A resistência que apresentam as serpentes peçonhentas às suas próprias peçonhas, assim como a resistência observada em alguns animais está bem documentada, e é atribuída a fatores solúveis presentes no seu plasma, soro ou músculo. No caso das serpentes peçonhentas estes fatores as amparam de sofrer danos decorrentes da própria peçonha. No presente trabalho foi isolado do soro da serpente Bothrops alternatus um inibidor de metaloproteases, denominado BaltMPI, mediante cromatografia em DEAE Sepharose(TM), Superdex(TM) 200, MonoQ(TM) 5/50 GL e cromatografia de fase reversa em C18, com uma recuperação proteica de 0,3%. A massa molecular determinada para o BaltMPI por SDS - PAGE foi de 60,5 kDa, e por espectrometria de massas MALDI/TOF de 42,4 kDa. Seu ponto isoelétrico, determinado por focalização isoelétrica, é 5,27. Portanto, o BaltMPI, é um SVMPIs com caráter ácido, pertencente aos SVMPIs de baixa massa molecular. Os primeiros 60 aminoácidos da região N-terminal do BaltMPI foram determinados mediante degradação de Edman, e apresentou alto grau de homologia com a sequência para a mesma região de outros SVMPIs isolados a partir do soro de serpentes peçonhentas. Outros segmentos da sequência também foram determinados após clivagem com tripsina e posterior análise por espectrometria de massas. Posteriormente realizou-se o alinhamento da sequência parcial determinada para o BaltMPI, com a sequência do BJ46a, um SVMPI proveniente da Bothrops jararaca, encontrando alta homologia entre elas. Tanto o soro da serpente, quanto o inibidor, BaltMPI, inibiram a atividade hemorrágica da Batroxase, uma SVMP da classe P-I, e a da BjussuMP-I, uma SVMP da classe P-III. Já, em relação à DHM da Batroxase, foi determinado que o BaltMPI tem uma DIHM de 5ug, e uma CE50% de 0,857ug. O BaltMPI também apresentou um efeito inibitório sobre a ação proteolítica da Batroxase, sobre os substratos: fibrinogênio, fibrina e azocaseína. Sobre a atividade fibrinogenolítica da serinoprotease BjSP, o BaltMPI não apresentou um efeito inibitório, corroborando assim com a especificidade descrita para inibir as SVMPs que possuem os SVMPIs. O BaltMPI inibiu a ação hemorrágica e proteolítica da Batroxase, ao formar um complexo mediante ligações não covalentes com esta SVMP. O inibidor BaltMPI, ao igualmente aos demais SVMPIs descritos, é estável em uma ampla faixa de pH (1 - 9), e a temperaturas elevadas, sendo que em temperaturas acima de 60°C foi observada uma diminuição na sua capacidade de inibir a atividade hemorrágica da Batroxase. A inibição da atividade hemorrágica da Batroxase, quando avaliado o potencial do BaltMPI como complemento à soroterapia, foi menor à inibição observada ao realizar os testes com incubação prévia entre o inibidor e a metaloprotease. No entanto, os resultados obtidos são promissores, reforçando o grande potencial que os SVMPIs possuem, tanto como ferramentas moleculares, como opção para o tratamento dos acidentes ofídicos, em especial o acidente botrópico, no qual as SVMPs tem papel fundamental na fisiopatologia observada, e que conduz à alta morbidade associada com este tipo de acidente. / Resistance exhibited by snakes to their own venom, as well as resistance observed in some animals has been well recorded, and has also attributed to soluble factors present in the plasma, serum or muscle. In the case of poisonous snakes, these factors protect them from damages caused by their own venom. An inhibitor, named as BaltMPI, was isolated from the snake´s serum of Bothrops alternates. This inhibitor was isolated through several chromatographic steps including DEAE Sepharose(TM), Superdex(TM) 200, MonoQ(TM) 5/50 GL and C-18 reverse phase, with a protein yield of 0.3%. Molecular mass of 60.5 kDa for BaltMPI was determined by SDS - PAGE and 42.4 kDa by MALDI/TOF mass spectrometry. Its isoelectric point, determined by isoelectric focalization, was 5.27. According to the obtained data, it was established that BaltMPI is an SVMPIs of acid character, belonging to low molecular mass SVMPIs. The first 60 aminoacids from the N-terminal region were determined by Edman degradation. This parcial sequence showed high homology to the corresponding sequence of other SVMPIs isolated from poisonous snake´s serum. Other segments from the sequence were also determined after cleavage with tripsine and MS analyses. Consequently, alignment of the partial sequence of BaltMPI with