Made available in DSpace on 2017-07-10T14:17:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 kelly Jaque.pdf: 1788989 bytes, checksum: 65d07041b0d9003d6666dd84d7fee873 (MD5) Previous issue date: 2013-08-01 / The growing number of overweight and obesity has led to an increase in the number of patients with insulin resistance and diabetes mellitus type 2. MSG obese rats were glucose intolerant, insulin resistant and theirs pancreatic islets secrete more insulin in response to glucose. Subdiafragmatic vagotomy changes the response of islets to glucose and improves glucose homeostasis, supporting the hypothesis that an unbalance of autonomic nervous system with increased parasympathetic nervous system (PNS) action but a decreased sympathetic nervous system function. Studies showed that the PNS is also involved in β-cell proliferation. Therefore, we investigated of PNS participation, using a subdiafragmatic vagal denervation, upon pancreatic β-cell function and mass regulation, and the body glucose control disruption in MSG-obese rats. For this, Male Wistar rats received during the first five days of life monosodium glutamate (MSG) or saline. Subdiaphragmatic vagotomy was performed at 30 days of life. At 90 days of age, we verified static insulin secretion, pancreas morphometric, ERK expression in islets, glucose homeostasis and lipidis. The MSG treatment caused obesity at 90 days of life. MSG rats presented lower body weight and nasoanal length, increased Lee index and fat depots, normoglycemia, hyperinsulinemia, dyslipidemia, glucose intolerance and insulin resistance when compared to CTL. Vagotomy performed at 30-days of age prevented obesity, fat deposition in the liver and ameliorated glucose tolerance and insulin sensitivity in adult MVAG rats in relation to MSG rats. Islets from MSG rats secreted more insulin at stimulatory glucose concentrations than CTL islets. Histological analysis showed that pancreatic islets from MSG rats were lower with a reduction in β-cell area without modification in α-cell content when compared with CTL. Also, MSG group presented an increased number of pancreatic islets per mm2, with higher number of islets, which may contributes to the higher islet and β-cell relative mass in the MSG pancreas. These effects were associated with enhanced proliferation in MSG group. The number of MVAG pancreatic islet were less than MSG. Vagotomoy performed at 30-days of age, reduced islet and β-cell area in the pancreas from 90-days old CVAG rats. Finally, the relative islet and β-cell mass in MVAG and CVAG rats was similar to CTL. Here we verified if ERK was involved in β-cell replication in MSG rats, but presented no alteration. We demonstrate for the first time that adult MSG rats showed enhanced pancreatic β-cell proliferation which contributes to the higher islet insulin secretion in response to glucose. The vagus nerve is the main factor involved in such a process, since vagotomy performed at 30 days of age prevented islet morphological alterations in adult MVAG rats. Possibly this increase PNS activity in MSG endocrine pancreas is responsible to hyperinsulinemia that enhanced fat storage, damaged glucose homeostasis and insulin action in MSG obesity / O crescente número de pessoas com sobrepeso e obesidade tem levado ao aumento no número de pacientes com resistência à insulina (RI) e portadores do Diabetes mellitus tipo 2. Ratos obesos MSG são intolerantes à glicose (Gli), RI e suas ilhotas pancreáticas secretam mais insulina em resposta à concentrações de Gli. A vagotomia subdiafragamática altera a responsividade das ilhotas à Gli e melhora a homeostase glicêmica nestes animais, sugerindo um desbalanço do sistema nervoso autonômico, com aumento do tônus parassimpático e redução do simpático. Estudos demonstram que o sistema nervoso parassimpático (SNP) possui efeito na proliferação das células β-pancreáticas. Desta forma, investigamos a participação do SNP, através da vagotomia subdiafragmática, no metabolismo energético e na proliferação das ilhotas e de células β-pancreáticas de ratos obesos-MSG. Para isto, ratos Wistar machos receberem durante os cinco primeiros dias de vida glutamato monossódico (grupo MSG) ou salina (grupo CTL). A vagotomia subdiafragmática foi realizada aos 30 dias de vida formando os grupos MVAG e CVAG. Aos 90 dias, verificamos a secreção estática de insulina, homeostase glicêmica e lipídica, morfometria do pâncreas e conteúdo proteico da ERK nas ilhotas. Ratos MSG apresentaram redução do peso corporal e comprimento nasoanal, aumento do índice de Lee e acúmulo de gordura, normoglicêmia, hiperinsulinemia, dislipidemia, intolerância à Gli e RI comparados aos CTL. A vagotomia realizada aos 30 dias de vida preveniu obesidade, acúmulo de gordura no fígado e melhorou a tolerância à Gli e a sensibilidade à insulina em ratos MVAG adultos em relação aos ratos MSG. As ilhotas dos animais MSG secretaram mais insulina quando estimulada pela Gli, em relação aos animais CTL. As análises histológicas mostram que as ilhotas pancreáticas dos animais MSG são menores com redução da área das células β sem alteração nas células α em relação aos CTL. O grupo MSG apresenta um aumento do número das ilhotas por mm2, que pode estar contribuindo com o aumento da massa relativa das ilhotas e das células β. Esse efeito está associado ao aumento da proliferação no grupo MSG. O número de ilhotas foi menor nos MVAG em relação aos MSG. A vagotomia realizada aos 30 dias de vida reduziu a área das ilhotas e das células β aos 90 dias de vida nos animais CVAG. Finalmente, a massa relativa das ilhotas e da células β no MVAG e CVAG foram similares ao CTL. Verificamos se a ERK estava envolvida na proliferação das células β nos ratos MSG, porém não apresentaram alterações desta proteína. Pela primeira vez demonstramos que ratos MSG apresentam aumento da proliferação das células β que contribui com o aumento da secreção de insulina em resposta à Gli. O nervo vago é o principal fator envolvido neste processo, visto que a vagotomia realizada aos 30 dias de vida preveniu as alterações morfológicas das ilhotas nos ratos MVAG adultos

