Orientador: Jose Camillo Novello / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-12T20:39:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Caetano_HugoTakeda_M.pdf: 2768082 bytes, checksum: 642bc9cfafd5a35858bee1896b5da5df (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A proteômica tem-se tomado ao longo dos últimos anos uma área de estudo cada vez mais essencial para o melhor entendimento dos mecanismos efetores e regulatórios das células e suas interações em sistemas biológicos. Patologias de origem genética como a hipertrigliceridemia, que geralmente modificam o perfil lipídico com o aumento dos níveis de triglicérides e colesterol, estão fortemente relacionadas com diversas doenças cardiovasculares. Estudos com animais e humanos têm sido realizados em busca do entendimento dos mecanismos celulares e moleculares implicados nestas patologias para potenciais intervenções terapêuticas e preventivas. Estudos em camundongos geneticamente hipertrigliceridêmicos para super expressarem a apolipoproteína C-III humana demonstraram que elevadas concentrações plasmáticas de triglicérides e ácidos graxas livres constituem uma condição metabólica que altera a funcionalidade mitocondrial. Essas mudanças no controle respiratório das mitocôndrias transgênicas representam uma adaptação atribuída a diferenças estruturais ou funcionais das membranas internas da mitocôndria transgênica. Assim, foi feito o estudo comparativo do proteoma de mitocôndria obtido destes animais transgênicos hipertrigliceridêmicos com o proteoma de camundongos controles não transgênicos. Para tanto, após o isolamento das mitocôndrias normais e transgênicas, foram utilizadas técnicas de eletroforese bidimensional (2DE) e espectrometria de massas do tipo MALDI-ToF e Q-ToF para a identificação das proteínas diferencialmente expressas. Dentre elas foram identificadas as proteínas Hidroximetilglutaril-CoA sintase, Carbamoil-fosfato sintetase e Flavoproteína transferidora de elétrons. Estas e outras proteínas podem representar interessantes alvos moleculares para o estudo da funcionalidade mitocondrial, visando futuras aplicações clínicas para o tratamento de determinadas condições patológicas como a hipertrigliceridemia. / Abstract: Along the last years, Proteomics has become an area of study each more essential to the better understanding of the effective and regulatory mechanisms of the cells and their interactions inside biological systems. Pathologies of genetic origin like the hypertriglyceridemia, that usually modify the lipid profile with the increase in the triglycerides and cholesterol levels, are strongly related to various cardiovascular diseases. Studies with animals and humans have been made in search of the understanding of 0011 and molecular mechanisms implied in these pathologies for potential therapeutic and preventive interventions. Studies in genetically hypertriglyceridemic mice to over expressing the human apolipoprotein C-III showed that high plasmatic concentrations of triglycerides and free fatty acids constitute a metabolic condition that changes the mitochondrial functionality. These changes in the breathing control of the transgenic mitochondria represent an adaptation attributed to structural or functional differences on the inner membrane of transgenic mitochondria. This way, we made the comparative study of the mitochondrial proteome obtained from these hypertriglyceridemic transgenic animals with the proteome from non transgenic control mice. For such, after the isolation of the normal and transgenic mitochondria, we used two-dimensional gel electrophoresis (2DE) and MALDI-ToF and Q-ToF mass spectrometry techniques to identify the differentially expressed proteins. Among them we identified the proteins Hydroxymethylglutaryl-CoA synthase, Carbamoyl-phosphate synthase and Electron transfer flavoprotein. These and other proteins can represent interesting molecular targets for the study of the mitochondrial functionality, aiming future clinical applications for the treatment of certain pathological conditions like hypertriglyceridemia. / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Jorg Kobarg / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T07:55:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Quaresma_AlexandreJoseChristino_D.pdf: 9068041 bytes, checksum: 9661a43a5c28440721d55ca90f6c94ac (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Os membros da família de proteínas chamada hnRNPs (heterogenous nuclear ribonuclein