Realizamos neste trabalho a automatização da nova metodologia MHCalc, desenvolvida anteriormente em nosso laboratório, que teve como resultado o programa homônimo escrito em linguagem C para ambiente GNU/Linux, o qual avalia quantitativamente a seletividade de uma determinada proteína MHC. Esta avaliação quantitativa possibilita o estabelecimento de uma escala de preferência dos resíduos de ocorrência natural para cada uma das posições de interação da fenda de apresentação do MHC; por permutação destes resíduos, podem-se derivar regras de composição para peptídeos reconhecíveis em cada alelo estudado, inclusive na ausência de dados experimentais. A metodologia desenvolvida em nosso laboratório se baseia na avaliação da seletividade de cada bolsão independentemente, através da energia de interação do mesmo com cada aminoácido de ocorrência natural. O programa MHCalc utiliza o pacote de programas THORMM [Moret, 1998] de modelagem molecular para otimização geométrica das estruturas descritas, e tem como entrada unicamente um arquivo de coordenadas em formato POB contendo as coordenadas de um complexo MHC/peptídeo, tendo como saída uma tabela de dados contendo os resíduos de ocorrência natural em ordem de preferência para cada bolsão. Testamos o programa MHCalc para o complexo formado pela molécula HLA-DR1 (DRA DRB1 *01 01) e o peptídeo de Hemaglutinina, obtido no Brookhaven Protein Data Bank com a entrada 10LH, sendo este sistema escolhido por ser altamente estudado e com abundância de dados experimentais e teóricos para comparação de resultados. Até o presente momento obtivemos os dados referentes ao bolsão 1, os quais estão em pleno acordo com a literatura. / In this work we automated the new methodology MHCalc, developed previously in our laboratory, which resulted in the computational program with the same name, written in C language to GNU/Linux environment. The program MHCalc evaluates quantitatively the selectivity of a given MHC protein. This quantitative evaluation allows the establishment of a preference scale of the naturally occurring residues for each pocket of a MHC molecule. From such a study it may be derived composition rules to peptides recognizable in each allele studied, even in the absence of experimental data. The methodology developed in our laboratory is based on the selectivity evaluation of each pocket independently, through its interaction energy with each naturally occurring amino acid. The program MHCalc uses the molecular modeling package THORMM [Moret, 1998] to optimize the geometry of the structures described below, and needs as only entry the PDS like file with the coordinates of the MHC/peptide complex. The program finishes printing out a data file containing the naturally occurring residues in preference order for each pocket and the data used to order these residues. We tested the program MHCalc to the complex molecule HLA-DR1 (DRA DRB1 *01 01) with the Hemaglutinin peptide, obtained at the BrookHaven Prote in Data Bank (1 DLH entry). This system was chosen because it has been highly studied and so offers abundant experimental and theoretical data to compare our results. We obtained data referring to pocket 1 so far, which is in full agreement with the literature.

CNPq / Este trabalho apresenta um algoritmo genético paralelo (AGP) para o problema de dobramento de proteínas, utilizando o modelo 3DHP-SC. Este modelo tem sido pouco abordado devido ao elevado grau de complexidade envolvido. Foi proposta uma função de fitness baseada na energia livre e na compacidade do dobramento. Operadores genéticos especiais foram desenvolvidos, além de estratégias para auxiliar o algoritmo no processo de busca de conformações de proteínas. Vários experimentos foram realizados para ajustar todos os parâmetros do sistema, incluindo os parâmetros básicos do AG (probabilidades de mutação e crossover, e o tamanho de torneio) e os parâmetros dos operadores especiais e das estratégias. O efeito da matriz de energias para o modelo no desempenho do algoritmo também foi estudado. Uma comparação com outra abordagem de computação evolucionária também foi realizada, a fim de verificar o desempenho do método proposto. Devido a não existir, até então, benchmarks para teste deste modelo, foi proposto um conjunto de 25 sequências baseado em outro modelo mais simplificado. Os resultados obtidos mostraram que o AGP alcançou um bom nível de eficiência e obteve dobramentos biologicamente coerentes, sugerindo a adequabilidade da metodologia proposta. / This work presents a parallel genetic algorithm (PGA) for the protein folding problem, using the 3DHP-SC model. This model has been sparsely studied in the literature due to its complexity. A new fitness function was proposed, based on the free-energy and compacity of the folding. Special genetic operators were developed, besides strategies to aid the algorithm in the search of protein conformations. Many experiments were done to adjust all the parameters of the system, including the basic parameters of the GA (mutation and crossover probability, and tournament size) and parameters of the special genetic operators and strategies. The effect of the energy matrix of the model in the performance of the algorithm was also studied. Moreover, a comparison with other evolutionary computation approach was done, to verify the performance of the proposed method. Since there is no benchmark available to date, a set of 25 sequences was used, based on a simpler model. Results show that the PGA achieved a good level of efficiency and obtained biologically coherent results, suggesting its adequacy for the problem.