the sequence of BJ46a, a SVMPI from Bothrops jararaca, was made finding high homology. Both, snake´s serum and BaltMPI, inhibited the hemorragic activity of Batroxase, a class P-I SVMP, and of BjussuMP-I, a class P-III SVMP. When compared to the Batroxase DHM, it was determined a DIHM of 5?g and a CE50% of 0.857?g. BaltMPI also exhibited an inhibitory activity against the proteolitic effect of Batroxase on fibrinogen, fibrin and azocasein as substrates. On the fibrinogenolitic activity of serineprotease BjSP, BaltMPI did not showed inhibitory effect, demonstrating its specificity for inhibiting SVMPs that SVMPIs possess. BaltMPI inhibits the hemorragic and proteolitic action of Batroxase by forming a complex through non covalent linkages with that SVMP. BaltMPI, as well as other reported SVMPIs, is stable in a very high range of pH (1-9), and at high temperatures, although above 60°C a decrease in its inhibition capacity to the hemorrhagic activity of Batroxase. Inhibition of the hemorrhagic activity of Batroxase, when BaltMPI potencial as serum-therapy complement was evaluated, was less than the inhibition observed when tests by previously incubating inhibitor and metalloprotease were made. However, the results obtained are encouraging, highlighting the potential that these kind of proteins, SVMPIs, have as molecular tools, optional treatments for ophidic accidents, specially bothropic accident, in which SVMPs have a fundamental role in the observed physiopathology, leading to a high associated morbidity to this kind of accidents.

Sementes das plantas pertencentes à família Leguminosae são excelentes fontes de inibidores de proteases. O gênero Acacia é um dos membros mais importantes deste grupo. Neste trabalho, foram descritos novos inibidores de proteases das sementes de Acacia plumosa Lowe. A partir do extrato salino das sementes maduras, os inibidores foram purificados por cromatografia de exclusão molecular em coluna Superdex-75 (equilibrada e eluída com PBS) e cromatografia de troca iônica em coluna Mono-S, equilibrada e eluída com o tampão Acetato de Sódio 50 mM (pH 5.0) num gradiente linear de \'NA\'\'CL\' 0-0.5 M. Quatro frações (eluídas por volta de 0.1 8, 0.22, 0.33 e 0.37 M de \'NA\'\'CL\') apresentaram atividade anticoagulante e ação inibitória sobre serinoproteases, estas frações foram denominadas ApTIA, ApTIB, ApTIC e ApTID, respectivamente. Em condições nativas, a espectrometria de massas mostrou as massas moleculares de três deles (A, B e C): 19.709; 19.869 e 20.378 Dáltons, enquanto que em SDS-PAGE na presença de \'beta\'-mercaptoethanol, foram observadas duas cadeias para cada um dos inibidores. A análise dos primeiros 10 resíduos de aminoácidos da região N-Terminal das duas cadeias das formas A, B, C revelou identidade com inibidores do tipo Kunitz, e também mostrou dois resíduos diferentes na ApTIC, em relação as formas A e B. Estes dados levam a interpretação de que estes inibidores são diferentes isoformas encontradas nesta semente. O espectro de dicroísmo circular foram compatíveis com proteínas que majoritariamente apresentam elementos- β e não-ordenados em sua estrutura, apresentando máximos positivos por volta de 230 nm e mínimos em 202 nm. Os três isoinibidores foram muito estáveis em pHs ácidos e alcalinos, e suas estruturas foram afetadas somente acima de 75oC. As constantes de associação (KA) e de dissociação(KD) determinadas por SPR (num sistema BIACORE) com enzimas proteolíticas indicaram que a afinidade destes inibidores por tripsina foi até 20 vezes maior que para quimotripsina (tripsina: KA2.57x109 M-1 e quimotripsina: KA 1.34x108M-1), e o complexo tripsina-inibidor mostrou maior estabilidade (tripsina: KD por volta de 0,5 nM e quimotripsina: 6 nM). Estes inibidores também apresentaram ação inibitória sobre o crescimento dos fungos Aspergillus niger, Thielaviopsis paradoxa, Colletotrichum sp P10 e Fusarium moniliforme, mostrando que provavelmente a inibição de suas serinoproteases possa ser um mecanismo de controle das suas proliferações. / Seeds of plants belonging to Leguminosae family are rich sources of protease inhibitors. The Acacia genus is one of the most important members of this group. In this work, novel protease inhibitors from Acacia plumose Lowe seeds have been described. From the saline extract of mature seeds, the inhibitors were purified by size exclusion chromatography on Superdex-75 column (equilibrated and eluted with PBS) and ionic exchange chromatography on Mono-S column, equilibrated and eluted with Sodium Acetate 50 mM (pH 5.0) in a linear gradient of NaCl 0-0.5M. Four fractions (eluted around 0.18, 0.22, 0.33 and 0.37 M of NaCl) presented anticoagulant activity and inhibitory action on serineprotease, these fractions were denoted ApTIA, ApTIB, ApTIC and ApTID, respectively. In native conditions, mass spectrometry showed the molecular weights of three of them (A, B and C): 19,709; 19,869 and 20,378 Daltons, while in SDS-PAGE in ?