proteins) apresentam importantes papeis no controle da expressão gênica e no metabolismo dos mRNAs. Os membros hnRNPD (AUF1) e hnRNPQ (NSAP1) foram alvos deste estudo. AUF1 apresenta dois domínios de ligação à RNA do tipo RRM (RNA recognition motif) e participa ativamente no processo de desestabilização de uma classe de mRNAs que apresentam um motivo rico em AU na região 3' não traduzida. Demonstramos, através do sistema de duplo híbrido em levedura, que a isoforma p37 de AUF1 interagiu com as proteínas hnRNPQ, IMP-2, NSEP1 (YB-1) e UBC9. Além disso, a proteína hnRNPQ também foi pescada num outro ensaio de duplo híbrido em levedura, que utilizou como isca a proteína humana arginina metiltransferase (PRMT1). hnRNPQ apresenta, na sua região Cterminal, um ¿motivo rico em argininas e glicinas¿ (RGG box). Demonstramos que ela é alvo de metilação pela PRMT1 in vitro e in vivo. Funcionalmente, sua metilação é importante para sua localização nuclear. NSAP1 têm uma constituição modular com um domínio ácido (AcD) no seu Nterminal, seguido por três domínios de ligação à RNA do tipo RRM e o já mencionado RGG box no seu C-terminal. Funcionalmente hnRNPQ está envolvido em vários aspectos do etabolismo de RNA, incluindo a edição do mRNA da proteína humana ApoB. Para isso, ela interage não somente com o mRNA de ApoB, mas com a enzima efetora da edição Apobec1 e com a proteína que ativadora do Apobec1 (ACF1). Mostramos que o domínio ácido, de NSAP1 é capaz de interagir com Apobec1 e que sua fosforilação in vitro pela PKC inibe esta interação. Ainda identificamos que hnRNPQ interage com proteínas da família heat shock (incluindo HSP70 e BiP), e vimos que hnRNPQ é um alvo de fosforilação principalmente pela PKCd, in vitro. A localização sub-celular de hnRNPQ é modificada pela ativação in vivo das PKCs. Em conseqüência desta ativação ou da aplicação de estresse oxidativo, térmico ou indução de estresse do reticulo endoplasmático (tratamento com tapsigargina) hnRNPQ se desloca do núcleo para o citoplasma aonde se encontra em vesículas/corpúsculos definidas. Em resumo, nossos dados sugerem que as diversas funções da hnRNPQ relacionadas ao metabolismo de mRNAs, sofrem diferentes regulações, mediadas por modificações pós-traducionais (fosforilação e metilação), que interferem tanto na sua localização celular quanto na sua afinidade por determinados proteínas parceiras / Abstract: The members of the hnRNPs family (heterogenous nuclear ribonuclein proteins) play important roles in gene expression control and mRNAs metabolism. The proteins hnRNPD (AUF1) and hnRNPQ (NSAP1) were the main targets of this study. AUF1 has two RNA recognition motifs (RRM) and participates in the process of destabilization of a class of mRNAs that contain AU-rich sequences in their 3' untranslated regions (3'-UTR). We found, using the ¿yeast two-hybrid system¿ (Y2HS), that the isoform p37 of AUF1 (AUF1p37) interacts with the proteins: hnRNPQ, IMP-2, NSEP1 (YB-1) and UBC9. Moreover, the protein hnRNPQ was also identified as a prey protein in another Y2HS screen, which used as bait the human protein Arginine methyltransferase (PRMT1). HnRNPQ presents, in its C-terminal region, an "Arginine/Glicine-rich sequence" (RGG box). We are able to show that this RGG box is a target for methylation by PRMT1 in vitro and is methylated in vivo. Functionally, this methylation is important for its nuclear localization. hnRNPQ has a modular organization with an acid domain (AcD) in its N-terminal, followed by three RNA-binding domains (RRM) and the previously mentioned RGG box in its C-terminal. Functionally, hnRNPQ is involved in diverse aspects of RNA metabolism, including editing of the mRNA encoding the human protein ApoB. It has been shown previously to interact with the mRNA of ApoB, and also with the editing enzyme Apobec1 and the Apobec1 activation protein (ACF1). Here we show that the acid domain of hnRNPQ mediates the interaction with Apobec1 and that its in vitro phosphorylation (by PKC) inhibits this interaction. Furthermore, we found that hnRNPQ interacts with members the heat shock family of proteins (including HSP70 and BiP), and demonstrated that hnRNPQ can be in vitro phosphorylated by PKCd. Finally, we discovered that the sub-cellular localization of hnRNPQ undergoes modification after activation of PKC pathways. This also occurs after application of endoplasmic reticulum stress (using tarpsigargin), oxidative or heat stress. Under all of these conditions hnRNPQ translocated from the nucleus