Orientador: Nilson Ivo Tonin Zanchin / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T09:08:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Smetana_JulianaHelenaCosta_D.pdf: 8660811 bytes, checksum: cb33e97d4c49fdce1e29094a2f6089cc (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: As células respondem constantemente a uma enorme variedade de estímulos, que são interpretados e integrados por meio de redes de sinalização, dando origem a uma resposta biológica. Defeitos nesses circuitos são a causa de diversas doenças, incluindo muitos, se não todos os tipos de câncer. As fosfatases, enzimas que removem grupamentos fosfato dos substratos de quinases, dependem principalmente de subunidades regulatórias para definir sua especificidade. As fosfatases do tipo 2A constituem a subfamília PPP, que é formada por PP2A, PP4 e PP6. PP2A é a principal fosfatase solúvel de fosfosserina e fosfotreonina em células animais e é encontrada predominantemente como uma holoenzima formada por uma subunidade catalítica (C), uma subunidade regulatória (B, B', B'' ou B''') e uma de ancoragem (PR65/A). Em levedura, as fosfatases 2A desempenham um importante papel na via da quinase TOR, o que ocorre por meio da proteína essencial Tap42. A proteína Tip41 foi identificada como um parceiro de interação de Tap42 e regulador da via da quinase TOR em levedura. A homóloga de Tap42 em mamíferos, chamada de a4, está envolvida na regulação de diversos processos celulares, como diferenciação, desenvolvimento, migração celular e apoptose, por meio de seu papel conservado de regulador de fosfatases 2A. A homóloga em mamíferos de Tip41, chamada TIPRL, é uma proteína ainda pouco caracterizada. Este trabalho teve como objetivo analisar a função das proteínas a4 e TIPRL humanas e esclarecer seu papel na regulação de fosfatases 2A. A caracterização estrutural de a4 e Tap42, usando dados de SAXS, dicroísmo circular e proteólise limitada, mostrou que essas proteínas apresentam um domínio N-terminal compacto formado por a-hélices e um domínio C-terminal desestruturado. Em uma triagem de interações com a proteína TIPRL humana, identificamos as fosfatases PP2Ac, PP4c e PP6c como seus parceiros de interação, assim como os fatores de transcrição MafB e TAF10. Ao contrário do esperado a partir do modelo de levedura, a4 e TIPRL não interagem diretamente, mas formam um complexo ternário com PP2Ac. Uma triagem de substratos de fosfatases 2A regulador por TIPRL identificou os fatores de splicing SF2/ASF e SF2p32. Nossos resultados sugerem um modelo estrutural para a regulação das fosfatases 2A por a4 e mostram que TIPRL é um novo regulador comum dessas fosfatases com funções na regulação da expressão gênica. / Abstract: Cells respond constantly to a variety of stimuli, which are interpreted and integrated through signaling networks, giving rise to biological responses. Defects in this circuitry are a cause of many diseases, including cancer. Protein phosphatases are enzymes which remove phosphate groups from kinase substrates, relying mainly on regulatory subunits for their substrate specificity. Type 2A phosphatases belong to the PPP subfamily, which is formed by PP2A, PP4 and PP6. PP2A is the major soluble serine/threonine phosphatase in animal cells and is found predominantly as a heterotrimer composed of a catalytic (C), a regulatory (B, B', B'' or B''') and a scaffold (PR65/A) subunit. Type 2A phosphatases play a major role in the yeast TOR signaling pathway through their interaction with the essential protein Tap42. Tip41 was identified as a Tap42 interacting protein and regulator of the TOR pathway. a4, the mammalian orthologue of Tap42, regulates many cellular processes such as differentiation, development, cell migration and apoptosis as a conserved type 2A phosphatase regulator. TIPRL, the mammalian orthologue of Tip41, is still poorly characterized. The objective of the present