-mercaptoethanol presence, two chains for each inhibitor were observed. The N-terminal analysis of the first 10 amino acid residues of both chains of the isoforms A, B, and C revealed identity with Kunitz protease inhibitors and also showed two different residues in ApTIC, comparing with A and B isoforms. These data indicate that the inhibitors are different isoforms present in this seeds. The circular dichroism spectra were compatible with proteins that majority present unordered and beta-elements in these structures, presenting positive maxima around 230 nm and minima about 202 nm. The three isonhibitors were very stable at acids and alkalines pH, and their structures are only affected over 75ºC. The association (KA) and dissociation constants (KD) determined by SPR (BIACORE system) with proteolytic enzymes indicated that the affinity of these inhibitors for trypsin was up to 20 times bigger than for chymotrypsin (trypsin: KA 2.57x109 M-1 and chymotrypsin: KA 1.37x108 M-1), and the complex inhibitor-trypsin showed higher stability (trypsin: KD around 0,5 nM and chymotrypsin: 6 nM). These inhibitors also presented inhibitory action on the fungi growth of Aspergillus niger, Thielaviopsis paradoxa, Colletotrichum sp P10 e Fusarium moniliforme showing that probably the inhibition of their serineproteases can be a mechanism of control of their proliferation.

Lors de la réponse immunitaire de la drosophile, la voie Toll est activée lors d'un challenge immunitaire par des bactéries à Gram positif ou des champignons. Ce mécanisme est initié soit par la reconnaissance de motifs moléculaires associés aux pathogènes (PAMPs) qui activent la voie de reconnaissance, soit par des facteurs de virulence et des protéases produits par les agents pathogènes qui activent la voie des signaux de danger. Le travail que j'ai effectué a pour but de caractériser les différentes molécules impliquées dans ces cascades protéolytiques en amont de Toll. Cela permettra de reconstituer ces cascades in vitro et de comprendre comment elles sont organisées, comment et où des complexes peuvent être formés. La première partie concerne les approches génétiques utilisées pour générer des mutants des gènes pouvant être impliqués dans l'activation de la voie Toll par la voie des PAMPs. La deuxième partie se concentre sur un homologue inactif de protéase à sérine appelé spheroide et sur son implication dans la voie de reconnaissance des signaux de danger. Pour la première fois, nous avons pu démontrer qu'une protéase inactive est requise dans la cascade protéolytique, et plus particulièrement dans la détection des signaux de danger après un challenge immunitaire par des bactéries pathogènes à Gram positif. / The Toll pathway in Drosophila immune response is activated upon immune challenge with Gram positive bacteria and fungi. This can be achieved either through recognition of Pathogen Associated Molecular Patterns (PAMPs), which triggers the recognition cascade; or by virulence factors and proteases produced by the pathogens, which triggers the danger signal cascade. The work I have done aimed to characterize the various molecules involved in proteolytic cascade supstream of Toll. This will help to reconstitute these cascades in vitro and understand how they are organized, how and where complexes could be formed. The first part focuses on genetic approaches used to generate mutants for genes suggested to be involved in the activation of Toll pathway via the recognition cascade. The second part focuses on an inactive serine protease, aserine protease homolog spheroide and its involvement in the danger signal cascade. For the first time, we could demonstrate that an inactive protease is required in the proteolytic cascade,involved in the sensing of danger signais upon immune challenge with pathogenic Gram-positive bacteria.