to the cytoplasm, where it is found at defined vesicles or granules. In summary, our data suggest that the diverse functions of hnRNPQ in the context of mRNA metabolism, may suffer specific regulations, by post-translational modifications, including phosphorylation and methylation, which modify both the proteins sub-cellular localizations as well as its affinity to interacting protein partners / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Everson Alves Miranda / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-14T10:04:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Robic_Goran_D.pdf: 5874566 bytes, checksum: 5a69e6daebf342bd09772a2c02c0c766 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A técnica de eletrocoagulação tem sido usada basicamente em tratamento de água potável e águas residuais. Neste trabalho propusemos o uso desta técnica na recuperação e purificação (RPB) de proteínas recombinantes produzidas em plantas geneticamente modificadas. O desafio principal da RPB de uso de plantas como biorreatores é a presença de clorofila e polifenóis nos seus extratos, que causam precipitação e desnaturação das proteínas de interesse, além de danificarem membranas e géis de separação. Portanto, a remoção destes compostos é essencial. No presente trabalho estudou-se a aplicação de eletrocoagulação para clarificar extratos de folhas de Nicotiana benthamiana transgênica removendo a clorofila e polifenóis, sem remover a proteína recombinante sGFP (proteína verde fluorescente sintética). Primeiramente foi necessário desenvolver um método de determinação e quantificação de sGFP baseado na fluorescência intrínseca desta proteína. Os problemas com a fluorescência de fundo presente nos extratos de folhas de N. benthamiana e o aumento de intensidade da fluorescência da sGFP nestes extratos - provavelmente o resultado de dimerização de moléculas de sGFP promovida por composto(s) do extrato - por nós observados, tinham que ser resolvidos. Diluição de 20 vezes dos extratos contendo sGFP com solução de uréia 6 mol/L em fosfato de sódio 50 mmol/L pH 7,00 eliminou completamente estas duas interferências. Os estudos da eletrocoagulação foram iniciados desenvolvendo-se dois modelos de remoção de compostos biológicos de soluções aquosas por esta técnica. Os modelos desenvolvidos são baseados na formação de complexos entre o composto e o gel de hidróxido de alumínio ou a partição do composto entre a fase aquosa e fase do gel de hidróxido de alumínio. Análises teóricas e experimentais revelaram que os parâmetros relevantes na remoção destes compostos são a corrente utilizada - que afeta a taxa de formação de hidróxido de alumínio - e o pH da eletrocoagulação - que afeta a carga tanto do gel formado como dos compostos a serem removidos. Gel de hidróxido de alumínio produzido a pH 8,0 apresentou alta eficiência em remover clorofila e polifenóis dos extratos de folhas de N. benthamiana não-transgênica, ao passo que somente uma pequena porção de proteínas nativas foi removida. Portanto, o gel de hidróxido de alumínio produzido nesta condição foi adicionado a extratos de N. benthamiana transgênica contendo sGFP. A remoção de 99,7% clorofila, de 88,5% dos polifenóis e de 38,4% de proteína total do extrato foi observada sem remoção da sGFP (fator de purificação de 1,6). Portanto, a eletrocoagulação pode também ser usada como técnica de pré-purificação de proteínas recombinantes e ao mesmo tempo como método de clarificação de extratos de folhas. / Abstract: Electrocoagulation is a technique that has been basically applied to water and wastewater treatment. We propose here the extension of this relatively cheap technique to the field of downstream processing (DSP) of plant-derived proteins, in which plants are used as a bioreactor for recombinant protein production. The main problem in the DSP of this plant-based technology is the presence of chlorophyll and phenolic compounds in plant extracts, which tend to precipitate and denature the proteins besides damaging separation membranes and gels. Therefore their removal from the extracts is essential. In the present work we studied the application of a electrocoagulation based technique as a prepurification technique to clarify transgenic Nicotiana benthamiana leaf extracts by removing chlorophyll and phenolic compounds without removing the recombinant protein sGFP (synthetic green fluorescent protein). First, a method for fluorescence-based quantification of sGFP had to be developed. The background fluorescence