Células de miométrio e leiomioma expressam as duas isoformas de PRs in vitro. Mais estudos são necessários para esclarecer o papel da mifepristona na regulação da expressão gênica e proteica dos PRs. / Introduction: uterine leiomyomata are the most common benign tumors in women of reproductive age, with an estimated incidence greater than 50% and being the most common indication for hysterectomy. Importance of ovarian steroids in the etiology of leiomyomas is well established; however, relative contributions of estrogens and progesterone in leiomyomas growth are still controversial. Many studies have presented evidences that progesterone is more important than estrogens for the development of these tumors, and antiprogestins like mifepristone have become a new possibility for conservative treatment. Clinical trials suggest that mifepristone is effective in treating leiomyomata, producing reduction of their size. However, recurrence of tumor proliferation after treatment and molecular mechanisms of mifepristone action in regulating progesterone receptors remains unknown. Therefore, the aim of this study was to evaluate the effect of mifepristone on cell proliferation and progesterone receptors A and B gene expression, in a model of leiomyoma and matched myometrium cell cultures under different hormonal conditions. Methods: human leiomyoma and matched myometrial tissues were obtained from five patients undergoing hysterectomy. Cells maintened in culture from each tissue were divided into 5 treatment groups: estradiol, estradiol and mifepristone, estradiol and progesterone, estradiol, progesterone and mifepristone, and control group (ethanol as a vehicle from hormones). Immunocytochemistry analysis for α-actin was performed. Cell proliferation was evaluated by hemocytometer counting and MTT assay at day 7 (after mifepristone treatment) and day 9 (after recovery from treatment). RNA extraction was performed at day 7 to evaluate progesterone receptors (PRs) A and B expression by real time PCR. Results: culture cell establishment was confirmed by positive staining for α-actin and by observed morphological characteristics from smooth muscle cells. Cell proliferation evaluating techniques, hemocytometer counting and MTT, showed positive correlations. Estradiol treatment increased cell proliferation for leiomyoma and myometrium cells compared to control group. Progesterone combined to estradiol increased cell proliferation in both cell types, compared to estradiol alone and control group. For both hormonal treatments, leiomyoma showed significantly higher proliferation than myometrial cells. At day 7, mifepristone treatment in association with estradiol inhibited cell proliferation in leiomyoma (42%) and myometrial cells (23%), compared to the same tissue treated with estradiol alone. Mifepristone treatment in association with estradiol and progesterone also inhibited cell proliferation in leiomyoma (105%) and myometrial cells (56%), compared to the same tissue treated with estradiol and progesterone. At day 9, after recovery from mifepristone treatment, myometrial cells showed greater proliferative response than leiomyoma cells. However, mifepristone treatment was not able to completely inhibit cell proliferation, whereas treated groups showed increased proliferation from day 7 to 9. We have found that two isoforms of PRs, A and B, were expressed in both myometrial and leiomyoma in vitro; however, comparisons between groups were not possible due to the small sample size. Conclusions: primary myometrial and leiomyomata cell cultures are a viable model for cell proliferation analysis under different hormonal conditions, and MTT assay could also be a good evaluation method. Mifepristone inhibited cell proliferation of both types of tissue, with maximum effect in association with estradiol and progesterone in leiomyoma cells. PRs A and B were expressed in myometrial and leiomyoma cells in vitro. Further investigation is needed to clarify whether mifepristone regulates gene and protein expression of PRs.

Introdução: A glândula prostática depende de hormônios esteróides para ter um adequado desenvolvimento e funcionalidade secretora. Com o avanço da idade, surgem alterações no tecido prostático junto com outras doenças da próstata. As duas formas, clinicamente, mais importantes e prevalentes do crescimento anormal da próstata são hiperplasia prostática benigna (HPB) e câncer de próstata (CaP). Estas doenças são o resultado de alterações do ciclo celular que é regulado por dois processos: a proliferação e a apoptose. Estes processos são regulados pela expressão do produto de genes, tais como o p53, MDM2, p21, Bcl2 e Bax. Objetivos: Avaliar a proliferação celular em cultura primária de células prostáticas tratadas com diferentes concentrações de diidrotestosterona (DHT); verificar os níveis do mRNA do Bcl2, Bax, p53, MDM2 e p21 em cultura primária de células prostáticas tratadas com diferentes concentrações de DHT; determinar os níveis do mRNA do Bcl2, Bax, p53, MDM2 e p21 em tecido proveniente de HPB e CaP e avaliar a razão de chance de ter CaP. Métodos: Para realização das culturas primárias foram utilizados amostras de tecido com diagnóstico de HPB. As células prostáticas epiteliais e estromais foram semeadas separadamente para a análise de proliferação celular e para a expressão gênica. Os grupos referentes ao tratamento foram divididos em subgrupos tratados com diferentes doses de DHT e com o antiandrogênio hidroxiflutamida (OH-FLU): grupo controle (meio de cultivo suplementado com 5% de SBF desteroidado), grupo DHT 10-8 M, grupo DHT 10-13 M, grupo OH-FLU 10-6 M, grupo DHT 10-8 M associado com OH-FLU 10-6 M e o grupo DHT 10-13 M associado com OH-FLU 10-6 M. Para a avaliação da proliferação celular as células em cultura foram avaliadas por MTT. Para a avaliação da expressão gênica foi realizada a extração total do RNA das células em cultura seguido por PCR em tempo real. Para avaliar a expressão gênica de tecido, as amostras com HPB e com CaP foram submetidas ao protocolo da extração do RNA total seguido pela técnica da PCR em tempo real. Resultados: A avaliação da proliferação celular das células prostáticas epiteliais, tratadas com DHT 10-13M, apresentou um aumento de 33% na proliferação celular e as células tratadas com DHT 10-8M, OH-FLU 10-6M, DHT 10-13M associada com OH-FLU 10-6M e DHT 10-8M associada com OH-FLU 10-6M apresentaram um aumento na proliferação de 24%, 31%, 25% e 21% respectivamente, quando comparadas com o grupo controle. As células prostáticas estromais, em cultura, tratadas com diferentes doses do hormônio apresentaram uma variação na proliferação