Candida spp. se tornaram, nas últimas décadas, importantes agentes causadores de infecções invasivas, responsáveis por altos índices de morbidade e mortalidade. Acredita-se que a aspartato protease secretada (Sap) seja um fator diretamente associado aos processos infecciosos exercendo papel determinante na patogenicidade de Candida spp. e que a exposição a concentrações subinibitórias de antifúngicos, pode aumentar a produção de Sap e selecionar isolados resistentes. Analisaram-se isolados de Candida albicans e Candida não-albicans oriundos de casos de infecção hospitalar. Avaliou-se o perfil proteico destes isolados por eletroforese SDS-PAGE. Avaliou-se, também, o perfil de sensibilidade dos isolados frente a antifúngicos de uso convencional em esquemas terapêuticos (fluconazol e anfotericina B) e a antifúngicos mais novos que ainda não fazem parte das rotinas hospitalares (voriconazol e caspofungina). Determinou-se a atividade proteolítica qualitativa e quantitativa de Sap e atividade metabólica de C. albicans e Candida não-albicans cultivados na presença e ausência de concentrações subinibitórias de fluconazol e anfotericina B. Estabeleceu-se a correlação entre os testes e por fim, avaliou-se a expressão do gene SAP2 em C. albicans ATCC 64548 e C. krusei ATCC 6258. 100% dos isolados foram sensíveis a anfotericina B, voriconazol e caspofungina e 89,9% a fluconazol. Dois isolados (7,4%) apresentaram sensibilidade dependente da dose e um (3,7%) apresentou resistência ao fluconazol. Na análise qualitativa da atividade proteolítica, 77,7% dos isolados apresentaram atividade. A maioria dos isolados de C. albicans (50%) e Candida não-albicans (32%) apresentou atividade proteolítica moderada. A adição de fluconazol ao cultivo não promoveu alterações significativas na atividade proteolítica dos isolados padrões, enquanto anfotericina B inibiu o crescimento de C. glabrata ATCC 90030 e C. krusei ATCC 6258. Na análise quantitativa, todos os isolados se apresentaram ativos, sendo que a maior atividade foi observada em Candida complexo “psilosis” 210 (100%) e a menor em C. albicans 257 (2,44%). A maioria dos isolados de C. albicans (50%) foi classificada como fracamente proteolítica, enquanto Candida não-albicans (53%) como moderadamente proteolítica. A presença de antifúngicos no cultivo alterou significativamente o percentual de degradação da maioria dos isolados. A maior diferença de percentual foi observada em C. lusitaniae 286, que na presença de ¼ da IC90 de anfotericina B aumentou 13,7x em relação à ausência do fármaco. O método quantitativo de determinação da atividade proteolítica apresentou maior sensibilidade. 63% dos isolados de C. albicans apresentaram alta atividade metabólica e 68% de Candida não-albicans, atividade moderada. A maior atividade metabólica foi observada em C. albicans 120 (61,72%) e a menor em C krusei ATCC 6258 (2,35%). A atividade metabólica da maioria dos isolados foi significativamente alterada. A maior diferença de percentual foi observada em Candida complexo “psilosis” 210, que na presença de ½ da IC50 de fluconazol apresentou redução de 8x na atividade metabólica em relação à ausência do fármaco. Houve expressão de SAP2 apenas em C. albicans ATCC 64548, que foi reduzida significativamente na presença de ¼ da IC90 de anfotericina B. A atividade de Sap pode ser considerada um fator potencial associado à virulência, uma vez que o isolado que apresentou a maior atividade apresentou sensibilidade antifúngica reduzida. / Candida spp. has become in recent decades, major causative agents of invasive infections, responsible for high rates of mortality and morbidity. It is believed that the secreted aspartate protease (Sap) is a factor directly associated with infection exerting decisive role in the pathogenicity of Candida spp. and that the exposure to subinibitory concentrations of antifungals may increase the production of Sap and to select resistant isolates. We analyzed isolates of Candida albicans and Candida non-albicans from cases of hospital infection. We evaluated the protein profile of the isolates of Candida spp. by SDS-PAGE. We evaluated also the susceptibility profile of the isolates against antifungals of use conventional in regimens therapeutics (fluconazole and amphotericin B) and newer antifungals that are not yet part of the hospital routine (voriconazole and caspofungin). It was determined the proteolytic activity qualitative and quantitative of Sap and metabolic activity of isolates of C. albicans and Candida non-albicans grown in the presence and absence of subinhibitory concentrations of fluconazole and amphotericin B. Was established the correlation between the tests and, finally, the expression of the SAP2 gene in C. albicans ATCC 64548 and C. krusei ATCC 6258 was evaluated. 