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:58Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-09-30. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:27Z : No. of bitstreams: 1 Publico-00264.pdf: 1668171 bytes, checksum: dbdf365617164c11a9a209e69d18f997 (MD5) / O ƒÑ-tocoferol tem sido o foco das pesquisas dentre os demais componentes da vitamina E por ser a forma predominantemente encontrada nos tecidos de mamiferos, e por possuir uma extensa gama de atividades biologicas. O ƒÑ-tocoferol pode atuar como regulador de enzimas especificas e de fatores de transcricao de forma a influenciar estruturas celulares como membranas e dominios lipidicos, desencadeando respostas celulares que muitas vezes se mostram independentes de sua funcao antioxidante. No sistema hematopoetico, seus efeitos foram favoraveis em casos de anemias hemoliticas, aumentando a resistencia dos eritrocitos a lise. Tambem foi observado que a suplementacao previa com ƒÑ-tocoferol a irradiacao resulta em aumento da sobrevida de camundongos por induzir aumento no numero de unidades formadoras de colonias (CFUs). Entretanto, os mecanismos biologicos ativados pelo ƒÑ-tocoferol nas celulas hematopoeticas ainda nao foram descritos. Assim, os bjetivos deste trabalho foram verificar os efeitos do ƒÑ-tocoferol na hematopoese murina e os mecanismos intracelulares relacionados a estes efeitos. Para tal, camundongos foram tratados intraperitonealmente com doses de 40 mg/kg/dia de ƒÑ-tocoferol durante 2 semanasem dias intercalados, sendo sacrificados 24 horas apos a ultima dose; condicoes estas que nao causaram toxicidade as celulas da medula ossea. Amostras histologicas dos femures dos animais que receberam o tratamento com ƒÑ-tocoferol apresentaram hiperplasia medular. O tratamento com ƒÑ-tocoferol induziu aumento na porcentagem das celulas progenitoras hematopoeticas (Lin-Sca-1+c-Kit+ e Lin-Sca-1-c-Kit+), assim como o aumento do estado proliferativo destas populacoes (com mais celulas primitivas na fase S/G2/M do ciclo celular), com o consequente aumento da capacidade de formar CFUs de granulocitos e macrofagos. Dentre as distintas populacoes de celulas maduras da medula ossea, houve um favorecimento da linhagem granulocitica/monocitica (Mac-1+Gr-1+) em detrimento das linhagens eritrociticas (Ter119+) e linfociticas (B220+ e CD3+). Como forma de avaliar o mecanismo de acao do ƒÑ-tocoferol, investigou-se tambem a ativacao das proteinas relacionadas com a sinalizacao das celulas hematopoeticas. Assim, observou-se que as populacoes primitivas medulares apresentaram uma menor ativacao da cinase regulada por sinais extracelulares 1/2 (ERK1/2), da proteina cinase C (PKC), do ¡§ativador de transcricao e transdutor de sinal ¡V 5¡§ (STAT-5), mas nao da proteina cinase B/Akt. Tambem foi verificado que a diminuicao do estado fosforilado da ERK1/2 ocorreu desde os primeiros dias de tratamento. Interessante destacar quer o ƒÑ-tocoferol potencializou o efeito da interleucina-3 (IL-3) sobre a ativacao da ativacao da ERK1/2 nas celulas primitivas hematopoeticas. O inibidor da MEK (PD98059) foi capaz de restabelecer as porcentagens normais das linhagens eritrocitica e granulocitica/monocitica, assim como os niveis normais da fosfo- ERK1/2, alem da resposta da ERK1/2 ao estimulo com IL-3. Entretanto, o PD98059 nao restabeleceu as porcentagens normais das celulas primitivas hematopoeticas, nem da linhagem linfocitica. A quantificacao das especies reativas de oxigenio nas diferentes populacoes da medula ossea mostrou que, nas condicoes de tratamento estabelecidas, o ƒÑ-tocoferol nao exerceu funcao proou antioxidante, pois nao houve alteracao significativa dos niveis de especies reativas de oxigenio entre os grupos controle e tratado com ƒÑ-tocoferol. Desta forma, foi mostrada uma nova propriedade do ƒÑ-tocoferol independente de sua acao redox: a inducao de hiperplasia na medula ossea pelo aumento dos progenitores hematopoeticos e favorecimento da diferenciacao destes em granulocitos e macrofagos, pela potencializacao da resposta da ERK1/2 ao estimulo com IL-3. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-07-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Introducao: Um dos objetivos da Medicina e superar os danos causados ao organismo por doencas, senilidade e traumas, restabelecendo um equilibrio normo-funcional. Nas perdas teciduais, inumeros autores afirmam que o substituto gideal h e o proprio tecido saudavel, de mesma origem ou o tecido produzido por Engenharia Tecidual (ET). Porem, ainda sao necessarias muitas pesquisas para a utilizacao in vivo. Objetivo: Avaliar tres suplementos hemoderivados, empregados em meios de cultivo, quanto a proliferacao celular e o dano celular de celulas-tronco de origem dentaria. Metodos: Foram realizados cinco experimentos a partir de dentes terceiros molares em desenvolvimento. Apos a digestao enzimatica, as celulas-tronco adultas foram cultivadas em quatro diferentes meios de cultivo. Meio I, isento de suplemento hemoderivado; meio II, suplementado com FBS (heterologo); meio III, suplementado com soro humano homologo; meio IV, suplementado com soro humano autologo. Essas culturas foram analisadas comparativamente quanto a proliferacao celular, submetidas a testes com marcadores Von Kossa e Alizarina Vermelha durante quatro semanas (avaliadas semanalmente) e a cada duas semanas quanto as unidades formadoras de colonias (UFCs). No 28o dia as quatro culturas foram submetidas ao teste do gcometa h, analisando-se possivel