Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. / Submitted by Allan Wanick Motta (allan_wanick@hotmail.com) on 2010-03-11T20:16:38Z No. of bitstreams: 1 2009_DianaPaolaGomezMendonza.pdf: 1719944 bytes, checksum: 7f9cd7d8e9a8ea98371da5f284ba1d63 (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-05-04T18:33:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_DianaPaolaGomezMendonza.pdf: 1719944 bytes, checksum: 7f9cd7d8e9a8ea98371da5f284ba1d63 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-04T18:33:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_DianaPaolaGomezMendonza.pdf: 1719944 bytes, checksum: 7f9cd7d8e9a8ea98371da5f284ba1d63 (MD5) Previous issue date: 2009 / O fungo filamentoso Trichoderma harzianum conhecido produtor de enzimas extracelulares como xilanases e celulases foi crescido em três fontes de carbono quimicamente definidas, glicose, celulose e xilana e uma fonte complexa, bagaço de cana, a fim de determinar-se as variações que cada uma geraria na atividade enzimática e na composição do secretoma do fungo. A produção enzimática de T. harzianum sobre bagaço de cana foi inicialmente avaliada durante 15 dias, evidenciando pouca variação em termos de concentração, produção de proteínas e perfis eletroforéticos ao longo do tempo. Após crescimento por 9 dias, detectou-se atividade xilanolítica (0,00610 UI/mL) e celulolítica (0,00497 UI/mL, 0,00926 UI/mL) no meio suplementado com glicose, indicando uma possível produção constitutiva das enzimas. A mais alta atividade xilanolítica(0,09514UI/mL) e celulolítica (0,03257UI/mL, 0,06353UI/mL) foram observadas quando T. harzianum foi cultivado em meio com bagaço de cana como fonte de carbono. Os secretomas foram submetidos a eletroforese bidimensional (2-DE) em faixa de pH 3-10 que mostrou perfil pouco complexo na amostra do meio com glicose e uma maior concentração de spots protéicos na região ácida dos demais géis. Foram então realizadas eletroforeses 2-DE na faixa de pH 4-7, a fim de obter melhor resolução de spots correspondentes a possíveis isoformas protéicas. Os géis bidimensionais na faixa de 4-7 foram submetidos a análise de imagens para determinar o número total de spots em cada gel assim como os spots exclusivos e os pareados entre as diferentes condições. Tentativas de identificação de spots por peptide mass fingerprinting e MS/MS mostraram baixa porcentagem de sucesso, provavelmente devido ao baixo número de sequências de T. harzianum em banco de dados e a existência de modificações pós-traducionais como glicosilações nas enzimas secretadas. Nacetil-glucosaminidase e α-L-Arabinofuranosidase, foram identificadas no secretoma obtido em meio contendo bagaço de cana. Espera-se que a conclusão dos mapas secretômicos possa contribuir na compreensão dos mecanismos de expressão e secreção de enzimas de T. harzianum e aplicações destas em processos biotecnológicos. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The filamentous fungus Trichoderma harzianum recognized producer of extracellular enzymes such as xylanase and cellulases was grown in three chemically defined carbon sources, glucose, cellulose and xylan, and a complex source, sugarcane bagasse, in order to determine the variations in enzyme activity and secretome composition of fungus. The enzyme production of T. harzianum on sugarcane bagasse, was initially evaluated for 15 days, showing little variation in terms of concentration, protein production and electrophoretic profiles over time. After 9 days of growth, xylanolytic (0,00610 UI/mL) and cellulolytic (0,00497 UI/mL, 0,00926 UI/mL) activities were detected in the medium supplemented with glucose, indicating a possible constitutive production of enzymes. The major cellulolytic (0,03257UI/mL, 0,06353UI/mL) and xylanolytic (0,09514UI/mL) activities were observed when the T. harzianum was grown in medium with sugarcane bagasse. The secretoms were subjected to two-dimensional electrophoresis (2-DE) in pH range 3-10 showed low complex profile in the sample of medium with glucose and a greater concentration of proteic spots in the acidic region of other gels. Electrophoresis were then performed 2-DE in the range of pH 4-7, to obtain greater resolution of spots corresponding to possible protein isoforms. The two-dimensional gels in the range of 4-7 were subjected to computational analysis of images that showed the total number of spots in each gel as well as exclusive and matched spots between the different conditions. Attempts to identify spots by peptide mass fingerprinting and MS / MS showed low percentage of success, probably due to the low number of sequences of T. harzianum in the database and the existence of posttranslational modifications as glycosylation in the secreted enzymes. N-acetyl-glucosaminidase and α-L- arabinofuranosidase, were identified in sugarcane bagasse secretome. It is expected that the conclusion of secretomic maps can contribute to a better understanding of the expression and secretion mechanisms of T. harzianum enzymes and their applications in biotechnological processes.