celular menor que 10% quando comparadas com o grupo controle. A expressão gênica do MDM2, p53, p21, Bcl2 e Bax das células prostáticas epiteliais e estromais, tratadas com diferentes concentrações de DHT, não mostrou diferença estatisticamente significativa. A expressão do RNAm, no tecido prostático, dos genes MDM2, p53, p21, Bcl2 mostrou um aumento estatisticamente significativo em CaP quando comparado com o grupo HPB. O gene Bax que não mostrou diferença significativa quando comparado com o grupo HPB. A partir da escolha do melhor ponto de corte da curva ROC, nossos resultados mostraram que indivíduos que apresentam a expressão de MDM2 acima de 2,89 a razão de chance de o indivíduo ter CaP aumentada 69 vezes. Para a expressão dos genes p53, p21, Bcl2 e Bax, quando apresentarem uma expressão mais alta que o valor do ponto de corte a chance de ter CaP aumentam 15, 31, 17 e 4 vezes respectivamente. As expressões dos genes MDM2 e p21 apresentaram boa sensibilidade e ótima especificidade quando comparado ao PSA. Já os genes p53 e Bcl2 apresentaram boa sensibilidade e especificidade e Bax mostrou uma boa sensibilidade, mas uma baixa especificidade quando comparado ao PSA. Baseado nos dados de especificidade e sensibilidade foram avaliados os testes em paralelo e em série, em que a análise em paralelo apresentou melhor sensibilidade do que especificidade e a análise em série se mostrou mais específica do que sensível. Conclusões: O modelo de cultura primária de células para avaliar a proliferação celular é viável. As células prostáticas epiteliais e estromais, tratadas com DHT, não apresentaram diferença significativa na expressão gênica entre os grupos. O aumento da expressão gênica nas amostras de CaP indicam que os genes MDM2, p53, p21 e Bcl2 podem estar envolvidos no desenvolvimento do câncer de próstata. De acordo com as análises em série estes genes podem ter uma grande importância na clínica quando avaliados em série com o PSA para confirmar o diagnóstico de CaP em pacientes com níveis de PSA elevados, exame de toque retal alterado e biópsia negativa. / Introduction: The prostate gland depends on the steroid hormones to have. an adequate development and secretory functionality With the advancing age, changes occurs in prostate tissue with other prostate diseases. The two forms clinically most important and prevalent of abnormal growth of the prostate gland are benign prostate hyperplasia (BPH) and prostate cancer (PCa). These diseases are the result of changes in cell cycle which is maintained by two processes: proliferation and apoptosis. These processes are regulated by expression of gene product, such as the p53, MDM2, p21, Bcl2 and Bax. Aims: To evaluate the cell proliferation in primary cultures of prostatic cells treated with different concentrations of dihydrotestosterone (DHT), to verify the levels of RNAm of Bcl2, Bax, p53, MDM2 and p21 in primary culture of prostatic cells treated with different concentrations of DHT; to determine levels of mRNA of the Bcl2, Bax, p53, MDM2 and p21 in tissue from BPH and PCa and to evaluate the odds ratio for PCa. Methods: To perform the primary cultures were used tissue samples with the diagnosis of BPH. The epithelial and stromal prostatic cells were plated separately for the analysis of the cell proliferation and for gene expression. The groups regarding to the treatment were divided into subgroups treated with different doses of DHT and the antiandrogen hidroxiflutamide (OH-FLU): control group (culture medium supplemented with 5% of charcoal -treated FBS), group DHT 10-8 M, group DHT 10-13 M, group OHFLU 10-6 M, group DHT 10-8 M associated with OH-FLU 10-6 M and the group DHT 10-13 M associated with OH-FLU 10-6 M. For the evaluation of cellular proliferation cells in culture was evaluated by MTT. For the evaluation of gene expression, was performed the total RNA extraction for the cells in culture and real time PCR. To evaluate the gene expression of tissue, the samples with BPH and with PCa were submitted to the extraction of total RNA followed by the technique of real time PCR. Results: The evaluation cell proliferation for the prostatic epithelial cells, treated with DHT 10-13M, presented an increase of 33% in the cell proliferation and the cells treated with DHT 10-8M, OH-FLU 10-6M, DHT 10-13M associated with OH-FLU 10-6M and DHT 10-8M associated with OH-FLU 10-6M showed an increase in the proliferation of 24%, 31%, 25% e 21% respectively, when compared with the control group. Prostatic stroma cells, in culture, treated with different doses of hormone showed a variation in cell proliferation of less than 10% when compared with the control group. The gene expression of MDM2, p53, p21, Bcl2 and Bax of prostatic epithelial and stroma cells, treated with different concentrations of DHT, do not show statistically significant difference. The expression of mRNA into the prostatic tissue of the genes MDM2, p53, p21, Bcl2 showed an increase statistically significant in PCa when compared with the group BPH. The Bax gene did not show significant difference when compared with the group BPH. From the choice of best cut point of the ROC curve, our results showed that person that presented the expression of MDM2 above 2.89, the chance of the individual to have PCa is increased 69 fold. For expression of the genes p53, p21, Bcl2 and Bax, when they presenting an expression higher than the value of the cut point, the chance to have PCa increased 15, 31, 17 and 4 folds respectively. The expressions of the genes MDM2 and p21 showed a good sensibility and optimal specificity when compared to the PSA. Since the genes p53 and Bcl2 showed a good sensibility and specificity, and Bax showed a good sensibility, but a low specificity when compared to the PSA. Based on sensibility and specificity data, were evaluated the tests in parallel and in series, in which the analysis in parallel showed better sensibility than specificity, and the serial analysis was more specific than sensitive. Conclusions: The model of the primary culture of cells for assessment of cell proliferation is viable. The prostatic epithelial and stromal cells, treated with DHT, not show significant difference in gene expression between groups. The increase of the gene expression in the samples of PCa indicate that the genes MDM2, p53, p21 and Bcl2 may be implicated into the development of prostate cancer. In accordance with the analyzes in series, these genes may have an great importance in the clinical when evaluated in series with the PSA to confirm the diagnosis of PCa in patients with elevated levels of PSA, digital rectal examination altered and biopsy negative.