dano no DNA celular. Os resultados foram submetidos a analise estatistica de Variancia de Friedman, estabelecendo-se significancia para (p) . a 5%. Resultados: O meio de cultivo IV atingiu uma proliferacao celular superior ao Meio I, demonstrando um resultado significante (p*=0,0074). O meio de cultivo II, mostrou proliferacao superior ao meio I e desenvolvimento semelhante ao meio III, porem nenhum demonstrou significancia em relacao ao meio IV. Os resultados do teste do cometa evidenciaram um menor dano celular nas culturas do meio IV em relacao ao meio II e meio III. As UFCs foram numerosas nos meios IV e III respectivamente, havendo maior indice de mineralizacao no meio IV do que nos meios II e III. Conclusao: O meio de cultivo suplementado com hemoderivado autologo favoreceu significativamente a proliferacao celular. O hemoderivado humano mostrou-se viavel como suplemento nas culturas de celulas-tronco dentarias humanas. / Introduction: One among many aims of medicine is to overcome injuries inflicted to the organism by diseases, aging and trauma, re-establishing the usual functions. About tissues losses, several authors claim that the ideal replacement is the healthy tissue itself, originated from the same source or developed by Tissue Engineering (TE). However, much research is needed before in vivo application. Objective: To evaluate three different kinds of sera supplies used in stem cell culture media, as to cellular proliferation and cellular injuries on dental stem cell. Methods: Five experiments were made utilizing incompletely developed third molar teeth. After enzymatic digestion, the adult stem cells were cultivated in four different kinds of culture media. Medium I, serum free (SF); medium II, supplied with FBS (heterologous serum- HeS); medium III, supplied with homologous human serum (homologous serum- HoS) and medium IV, supplied with autologous human serum (autologous serum . AuHS).These cultures were analyzed comparatively as to cellular proliferation; they were submitted Von Kossa (VK) and Alizarin Red (AR) markers tests for four weeks (checked weekly), and each two weeks checked for Colonies Forming Unities (CFUs). On the 28th day, all four cultures were submitted to comet assay, and were inspected for possible cellular DNA injuries. The results underwent a non-parametric statistical Friedman fs variance test, with significance (p) . 5%. Results: Culture medium IV reached a cellular proliferation rate higher than medium I, showing a significant result (p*=0,0074). Culture medium II presented a superior proliferation result than medium I, and similar to medium III, although neither of them presented significant result when compared to medium IV. The comet assay fs results showed minor cellular DNA injury in the medium IV cultures, when compared to medium II and III cultures. The CFUs were numerous in the media IV and III cultures, respectively, and there was higher mineralization rate in the medium IV than in the media II and III. Conclusion: The culture medium supplied with AuHS significantly improved cellular proliferation. Human sera proved to be a viable supply to human dental stem cell culture. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5178.pdf: 2466586 bytes, checksum: be50519a129b12383d84e69ae25b54db (MD5) Previous issue date: 2013-02-28 / Universidade Federal de Sao Carlos / The use of mesenchymal stromal cells (MSCs) for clinical therapy has been limited by the low amount of cells that can be obtained directly from tissue, making it necessary to develop techniques for in vitro cell number expansion. The current methods of expansion are laborintensive, exhibit unfavorable environments for cell growth, show still modest levels of expansion and low yield in the recovery of these cells. In the search for better alternatives, several types of bioreactors have been assessed, however, with results still discreet. A littlestudied system, which has showed itself very effective in the use with other types of animal cells, is the hollow fiber bioreactor. This bioreactor has relatively homogeneous culture environment, low level of hydrodynamic stress on cells and the process control is made through manipulation external to the culture. Thus, it is proposed in this work the study of the in vitro expansion of MSCs in 15 mL hollow fiber prototype bioreactor designed and built with a configuration specifically conceived for expansion of MSCs for use in therapeutic applications. The inoculum was prepared with MSCs precultured adhered to microcarrier Cultispher-S at concentration of 4 g/L in spinner flask containing 50 mL of α-MEM culture medium with 15% v/v fetal bovine serum. The preculture was performed in CO2 incubator at pH close to 7.3 and temperature of 37°C. For bioreactor expansion cultures, it was used the same culture medium, with addition of 12 g/L of alginate and 4.25-4.50 mM of CaCl2 as gelling agents to immobilize and keep in suspension the microcarriers, in the conditions of pH and temperature used in the preculture. The oxygenation of the culture medium continuously recirculated through the intracapilar space was carried out by air bubbling in an external flask. The oxygenation levels were of 70 to 90% of saturation with air. The experimental results obtained show that the used configuration of hollow fiber bioreactor promoted good conditions for expansion of MSCs without cell aggregation, reaching 15.3-fold expansion and cell recovery levels of 82%. These results also demonstrate the possibility of improving the efficiency of MSCs expansion through the renewal of medium to maintain suitable levels of arginine, nutrient present in limiting amounts, and ammonium, growth inhibitor metabolite. / A utilização de células estromais mesenquimais (MSCs em inglês) para a terapia clínica tem sido