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2010-03-31T12:08:06Z No. of bitstreams: 1 2009_ViniciusFiuzaDumas.pdf: 2487859 bytes, checksum: 18a4a6f267ffbccc4a5f9c47d3328dc3 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-05-12T14:43:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_ViniciusFiuzaDumas.pdf: 2487859 bytes, checksum: 18a4a6f267ffbccc4a5f9c47d3328dc3 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-12T14:43:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_ViniciusFiuzaDumas.pdf: 2487859 bytes, checksum: 18a4a6f267ffbccc4a5f9c47d3328dc3 (MD5) Previous issue date: 2009-05-15 / Nas últimas décadas, a agricultura mundial vem crescendo exponencialmente. Culturas como as da soja recebem destaque por influenciar na geração de divisas e empregos em todo mundo. Essa cultura está vulnerável a diversas pragas, dentre estas, destaca-se a lagarta da soja, Anticarsia gemmatalis Hübner, 1818 (Lepidoptera: Noctuidae), que é a principal desfolhadora da soja no Brasil. Além de provocar danos econômicos no setor agrícola, os insetos podem causar problemas relacionados à saúde pública. O principal exemplo é o Aedes aegypti, que é o vetor de doenças como a dengue e a febre amarela. Uma alternativa para o controle desses insetos é a utilização de agentes de controle biológico, como Bacillus thuringiensis (Bt). Essa bactéria possui a capacidade de produzir inclusões protéicas (proteínas Cry e Cyt) tóxicas para insetos e são largamente utilizadas no controle de pragas na agricultura e no controle de vetores de doenças humanas. Desta forma, o estudo do modo de ação e toxicidade dessas proteínas é importante para um melhor entendimento dos mecanismos de interação entre o patógeno e as pragas. Este trabalho teve como objetivo determinar a toxicidade de quatro proteínas Cry de B. thuringiensis para populações susceptíveis e resistentes de A. gemmatalis, e a construção de um baculovírus e de uma estirpe de Bt recombinantes contendo o gene cyt1Aa. Para o primeiro trabalho, as proteínas Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac e Cry2Aa foram expressas individualmente por estirpes de Bt. As proteínas foram purificadas, solubilizadas, ativadas com tripsina e biotiniladas para a realização de bioensaios, ensaios de ligação e ensaios de competição heteróloga. O ensaio de ligação mostrou que ocorreu interação entre todas as proteínas e os receptores das duas populações de lagartas. O ensaio de competição heteróloga e os bioensaios demonstraram haver competição das proteínas pelos mesmos sítios de ligação para a população resistente de A. gemmatalis e que essa população tornou-se resistente, provavelmente, devido a alterações nos seus receptores. Além disso, os resultados obtidos nos bioensaios demonstraram que, apesar de todas as toxinas testadas apresentarem toxicidade para lagartas de segundo instar de A. gemmatalis, as proteínas Cry1Ab e Cry1Ac possuem toxicidade elevada quando comparadas com as outras proteínas testadas. No segundo trabalho, o gene cyt1Aa da estirpe S1806 de B. thuringiensis subsp. israelensis, foi amplificado por PCR, clonado em um vetor de clonagem e seqüenciado. A análise da seqüência do gene mostrou 100% de identidade com o gene cyt1Aa depositado no GenBank. O gene foi removido do vetor de clonagem, introduzido em um vetor de transferência (pFastBacTM1) e transferido para o genoma do baculovírus AcMNPV, utilizando o sistema Bac-to-Bac (Invitrogen), originando o baculovírus recombinante vFastCyt1Aa. Entretanto, a expressão da proteína recombinante não foi detectada em células de inseto infectadas com o vFastCyt1Aa. Além disso, o gene cyt1Aa foi inserido em um vetor de expressão para células de Bt (pSVP27A) e o plasmídeo recombinante (pSVPcyt1Aa) foi introduzido em uma estirpe de Bt acristalífera. Uma proteína de 27 kDa correspondente ao tamanho esperado para a proteína recombinante Cyt1Aa foi detectada por SDS-PAGE e Western-Blot de extratos de Bt recombinante. Entretanto, o extrato do Bt recombinante mostrou baixa toxicidade para mosquitos. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / In the last decades, the world agriculture has grown exponentially. Crops like soybean have an important role in increasing foreign exchange and jobs all over the world. However, this crop is vulnerable to a diversity of insect pests that cause great economic losses. Among these insect pests, the soybean caterpillar, Anticarsia gemmatalis Hubner, 1918 (Lepidoptera: Noctuidae) is the main defoliator of soybean in Brazil. Besides the economic damage in agriculture, insects can also cause public health problems. Aedes aegypti, the vector of the dengue and yellow fever diseases is the main example. One alternative to control this insect is the use of biological control agents such as Bacillus thuringiensis (Bt). This bacterium produces protein inclusions (Cry and Cyt proteins) that are toxic to insects and are widelly used for the control of insect pests in agriculture and for the control of human disease vectors. Therefore, the study of the toxins mode of action and toxicity has a great importance for understanding the mechanisms of interaction between insect pests and their patogens. The aim of this study was the toxicity determination of four Cry proteins of B. thuringiensis to resistant and susceptible A. gemmatalis populations, and the construction of recombinant baculovirus and Bt containing the cyt1Aa gene. For the first work, the proteins Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac e Cry2Aa were expressed individually by Bt strains. The proteins were purified, solubilized, activated with trypsin and biotinilated for bioassays, binding assays and heterologous competition assays. The binding assay showed binding affinities between all the proteins and the receptors in both populations of