of plant extracts and the increased level of sGFP fluorescence in N. benthamiana leaves extracts - probably the result of dimerization of sGFP molecules promoted by interaction with some component(s) of tobacco extract - observed by us had to be overcome. Diluting the tobacco extract spiked with sGFP by 20 times with 6 mol/L urea solution in 50 mmol/L sodium phosphate buffer pH 7.00 completely eliminated the two mentioned interferences. The electrocoagulation studies started with the development of simple timedependent models for electrocoagulation of biological compounds from solutions. These models are based on either stoichiometric complex formation between aluminium hydroxide gel and the compound or the partition of the compound between the aqueous and the aluminium hydroxide gel phase. Theoretical and experimental analysis demonstrated that a relevant parameters in the process of electrocoagulation of biological materials are the current applied - since it affects the rate of aluminium hydroxide formation - and the pH of electrocoagulation - since it affects the charges of the aluminium hydroxide gel formed and the components to be removed. Aluminium hydroxide gel produced at pH 8.0 demonstrated a high efficiency of clorophyll and phenolic compounds removal from non-transgenic N. benthamiana leafs extracts, while removing only relative small portion of the native proteins. Therefore, the aluminum hydroxide gel produced at this pH was added to transgenic N. benthamiana leaf extracts containing recombinant sGFP. Removal of 99.7% of chlorophyll and 88.5% of phenolic compounds were observed. Also at this conditions 38.4% of total protein was removed, which resulted in a purification factor of 1.6 with 100% of the sGFP recovered. Therefore the method proposed could also be used as a strategy of pre-purification of recombinant proteins besides at the same time clarifying the tobacco leaf extracts. / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Doutor em Engenharia Química

Orientador: Laura Maria Mariscal Ottoboni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-23T19:15:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Novo_MariaTeresaMarques_D.pdf: 4388960 bytes, checksum: 4e9cc7ee25e2a967d6cd5387992b880d (MD5) Previous issue date: 1998 / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Ciências Biológicas

Mosquitos transgênicos incapazes de transmitir malária podem ser um controle alternativo, mas atualmente não estão disponíveis. O estudo da interação mosquitopatógeno é importante para melhorar o desenho de genes. A proteína circumsporozoita (CSP) tem dois domínios conservados que podem estar envolvidos na penetração dos esporozoítos na glândula salivar. Nosso objetivo foi expressar peptídeos contendo essas regiões na hemolinfa do mosquito usando o sistema de expressão transiente vírus Sindbis e a tecnologia de transgênese. Se a CSP está envolvida neste processo, os peptídeos competirão com spz impedindo a penetração. Cinco vírus sindbis e quatro linhagens transgênicas foram construídos e desafiados por P. gallinaceum. Nossos resultados mostram que os peptídeos não impediram a penetração de spz na glândula salivar, principalmente porque os peptídeos recombinantes não foram produzidos ou detectados. Aprimorar o desenho de genes, usando a otimização de códons e outras tecnologias, será essencial para a expressão de proteínas exógenas em mosquitos transgênicos. / Transgenic mosquitoes that impair malaria transmission can be an alternative control but currently an effective line is not available. A better understanding of mosquito interaction with pathogens is very important to improve refractory transgene design. Circumsporozoite protein (CSP) has two conserved domains that could be involved in spz penetration into mosquito salivary glands. Our aim was to express peptides encompassing these conserved regions in the mosquito hemolymph using Sindbis virus transient expression system and transgenesis technology. If CSP is involved in this process these peptides will compete with sporozoites impairing its penetration. Five Sindbis virus and four transgenic lines were constructed and challenged with P. gallinaceum. Our results showed these peptides could not impair sporozoites penetration in salivary glands, mainly because the recombinant proteins could not be produced or detected. Improving transgene design using codon usage and other technologies will be essential for expressing foreign proteins in transgenic mosquitoes.