limitada pela baixa quantidade de células que podem ser obtidas diretamente do tecido, tornando necessário o desenvolvimento de técnicas de expansão do número de células in vitro. Os métodos atuais de expansão apresentam necessidade de intensa mão de obra, ambientes desfavoráveis para o crescimento celular, níveis de expansão ainda modestos e baixo rendimento na recuperação destas células. Na procura de melhores alternativas, diversos tipos de biorreatores vêm sendo avaliados, porém, com resultados ainda discretos. Um sistema pouco estudado que tem se mostrado muito eficiente no uso com outros tipos de células animais é o biorreator de fibra oca. Este biorreator apresenta ambiente de cultura relativamente homogêneo, baixo nível de forças hidrodinâmicas sobre as células e o controle do processo é feito através de manipulação externa à cultura. Assim, é proposto neste trabalho o estudo da expansão in vitro de MSCs num protótipo de biorreator de fibra oca de 15 mL projetado e construído com uma configuração especialmente concebida para expansão de MSCs a serem utilizadas em aplicações terapêuticas. O inóculo foi preparado com MSCs précultivadas aderidas ao microcarregador Cultispher-S na concentração de 4 g/L em frasco spinner contendo 50 mL de meio de cultura α-MEM com 15% v/v de soro fetal bovino. O précultivo foi realizado em incubadora de CO2 a pH próximo a 7,3 e temperatura de 37°C. Para os cultivos de expansão no biorreator foi utilizado o mesmo meio de cultura, com adição de 12 g/L de alginato e 4,25-4,50 mM de CaCl2 como agentes geleificantes para imobilizar e manter suspensos os microcarregadores, nas condições de pH e temperatura utilizadas no précultivo. A oxigenação do meio de cultura continuamente recirculado pelo espaço intracapilar foi realizada mediante borbulhamento de ar em um frasco externo. Os níveis de oxigenação foram de 70 a 90% da saturação com ar. Os resultados experimentais obtidos mostram que a configuração utilizada propiciou boas condições para a expansão sem agregação celular das MSCs, chegando-se a fatores de expansão estimados de 15,3 vezes e níveis de recuperação de células de 82%. Esses resultados também evidenciam a possibilidade de melhora da eficiência da expansão das MSCs através da renovação do meio de cultivo para a manutenção de níveis adequados de arginina, nutriente presente em quantidades limitantes, e amônia, metabólito inibidor de crescimento.

INTRODUÇÃO: Atualmente as células da microglia têm recebido grande atenção dentro da resposta imune, isto devido ao fato de que sua ativação por citocinas inflamatórias é capaz de promover a infiltração e destruição do sistema nervoso central (SNC) durante algumas doenças, principalmente no caso da esclerose múltipla (EM). Além de seu papel pró-inflamatório, já demonstrou-se que estas também são capazes de expressar moléculas supressoras como a indoleamina-2,3-dioxigenase (IDO), capaz de suprimir a proliferação de células T. Contudo, ainda pouco se sabe sobre seu verdadeiro papel na patogenia da EM. Recentemente tem sido descrita uma população de células T chamadas Th17, capaz de secretar grandes quantidades de IL-17, IL-21 e GM-CSF possuindo uma importância fundamental na patogenia da EM e de seu modelo murino, a EAE. Nesse contexto, a relação entre as Th17 e as células da microglia pode nos fornecer dados importantes acerca dos mecanismos envolvidos nas lesões observadas no SNC. OBJETIVO: Este trabalho teve como objetivo melhor elucidar a relação existente entre a expressão das moléculas imunes por células da microglia e a ação que estas promovem sobre as células T. MÉTODOS: Utilizamos culturas de células da microglia de linhagem, chamadas C8-B4, assim como cultura primária de células da microglia obtidas a partir sistema nervoso de camundongos C57BL/6 adultos. Caracterizamos o perfil imune da microglia, avaliando a transcrição de genes para citocinas através de PCR em tempo real assim como a expressão de suas moléculas ativadoras por citometria de fluxo. A avaliação da IDO se deu através da expressão da mesma por células da microglia ativadas ou não por LPS ou IFN-?. Ja sua capacidade funcional foi medida através da atividade proliferativa de linfócitos T CD4 específicos para MOG 35-55. RESULTADOS: Nossos resultados demonstraram que as células de ambas as culturas possuem a capacidade de expressar diversas moléculas imunes, tanto pró quanto anti-inflamatórios. Dentre estas observamos TLR-4, TLR-2, IL-6, IL-10 e TGF-?. Além disso, confirmamos a expressão da enzima IDO por estas células. O bloqueio de tal enzima impede o controle que a microglia tem sobre a proliferação dos linfócitos T CD4, tanto in vitro quanto in vivo. No modelo in vivo tal efeito repercute em uma encefalomilite mais severa, onde o quadro clínico do animal não regride. CONCLUSÃO: Os resultados aqui obtidos nos dão a certeza da influência das microglias dentro do contexto inflamatório, afirmando sua capacidade de modular a resposta imune. Além disto, fica clara a importância da enzima IDO, cuja ação dentro do controle de uma autoimunidade demonstra ser altamente necessária / INTRODUCTION: Microglia cells has gained great attention recently because its activation by inflammatory cytokines can promote infiltration and destruction of Central Nervous System (CNS) during some disease, mainly in the case of Multiple Sclerosis (MS). On the other hand, these cells may also express suppressor molecules such as the indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO), able to suppress T cell proliferation. However, still little is known about its role in MS pathogenesis. Recently it has been described a new population of T cells called Th17, able to secrete high amounts of IL-17, IL-21 and GM-CSF, with a fundamental importance on MS and its murine model, EAE. In this context, the