caterpillars. The heterologous competition assay and the bioassays showed competition between proteins for the same binding site in the resistant population of A. gemmatalis and this population became resistant probably because of modifications in their receptors. Besides that, the results of the bioassays demonstrate that Cry1Ab and Cry1Ac have higher toxicity to second instar larvae of A. gemmatalis when compared to the others toxins tested. In the second work, the cyt1Aa gene from the strain S1806 of B. thuringiensis subsp. israelensis was amplified by PCR, cloned in a vector and sequenced. The sequence analyses showed that the cloned gene from strain S1806 has 100% identity with a cyt1Aa gene deposited in GenBank. The gene was removed from the cloning vector, introduced into a transfer vector (pFastBacTM1) and transferred to the baculovirus genome AcMNPV, using the Bac-to-Bac system (Invitrogen), originating the recombinant baculovírus vFastCyt1Aa. However, no recombinant protein expression was detected in insect cells infected with vFastCyt1Aa. Furthermore, the cyt1Aa gene was also inserted in an expression vector for Bt cells (pSVP27A) and the recombinant plasmid (pSVPcyt1Aa) introduced into an acrystalliferous strain of Bt. A 27 kDa protein of the expected size for the recombinant Cyt1Aa was detected by SDS-PAGE and Western-Blot in recombinant Bt extracts. However, the recombinant Bt extracts showed low toxicity towards mosquitoes.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ceilândia, Programa de Pós-Graduação em Ciências e Tecnologias em Saúde, 2013. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2014-02-18T14:09:58Z No. of bitstreams: 1 2013_MauricioFarnese.pdf: 1726214 bytes, checksum: 8eb23c08dcf2d229143b6daaa0152746 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-02-19T12:35:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_MauricioFarnese.pdf: 1726214 bytes, checksum: 8eb23c08dcf2d229143b6daaa0152746 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-02-19T12:35:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_MauricioFarnese.pdf: 1726214 bytes, checksum: 8eb23c08dcf2d229143b6daaa0152746 (MD5) / A doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi atinge milhões de pessoas em todo mundo, especialmente na América Latina, onde é endêmica. Em seu ciclo de vida, o parasito passa por diversos processos de diferenciação para adaptar-se a diferentes condições dentro do hospedeiro mamífero e do inseto triatomíneo. Componentes localizados na superfície do parasito e da célula hospedeira desempenham papéis importantes na invasão, entretanto os mecanismos envolvidos são muito discutidos. Sabe-se que a sinalização mediada por Ca2+ é um aspecto importante na invasão celular e na diferenciação do parasito. A calmodulina (CaM) é uma proteína citoplasmática Ca2+-dependente em eucariotos que regula várias proteínas. A ligação da CaM ao Ca2+ induz uma mudança conformacional que promove a interação desta com diversas proteínas com importantes funções biológicas. A CaM de T.cruzi (TcCaM) tem sido associada à várias funções diferentes como regulação do crescimento, estimulação enzimática, transdução de sinais, além de modular os efeitos do Ca2+. Desta forma, a fim de melhor entender o envolvimento das proteínas ligantes de CaM (CaM-BPs) nos processos de invasão e diferenciação de T. cruzi, foram adotadas nesse trabalho duas abordagens de identificação de proteínas ligantes de Ca2+ e/ou CaM. Primeiramente pela análise bioinformática de proteínas diferencialmente expressas durante a amastigogênese e proteínas presentes na superfície do parasito. Foram preditas 17 proteínas ligantes de Ca2+ dentre as identificadas com expressão regulada durante a amastigogênese e 36 proteínas na superfície de tripomastigota e amastigota. Estas possuem funções enzimática, de armazenamento, transporte dentre outras. A segunda foi uma abordagem experimental onde identificamos 6 proteínas, as quais desempenham funções estruturais, motilidade, adesão ou enzimática. Esta segunda vertente foi realizada experimentalmente por uma abordagem proteômica. As CaM-BPs extraídas da forma epimastigota foram enriquecidas por cromatografia de afinidade e separadas em géis eletroforéticos (1D-PAGE e 2D-PAGE). A identificação por espectrometria de massas foi iniciada e já foram identificados componentes da estrutura celular como α- e β-tubulinas, proteína paraflagellar rod putativa e uma proteína de transdução de sinal intracellular, a HSP70. Esses dados auxiliam no entendimento sobre como o Ca2+, a TcCaM e seus ligantes participam em processos celulares como invasão e diferenciação do T. cruzi. / Chagas' disease, caused by the protozoan Trypanosoma cruzi, afflicts millions worldwide especially in Latin America where it is endemic. During its life-cycle, the parasite undergoes several differentiation events in order to adapt to a variety of conditions inside both mammalian host and triatomine vector. Components from both parasite and host-cell surfaces play major roles in invasion, however the mechanisms involved are still much discussed. It is known that Ca2+ mediated signaling is an important aspect of host-cell invasion and parasite differentiation. Calmodulin (CaM) is a citoplasmic Ca2+-dependent protein that regulates several proteins in eukaryotes and the binding of Ca2+ to CaM induces conformational changes, which promotes the interaction to a variety of other proteins with