Mais de 90% dos indivíduos alcoolistas são fumantes e fumantes consomem duas vezes mais álcool que não fumantes. Uma justificativa para a elevada frequência do uso concomitante dessas duas drogas de abuso seria reduzir os efeitos indesejáveis e prolongar os efeitos prazerosos de ambos. Embora muitos estudos avaliem o efeito isolado dessas duas drogas sobre funções do sistema nervoso central, poucos avaliam o efeito da associação. Portanto, foi nosso objetivoavaliar o efeito da associação entre álcool e cigarro sobre a proliferação celular hipocampal e a memória, em ratos adultos.Ratos Wistar, machos, adultos (280 a 300g) foram divididos em grupos(n = 10/grupo): a) TAB: expostos diariamente à fumaça da queima de 6 cigarros, por 2 h, em câmara hermética com circulação de ar controlada; b) ALC: administrados com etanol, 2g/kg (20% w/v), via gavagem (VO), mantidos por 2 h em câmara com circulação de ar ambiental; c) ALCTAB: administrados com etanol (2g/kg),VO, e imediatamente após expostos à fumaça de 6 cigarros e d) CTR: administrados com salina, VO, mantidos por 2 h em câmara com circulação de ar ambiental. O tratamento se repetiu 2 vezes ao dia (9 e 14h), por 33 dias. No 25º dia do início do experimento foram avaliados para memória de trabalho no teste de reconhecimento espontâneo de objetos e no 28º (treino) e 29º (teste) para memória de longa duração no teste da esquiva inibitória. No 34º dia do início do experimento os ratos foram anestesiados com cetamina (50 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) após duas administrações de 100 mg/kg de 5-bromo-2-deoxyuridine, via intraperitoneal, 24 e 2 h antes da eutanásia. Após perfusão transcardíaca para fixação do encéfalo os cérebros foram removidos para posterior inclusão em parafina. Células imunorreativas foram quantificadas na camada granulare zona subgranular do giro denteado do hipocampo dos ratos. Os resultados foram analisados por análise de variância (ANOVA) de uma via, seguida do teste de Bonferroni para detecção de diferença entre os grupos (P< 0,05). O sangue troncular de alguns ratos foi coletado para determinação de parâmetros bioquímicos. Nossos resultados mostraram queálcool,cigarroou sua associação não afetaram a memória de trabalho ou a memória de longa duração. No entanto, a associação ALCTAB reduziu em cerca de 60% a proliferação celular hipocampal. Adicionalmente, observamos que o uso de álcool, isoladamente,reduziu a proliferação hipocampalem 40% e a exposição ao cigarro, em 20%. O consumo hídrico aumentou de modo significativo para o grupo ALCTAB, do mesmo modo que a glicemia. Portanto, nossos resultados indicam que a associação entre álcool e tabaco afeta negativamente a proliferação celular hipocampal de ratos. A redução observada nos animais ALCTAB resulta da soma dos efeitos observados nos grupos ALC e TAB isoladamente, sugerindo um efeito aditivo. Todavia, não observamos efeitos na memória de trabalho ou na de longo prazo, possivelmente relacionados à exposição de doses moderadas de álcool ou exposição à fumaça de pouco cigarros ao dia. Não descartamos, contudo, que um tempo maior de exposição possa afetar esses parâmetros. / More than 90% of alcoholics are smokers and smokersdrink twice than nonsmokers. One possible reason for the high frequency of concomitant use of these two drugs of abuse could be related to decreasing on undesirable effects and prolong the pleasurable effects of both. Although there are many studies evaluating the effect of these two drugs in the central nervous system, few studies evaluate the effect of the combination between alcohol and tobacco. Therefore, our objective was to evaluate the effect of the association between alcohol and cigarette smoking on hippocampal cell proliferation and memory in adult rats. Male Wistar rats, adult (280 to 300g) were divided into groups (n = 10/group): a) TAB: daily exposed to the smoke from burning of 6cigarettes for 2 h in hermetic chamber with controlled air circulation; b) ALC: administrated with ethanol 2g/kg (20% w / v), by gavage (PO), kept for 2 h in a chamber with air circulation environmental c) ALCTAB: administrated with ethanol (2g/kg) PO, and immediately after exposure to 6cigarette smoke and d) CTR: administered with glucose solution (5%0 , PO, kept for 2 h in a chamber with air circulation environment. The treatment was repeated twice a day (9 a.m. and 2 p.m.) for 33 days. On the 25th day of the beginning of the experiment rats were assessed for working memory the in the novel spontaneous objects recognition task and 28th (training) and 29th(test) to long-term memory in inhibitory avoidance test. After 34 days from the beginning of the experiment, rats were anesthetized with ketamine (50 mg / kg) and xylazine (10 mg / kg) after two administrations of 100 mg/kg of 5-bromo-2-deoxyuridine, intraperitoneally, 2 h before the euthanasia. After transcardiac perfusion the brain were fixed and included in paraffin. Immunoreactive cells were quantified in the granular layer and subgranular zone of the dentate gyrus(GD) of the hippocampus of rats. Results were analyzed by analysis of variance (ANOVA)-one way followed by the Bonferroni test for detecting difference between groups (P <0.05). Biochemical parameters were analyzed from the trunk blood of some rats. Our results showed that alcohol, cigarettes or their association did not affect working memory or long term memory. However, the association ALCTAB reduced the hippocampal cell proliferation by about 60%. Additionally, we observed that the use of alcohol alone reduced hippocampal proliferation by 40% and exposure to smoking in 20%. The water consumption increased significantly in the group ALCTAB in the same way that blood glucose levels. Therefore, our results indicate that the association between alcohol and tobacco negatively affects hippocampal cell proliferation in rats. Decreasing on cell proliferation in the ALCTAB group can be taken as the sum from ALC and TAB groups, suggesting an additive effect. However, we observed no effects on working memory or long-term memory, possibly related to exposure to moderate doses of alcohol or few cigarettes smokes along the day. We do not discard that longer exposition would affect these parameters.