relationship between Th17 and microglia cells can provide us important data about the mechanisms involved in the establishment of CNS lesions. OBJECTIVES: This work had the objective to better elucidate the relationship between the expression of some molecules by microglia and its role T cell activation. METHODS: Through a cellular lineage knowing as C8-B4 and primary cultures of microglia obtained from CNS of adult mice C57BL6 we investigated the transcription of several genes for cytokines and membrane expression of several pattern recognition receptors. The IDO evaluation was performed after activation with LPS or rIFN-?. Its functional capacity was measured trough its action over T cell proliferation. RESULTS: Our results demonstrated that both cells have the capacity of express several immune molecules, both pro and anti-inflammatory. Among this, we observed TLR-4, TLR-2, IL-6, IL-10 and TGF-?. We also confirmed IDO expression by these cells. The blockade of such enzyme prevents the control of microglia above T CD4 lymphocytes proliferation, both in vitro and in vivo. Using the in vivo model, IDO blocker rendered a encephalomyelitis more severe. Conclusion: The results here obtained give us the certainty of microglia influence in inflammatory context, stating its capacity of modulating the immune response

O gânglio estrelado (GE) é o principal componente da inervação cardíaca extrínseca e está envolvido na gênese de diversas cardiomiopatias. Durante o envelhecimento, o controle neural do coração dos mamíferos é alterado de forma complexa e não clara, geralmente ocasionando decremento da função cardíaca e maior propensão a doenças degenerativas. A ocorrência de resultados dissonantes quanto aos parâmetros morfoquantitativos durante o envelhecimento, como o aumento ou diminuição do número total de neurônios simpáticos, é assunto para discussões interessantes. Esta pesquisa foi conduzida em preás machos (Galea spixii), um pequeno roedor da fauna brasileira. Desta forma, estudou-se o efeito do desenvolvimento pós-natal (maturação e envelhecimento) na macro e microestrutura do gânglio estrelado esquerdo (GEe) de preás, por meio de microscopia quantitativa tridimensional (Estereologia) associada a técnicas de imuno-histoquímica. De acordo com a fase específica do desenvolvimento pós-natal, os animais foram alocados nos seguintes grupos etários: Neonatos, Jovens, Adultos e Senis. Inicialmente, os animais foram submetidos à eutanásia e seus gânglios estrelados esquerdos coletados e fixados em solução de formaldeído (4%) em PBS. Foi realizada amostragem sistemática e uniformemente aleatória (SURS), estimando-se: volume do GEe, volume neuronal e número total de neurônios do GEe. Os principais achados deste estudo foram: i) aumento do comprimento do gânglio - 42% entre Neonato e Senil; 34% entre Jovem e Senil e 35% entre Adulto e Senil; ii) hipertrofia do GEe - 171% entre os grupos Neonato e Adulto; iii) aumento do tecido não neuronal - 268% entre os grupos Neonato e Adulto; iv) estabilidade no número total de neurônios uninucleados, binucleados e total (uni+bi); v) estabilidade no tamanho (volume) dos neurônios uninucleados e binucleados; e vi) estabilidade no número total de neurônios imunorreativos ao Ki-67 (uni+bi). Espera-se que os resultados gerados por esta pesquisa possam esclarecer alguns aspectos estruturais da plasticidade neural durante o desenvolvimento pós-natal de preás, avançando assim o conhecimento acerca da inervação cardíaca extrínseca / The stellate ganglion (SG) is a main component of extrinsic cardiac innervation and is involved in the genesis of various cardiomyopathies. During ageing, the neural control of heart in mammals is altered in the complex shape and unclear, generally cause decrement in the cardiac function and a greater propensity to degenerative diseases. The occurrence of discordant results regarding the morphoquantitative parameters during ageing, such as increase or decrease in the total number of sympathetic neurons, is a subject for interesting discussions. This research was conducted in males preas (Galea spixii), a small rodent of the Brazilian fauna. Therefore, this work aimed to study the effect of postnatal development (maturation and ageing) in the macro and microstructure of the left stellate ganglion (LSG) in preas by dimensional quantitative microscopy (Stereology) associated to immunohistochemistry techniques. According to a specific stage of postnatal development, the animals were allocated into the following age groups: Newborn, Young, Adult and Elderly. The animals were euthanised and the left stellate ganglia were collected and fixed in 4% formaldehyde solution in PBS. A systematic uniformly random sampling (SURS) was performed to estimate: the volume of LSG, neuron volume and the total number of LSG neurons. The main findings of this study were: i) increase in length ganglia - 42% between Newborn and Elderly; 34% between Young and Elderly and 35% between Adult and Elderly; ii) hypertrophy of LSG - 171% between the groups Newborn and Adult; iii) increase of non-neuronal tissue - 268% between the groups Newborn and Adult; iv) stability for the total number of uninucleate neurons, binucleate neurons and total (uni+bi); v) stability in the size (volume) of uninucleate and binucleate neurons; and, vi) stability for the total number of neurons immunorreactive to Ki-67 (uni+bi). It is expected that the results generated for this research may clarify structural aspects of neural plasticity during the postnatal development of preas, thus advancing the knowledge about the extrinsic cardiac innervation