Realizamos neste trabalho a automatização da nova metodologia MHCalc, desenvolvida anteriormente em nosso laboratório, que teve como resultado o programa homônimo escrito em linguagem C para ambiente GNU/Linux, o qual avalia quantitativamente a seletividade de uma determinada proteína MHC. Esta avaliação quantitativa possibilita o estabelecimento de uma escala de preferência dos resíduos de ocorrência natural para cada uma das posições de interação da fenda de apresentação do MHC; por permutação destes resíduos, podem-se derivar regras de composição para peptídeos reconhecíveis em cada alelo estudado, inclusive na ausência de dados experimentais. A metodologia desenvolvida em nosso laboratório se baseia na avaliação da seletividade de cada bolsão independentemente, através da energia de interação do mesmo com cada aminoácido de ocorrência natural. O programa MHCalc utiliza o pacote de programas THORMM [Moret, 1998] de modelagem molecular para otimização geométrica das estruturas descritas, e tem como entrada unicamente um arquivo de coordenadas em formato POB contendo as coordenadas de um complexo MHC/peptídeo, tendo como saída uma tabela de dados contendo os resíduos de ocorrência natural em ordem de preferência para cada bolsão. Testamos o programa MHCalc para o complexo formado pela molécula HLA-DR1 (DRA DRB1 *01 01) e o peptídeo de Hemaglutinina, obtido no Brookhaven Protein Data Bank com a entrada 10LH, sendo este sistema escolhido por ser altamente estudado e com abundância de dados experimentais e teóricos para comparação de resultados. Até o presente momento obtivemos os dados referentes ao bolsão 1, os quais estão em pleno acordo com a literatura. / In this work we automated the new methodology MHCalc, developed previously in our laboratory, which resulted in the computational program with the same name, written in C language to GNU/Linux environment. The program MHCalc evaluates quantitatively the selectivity of a given MHC protein. This quantitative evaluation allows the establishment of a preference scale of the naturally occurring residues for each pocket of a MHC molecule. From such a study it may be derived composition rules to peptides recognizable in each allele studied, even in the absence of experimental data. The methodology developed in our laboratory is based on the selectivity evaluation of each pocket independently, through its interaction energy with each naturally occurring amino acid. The program MHCalc uses the molecular modeling package THORMM [Moret, 1998] to optimize the geometry of the structures described below, and needs as only entry the PDS like file with the coordinates of the MHC/peptide complex. The program finishes printing out a data file containing the naturally occurring residues in preference order for each pocket and the data used to order these residues. We tested the program MHCalc to the complex molecule HLA-DR1 (DRA DRB1 *01 01) with the Hemaglutinin peptide, obtained at the BrookHaven Prote in Data Bank (1 DLH entry). This system was chosen because it has been highly studied and so offers abundant experimental and theoretical data to compare our results. We obtained data referring to pocket 1 so far, which is in full agreement with the literature.