Submitted by Chaylane Marques (chaylane.marques@ufpe.br) on 2015-03-13T19:08:11Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE_DOUTORADO 2012 - Cynarha Daysy Cardoso da Silva.pdf: 3444226 bytes, checksum: a9c71962304b89acd2a0635de279f563 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-13T19:08:11Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE_DOUTORADO 2012 - Cynarha Daysy Cardoso da Silva.pdf: 3444226 bytes, checksum: a9c71962304b89acd2a0635de279f563 (MD5) Previous issue date: 2012-07 / CNPQ / As lectinas são um grupo de proteínas que se ligam especificamente a carboidratos e aglutina diferentes células através da ligação a glicoconjugados da superfície celular. A propriedade de ligação a carboidratos determina a classe da lectina que é promovida pelo domínio de reconhecimento de carboidratos (CRD). O estudo com lectinas de peixes propriedade, funções e eventos biológicos foi apresentado em forma de artigo de revisão. A lectina do soro de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus), OniL, foi parcialmente purificada e caracterizada. A pré-purificação foi realizada por precipitação com sulfato de amônio (fração 20-40%), F2, seguida de diálise, atividade hemaglutinante e inibição da atividade hemaglutinante. A fração foi cromatografada em matriz de afinidade (Con A-Sepharose 4B) e eluída com metil-α-D-mannopyranosideo (200 mM) em TBS seguida de diálise para avaliar suas características bioquímicas como: especificidade a caboidratos, teste de temperatura e íons, SDS-PAGE e PAGE. Nos ensaios imunológicos, in vitro, foram analisados índices de citotoxidade e proliferação, produção de citocinas, viabilidade celular e tipo de resposta imune em culturas de esplenócitos de camundongos BALB/c. No ensaio de citotoxidade, seis concentrações (100, 50, 25, 10, 5 e 1 μg/mL) de OniL foram analisadas por 24 h; saponina foi empregada como um controle positivo; para avaliar a atividade proliferativa, células foram tratadas por 72 h com OniL (2,5, 5 e 10 μg/mL) ou Con A (2,5 μg/mL) comparando com o controle; a citotoxidade e proliferação dos compostos foi determinada comparando o percentual de incorporação da [3H]-timidina como indicador de viabilidade celular usando radiação beta counter. A produção de citocinas (IL-2, IL-6, IL-10 e IFN-γ) foi determinada por ELISA; sobrenadantes de cultura não tratadas foram considerados controles; as culturas foram estimuladas durante 24, 48, 72 h e 6 dias com concentrações de 10 μg/mL de OniL e 2,5 μg/mL de Con A, este último tratamento considerado o controle positivo. A morte celular, analisada por citometria de fluxo, foi verificada com marcadores Anexina V-FITC e Iodeto de Propídeo. Os esplenócitos foram estimulados por 24 e 48 h com OniL (10 μg/mL) e Con A (2,5 μg/mL); células marcadas com Anexina-FITC (negativa) e Iodeto de propídeo (positivo) foram consideradas necróticas; Anexina-FITC (positiva) e Iodeto de Propídeo (negativa), apoptóticas. O método colorimétrico de Griess avaliou a concentração de nitritos dos sobrenadantes de culturas tratadas com OniL (10 μg/mL) e Con A (2,5 μg/mL) nos tempos de 24, 48, 72 h e 6 dias de incubação. F2 e OniL apresentou atividade hemaglutinante específica de 330,3 e 94,7, respectivamente. A lectina purificada apresentou um rendimento de 31,1%; OniL, aglutina eritrócitos de coelho (título, 64-1) e eritrócitos humanos A, B, AB e O (título, 8-1, 64-1, 4-1 e 32-1, respectivamente); a atividade hemaglutinate foi detectada numa faixa de pH entre 7,0 e 11,0 e foi completamente preservada após o aquecimento de 10 min a 25, 30, 40, 50 e 60 °C, porém a atividade foi completamente abolidas após 70 °C. A adição de um agente quelante de Ca2+, EDTA, diminuiu a atividade revelando que OniL é uma lectina cálcio-dependente. O peso molecular foi de 17 kDa na SDS-PAGE em condições não redutoras; e 11 e 6,6 kDa na presença de uma agente redutor a proteína apresentou duas subnidades ligadas por pontes disulfeto; OniL apresentou-se, através de PAGE, como uma proteína ácida com banda única de polipeptídeo. Os ensaios imunológicos revelaram que OniL não é citotóxica para esplenócitos de camundongos e induziu alta produção de citocinas em relação ao controle: IFN-γ (24 h), IL-2 e IL-6 em todos os tempos analisados. Porém, a produção de IL-10 e concentrações de nitritos foram baixas quando comparadas com o controle; OniL apresentou atividade proliferativa em relação ao controle para todas as concentrações e não induz morte celular significativa nos tempos analisados. A lectina purificada do soro de tilápia (Oreochromis niloticus) é manose-específica, não apresenta citotoxidade para esplenócitos, com atividade imunomoduladora induzindo produção de citocinas para diferenciação e proliferação de células preferencialmente Th1 CD4+, assim, esta proteína pode ser utilizada como um potente agente mitogênico em mamíferos.