work was to analyse the function of a4 and TIPRL and improve the understanding of their role as type 2A phosphatase regulators. The structural characterization of a4 using SAXS analyses, circular dichroism and limited proteolysis, showed that these proteins are formed by an a-helical N-terminal domain and an unfolded C-terminal domain. A screen for TIPRL interacting proteins identified PP2Ac, PP4c and PP6c and also the transcription factors MafB and TAF10. Unlike their yeast conterparts, a4 and TIPRL do not interact directly, but rather form a ternary complex with PP2A. A search for type 2A phosphatase substrates regulated by TIPRL identified the splicing factor SF2/ASF and its regulatory protein SF2p32. Our results suggest a structural model for the regulation of type 2A phosphatases by a4 and show that TIPRL is a novel common regulator of these phosphatases which functions in regulation of gene expression. / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

O cachorro-do-mato (Cerdocyon thous - Linnaeus, 1766) é um canídeo de médio porte com distribuição ampla na América do Sul e que ocorre em quase todo o Brasil. Dentre as principais ameaças à sua conservação estão os atropelamentos causados principalmente pela perda de habitat. A escassez de dados laboratoriais de cachorro-do-mato prejudica o atendimento médico veterinário dificultando a aplicação de terapias adequadas. Este trabalho teve como objetivo avaliar os níveis de Proteína C Reativa, Albumina, Pré-albumina, Ceruloplasmina, Haptoglobina e Alfa 1 Glicoproteína Ácida bem como o Indice Prognóstico Inflamatório Nutricional (IPIN) nesta espécie, obtendo portanto uma primeira descrição destes marcadores prognósticos. Foram coletados 1,5 ml de sangue por acesso jugular de oito exemplares de Cachorro-do-mato (Cerdocyon thous) provenientes do acervo do Laboratório de Ensino e Pesquisa em Animais Selvagens (LAPAS) da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Federal de Uberlândia para exames de rotina. As amostras foram coletadas através da veia jugular após contenção física dos animais e tricotomia da região. Após análise estatística, os valores encontrados foram: albumina: entre 2,7 e 3,0 g/dl, alfa 1 glicoproteína ácida: entre 0,19 e 0,21 g/l, proteína C reativa: entre 1,7 e 2,2, pré-albumina: entre 30 e 35 mg/l e haptoglobina: entre 0,078 e 0,156 e IPIN ≤ 0,006 sendo considerado normal e valores ≥ 0,006 considerados altos. Esta prima descrição servirá como base para estudos utilizando animais com doenças específicas e, após as análises, comparadas com os valores encontrados neste trabalho verificando se o comportamento segue a semelhança de cães domésticos. / The dog-eating fox (Cerdocyon thous - Linnaeus, 1766) is a medium sized canid widely distributed in South America and occurs in almost all of Brazil. Among the main threats to their conservation are the roadkill mainly caused by habitat loss. The shortage of laboratory bush dogs data affect the veterinary medical care hindering the application of appropriate therapies. This study aimed to evaluate the levels of C-reactive protein, albumin, pre-albumin, ceruloplasmin, haptoglobin and Afla 1 acid glycoprotein and the Prognostic Index Inflammatory Nutritional (IPIN) in this species, thus obtaining a first description of these prognostic markers. They collected 1.5 ml of blood by jugular access 8 of Mato Dogs copies (thous thous) from the Laboratory of collection of Teaching and Research in Wildlife (limpets), Faculty of Veterinary Medicine, Federal University of Uberlândia for exams routine. The samples were collected via the jugular vein after physical restraint of animals and trichotomy of the region. After statistical analysis, the values were: albumin: between 2.7 and 3.0 g / dl, alpha 1-acid glycoprotein: between 0.19 and 0.21 g / l, C-reactive protein: between 1.7 and 2 2, prealbumin between 30 and 35 mg / l haptoglobin: between 0.078 and 0.156 and IPIN ≤ 0.006 being considered normal and values ≥ 0.006 considered high. This press description will serve as a basis for studies where animals may be used with specific diseases and, after analysis, compared with the values found in this study and verified the behavior follows the likeness of domestic dogs. / Tese (Doutorado)