As repetições ricas em leucina (LRR) são domínios presentes em diversas famílias de proteínas com diferentes funções, sendo responsáveis pela formação de uma estrutura capaz de estabelecer interações protéicas. Em decorrência do projeto de caracterização de um segmento do cromossomo 17 de L. amazonensis, identificamos um gene que codifica uma proteína de 72 kDa, contendo em sua região central, seis motivos LRR. Genes ortólogos estão presentes nos genomas de L. major e L. braziliensis. Observamos que o gene LRR17 é regulado de forma distinta ao longo dos ciclos biológicos de L. braziliensis e L. amazonensis. A proteína LRR17 de L. braziliensis e secretada tanto nos estágios promastigota como amastigota. Identificamos também a secreção da proteína LRR17 em promastigotas de L. amazonensis. Obtivemos mutantes hiperexpressores da proteína LRR17 em L. braziliensis e L. amazonensis. As linhagens mutantes foram mais infectivas em infecções de macrófagos in vitro quando comparadas com a linhagem selvagem. A proteína LRR17 parece estar envolvida no processo de invasão do parasita em infecções in vitro e no estabelecimento da infecção da forma amastigota de Leishmania. / Leucine-rich repeats (LRRs) are versatile binding motifs found in a variety of proteins involved in protein-protein interactions. The LaLRR17 gene, identified initially in the L. amazonensis genome, encodes a protein with 6 LRR in its central region, that is secreted to the cytoplasm of L. amazonensis-infected macrophages. An orthologue to LaLRR17 was identified in L. braziliensis chromosome 17. LRR17 gene expression is regulated differentially during the life cycle of L. braziliensis and L. amazonensis. The LbLRR17 protein is secreted in L. braziliensis promastigotes and amastigotes. To characterize the function of the LRR17 protein we obtained transgenic parasite lines of L. amazonensis overexpressing the LaLRR17 gene and of L. braziliensis overexpressing the LbLRR17 gene. The mutants were more infective to macrophages in vitro when compared with the wild type strains, indicating that the LRR17 protein may interact with macrophage molecules, modulating the cellular response to increase parasite survival.

Orientador: Marcos Antonio Machado / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-09T03:27:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Winck_FlaviaVischi_M.pdf: 4501613 bytes, checksum: 37c71381bde27b6bd814d565ab527886 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) é o agente causador do cancro cítrico, doença que leva a severas perdas econômicas devido à contaminação e à erradicação de plantas de citros. Com o seqüenciamento completo do genoma de Xac, vários genes supostamente envolvidos com a patogenicidade de Xac foram identificados. Os genes ligados à resposta de hipersensibilidade (hrp) e avirulência (avr) em geral estão relacionados à patogenicidade de Xanthomonas, entretanto, poucos estudos funcionais destes genes de Xac foram feitos. Foram construídas linhagens mutantes de Xac para a perda de função dos genes hrpF e avrXacE2 e, nas análises in vivo, foi verificado que hrpF está envolvido na patogenicidade de Xac e é essencial para a manifestação dos sintomas primários da doença. A mutação de avrXacE2 não provocou alterações na capacidade de Xac em provocar os sintomas do cancro, portanto, este gene não parece ser essencial para a patogenicidade da bactéria, podendo não estar envolvido diretamente na patogenicidade de Xac. Os genes hrpF e avrXacE2 foram clonados em vetores de expressão e foram realizados testes de indução da expressão destas proteínas em sistemas heterólogos. Somente a proteína AvrXacE2 foi expressa, purificada e submetida a teste de interação com as proteínas citoplasmáticas da linhagem mutante de Xac para o gene avrXacE2. Os testes de interações não confirmaram a identificação de proteínas com afinidade específica pela proteína recombinante AvrXacE2. A proteína HrpF não foi super-expressa em sistema heterólogo. Nas análises de proteoma comparativo da linhagem de Xac selvagem versus linhagem mutante para o gene hrpF, foram detectadas alterações na expressão de proteínas citoplasmáticas e "pericelulares". Com base nas observações pode-se