100% of the isolates were susceptible to amphotericin B, voriconazole and caspofungin and 89.9% to fluconazole. Two isolates (7.4%) showed susceptibility dose dependent and one (3.7%) showed resistance to fluconazole. In the qualitative analysis of proteolytic activity, 77.7% of the isolates showed activity. The most isolates of C. albicans (50%) and Candida non-albicans (32%) had moderate proteolytic activity. The addition of fluconazole to culture did not promote significant changes in the proteolytic activity of the isolates patterns, while amphotericin B inhibited the growth of C. glabrata ATCC 90030 and C. krusei ATCC 6258. In quantitative analysis, all isolates were active, being that the highest activity was observed in Candida complex “psilosis” 210 (100%) and the lowest in C. albicans 257 (2.44%). The most of the C. albicans isolates (50%) were classified as weakly proteolytic, while Candida non-albicans (53%) as moderately proteolytic. The presence of antifungals in the culture significantly changed the percentage of substrate degradation of the most of isolates. The greatest difference of percentage was observed in C. lusitaniae 286, which in the presence of ¼ IC90 of amphotericin B increased 13.7x regarding to absence of the drug. The quantitative method of determining the proteolytic activity presented greater sensitivity. 63% of the isolates of Candida albicans showed high metabolic activity and 68% of Candida non-albicans had moderate activity. The higher metabolic activity was observed in C. albicans 120 (61.72%) and lowest in C krusei ATCC 6258 (2.35%). The metabolic activity of the most of the isolates was significantly altered. The major difference of percentages was observed in Candida complex “psilosis” 210, which in the presence of ½ IC50 of fluconazole showed reduction of 8x in the metabolic activity regarding to absence of the drug. There was expression of SAP2 only in C. albicans ATCC 64548, which was significantly reduced in the presence of ¼ IC90 of amphotericin B. The Sap activity may be considered a potential factor associated to virulence, once that the isolate that showed the greatest activity showed susceptibility reduced. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

As cianobactérias são micro-organismos reconhecidos por seu potencial em produzir cianotoxinas que afetam não só o ecossistema e a outros organismos dos ambientes aquáticos, mas também aos seres humanos, agindo em diversos órgãos e tecidos. Cerca de 600 metabólitos secundários produzidos por cianobactérias já foram descritos na literatura, sendo que muitos deles possuem potencial biológico. Os peptídeos de baixo peso molecular, produzidos por cianobactérias chamados cianopeptídeos, dos quais se podem citar as anabaenopeptinas, aeruginosinas, microviridinas, cianopeptolinas e microgininas, são compostos provindos do metabolismo secundário de cianobactérias e são descritos como inibidores de proteases e fosfatases em alguns sistemas biológicos. Sendo assim, o objetivo do estudo foi identificar a ocorrência de cianopeptídeos em cianobactérias brasileiras e testar seu efeito de inibição da atividade sobre enzimas proteases. Os objetos de estudo foram: uma linhagem da espécie Sphaerospermopsis torques-reginae, duas de Cylindrospermopsis raciborskii, duas de Microcystis sp, uma de Oscillatoria e uma de Pseudanabena sp. A partir dos resultados obtidos pode-se afirmar que do total de linhagens analisadas, ao menos 4 destas parecem produzir os cianopeptídeos de interesse, quando avaliados por cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodos (HPLC-DAD). Em seguida, culturas de duas linhagens de C. raciborskii (uma produtora e outra não produtora de saxitoxina) foram amostradas a cada 3 dias, para a avaliação do crescimento celular, produção de cianopeptídeos e de saxitoxina e suas variantes. Não foi possível confirmar a produção de cianopeptídeos nas duas linhagens