O metaboloma é definido como a coleção qualitativa e quantitativa de todos os metabólitos de baixa massa molecular presentes nas células, os quais participam de reações bioquímicas necessárias para a manutenção, crescimento e fisiologia celular. A avaliação metabolômica permite o delineamento do processo bioquímico de sistemas a fim de ampliar o entendimento de como as patologias se manifestam. A Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) é usada para investigar uma variedade de processos biológicos em diversos sistemas. A magnética aplicada a células e biópsias de tecido intacto de melanoma murino B16F10 contribuiu para a caracterização bioquímica de biomarcadores das diferentes fases de progressão tumoral do melanoma murino B16F10. Os resultados obtidos neste estudo permitiram a identificação de 33 metabólitos possíveis, envolvidos na carga lipídica e no metabolismo secundário da via glicolítica, que favorecem o crescimento e a progressão tumoral. A presença da taurina, prolina, serina, fenilalanina, que aumentaram quantitativamente, são possíveis marcadores da invasão, progressão e metastatização. A análise quantitativa desses metabólitos mostrou diferença significativa em 11 compostos, dos quais 9 estão diretamente envolvidos na expressão das respostas proliferativas, de morte celular e angiogênese, nos diferentes períodos de crescimento do melanoma B16F10, avaliados neste estudo. Desta forma, os achados obtidos neste estudo, quando associados no futuro a outros fatores, poderão ser úteis no diagnóstico e auxiliar na escolha terapêutica alvo com maior especificidade e menores efeitos colaterais. RMN pode ter um importante impacto na monitorização de metabólitos em células e tecidos tumorais, possibilitando a detecção mais precoce de tumores malignos, em suma, através da combinação de métodos de ressonância magnética. / The metabolome is defined as the qualitative and quantitative collection of all low weight molecular metabolites in cells that participate in biochemical reactions necessary for the maintenance, growth and physiology of cell. The metabolomic evaluation allows the design of systems of biochemical process in order to broaden the understanding of how diseases manifest. The Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) is used for investigating a variety of biological processes in several systems. The magnetics applied to cell and tissue biopsies intact murine melanoma B16F10 contributed to the biochemical characterization of biomarkers of different stages of tumor progression of murine melanoma B16F10. The results obtained in this study allowed the identification of 33 potential metabolites involved in lipid content in the secondary metabolism of the glycolytic pathway, which promote growth and tumor progression. The presence of taurine, proline, serine, phenylalanine, which quantitatively increased, is possibly markers of invasion and metastasis progression. Quantitative analysis of these metabolites showed a significant difference in 11 compounds, of which 9 are directly involved in the expression of proliferative responses, cell death and angiogenesis in different periods of growth of B16F10 melanoma, evaluated in this study. Thus, the findings from this study, when associated in the future with other factors, may be useful in the diagnosis and may assist in choosing therapeutic target with greater specificity and fewer side effects. NMR may have a significant impact on monitoring metabolites in tumor cells and tissues, allowing for earlier detection of malignant tumors; in short, by combining MRI methods.

A neuraminidase-1 (Neu1) participa da regulação do catabolismo de sialoglicoconjugados nos lisossomos. A deficiência congênita da Neu1 é a base da sialidose, doença neurossomática grave associada a deformidades osteoesqueléticas, hipotonia e fraqueza muscular. Camundongos com deficiência de Neu1 (Neu1-/-) desenvolvem uma forma atípica de degeneração muscular caracterizada por expansão da matriz extracelular (MEC), invasão das fibras musculares por fibroblastos, fragmentação do citoplasma, formação vacuolar e atrofia muscular. Apesar de a degeneração muscular estar bem caracterizada nestes animais, a miogênese ainda não havia sido estudada. O objetivo desta pesquisa foi avaliar o envolvimento da Neu1 no processo de regeneração muscular, após aplicação de cardiotoxina (CTX) em camundongos Neu1-/-, em comparação com controles normais. A CTX foi administrada no músculo tibial anterior direito e os animais foram eutanasiados por deslocamento cervical 1, 3, 5, 7, 10, 14, 21 e 28 dias após a lesão. Os músculos foram analisados através de histologia; medição da área transversa das fibras musculares centronucleadas; verificação do potencial proliferativo celular por quantificação de marcação de BrdU; imunoistoquímica para inflamação, fibras regenerativas e fibrose; e expressão gênica e proteica de fatores de transcrição musculares. Os dados foram comparados estatisticamente e as variações significativas devem apresentar p <= 0,05. Nos animais com deficiência de Neu1, o processo inflamatório (especialmente a reação macrofágica) e o potencial proliferativo estavam aumentados nas fases iniciais, acompanhados da hiperexpressão de Pax7. Observamos atraso na maturação muscular caracterizado por maior expressão de miosina embrionária em estágios mais tardios da regeneração. Os genes MyoD e MyoG estavam com expressão aumentada no período de 5 a 10 dia após a lesão, embora a expressão destas proteínas estivesse reduzida. Ao final da regeneração, houve maior deposição de reticulina na MEC, indicando processo fibrótico. A Neu1 parece atuar em todos os estágios da regeneração muscular, desde a fase aguda da lesão através do controle da proliferação celular, até a maturação muscular e estágios finais em que regularia a deposição de componentes da MEC / Neuraminidase-1 (Neu1) participates in sialoglycoconjugates catabolism in lysosomes. Congenital Neu1 deficiency is the basis of sialidosis, a severe