Orientadores: João Ernesto de Carvalho, Wanda Pereira Almeida / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-05T13:14:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kohn_LucianaKonecny_D.pdf: 3966647 bytes, checksum: 884bfab3a168fe2feddf628f0cc13684 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Os adutos de Baylis-Hillman apresentam em sua estrutura grupos funcionais passíveis de interação com biomoléculas, tornando-os potentes protótipos para o desenvolvimento de novas drogas antineoplásicas. O objetivo deste estudo é avaliar a atividade anticâncer de alguns b-hidroxiacrilatos e alguns derivados hidrogenados e protegidos. As substâncias contendo ligação dupla conjugada a carbonila foram obtidas através da reação de Baylis-Hillman, catalisada por DABCO, entre acrilato de metila e o aldeído correspondente. Os derivados hidrogenados e os protegidos foram obtidos pelo tratamento do aduto correspondente com hidrogênio (H2, Pd/C) e cloreto de trietilsilila, respectivamente. Os testes in vitro foram realizados com sete linhagens: UACC-62 (pele tipo melanoma), MCF-7 (mama), NCI-H460 (pulmão), OVCAR-3 (ovário), PC-03 (próstata), 786-0 (rim) e NCI-ADR (mama resistente) em diferentes concentrações (0,25 a 250mg/mL). Os resultados foram obtidos através do ensaio do doseamento protéico pela sulforrodamina B.Os adutos aromáticos apresentaram atividade antiproliferativa significativa, enquanto seus derivados hidrogenados não inibiram o crescimento celular. Em relação aos diferentes substituintes do anel aromático, o aduto 9 apresentou maior efeito citocida, porém sem seletividade. Já o aduto 10, com substituinte doador de elétrons, apresenta seletividade para a linhagem de carcinoma ovariano. O aduto 4 com substituinte retirador de elétrons, apresentou o melhor perfil de atividade com potência elevada, concentração-dependente e seletividade. O fato do grupo NO2 ser fortemente retirador de elétrons parece ter sido decisivo para a atividade, visto que é o único fator diferencial do aduto com substituintes doadores.O aduto 4 foi selecionado para verificação de sua toxicidade e possível(is) mecanismo(s) de ação. A dose letal 50 (DL50) em camundongos Swiss foi de 1,3g/Kg de peso corporal animal, sendo considerado de baixa toxicidade segundo Loomis em ¿Fundamentos de Toxicologia¿. As alterações morfológicas desta substância sobre a linhagem de ovário (OVCAR-3) estão em concordância com o resultado obtido no teste de atividade antiproliferativa, uma vez que manteve uma resposta concentração dependente, com um aumento da citotoxicidade em relação à dose utilizada e a morte celular pelo processo de apoptose. A possibilidade de o aduto estar inibindo a proliferação celular através de intercalação na dupla fita de DNA foi descartada através do ensaio DNA methyl green no qual o aduto 4 não apresentou atividade quando comparado a doxorrubicina, a qual apresentou intercalação concentração dependente na faixa de 32 a 82%, confirmando assim nossa hipótese que o aduto não intercalaria com a dupla fita de DNA. Quando foi avaliada a interferência do óxido nítrico (NO) na atividade antitumoral pode-se observar claramente a perda de atividade da substância quando a cultura foi pré-tratada com L-NAME para a linhagem NCI-ADR e diminuição do potencial da atividade para as demais linhagens; com o pré-tratamento com AMG só ocorreu a diminuição da atividade. A quantificação enzimática permitiu concluir que a atividade do aduto 4 tem correlação com a NOs constitutiva dependente de cálcio (nNOs e eNOs). Os resultados interessantes com os inibidores da NOs sobre a linhagem de mama (NCI-ADR) que expressa o fenótipo de resistência a múltiplas drogas (MDR) sugere a hipótese dessa substância ter alguma correlação com o processo de resistência. Dessa forma, tanto o derivado 4 como a doxorrubicina tiveram sua atividade anticâncer avaliada na presença de um bloqueador de canais de Ca+2, o verapamil. Verificou-se que a atividade da doxorrubicina aumenta significantemente na presença do verapamil sem alterações na atividade do aduto 4. Esse resultado descarta a hipótese de que esta substância tenha envolvimento com o processo de resistência.Conclui-se que os adutos de Baylis-Hilman apresentam atividade antiproliferativa ¿in vitro¿ em células tumorais humanas sendo esta dependente o sistema a-b insaturado e anel aromático presente na estrutura. O padrão toxicológico observado na análise permite dizer que a morte celular ocorre por apoptose e possui baixa atividade em fibroblastos normais. A toxicidade ¿in vivo¿ foi avaliada como ligeiramente tóxico / Abstract: Baylis-Hillman adducts present in their structures functional groups capable to interact with biomolecules. This capacity makes them good lead compounds for the design of anti-neoplastic drugs. This study is focusing on anticancer activity evaluating for some b-hydroxyacrylates and their hydrogenated or O-protected derivatives. Baylis-Hillman adducts of this study were obtained from reaction between an aldehyde and methyl acrylate in the presence of 1,4-diazabicyclo-2,2,2-octane (DABCO). Hydrogenated or O-protected BHAs-derivatives were produced from the hydrogenation (H2, Pd/C) or treatment of correspondent BHA-precursor with triethylsilil chloride and triethylamine. In vitro tests were performed against the following human tumor cell lines: UACC62 (melanoma), MCF-7 (breast), NCI-460 (lung), OVCAR-3 (ovarian), PC-03 (prostate), 786-0 (renal), NCI-ADR (multi-resistant breast). BHAs concentration were employed in the range of 0.25 - 250 mg/mL and doxorubicin (DOX, at the sameconcentration range), as positive control. Cell proliferation was determined by spectrophotometric assay using sulforhodamine B as protein-binding dye. Aromatic adducts displayed significant antiproliferative activity while their hydrogenated derivatives were not able to inhibit cell growth. Concerning to different groups attached in the aromatic ring, adduct 9 presented the highest cytotoxic activity, however with no selectivity. On the other hand, adduct 10, which possess an electron-donating group in the aromatic ring, show to be selective for OVCAR-3 (ovarian cancer cell). Electron-withdrawing group (-NO2 in adduct 4) improved both potency and selectivity of Baylis-Hillman