desta espécie. Por outro lado, foi evidenciado um aumento da produção de saxitoxinas quando cultivada num meio sem nitrogênio em comparação com a condição controle. Quando analisada a linhagem de Microcystis sp. (LTPNA 08), produtora de microcistinas, foi possível confirmar por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas (LC-MS) a produção de dois cianopeptídeos, sendo estes, duas microgininas. Desta forma, desenvolveu-se um método cromatográfico para a separação desses compostos e purificação por cromatografia líquida semi-preparativa, onde foi possível a obtenção de frações enriquecidas de microgininas e microcistinas-RR e LR, com cerca de 70%, 86% e 97% de pureza. Por fim, realizaram-se ensaios avaliando a atividade da enzima conversora de angiotensina (ECA) e aminopeptidase M (AMP M) com as frações isoladas de microgininas e microcistina-LR. A atividade da ECA foi ± 50% inibida pelas frações testadas de cianopeptídeos, microcistina-LR isolada e microcistins-lR comercial. A atividade da AMP M foi 100% e 24,5% inibida quando incubada com 20 µM da fração de microgininas e microcistina-LR, respectivamente. Desta forma, as microgininas isoladas de cianobactérias brasileiras, mostraram-se como importantes inibidores da ECA e AMP M, podendo, no futuro, serem utilizadas como compostos para o tratamento de patologias cardiovasculares e renais. / Cyanobacteria are micro-organisms recognized for their potential to produce cyanotoxins that affect not only the ecosystem and other organisms of aquatic environments, but also humans, acting in various organs and tissues. Around 600 secondary metabolites produced by cyanobacteria have been described in the literature; many of them have biological potential. Low molecular weight peptides produced by cyanobacteria are called cyanopeptides, among them we can cite the anabaenopeptins, aeruginosins, microviridins, cyanopeptolins and microginins, these compounds are derived from secondary metabolisms of cyanobacteria and apparently cause inhibition of proteases and phosphatases in some biological systems. Therefore, this study targeted the identification of the occurrence of cyanopeptides in Brazilian cyanobacterias and testing its effect on the inhibition of proteases activity. The targets of study were: a strain of species Sphaerospermopsis torques-reginae, two strains of Cylindrospermopsis raciborskii, two strains of Microcystis sp. and, one strain of Pseudanabena and Oscillatoria sp. From the results obtained in this study it can be stated that at least four of the total of strains analyzed appear to produce cyanopeptides of interest, when analyzed by high-performance liquid chromatography whit phodo diodo array detector (HPLC-PDA). The cultures of two strains of C. raciborskii (a producer of saxitoxin and a non-producer) were sampled every 3 days for assessment of cell growth, production of cyanopeptides and saxitoxins. It was not possible to confirm the production of cyanopeptides in strains of this species. Nevertheless, an increase in production of saxitoxins was shown when cultivated in an environment without nitrogen, as compared to the control condition. When the strain of Microcystis sp. (LTPNA 08), a producer of microcystins, was analyzed, the production of two cyanopeptides was confirmed by using liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). After confirmation, a method using HPLC-PDA was used to do the separation and purification of these compounds by semi-preparative chromatography, in which it was possible to obtain an enriched fraction of microginins, microcystin-RR and microcystin-LR with approximately 70%, 86% and 97% purity, respectively. Lastly, inhibition experiments were run with angiotensin-converting enzyme (ACE) and aminopeptidase M (AMP M) with the isolated fractions. The microginins fractions, MC-LR commercial and MC-LR isolated, showed an inhibition of ± 50% of the angiotensin-converting enzyme. The activity of AMP M was 100% and 24.5% inhibited when incubated with microginins and microcystin-LR fractions in a concentration of 20 µM, respectively. Thus, isolated microginins from Brazilian cyanobacteria have exhibited properties as potential therapeutic agents in development of inhibitors of ACE and AMP M, which can be a benefit of using these molecules in the treatment of cardiovascular and renal pathologies.