neurosomatic disorder associated with osteoskeletal deformities, hypotonia and muscle weakness. Mice with Neu1 deficiency (Neu1-/-) develop an atypical form of muscle degeneration characterized by abnormal fibroblast proliferation and expanded extracellular matrix (ECM), invasion of muscle fibers by fibroblast, cytosolic fragmentation, vacuolar formation and muscle atrophy. Despite muscle degeneration is well characterized in these animals, myogenesis has not been studied so far. The aim of this study was to evaluate the involvement of Neu1 in muscle regeneration process after cardiotoxin (CTX) injection in Neu1-/- mice and normal controls. CTX was applied in the right tibialis anterior muscle, and the animals were euthanized by cervical dislocation 1, 3, 5, 7, 10, 14, 21 and 28 days after injury. The muscles were analyzed through histology; cross-sectional area of regenerative muscle fibers; quantification of BrdU labeling; immunohistochemistry labelling for inflammation, regenerative fibers, and fibrosis; and gene and protein expression of muscle transcription factors. The data were compared and variances considered statistically significant in case p <= 0.05. In animals with Neu1 deficiency, both inflammatory process (mainly macrophagic response) and proliferative potential were increased in the initial stages, accompanied by overexpression of Pax7. We observed delay in muscle maturation characterized by higher expression of embryonic myosin later in muscle regeneration. MyoD and MyoG genes were overexpressed from 5 to 10 days after injury, though the expression of these proteins was reduced. At the end of muscle regeneration, reticulin deposition in ECM was increased, indicating fibrotic process. Neu1 seems to participate in all stages of muscle regeneration, since acute injury phase through the control of cell proliferation, towards muscle maturation, and at the final stages when it would regulate the deposition of ECM components

INTRODUÇÃO: As células-tronco hematopoiéticas (CTH) do sangue do cordão umbilical (SCU) têm sido utilizadas com sucesso para o tratamento de doenças malignas e não malignas. No entanto, algumas unidades de SCU podem apresentar baixa quantidade de células nucleadas totais (CNT). Algumas abordagens têm sido sugeridas para evitar problemas em relação à baixa concentração de CTH no transplante, como a administração de duas unidades de SCU para o paciente e a expansão ex vivo de CTH. OBJETIVO: Avaliar as taxas de proliferação celular na expansão ex vivo do SCU em sistema de cocultura com células-tronco mesenquimais (CTM) obtidos a partir de diferentes fontes com alta e baixa confluência e adicionando-se ou não coquetel de citocinas no meio de cultura. MÉTODOS: Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética de Pesquisa (CAPPesq) do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da USP. A coleta do SCU (n =10) foi realizada após o nascimento do bebê e expulsão da placenta. O processamento foi realizado utilizando o método de redução de volume, o qual consiste em depleção de eritrócitos. As amostras de CTM provenientes do endotélio vascular do cordão umbilical foram obtidas de doadores diferentes (n=3) e o tecido adiposo (n=3) do inventário do LIM-31. A expansão das CNT e das células com expressão de marcadores CD133+/CD34+ foram observados depois de sete dias de cultura. Além disso, o ensaio para análise de unidades de formadoras de colônias (UFC) foi realizado em todas as amostras antes e depois da expansão do SCU. Para a expansão em sistema de cocultura foi separado dois grupos para ambas as fontes de CTM (Grupo I - cocultura com adição de coquetel de citocinas vs. Grupo II - cocultura sem citocinas). RESULTADOS: Após sete dias, no grupo I com cocultura confluente, a taxa de proliferação de CNT foi duas vezes maior ao comparar com cocultura subconfluente (35 vs. 16 vezes). No mesmo grupo também foi possível evidenciar elevada taxa de proliferação de células CD133+/CD34+. O índice de proliferação das UFC no grupo I aumentou até oito vezes. A cocultura subconfluente tanto do endotélio vascular do cordão umbilical como do tecido adiposo apresentou menor rendimento em comparação as CTM confluentes. A expansão das células na presença de citocinas apresentou maior proliferação celular ao comparar às coculturas sem adição de citocinas. CONCLUSÃO: Este estudo mostrou que para alto rendimento de células do SCU, o sistema de cocultura requer adição de coquetel de citocinas e CTM confluente independentemente da fonte utilizada / INTRODUCTION: Umbilical cord blood (UCB) hematopoietic stem cells have been successfully used for the treatment of both malignant and non-malignant diseases. Nevertheless, some UCB units could have low total nucleated cells (TNC) dose. Several approaches have been suggested to avoid inadequacy problems of hematopoietic stem cells (HSC) number for transplantation, such as administration of two UCB units to the patient and HSC ex vivo expansion. OBJECTIVE: Evaluate UCB ex vivo expansion proliferative rates in a high and low mesenchymal stem cells (MSC) confluence feeder layer obtained from different MSC sources and by adding or not cytokines cocktail into the medium. METHODS: This study was approved by the Research Ethic Committee (CAPPESQ) of Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da USP. The collection of UCB (n=10) was made after delivery of the infant and the expulsion of placenta. Processing was performed using volume reduction method which consists in red blood depletion. MSC samples from umbilical cord endothelium were obtained from three different donors and adipose tissue (n=3) obtained from LIM31\'s pattern inventory. The total nucleated cell (TNC), expression of hematopoietic surface markers such as CD133+/CD34+ were observed after seven days of culture. Beyond