important biological functions. T. cruzi CaM (TcCaM) has been linked to several functions such as growth regulation, enzyme stimulation, and signal transduction, besides modulating the effects of Ca2+ concentration. Thus, in order to better understand the involvement of CaM binding proteins (CaM-BPs) in the invasion process and T. cruzi differentiation, was adopted here two approaches to identify Ca2+- and/or CaM- binding proteins. First though bioinformatic prediction of such proteins among those identified as differentially expressed during amastigogenesis and those presented in the parasite cell surface. It was predicted 18 Ca2+-binding proteins with regulated expression level during differentiation and 36 in the surface of trypomastigotes and/or amastigotes. These have enzymatic, storage, transportation and others functions. The second was an experimental approach where we identified 6 proteins, which play structural, motility, adhesion or enzymatic functions. This second part was an experimental proteomic approach, where CaM-BPs from epimastigotes were enriched by affinity chromatography and separated by gel electrophoresis (1D-PAGE and 2D-PAGE). Mass spectrometric identifications were initiated and it already has been identified cell structure components such as α-and β-tubulins, putative paraflagellar rod proteins and a signal transduction protein, the HSP70. This data contribute to the understanding of the involvement of Ca2+, TcCaM and their ligands in the invasion and differentiation processes.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-graduação em Biologia Molecular, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2014-04-11T15:30:57Z No. of bitstreams: 1 2013_MarxGomesVanderLinden.pdf: 9956920 bytes, checksum: f23ee1a3a019a055fc303b9a6d469e9d (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-04-25T12:05:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_MarxGomesVanderLinden.pdf: 9956920 bytes, checksum: f23ee1a3a019a055fc303b9a6d469e9d (MD5) / Made available in DSpace on 2014-04-25T12:05:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_MarxGomesVanderLinden.pdf: 9956920 bytes, checksum: f23ee1a3a019a055fc303b9a6d469e9d (MD5) / Há muito tempo se sabe que estruturas tridimensionais de proteínas são determinadas por suas respectivas sequências de aminoácidos, entretanto as possíveis regras que associam sequências a estruturas continuam em larga medida desconhecidos. A construção de um algoritmo geral para predição ab initio de estruturas proteicas, isto é, uma metodologia que determine computacionalmente a estrutura nativa de qualquer proteína com base em sua sequência de aminoácidos, é possivelmente o maior desafio teórico atual da Biofísica computacional. Esta tese parte da hipótese inovadora de que a única informação dependente de sequência necessária para se determinar a conformação nativa de uma proteína é a distância de cada um de seus átomos até o centro geométrico da estrutura, uma medida que denominamos enterramento atômico. O objetivo principal do trabalho é avaliar a aplicabilidade dessa hipótese através da construção da primeira versão de um método computacional para predição ab initio que utilize os enterramentos como único intermediário informacional entre sequência e estrutura proteica. Nossa metodologia está dividida em duas partes principais: a primeira descreve a construção de um método computacional capaz de realizar predições de enterramentos atômicos a partir de sequências de aminoácidos; a segunda trata de simulações computacionais do enovelamento que utilizam as predições obtidas na primeira parte para obter estruturas terciárias próximas à nativa para algumas proteínas selecionadas. O método computacional que foi desenvolvido neste trabalho para prever os enterramentos atômicos de proteínas a partir de suas sequências de aminoácidos é um algoritmo de aprendizado supervisionado baseado em um modelo oculto de Markov (Hidden Markov Model - HMM). Análises informacionais realizadas sobre os resultados alcançados pelo HMM implementado revelaram que suas predições são ótimas, no sentido de que elas são capazes de extrair praticamente toda a informação sobre enterramentos disponível na sequência, de acordo com o modelo de dados adotado. Na segunda parte do trabalho, um método de dinâmica molecular com um potencial simplificado, que não inclui nenhuma informação derivada da estrutura nativa e utiliza as predições de enterramentos atômicos como base para o único termo dependente de sequência do potencial, foi aplicado a três proteínas pertencentes a diferentes classes estruturais, selecionadas entre os melhores resultados de predição alcançados na etapa anterior. Nos três casos, o algoritmo foi capaz de obter e distinguir a conformação nativa correta em simulações do enovelamento que partiram de conformações completamente estendidas. Os resultados obtidos demonstram que, ao menos para algumas classes de proteínas, os enterramentos atômicos podem de fato atuar como os únicos intermediários informacionais entre sequência e estrutura, fornecendo um novo arcabouço conceitual que esperamos contribuir para a compreensão dos fundamentos do enovelamento proteico e para a investigação do problema da predição estrutural de proteínas. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / It has been long known that the three-dimensional structures of proteins are determined by their respective amino acid sequences. The possible rules, however, that associate protein sequences to structures remain at large elusive. The development of an ab initio general algorithm for protein structure prediction, that is, a computational methodology that should be able to determine the native structure of any protein from its amino acid sequence, is possibly the greatest theoretical challenge of current computational biophysics. The premise of this work is based on the innovative hypothesis that the only sequence-dependent information needed to determine the native conformation of a protein is the distance of each of its atoms to the geometric center of the structure, a measure we call atomic burial. Our main objective is to evaluate the applicability of this hypothesis through the development of the first version of a computational method for ab initio prediction that employs burials as the only informational intermediate between protein sequence and structure. Out methodology is divided in two main parts: the first part describes the construction of a computational method to produce atomic burial predictions from amino acid sequences; the second part refers to folding simulations that employ the previously obtained predictions to obtain tertiary structures that are close to the native configuration for selected proteins. The computational method that was developed in this work for atomic burial prediction from amino acid sequences is a supervised learning algorithm based in a Hidden Markov Model (HMM). Informational analyses performed on the HMM results revealed that its predictions are optimal, in the sense that they are capable of extracting almost the totality of the information about burials that is available in amino acid sequences, according to the data model that was adopted. In the second part of this work, a molecular dynamics method with a simplified potential, which does not include any information derived from the native structure and employs atomic burial predictions as its only sequence-dependent term, was applied to three proteins belonging to different structural classes, selected among the best prediction results achieved in the previous step. In all three cases, the algorithm was capable of obtaining and distinguishing the native conformation in folding simulations that started from fully extended conformations. The results achieved in this work demonstrate that, at least for some protein classes, atomic burials are in fact able to act as the sole informational intermediates between sequence and structure, providing a new conceptual framework that we expect to be able to contribute for our knowledge of the fundamentals of protein folding and to the problem of protein structure prediction.

Orientador: Renato M. E. Sabbatini / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Eletrica / Made available in DSpace on 2018-07-21T01:42:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Porrelli_RaulNeder_M.pdf: 10278987 bytes, checksum: 09e9a4c65fd6c396aa90700be5fdf713 (MD5) Previous issue date: 1995 / Resumo: Apesar do grande número de algoritmos existentes para a previsão de estrutura secundária de proteínas, determinadas técnicas estatísticas ainda não haviam sido exploradas. Utilizamos a metodologia de funções discriminantes logísticas na tentativa de ultrapassar a acurácia obtida por métodos que usaram redes neurais e teoria da informação. O número de parâmetros foi limitado explorando-se a natureza periódica das alfa-hélices e placas pregueadas beta. Uma grande variedade de modelos foi pesquisada, usando abordagem semi-paramétrica (máxima verossimilhança com penalização) combinada com seleção gradual de parâmetros. Mostramos que os modelos mais bem sucedidos tem ao redor de 800 parâmetros "efetivos" para o conjunto de dados utilizado. Os 340 parâmetros lineares e parte dos 800 parâmetros quadráticos puderam ser interpretados do ponto de vista físico-químico, contrastando com outros métodos da literatura. Após otimização e validação _cruzada, a acurácia foi de 65.9% para três estados estruturais, o que representa um resultado ligeiramente superior aos dos algoritmos já publicados. A maior acurácia de previsão está concentrada numa porção dos resíduos e a confiança da previsão pode ser facilmente calculada. Exploramos a possibilidade de usar estes resíduos, previstos com alta confiabilidade, para prever a estrutura completa da proteína, assim como muitos outros artifícios para aumentar a eficiência do método, com resultados limitados. Embora tenhamos obtido apenas uma modesta melhora da acurácia, a maneira como implementamos o modelo sugere que utilizamos toda a informação estrutural contida em segmentos de até 17 aminoácidos, no nível de complexidade que a quantidade de dados permite / Mestrado / Mestre em Engenharia Elétrica