O gene PKHD1, mutado na doença renal policística autossômica recessiva, apresenta um padrão de splicing complexo associado a múltiplos transcritos alternativos. Neste trabalho estudamos o perfil de expressão de seu produto, poliductina. Análises por western blot revelaram produtos putativos de membrana de > 440 kDa e ~230 kDa, e de ~140 kDa em frações solúveis de rim, fígado e pâncreas. Estudos imunoistoquímicos mostraram marcação em ductos coletores renais e porção ascendente espessa da alça de Henle, em epitélios ductais biliar e pancreático e, no período embrionário, em broto ureteral, ductos biliar e pancreático e glândula salivar. Análises por imunofluorescência e microscopia imunoeletrônica sugerem que poliductina se localize em cílio apical primário, membrana apical e citoplasma de células do ducto coletor. Nossos resultados indicam que PKHD1 codifica isoformas de membrana e solúveis / PKHD1, the gene mutated in autosomal recessive polycystic kidney disease, presents a complex splicing pattern, associated with multiple alternative transcripts. In this work we have studied the expression profile of its product, polyductin. Western blot analysis revealed putative membrane products of > 440 kDa and 230 kDa, and of ~140 kDa in soluble fractions in kidney, liver and pancreas. Immunohistochemistry studies showed staining in renal collecting duct and thick ascending limb of Henle, in biliary and pancreatic ductal epithelia and, in the embryonic period, in ureteric bud, biliary and pancreatic ducts and salivary gland. Immunofluorescence and immunoelectron microscopy studies suggest that polyductin localizes to primary apical cilium, apical membrane and cytoplasm of collecting duct cells. Our data indicate that PKHD1 codifies membrane and soluble isoforms

O gene PKHD1, mutado na doença renal policística autossômica recessiva, apresenta um padrão de splicing complexo associado a múltiplos transcritos alternativos. Neste trabalho estudamos o perfil de expressão de seu produto, poliductina. Análises por western blot revelaram produtos putativos de membrana de > 440 kDa e ~230 kDa, e de ~140 kDa em frações solúveis de rim, fígado e pâncreas. Estudos imunoistoquímicos mostraram marcação em ductos coletores renais e porção ascendente espessa da alça de Henle, em epitélios ductais biliar e pancreático e, no período embrionário, em broto ureteral, ductos biliar e pancreático e glândula salivar. Análises por imunofluorescência e microscopia imunoeletrônica sugerem que poliductina se localize em cílio apical primário, membrana apical e citoplasma de células do ducto coletor. Nossos resultados indicam que PKHD1 codifica isoformas de membrana e solúveis / PKHD1, the gene mutated in autosomal recessive polycystic kidney disease, presents a complex splicing pattern, associated with multiple alternative transcripts. In this work we have studied the expression profile of its product, polyductin. Western blot analysis revealed putative membrane products of > 440 kDa and 230 kDa, and of ~140 kDa in soluble fractions in kidney, liver and pancreas. Immunohistochemistry studies showed staining in renal collecting duct and thick ascending limb of Henle, in biliary and pancreatic ductal epithelia and, in the embryonic period, in ureteric bud, biliary and pancreatic ducts and salivary gland. Immunofluorescence and immunoelectron microscopy studies suggest that polyductin localizes to primary apical cilium, apical membrane and cytoplasm of collecting duct cells. Our data indicate that PKHD1 codifies membrane and soluble isoforms