adduct. These results showed that the presence of electron-withdrawing groups in the aromatic is very important for determining high activity of this Baylis-Hillman adduct. Based on this, adduct 4 was chosen for verifying of its toxicity on mice swiss as well as the possible mechanism of action of this molecule. Lethal dose (LD50) was shown to be 1.3 g of adduct 4/Kg of corporeal weight mouse, demonstrating that this compound has low toxicity according to Loomis (Fundamentos de Toxicologia). In addition to this, morphological modifications caused by adduct 4 on OVCAR-3 are in agreement with results obtained in the antiproliferative activity assays where it was observed a concentration-dependent effect of this compound. DNA methyl green assay demonstrated that the adduct 4 is not able to bind DNA as compared to doxorubicin a positive control. Interestingly, pre-treatment of NCIADR with Nitric Oxide Synthase (NOS) inhibitor NG-Nitro-L-arginine methyl ester (LNAME) abolished the antiproliferative activity of adduct 4. No significant loss of activity for adduct 4 was observed on the other cancer cell lines when they were pre-treated with LNAME. Only slight decrease of adduct 4 activity studied was observed on all cancer cell lines under pre-treatment with NOS-inducible inhibitor aminoguanidine (AMG) suggesting that the antiproliferative activity of adduct 4 on NCI-ADR is related to the increase of constitutive NOS activity. However, measurement of NOS activity using substrate labeled with 14C showed decreasing in the activity of constitutive NOS (nNOS and eNOS) according to the time of NCI-ADR cells exposure to adduct 4. Although these results are not conclusive, it is noteworthy the involvement of NOS enzyme in the antiproliferative activity of adduct 4 on NCI-ADR cells. Since NCI-ADR cells present multiple drugs resistance (MDR) and considering the participation of NOS enzymes it seems that the effect of adduct 4 may be related to the resistance process of these cells. Nevertheless, the antiproliferative activity of adduct 4 on NCI-ADR in the presence of the calcium channels blocking verapamil revealed that no alteration on adduct 4 activity was observed suggesting that calcium channels are not involved in the mechanism of action of this adduct. Overall, these results indicate that Baylis-Hillman adducts present in vitro antiproliferative activity against different human cancer cell lines. This activity is associated to the presence of a,b-unsaturated system and aromatic ring. Among the compounds studied, adduct 4 was the most active and selective compound. Besides this, the high cytotoxic activity of adduct 4 against cancer cells appears to be specific for tumor cells since in vivo assay demonstrated low toxicity of this compound (1.3 g/Kg) on mice as well as low in vitro activity on normal fibroblasts. Cell death caused by adduct 4 presents hallmarks of apoptotic process / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Konradin Metze / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-21T22:13:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Neder_Fatima_M.pdf: 6673289 bytes, checksum: 387ff07bef49552d9e818ac22bbe569d (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: As regiões organizadoras do nucléolo (NORs) são áreas de DNA extra ou intranucleolares, contendo genes que codificam o RNA ribossomal. Estas regiões têm grande afinidade com a prata, em virtude da presença de proteínas não- histonas associadas ao RNA ribossomal e, por isso, são chamadas de AgNORs. o estudo das AgNORs tem sido utilizado predominantemente para avaliar proliferação celular, distinguir tumores malignos, de benignos, e como indicador prognóstico em neoplasias. Entretanto, a grande variedade de métodos utilizados para medir ou contar AgNORs, nos diferentes estudos, toma dificil a comparação de resultados. A escassez de trabalhos que avaliem a morfologia e a evolução das AgNORs em tecidos normais em desenvolvimento, e a falta de estudos ultra-estruturais sobre estas regiões, que poderiam contribuir para uma padronização de sua contagem, estimulou-nos a essa pesquisa.. O tecido escolhido para o estudo foi o do miocárdio de ratos em desenvolvimento intra e extra-uterino. Utilizamos o ventrículo esquerdo do coração de 95 ratos, entre o 16Q dias após a concepção e 60Q dias pós-parto, subdivididos em dois grupos: a) 16, 19 e 21 dias de vida pré-natal e b) 1,5, 8, 21 e 60 dias de vida pós-natal. Para o estudo em microscopia óptica (M. O.) utilizamos 74 animais e, para a microscopia eletrônica (M.E.), 21. O material para M. O. foi fixado em formalina tamponada 10% durante 1 hora e incluído em parafina. Os cortes de 31lm foram desparafinados e corados pela técnica de AgNOR, descrita por CROCKER & NAR (1987). Como não encontramos na literatura uma técnica para evidenciar as estruturas das AgNORs em microscopia eletrônica, desenvolvemos um procedimento novo, empiricamente, no qual não utilizamos tetróxido de ósmio, acetato de uranila e citrato de chumbo, com o intuito de assegurarmos que qualquer precipitação elétron-densa poderia ser atribuída a prata. As AgNORs foram subdivididas em "clusters" (que correspondem ao nucléolo) e pontos ("dots"). O estudo ultra-estrutural mostrou que, o "cluster" é constituído por um conjunto de precipitações de prata, interligadas entre si por faixas mais claras, dentro de uma matriz pouco elétron-densa. O "dot" é apenas uma precipitação escura, sem matriz. A partir destas observações, adotamos o critério de contar o cluster (nucléolo) como uma unidade, visto que a contagem individual de precipitações de prata, dentro dele, pareceunos pouco reproduzível e arbitrária. Os cardiomiócitos dos ratos fetais (16, 19 e 21 dias) e com 1,5 dias após o nascimento apresentaram um índice maior de "clusters" de AgNORs de grande tamanho, quando comparados com os de animais de 8, 21 e 60 dias após o nascimento. Esta diferença provavelmente está relacionada à atividade proliferativa da célula, que é maior na vida intra-uterina. O aparecimento de maior quantidade de "dots", nos animais com 60 dias de vida após o nascimento, foi interpretado como provável indicador de nova síntese protéica, necessária para o complexo miofibrilar. Qualitativamente, entre as idades de 16, 19 e 21 dias de