Orientador: Antonio Celso Ramalho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-16T14:28:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marialva_JoseEduardode_M.pdf: 7870151 bytes, checksum: a0f9f8c17011a9a648d4a84741c40741 (MD5) Previous issue date: 1987 / Resumo: O presente trabalho foi realizado com o objetivo de estudar as possíveis alterações testiculares decorrentes da extirpação bilateral da glândulas salivares submandibulares e sublinguais de ratos jovens, alimentados com dietas contendo diferentes teores de proteína. Foram utilizados 48 ratos (Rattus norvergicos, albinos, Wistar), machos com 20 dias de idade, distribuídos em 2 grupos experimentais, alimentados com dieta com teores de proteína diferentes (Grupo A = 17,5% de proteína; Grupo B = 10% de proteína). Em cada grupo um terço dos ratos foram submetidos à extirpação bilateral das glândulas submandibulares ¿ sublinguais e os dois terços restantes sofreram apenas anestesia, incisão cervical e sutura. Em seguida, tanto no grupo A quanto no B, foram redistribuídos em 3 subgrupos, de forma que cada deles ficou constituído de 8 animais normais, (NO) 8 sialoadenectomizados (SI) e 8 normais alimentação pareada (NP). Todos os animais foram mantidos em gaiolas metabólicas individuais durante os 24 dias de experimentação. Ao final de cada período de 4 dias, verificou-se o peso dos ratos sempre à mesma hora. Anotou-se a ingestão diária de dieta bem como após cada período de 4 dias. Após 24 dias de observação, os animais foram sacrificados por decapitação e, na necropsia, os testículos e epidídimos esquerdos foram retirados por via abdominal. ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Not informed. / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador : Adilson Leite / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-18T19:43:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Freitas_FernandoAugustode_M.pdf: 5604182 bytes, checksum: 36139078eef73266670afa05af18a0a9 (MD5) Previous issue date: 1993 / Mestrado / Genetica de Plantas / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: João Francisco Marques Neto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-19T18:27:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Innocencio_ReginaMaria_D.pdf: 4117654 bytes, checksum: fa6c9ade194fbd27ff11e859abca2a69 (MD5) Previous issue date: 1994 / Resumo: A amiloidose secundaeia associada as doencas reumaticas caracteriza-se pelo depósito de fibrilas AA, derivadas de proteína sérica amilóide A (SAA), em determinados tecidos e órgãos. Os objetivos deste esudo consistiram em estabelecr a frequência da amiloidose na artrite reumatóide (AR) e esclerose sistêmica (ES) através da biópsia de tecido adiposo subcutâneo abdominal, determinar os níveis de proteína SAA e sua associação à amiloidose, parâmetros clínicos e atividade de doença em 48 pacientes com AR e 39 em ES. Todos foram submentidos à biopsia de tecido adiposo. O material resultante foi corado pelo vermelho Congo e analisado à luz polarizada. A biópsia de tecido adiposo foi positiva em dois pacientes com AR (4,17%), ambos do sexo feminino, com níveis elevados de proteína SAA, proteinúria, doença de longa evolução, soropositiva para o fator reumatóide e resultou negativa em todos pacientes com ES. Esta técnica representa um procedimento simples e sensível para o diagnóstico de amiloidose secundária, deve ser recomentdada devido ao baixo risco de complicações, como sangramento e ao menor custo em relação a métodos mais invasivos. A determinação dos níveis de proteína SAA foi realizada através da técnica de enzimaiunoesmaio em 43 pacientes voluntários saudáveis, 46 pacientes com AR e 37 com ES. Os níveis de proteína SAA mostraram-se significativamente elevados nos pacientes com AR em relação ao grupo de controle e entre aqueles com artrite periferica quando comparados com aqueles sem esta maifestacao, para niveis de proteina SAA inferiores a 100ug/ml. Entre os pacientes com ES, 26 apresentaram a forma limitada e 13 a forma difusa. Houve diferença significativa nos níveis de proteína SAA, tempo de duração da doença, escore cutâneo total e proteinuria em relação às duas formas clínicas. A proteína SAA é um sensível marcador de fase aguda que reflete o grau de atividade inflamatória nas doenças reumáticas / Abstract: The amyloid protein(AA) deposited in rheumatic diseases is derived from serum amylid protein A (SAA). The purposes of the present study were to verifythe frequency of amyloidoses in rheumatoid arthrits (RA) and systemic sclerosis (SSc) through the evaluation of subcutaneous abdominal fat biopsy and to determine the SAA response associated with amyloidosis, clinical features and disease activity in 48 patients with RA and 39 with SS. The fat biopsy specimens were stained with Congo red, examined for green birefringence through a polarizing microscope and showed positive results in two Caucasian women with RA (4,17%), high SAA levels, long standing disease proteinuria and positive rheumatoid factor and negative results in SSc patients. Congo red staining of subcutaneous fat tissue biopsu is a simples and sensitve method for the diagnosis of systemic amyloidosis. It may be recommended because of the low risk of complications from bleeding and lower costs than more invasive biopsy procedures. SAA levels were determined by solid phase enzyme immunoassay in sera from 43 healthy volunteers, 46 patients with RA and 37with SSc. There were significant differences in SAA concentration between RA and control groups and patients with or without arthristis and SAA levels under 100ug/ml. The patients with SSc were divided in two groups, 26 having limited systemic sclerosis (ISSc) and 13 having diffuse systemic sclerosis(dSSc). There wre significant differences in SAA concentration, mean disease duration, total skin score and proteinuria between ISS and dSSc groups. SAA is a sensitive acute phase reactant that reflects the inflammatory activity of rheumatic diseases. diseases / Doutorado / Doutor em Ciências Médicas