supor que HrpF possa influenciar processos celulares relacionados à respostas à situações de estresse e não somente atuar na translocação de moléculas efetoras via T3SS. A partir do que foi exposto neste trabalho, sugere-se que as técnicas de estudos funcionais de genes e análises proteômicas podem conjuntamente permitir que novos mecanismos relacionados a patogenicidade de Xac sejam interpretados. Com os mutantes produzidos neste estudo, espera-se criar condições para novos ensaios funcionais visando a melhor compreensão da patogenicidade de Xac e buscar novas formas de combate ao cancro cítrico / Abstract: The bacterium Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) is the causative agent of the citrus canker disease, which leads to economic losses due the contamination and erradication of citrus plants. The complete sequencing of its genome identified a number of genes supposedly involved with pathogenicity. Genes that code for hipersensitivity response (hrp) and avirulence (avr), in general, are related to the pathogenicity of Xanthomonas, however, only a few functional studies of these genes in Xac have been made. Here we report findings based on genomics and proteomics methods for Xac. Mutant strains of Xac for genes hrpF and avrXacE2 and in vivo assays demonstrated that hrpF is strongly involved in the pathogenicity of Xac and is essential for the manifestation of the primary symptoms of the citrus canker. On the other hand, the lack of avrXacE2 expression did not result in modifications in the capacity of Xac to elicite the symptoms of canker, therefore, this gene does not seem to be essential for the pathogenicity of the bacterium. The genes hrpF and avrXacE2 were cloned in expression vectors and tests of induction of the expression of these proteins in heterologous systems were carried out. The protein AvrXacE2 was expressed, purified and tested on interaction assays with cytoplasmic proteins of the mutant of Xac for the gene avrXacE2. The tests of interactions had not confirmed the identification of proteins with specific affinity for the recombinant protein AvrXacE2. The protein HrpF was not overexpressed in heterologous system. In the comparative proteome of the wild versus mutant strains for hrpF, modifications in the cytoplasmic protein expression and "pericellular" expression levels were detected. We postulate that, besides acting as a translocator of molecules through T3SS, HrpF may influence stress-related cellular responses. Thus, it is an opportune time to highlight the new and different ways in which HrpF serves Xac function. Moreover, we can assume that the techniques of functional genomics and proteomics analyses will clarify the mechanisms of pathogenicity used by Xac to cause citrus canker and, thus, enable the search for additional information to control the disease / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Nilson Ivo Tonin Zanchin / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T17:37:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vaz_ThaisHaline_D.pdf: 13126521 bytes, checksum: 672f3c7b0345ee333ab24793e624068d (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A resposta individual das células está na base da resistência do organismo à infecção viral. O principal mecanismo de resistência envolve a participação de inúmeros genes da via de sinalização dos interferons. Vários estudos vêm sendo conduzidos em larga escala para identificar genes que respondem aos mais variados tratamentos, assim como clusters gênicos relacionados a determinadas enfermidades, como a leucemia. A função do produto de muitos destes genes ainda não foi caracterizada. Numa ampla revisão destes artigos identificamos a proteína KIAA0082/ISG95 respondendo a interferon, à infecção pelo vírus da hepatite C (HCV), ao tratamento celular com oligodeoxinucleotídeos CpG, fazendo parte de um cluster de genes relacionados à leucemia e sendo super-expressa em linfócitos T ativados. Embora não possua função conhecida, esta proteína apresenta quatro domínios que indicam uma possível atividade relacionada ao metabolismo de RNA. Neste trabalho demonstramos que o promotor do gene ISG95 responde à estimulação por interferon num