vida intra-uterina e 1,5 dias pós-natal e entre 8, 21 e 60 dias após o nascimento, dificilmente conseguimos distinguir diferenças na estrutura morfológica dos "clusters" das AgNORs. Podemos observar diferenças em relação ao tamanho dos "clusters" das AgNORs, em todas as idades, com análise quantitativa. Em determinados núcleos dos cardiomiócitos, encontramos duas, três ou mais AgNORs alinhadas, o que chamamos de fenômeno de alinhamento. Nas idades de 1<6, 19 e 21 dias de vida intra-uterina e 1,5 pós-natal foi encontrada uma baixa porcentagem das AgNORs alinhadas, enquanto nos núcleos dos animais com 8, 21 e 60 dias ap'os o nascimento, o alinhamento das AgNORs apresentou maior freqüência e quantidade. A análise discriminante mostrou, para a separação das idades, que: a. os números dos núcleos com alinhamento das AgNORs, têm, em geral, importância maior que os números médios das AgNORs (57,3). b. dentro das variáveis que dependem do tamanho das AgNORs, as precipitações maiores que 2 J.1m são as mais importantes (36,5). Os dados morfométricos das AgNORs permitiram a determinação exata da idade do animal em 79,7% dos casos / Abstract: Nuc1eolar organizing regions (NORs) are areas of extra or intranuc1eolar DNA which harbor genes coding for ribosomal RNA. NORs have intense affinity for silver, which stains dots in the acrocentric chromosomes 13, 14, 15,20 and 21. These are called argyrophilic NORs or AgNORs. This is due to the presence of non-histone proteins associated to ribosomal RNA recently transcribed from DNA. Currently, the AgNOR technique is being employed in the evaluation of cellular proliferation, in distinguishing benign from malignant tumors and as an indicator of prognosis in malignant neoplasms. There has been considerable controversy in the criteria for measuring or counting AgNORs, making comparison of results from different authors often difficult. In an attempt to help define criteria for AgNOR measuring in light microscopy, we developed a technique for examining AgNORs in electron microscopy. A normal tissue, the rat heart left ventric1e in the fetal and postnatal periods as used. A total of95 animais were studied at the following ages: 16, 19 and 21 pre-natal days; 1, 5, 8,21 and 60 days after birth. For light microscopy 74 animais were used, and 21 for electron microscopy. For light microscopy, material was fixed in 10% buffered formalin for one hour, dehydrated and c1eared as usual and embedded in paraffin. Three f..lm sections were stained for AgNORs by the technique ofCrock~r & Nar (1987), slightly modified. As no EM technique for AgNORs was found in the literature, we developed the following procedure empirically: tissue was fixed in Karnovsky' s solution for one 110ur, followed by a quick rinse (3-5 seconds) in ethanol-acetic acid and incubated for 30 minutes in a solution containing 1 volume of 2% gelatine dissolved in 1 % formic acid and 2 volumes of 50% aqueous silver nitrate. Solution was prepared and Millipore filtered just before use. Tissue blocks were then dehydrated in ascending alcohols and embedded in Araldite. We avoided using osmium tetroxide, uranyl acetate or lead citrate to ensure that any electrondense precipitations could be reliably attributed to silver. EM revealed that an AgNOR c1uster is formed by a group of silver precipitations intermingled with lighter strands and embedded in electronlucent matrix. The clusters correspond to the nucleolus itself. An AgNOR dot is a single dark precipitation containing no matrix. Based on these observations, we adopted the criterion of counting a cluster (a nucleolus) as a single unit, since the counting of individual silver precipitations within a cluster proved unreliable and somewhat arbitrary. Exaroination of cardiomyocytes disclosed that large AgNOR clusters were more numerous in rats at 16, 19 and 21 prenatal days and 1,5 days postnatally than in animaIs at 8,21 and 60 days after birth. This difference was interpreted as probably related to a higher proliferative activity of the celIs in intrauterine life. At 60 days there was a high number of dots. This finding was thought to be a likely indicator of new protein synthesis necessary for the formation of the myofibrillary complexo On a qualitative basis, the morphological appearance of the clusters was extremely similar, if not indistinguishable, for the ages 16, 19 and 21 prenatal days and 1,5 days postnatalIy. The saroe occurred for animaIs aged 8, 21 and 60 days postnatalIy. However it was possible to distinguish clearly between these two groups on cluster morphology alone. On the other hand, inside each group quantitative analysis showed significant differences between alI ages. In some cardiomyocyte nuclei we found three or more AgNORs on a straight line, which we designated as the aIignment phenomenon. In animaIs with ages 16, 19 and 21 prenatal days and 1,5 days postnatalIy the number ofsuch lined up AgNORs was smalI, while in those of later ages the phenomenon w~ observed with higher frequency. Discriminating analysis showed that animais of different ages could be separated using morphometric data of AgNORs in 79,7 % of cases. For this effe~ the numbers of nuclei with AgNOR aIignment has a higher importance than the average AgNOR counting.IIIAmong the variables depending on the size of the AgNORs, precipitations larger than 2 I-l are most important. The high percentage of right results in age discrimination demonstrates that the technique here described is reliable and reproducible for morphometric evaluation of AgNORs / Mestrado / Anatomia Patologica / Mestre em Ciências