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2018. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAPDF). / A doença de Chagas afeta cerca de 8 milhões de pessoas ao redor do mundo e cerca de um terço dessas desenvolve as formas graves da doença, sendo o maior caso de cardiomiopatia causada na América Latina e também está entre o maior causador de mortes dentro das doenças tropicais negligenciadas. Mesmo sendo conhecida há 111 anos, os mecanismos que desenvolvem a patologia continuam um enigma, principalmente se tratando de estudos em humanos. Apesar disso, hoje é indiscutível o papel da resposta imune do hospedeiro frente ao agente etiológico, o Trypanosoma cruzi, no controle da infecção ou na sua disseminação, além dos mecanismos desencadeados na fase inicial da doença serem determinantes para o estabelecimento de uma fase crônica. Uma das primeiras células imunes a interagir com este patógeno são as céluls dendríticas (DCs), as quais são responsáveis por intermediar uma resposta imune não específica para uma específica e que possui uma função determinante dentro da patologia.. Este trabalho então visa uma análise da resposta inicial que é desencadeada em DCs frente ao T. cruzi a partir da validação de genes que foram vistos como diferencialmente expressos no trancriptoma realizado da interação inicial ente DCs e T. cruzi após 12h. Alguns desse genes modulados diferencialmente sob ação do patógeno foram o ligante da superfamília de fator necrose tumoral, membro 18 (TNFSF18), ligante 9 de quimiocina com motivo C-X-C (CXCL9) e peptidase específica de ubiquitina 18 (USP18), que possuíram sua expressão aumentada sob infecção. Essa superexpressão constatada por RNA-seq, foi confirmada neste estudo através de RT-qPCR após um processo de padronização e escolha de critérios rigorosos para garantir a qualidade da interpretação dos dados e poder comparar com veracidade os dados provenientes de duas metodologias distintas. Ficou comprovado então que a expressão gênica dessa interação patógeno-hospedeiro poderia ser atestada por RT-qPCR, viabilizando estudos posteriores de outros genes e também em uma população amostral maior, permitindo assim analisar a resposta inicial de forma mais abrangente. Isso tornará possível garimpar genes que tenham um papel fundamental na infecção e estuda-los com mais profundidade. Também é importante ressaltar que não necessariamente um aumento de expressão de transcrito reflete no nível proteico, como foi aferido neste trabalho ao mensurar algumas citocinas como IFN-γ, TNF, IL-6, IL-4, IL-10, IL-2 e IL-12, em que houve aumento de expressão de TNF sob infecção que condiz com seu nível de transcrito detectado, porém IL-10 que também foi supraregulado a nível transcricional, não possuía o mesmo comportamento a nível proteíco, tendo uma regulação importante e decisiva na expressão pelo hospedeiro. / Chagas disease affects around 8 million people worldwide and about one-third of them develops severe forms of the disease, being the largest case of cardiomyopathy caused in Latin America and also among the largest cause of death within neglected tropical diseases. Even though it has been known for 111 years, the mechanisms that develop pathology remain an enigma, especially when it comes to studies in humans. Despite this, the role of the host immune response to the etiologic agent, Trypanosoma cruzi, in the control of the infection or its dissemination is indisputable, besides the mechanisms triggered in the initial phase of the disease are determinant for the establishment of a chronic phase. One of the first immune cells to interact with this pathogen is the dendritic cells (DCs), which are responsible for being a mediator between a less specific immune response to a more specific and that has a determining function within the pathology. This work then aims an analysis of the initial response that is triggered in DCs against T. cruzi from a transcriptome performed from the initial interaction between DCs and T. cruzi after 12h. Some of these genes differentially modulated under the action of the pathogen were the tumor necrosis factor, member 18 (TNFSF18), CXC (CXCL9) motif chemokine ligand 9 and ubiquitin 18 specific peptidase (USP18), which had their expression considerably infection. This overexpression verified by RNA-seq was confirmed in this study through RT-qPCR after a process of standardization and selection of strict criteria to guarantee the quality of data interpretation and to be able to compare data from two different methodologies. It was then proved that the differential gene expression obtained in the transcriptome, a robust but more expensive and inaccessible technique, could be attested by RT-qPCR, allowing further studies of other genes and also in a larger sample population, thus allowing an analysis of the initial response in DCs by the T, I crossed more comprehensively in order to mine genes that have a fundamental role in the infection and study them in more depth. It is also important to note that not necessarily an increase in transcript expression reflects at the protein level, as measured in this work when measuring some cytokines such as IFN-γ, TNF, IL-6, IL-4, IL-10, IL-2 and IL-12, in which there was an increase in expression of TNF under infection that matches its detected level of transcript, but IL-10, which was also supraregulated at the transcriptional level, did not have the same behavior at the protein level, having an important and decisive regulation in expression by the host.