Orientador: Luciana Francisco Fleuri / Resumo: A fermentação em estado sólido (FES) é um bioprocesso especialmente adequado para obtenção de produtos de alto valor biotecnológico, tais como enzimas resultantes do metabolismo de micro-organismos. É particularmente interessante para fungos filamentosos, que são adaptados ao sistema, crescendo em substratos sólidos com baixo ou nenhum teor de água livre. A FES oferece diversas vantagens em relação à fermentação submersa, com destaque para a sustentabilidade e economia do processo pelo baixo consumo de água e a aproveitamento de resíduos agroindustriais, que podem ser utilizados como substratos e são amplamente disponíveis. Mundialmente, a demanda industrial por enzimas está em ascensão: movimentou USD 4,4 bilhões em 2015 e possui crescimento estimado em 7,8% (USD 2 bilhões) para 2015-2020. As enzimas obtidas por FES apresentam elevada versatilidade, relacionada às diferentes capacidades hidrolíticas e propriedades bioquímicas, cujas enzimas proteolíticas produzidas por esse sistema podem ser aplicadas na produção de fragmentos proteicos com atividades biológicas distintas capazes de beneficiar a saúde humana e animal, denominados peptídeos bioativos. Já foram obtidos peptídeos bioativos com ações antimicrobiana, antioxidante, antihipertensiva, imunomodulatória, opióide e antineoplásica. É reportado que estes compostos podem ser mais seletivos quando comparados a outras pequenas moléculas empregadas como fármacos. O leite é uma das principais fontes de obtenção de peptídeos r... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Influenza A virus (IAV) causes annual epidemics and sporadic pandemics of respiratory disease in humans. One of the main complications of primary IAV infection is increased susceptibility to secondary bacterial co-infection, with Staphylococcus aureus being the most common co-infecting species. Previous work identified secreted proteases from S. aureus as a pro-viral factor, leading to specific cleavage of the IAV surface hemagglutinin and increase in infectious viral titre. The aim of this study was to investigate the effect of bacterial proteases, and other secreted bacterial proteins, on IAV replication. Supernatants from the S. aureus community-associated epidemic clone USA300 were separated by size exclusion chromatography and each fraction was tested for an impact on IAV replication in primary chicken embryo fibroblast (CEF) cells. A fraction that increased viral titre by at least 10-fold was identified, but this effect was independent of known secreted proteases. Through the use of mass spectrometry fingerprinting and bacterial mutagenesis, a single protein, S. aureus lipase 1, was identified to be responsible for the pro-viral effect. Lipase 1 is expressed by an array of diverse S. aureus strains of distinct clonal origins. Both the native and recombinant form of lipase 1 were pro-viral only during the infection of primary cells, including primary human lung fibroblasts. Further validation of this interaction indicated lipase 1 was pro-viral in a concentration dependant manner and for a range of IAV strains. Investigation into the mechanism of action of lipase 1 revealed the protein acts during a single infectious cycle in a manner dependent on its active site. Time of addition studies and western blot analysis showed lipase 1 affects the later stages of virus replication, but there is no direct interaction with the virus particle; rather, the protein manipulates the cell, resulting in an increased number of infectious particles being produced. This work has identified and validated a single S. aureus protein, which affects IAV replication. Thus, it has elucidated some of the complex interactions that occur between the virus and bacteria during co-infection. It has also demonstrated a novel role for a bacterial enzyme in IAV replication, the study of which can further our understanding of both IAV and cell biology.

Orientador: Luciano Puzer / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia/Química, 2013

A matriz extracelular e as células musculares lisas das vias aéreas estão intimamente interrelacionadas. Poucos estudos porém, avaliaram a composição dos diferentes componentes da matriz extracelular e seus reguladores na camada do músculo liso brônquico na asma. Utilizando um programa de análise de imagens, a área fracionada do colágeno total e das fibras elásticas foi quantificada no interior do músculo liso brônquico de 35 indivíduos que faleceram devido a um ataque de asma (Asma Fatal), e comparada com 10 casos de indivíduos com asma e que faleceram de outras causas (Asma Não Fatal), e com 22 indivíduos controles sem patologia pulmonar. Expressão dos colágenos I e III, fibronectina, versicam, metaloprotease (MMP)-1, 2, 9 e 12, e inibidores de metaloprotease 1 e 2 foram quantificados no interior do músculo liso brônquico de 22 casos de asma fatal e 10 controles. Nas grandes vias aéreas dos casos de asma fatal, a área fracionada das fibras elásticas foi significativamente maior na camada do músculo liso