sistema repórter em células Vero. As atividades bioquímicas de ISG95 foram determinadas usando a proteína recombinante expressa em células de inseto Sf9. ISG95 interage com RNA e com S-adenosilmetionina, possuindo também atividade de metiltransferase in vitro. Ensaios de localização sub-celular demonstraram sua distribuição nuclear. Além disso, através do método duplo-híbrido de levedura e de ensaio de co-imunoprecipitação, foi possível identificar sua interação com o domínio C-terminal (CTD) da RNA polimerase II, o que é consistente com sua localização nuclear e com a função predita para o domínio WW localizado na extremidade C-terminal de ISG95. Os resultados indicam que ISG95 é parte da via de resposta a interferon e tem função associada possivelmente a eventos de processamento de prémRNA mediados pelo domínio CTD da RNA polimerase II / Abstract: A major mechanism of cellular resistance to viral invasion involves genes from the interferon signaling pathway, called ISGs (interferon stimulated genes). Global transcriptional profiling studies have linked increased expression of ISG95 (KIAA0082) to response to interferon treatment and to viral infection, suggesting that it may be part of the cellular defense against viral replication. In this work, we shown that the ISG95 promoter can drive interferoninduced transcription of a reporter gene in Vero cell cultures. The biochemical functions of ISG95 were assessed using recombinant protein. ISG95 shows RNA- and S-adenosyl-methionine binding and protein methyltransferase activity in vitro. ISG95 interacts with the C-terminal domain of RNA polymerase II, which is consistent with its nuclear localization and with the predicted function of the WW domain found in the C-terminal region of ISG95. The results presented in this work indicate that ISG95 is part of the interferon response pathway and functions in the pre-mRNA processing events mediated by the C-terminal domain of the RNA polymerase II / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

As repetições ricas em leucina (LRR) são domínios presentes em diversas famílias de proteínas com diferentes funções, sendo responsáveis pela formação de uma estrutura capaz de estabelecer interações protéicas. Em decorrência do projeto de caracterização de um segmento do cromossomo 17 de L. amazonensis, identificamos um gene que codifica uma proteína de 72 kDa, contendo em sua região central, seis motivos LRR. Genes ortólogos estão presentes nos genomas de L. major e L. braziliensis. Observamos que o gene LRR17 é regulado de forma distinta ao longo dos ciclos biológicos de L. braziliensis e L. amazonensis. A proteína LRR17 de L. braziliensis e secretada tanto nos estágios promastigota como amastigota. Identificamos também a secreção da proteína LRR17 em promastigotas de L. amazonensis. Obtivemos mutantes hiperexpressores da proteína LRR17 em L. braziliensis e L. amazonensis. As linhagens mutantes foram mais infectivas em infecções de macrófagos in vitro quando comparadas com a linhagem selvagem. A proteína LRR17 parece estar envolvida no processo de invasão do parasita em infecções in vitro e no estabelecimento da infecção da forma amastigota de Leishmania. / Leucine-rich repeats (LRRs) are versatile binding motifs found in a variety of proteins involved in protein-protein interactions. The LaLRR17 gene, identified initially in the L. amazonensis genome, encodes a protein with 6 LRR in its central region, that is secreted to the cytoplasm of L. amazonensis-infected macrophages. An orthologue to LaLRR17 was identified in L. braziliensis chromosome 17. LRR17 gene expression is regulated differentially during the life cycle of L. braziliensis and L. amazonensis. The LbLRR17 protein is secreted in L. braziliensis promastigotes and amastigotes. To characterize the function of the LRR17 protein we obtained transgenic parasite lines of L. amazonensis overexpressing the LaLRR17 gene and of L. braziliensis overexpressing the LbLRR17 gene. The mutants were more infective to macrophages in vitro when compared with the wild type strains, indicating that the LRR17 protein may interact with macrophage molecules, modulating the cellular response to increase parasite survival.