Recombinant proteins expressed in cell culture have been shown to be relevant in the biopharmaceutical production focusing human heaths. Insulin, interferon and vaccine against B hepatitis are products obtained from recombinant expression system. Importantly, the precipitation is a widely used technique for separating proteins from a mixture due to its simplicity, and the process is incremented by the use of salts. This study initially dealt with the validation of the salt precipitation method by using the purified BSA and trypsin, and then, to investigate the precipitation process of recAVLOEc protein synthesized by cells of E. coli BL21 (DE3) pLysS used as expression system for the AVLO. This protein has shown antiviral activity and it found in the hemolymph of Lonoimia obliqua caterpillar. The precipitation was conducted by the use of conventional salts (ammonium sulfate and sodium sulfate) and the volatile salt ammonium carbamate. The proteins of the bacterial expression system were evaluated for their antiviral potential virus-infected cell cultures. Bacterial cells were resuspended in phosphate buffer and lysade by ultrasound. In the experimental procedure, the saturated salt solution (ammonium sulfate, sodium sulfate or ammonium carbamate) was added dropwise to the protein solution. This mixture was kept at constant temperature of 5°C for 24 h. The supernatant phase was separated from the precipitate phase by centrifugation. The protein precipitate obtained from bacterial lysate was then added to cultures of L929 and Vero cells to evaluate the cytotoxic effect; and cultures of these cells were subsequently infected with virus (EMC and measles). The results showed better efficiency of sodium sulfate on the precipitation of BSA compared to ammonium sulfate, while for trypsin, the ammonium carbamate showed more effective. Toxic effect on the culture of L929 cells was observed for the precipitate obtained by the use of ammonium sulfate and sodium sulfate. However, as expected, the precipitated protein obtained by the use of volatile ammonium carbamate salt showed a lower cytotoxic effect. Tests in L929 cultures infected with EMC, were performed; however, protein samples obtained by conventional and volatile salts used as a precipitating agent did not show antiviral action. In Vero cell cultures, the precipitated protein from cell lysate by sodium sulfate showed antiviral action for measles. / Proteínas recombinantes, expressas em culturas celulares, têm se mostrado importantes na produção de fármacos de interesse para a saúde humana. Insulina, interferons e a vacina contra a hepatite B são exemplos de produtos obtidos a partir de sistemas recombinantes de expressão. A precipitação é uma técnica amplamente empregada para separação de proteínas a partir de uma mistura devido à sua simplicidade, sendo tal fato potencializado pelo uso de sais. Este estudo, inicialmente, abordou a validação do método de precipitação salina das proteínas puras BSA e tripsina e em adição a investigação do processo de precipitação da proteína recAVLOEc, sintetizada por células de E. coli BL21 (DE3) pLysS utilizadas como sistema de expressão. Tal proteína é originalmente encontrada na hemolinfa da lagarta Lonomia obliqua. A precipitação foi conduzida por meio do uso de sais convencionais (sulfato de amônio e de sódio) e do sal volátil carbamato de amônio. As células bacterianas foram ressuspendidas em tampão fosfato e submetidas à lise mecânica. No procedimento experimental estabelecido, o contato de um concentrado proteico com uma solução salina saturada (sulfato de amônio, sulfato de sódio ou carbamato de amônio) foi mantido por 24 horas a 5°C. O sobrenadante foi isolado do precipitado por meio de centrifugação e estas frações tiveram sua concentração proteica determinada através do método de Bradford. O precipitado proteico obtido do lisado bacteriano foi então administrado em culturas de células L929 e Vero para a avaliação do efeito citotóxico e posteriormente para a verificação da ação antiviral para o EMC e o sarampo. Os resultados demonstraram maior eficiência do sulfato de sódio na precipitação da BSA quando comparado ao sulfato de amônio. Enquanto que para a tripsina o carbamato de amônio foi mais efetivo. Um efeito tóxico em culturas de L929 foi observado para os precipitados obtidos pelo uso de sulfato de amônio e de sódio. Entretanto, como esperado, o precipitado proteico obtido pelo uso do sal volátil carbamato de amônio apresentou menor efeito citotóxico. Os testes em culturas de L929 infectadas com o vírus EMC foram efetuados e as amostras de proteínas precipitadas com os sais convencionais e o sal volátil não resultaram em ação antiviral. Em culturas de células Vero, o uso do sulfato de sódio como agente de precipitação das proteínas contidas no lisado bacteriano resultou em ação antiviral para o sarampo. / Mestre em Engenharia Química