brônquico quando comparada com os grupos de Asma Não Fatal e Controle. Semelhantemente, fibronectina, MMP-9 e MMP-12 estavam aumentadas no músculo liso das grandes vias aéreas nos casos de asma fatal quando comparadas aos controles. Apenas aumento das fibras elásticas foi observado nas pequenas vias aéreas na Asma Fatal, e somente quando comparadas aos casos de Asma Não Fatal. O conjunto dos resultados mostra que há uma composição alterada dos elementos da matriz extracelular e um ambiente de degradação protéica no músculo liso brônquico de indivíduos que morreram por asma, o qual pode acarretar importantes conseqüências nas funções sintéticas e mecânicas do músculo liso das vias áreas. / There is an intimate relationship between the extracellular matrix (ECM) and smooth muscle cells within the airways. Few studies have comprehensively assessed the composition of different ECM components and its regulators within the airway smooth muscle (ASM) in asthma. With the aid of image analysis, the fractional area of total collagen and elastic fibres was quantified within the ASM of 35 subjects with Fatal Asthma (FA) and compared with 10 Nonfatal Asthma (NFA) patients and 22 nonasthmatic control cases. Expression of collagen I and III, fibronectin, versican, matrix metalloprotease (MMP)-1, 2, 9 and 12 and tissue inhibitor of metalloprotease-1 and 2 was quantified within the ASM in 22 FA and 10 control cases. In the large airways of FA cases, the fractional area of elastic fibres within the ASM was increased compared with NFA and controls. Similarly, fibronectin, MMP-9 and MMP-12 were increased within the ASM in large airways of FA cases compared with controls. Elastic fibres were increased in small airways in FA only in comparison with NFA cases. The results shower that, there is altered extracellular matrix composition and a degradative environment within the airway smooth muscle in fatal asthma patients, which may have important consequences for the mechanical and synthetic functions of airway smooth muscle.

A matriz extracelular e as células musculares lisas das vias aéreas estão intimamente interrelacionadas. Poucos estudos porém, avaliaram a composição dos diferentes componentes da matriz extracelular e seus reguladores na camada do músculo liso brônquico na asma. Utilizando um programa de análise de imagens, a área fracionada do colágeno total e das fibras elásticas foi quantificada no interior do músculo liso brônquico de 35 indivíduos que faleceram devido a um ataque de asma (Asma Fatal), e comparada com 10 casos de indivíduos com asma e que faleceram de outras causas (Asma Não Fatal), e com 22 indivíduos controles sem patologia pulmonar. Expressão dos colágenos I e III, fibronectina, versicam, metaloprotease (MMP)-1, 2, 9 e 12, e inibidores de metaloprotease 1 e 2 foram quantificados no interior do músculo liso brônquico de 22 casos de asma fatal e 10 controles. Nas grandes vias aéreas dos casos de asma fatal, a área fracionada das fibras elásticas foi significativamente maior na camada do músculo liso brônquico quando comparada com os grupos de Asma Não Fatal e Controle. Semelhantemente, fibronectina, MMP-9 e MMP-12 estavam aumentadas no músculo liso das grandes vias aéreas nos casos de asma fatal quando comparadas aos controles. Apenas aumento das fibras elásticas foi observado nas pequenas vias aéreas na Asma Fatal, e somente quando comparadas aos casos de Asma Não Fatal. O conjunto dos resultados mostra que há uma composição alterada dos elementos da matriz extracelular e um ambiente de degradação protéica no músculo liso brônquico de indivíduos que morreram por asma, o qual pode acarretar importantes conseqüências nas funções sintéticas e mecânicas do músculo liso das vias áreas. / There is an intimate relationship between the extracellular matrix (ECM) and smooth muscle cells within the airways. Few studies have comprehensively assessed the composition of different ECM components and its regulators within the airway smooth muscle (ASM) in asthma. With the aid of image analysis, the fractional area of total collagen and elastic fibres was quantified within the ASM of 35 subjects with Fatal Asthma (FA) and compared with 10 Nonfatal Asthma (NFA) patients and 22 nonasthmatic control cases. Expression of collagen I and III, fibronectin, versican, matrix metalloprotease (MMP)-1, 2, 9 and 12 and tissue inhibitor of metalloprotease-1 and 2 was quantified within the ASM in 22 FA and 10 control cases. In the large airways of FA cases, the fractional area of elastic fibres within the ASM was increased compared with NFA and controls. Similarly, fibronectin, MMP-9 and MMP-12 were increased within the ASM in large airways of FA cases compared with controls. Elastic fibres were increased in small airways in FA only in comparison with NFA cases. The results shower that, there is altered extracellular matrix composition and a degradative environment within the airway smooth muscle in fatal asthma patients, which may have important consequences for the mechanical and synthetic functions of airway smooth muscle.