that, colony forming unit assay (CFU) was performed before and after UCB expansion. The expansion by coculture method was observed in two groups (Group I - coculture with cytokines cocktail added vs. Group II- coculture without cytokines cocktail) for both MSCs sources. RESULTS: After seven days, analysis of confluent coculture showed that TNC proliferation rate ware almost 2 times higher than in subconfluent coculture (35 vs. 16-fold) in Group I and also revealed higher proliferative rate in CD133+/CD34+ cells considering. CFU showed similar increase after seven days of culture in comparison of day 0 (up to 8-fold). Subconfluent coculture for both umbilical cord endothelium and adipose tissue showed lower yield compared with those with high MSC confluence. The expansion in the presence of cytokines showed higher cell proliferation compared to the cocultures without addition of cytokines. CONCLUSION: This study showed that coculture system may require the addition of cytokines cocktail in the media and confluent MSC regardless of source for high yield of UCB cells

A maior parte dos casos de doença renal policística autossômica dominante (DRPAD) é causada por mutações no gene PKD1 (Polycystic Kidney Disease 1). O insulto por isquemia/reperfusão (IR) constitui-se em uma causa freqüente de lesão renal aguda, incluindo a população de pacientes com DRPAD, mas a relação entre policistina-1 e IR é essencialmente desconhecida. Uma vez que a policistina-1 modula proliferação, diferenciação celular e apoptose em sistemas de cultura de células, sua menor atividade biológica na DRPAD poderia favorecer um maior grau de lesão renal. Utilizamos uma linhagem endogâmica de camundongos 129Sv com uma mutação nula em Pkd1 para testar esta hipótese. Camundongos Pkd1+/- não apresentam cistos renais até 12 semanas de vida, constituindo-se em um modelo puro de haploinsuficiência para este gene. Um insulto IR bilateral de 32 min foi induzido em camundongos machos de 10-12 semanas de idade, heterozigotos e selvagens, por meio do clampeamento reversível de ambos os pedículos renais. Os animais foram analisados 48 h, 7 dias (d) e 14 d após o insulto. Camundongos Pkd1+/- apresentaram FENa, FEK e SCr mais elevadas que animais Pkd1+/+ 48 h após IR. O dano cortical residual foi mais severo em heterozigotos que em selvagens em todos os tempos avaliados. A marcação para PCNA também foi mais alta em camundongos Pkd1+/- que Pkd1+/+ 48 h e 7 d pós-IR, enquanto a taxa de apoptose e a infiltração inflamatória intersticial foram maiores em heterozigotos que em selvagens nos seguimentos de 48 h, 7 d e 14 d pós-IR. A expressão renal de p21 foi menor nos camundongos Pkd1+/- que Pkd1+/+ no tempo de 48 h pós-insulto, tanto no nível transcricional como traducional. Análises adicionais realizadas 6 semanas após o insulto IR revelaram dilatação tubular e formação de microcistos nos camundongos haploinsuficientes para Pkd1, assim como fibrose renal aumentada nesses animais, comparados aos camundongos selvagens. Por fim, um insulto de 35 min de isquemia/reperfusão acompanhou-se de uma mortalidade precoce substancialmente maior nos animais Pkd1+/-. Esses achados sugerem que isquemia/reperfusão induza uma lesão mais severa em rins de camundongos haploinsuficientes para Pkd1, um processo aparentemente dependente de uma deficiência relativa da atividade de p21, assim como dilatação tubular e formação de microcistos. Em conjunto, nossos resultados sugerem que a heterozigose para mutação nula em Pkd1 em camundongo (e talvez em humanos) esteja associada a um risco aumentado para lesão renal por isquemia/reperfusão e a um pior impacto desse insulto sobre a progressão da doença renal. / The majority of autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) cases are caused by mutations in the PKD1 gene. Ischemia/reperfusion is a frequent cause of acute kidney injury, including the ADPKD patient population, but the relationship between polycystin-1 and ischemia/reperfusion is essentially unknown. Since polycystin-1 modulates cell proliferation, cell differentiation and apoptosis in cell culture systems, its lower biological activity in ADPKD might amplify the degree of renal injury. Using an inbred 129Sv mouse line with a Pkd1-null mutation, 32-min renal ischemia/reperfusion was induced in 10-12 week-old male non-cystic mice, heterozygotes and wild types. The animals were analyzed at 48h, 7 days (d) and 14d after the insult. Pkd1+/- mice showed higher FENa, FEK and SCr than Pkd1+/+ animals at 48h of follow-up. The residual cortical damage was more severe in heterozygotes than wild types at all evaluated time points. The PCNA staining was also higher in Pkd1+/- than Pkd1+/+ mice at 48h and 7d, while cell apoptotic rates and the interstitial inflammatory infiltration were higher in heterozygotes than wild types at 48h, 7d and 14d postischemia/ reperfusion. The expression of p21 was lower in Pkd1+/- than Pkd1+/+ kidneys at 48h, both at the transcriptional and translational levels. Additional analyses performed 6 weeks after the insult showed tubular dilatation and microcyst formation in the haploinsufficient mice, and increased renal fibrosis in these animals compared to wild types. Thirty-fivemin ischemia/reperfusion, at last, was accompanied by a substantially higher early mortality of Pkd1+/- animals. These findings suggest that ischemia/reperfusion induces a more severe injury in kidneys of Pkd1- haploinsufficient mice, a process that is apparently dependent on a relative deficiency of p21 activity, as well as tubular dilatation and microcyst formation. Altogether, our results suggest that mouse Pkd1-null heterozygosity (and maybe human) is associated with a higher risk for renal ischemia/reperfusion injury and with a worse impact of this insult upon renal disease progression.