Orientador: Sebastiao Roberto Taboga / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-09T02:18:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Campos_SilvanaGiselePegorinde_D.pdf: 8120725 bytes, checksum: 6e1192220bc56007d359fcae3023e8d1 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Há um grande interesse em melhor compreender a biologia da próstata devido à sua alta propensão em desenvolver lesões proliferativas, estando entre as mais comuns neoplasias que acometem o homem na atualidade. Entre os fatores de risco que contribuem para o aumento destas doenças destaca-se o envelhecimento, período em que ocorrem acentuados desequilíbrios hormonais. Vários grupos de pesquisa vêm tentando desenvolver, caracterizar e validar modelos roedores para análise do câncer de próstata sob diferentes aspectos e, modelos autóctones, têm desempenhado papel relevante nesse campo. Neste trabalho foi realizada a avaliação do comportamento biológico da próstata ventral do roedor gerbilo (Meriones unguiculatus) em fases distintas de seu desenvolvimento pós-natal. Em uma primeira etapa caracterizou-se através de análises morfológicas (estruturais e ultra-estruturais) e quantitativas os componentes celulares dos compartimentos epitelial e estromal, bem como o papel funcional de suas populações celulares na glândula. Para tanto foram utilizados gerbilos jovens, adultos e velhos. Considerando a próstata de animais jovens, constatou-se que nestes a glândula encontra-se estrutural e funcionalmente imatura. Já em animais adultos e velhos a atividade sintética está bem estabelecida e permanece estável nestas duas idades. Entretanto, a morfologia prostática em animais velhos apresentou-se diferenciada. Em uma mesma glândula puderam ser constatadas regiões funcionais com epitélio secretor semelhante aos adultos e, em outras, áreas completamente alteradas, dispondo de lesões histopatológicas. O comportamento prostático nas três fases do desenvolvimento analisadas foi diretamente influenciado pelos níveis de testosterona no soro, comprovando a importância desse andrógeno para homeostase e funcionalidade glandular. E, em animais velhos, o declínio de testosterona esteve associado a alterações proliferativas na glândula. Devido a essas constatações em uma segunda etapa, avaliou-se, exclusivamente, a próstata de animais velhos com o intuito de se caracterizar os principais tipos de lesões que podem acometê-la. As alterações mais freqüentes foram de origem epitelial, como as neoplasias intra-epiteliais (PIN), carcinomas microinvasivos e adenocarcinomas. O potencial invasivo das células anômalas pôde ser comprovado ultra-estruturalmente através da ruptura da membrana basal em alguns ácinos. No estroma, hiperplasia celular, quando constatada, esteve sempre associada a sítios de epitélio anômalo. Adicionalmente, uma maior deposição de fibrilas de colágeno (gerando fibrose estromal) foi encontrada em todos gerbilos velhos analisados. Parâmetros nucleares e nucleolares somente não foram efetivos para diagnosticar o potencial de severidade das alterações. Os índices de proliferação e morte celular, porém indicaram maior turnover celular à medida que alterações histopatológicas tornaram-se invasivas. A partir destes dados constatou-se que o gerbilo é um bom modelo para análise do comportamento prostático em diferentes fases do desenvolvimento pós-natal. Adicionalmente, o animal velho tem alta propensão em desenvolver alterações prostáticas espontâneas e estas podem auxiliar na melhor compreensão da evolução biológica do câncer prostático humano propriamente / Abstract: There is a great interest in understanding the prostate biology due to its high propensity in developing proliferative lesions. At the present time, this kind of illnes is one of the most common neoplasias which may damage men. Among the risk factors that contribute to the prostate cancer increase stands out aging, period when an accentuated hormonal unbalances happens. Several research groups are trying to develop, characterize and validate rodent models for analysis of the prostate cancer and, autochthonous models have been playing a relevant role in these aspects. In the present work, the biological behavior evaluation of the ventral prostate of gerbil rodent (Meriones unguiculatus) was accomplished in three different phases of postnatal development. Initially, the cellular components of epithelial and stromal compartments, as well as, the functional activity of those cellular populations in the gland were characterized through morphologic (structural and ultrastructural) and quantitative analyses. For this, young, adult and old gerbils were employed. Considering the prostate of young animals, it was verified that the prostate gland is structural and functionally immature. In adult and old animals the synthetic activity is well established and remained stable. However, in old animals, the prostatic morphology presented alterations. In a same gland it could be observed functional areas with a secretor epithelium similar to adults and regions completely modified, exhibiting histopathologic lesions. The prostatic behavior in the three phases of development was influenced directly by the serum testosterone levels, proving the importance of this androgen for glandular homeostasis and its functionality. In the old animals the testosterone decline was associated to the proliferative alterations presented in the gland. Because of these results, in a second stage of experiments, it was evaluated only the prostate of old animals with the purpose of characterizing the main types of lesions which may be develop in these gerbils. The most frequent changes noted were those originated in the epithelium, as the prostatic intraepithelial neoplasia (PIN), microinvasive carcinomas and adenocarcinomas. Ultrastructurally, the invasive potential of anomalous cells could be confirmed by the basement membrane disrupted noted in some acini. In the stroma, the cellular hiperplasia, when verified, it was always associated to the anomalous epithelium sites. Additionally, a larger deposition of collagen fibrils, which generates stromal fibrosis, it was found in all old gerbils analyzed. Nuclear and nucleolar parameters were not effective in diagnosing the severity potential of those alterations. The cellular proliferation and death indexes, however, indicated a larger cellular turnover according as the histhopatologic lesions become invasives. Concluding, these analyses allow confirming that the rodent gerbil is a good model for prostate behavior analysis in different phases of postnatal development. The old animal revealed a high propensity in developing spontaneous prostatic alterations and these changes may help to comprehend the natural course of the neoplasia's multistep and its biological behavior, contributing to a better understanding of the human prostate cancer / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural