Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-04-08T12:42:14Z No. of bitstreams: 2 Dissertação Karollina Lopes.pdf: 3113025 bytes, checksum: 4beb50fc12c91663e6d2118f10865bf1 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-08T12:42:14Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação Karollina Lopes.pdf: 3113025 bytes, checksum: 4beb50fc12c91663e6d2118f10865bf1 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012 / CNPq; FACEPE; CAPES / Atualmente a espécie Oreochromis niloticus é uma das principais espécies cultivadas no país tanto por suas características biológicas, que permitem um fácil manejo e quanto por sua carne ser de grande aceite comercial. O cultivo desses animais pode ser de dois tipos: semi-intensivo – onde há a utilização de adubos para aumentar a produção, a alimentação se dá pela inserção de ração comercial e o alimento natural pode suprir uma possível falta de proteína; intensivo – caracteriza-se pela alta produção e a alimentação é completamente comercial. Sabendo da grande influência que a forma de cultivo exerce sobre os animais, o presente estudo objetivou analisar o crescimento zootécnico dos animais submetidos aos dois tipos de cultivo, analisar as atividades enzimáticas de proteases presentes no intestino desses animais e obter e comparar os perfis proteômicos do estômago e intestino desses peixes, para tentar elucidar algumas formas de adaptação desses animais aos sistemas semi-intensivo e intensivo de cultivos. Os cultivos foram realizados, durante 120 dias, com dois tipos de planos nutricionais. Foram realizadas biometrias durante todo o período dos cultivos, a partir das quais os parâmetros zootécnicos foram calculados. Após os cultivos houve a coleta dos animais, os quais tiveram seus intestinos e estômagos retirados. Um extrato bruto foi preparado para o ensaio das atividades enzimáticas: protease total com azocaseína como substrato e tripsina utilizando BApNA como substrato. Para os perfis proteômicos foram feitos géis 2D-PAGE utilizando fitas de 13 cm e pH na faixa de 3-10. Pela análise do crescimento zootécnico, apenas os parâmetros de peso médio final, conversão alimentar e sobrevivência foram estatisticamente diferentes. Quanto às atividades enzimáticas, essas não se mostraram estatisticamente diferentes e mostraram um mesmo padrão ao longo do tempo. Nos perfis proteômicos dos intestinos pode-se detectar 731 spots diferentes, na análise do estômago foi observada a presença de 543 spots diferenciais. Com isso, o presente trabalho conclui que os sistemas de cultivo influenciaram diretamente os animais. Os presentes resultados contribuem na elucidação da influência dos fatores dos sistemas sobre o crescimento e a fisiologia digestivas da tilápia do Nilo.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:51:42Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3102_1.pdf: 1259276 bytes, checksum: c0878ec8ef24a46259582227748106b4 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A protease alcalina extraída do ceco pilórico do pirarucu (Arapaima gigas) foi purificada em quatro etapas: tratamento térmico, precipitação com sulfato de amônio, cromatografia de gel-filtração em coluna Sephadex® G-75 e cromatografia de afinidade em coluna benzamidina-agarose. Após as etapas de purificação aplicou-se uma amostra da proteina obtida em gel de eletroforese e verificou-se a presença de única banda que apresentou peso molecular aproximado de 28,0 kDa. Desta forma, após purificação, avaliaram-se as propriedades físico-químicas e cinéticas da enzima e o efeito de íons metálicos e de inibidores de proteases na atividade proteolítica da mesma, utilizando-se benzoyl-DL-arginine-p-nitroanilide (BApNA) como substrato. O pH e a temperatura ótima de reação encontrada foram 9,0 e 65°C, respectivamente. A enzima mostrou-se estável, após 30 min de incubação, em ampla faixa de pH alcalino (pH 6,0 a 11,5). Após 30 minutos de incubação a 60ºC, foi detectada uma perda de 10% da atividade tríptica. Os valores encontrados para os parâmetros cinéticos (Km, Kcat e Kcat/Km) foram: 0,47 ± 0,042 mM, 1,33 s-1 and 2,82 s-1 · mM-1, respectivamente, usando BApNA como substrato. A atividade tríptica mostrou-se sensível a alguns íons metálicos. A atividade tríptica foi inibida, em ordem crescente, pelos íons: Mn2+ > Ca2+ > Li+ > Cd2+ > Cu2+ > Fe2+ > Hg2+ > Zn2+ > Al3+ > Pb2+. Por outro lado, os íons K+, Mg2+ e Ba2+ não promoveram nenhum efeito na atividade da protease. A enzima foi fortemente inibida por inibidores de tripsina. Os ensaios com substrato específico e inibidores de tripsina forneceram evidências de que esta enzima é provavelmente uma tripsina-símile e suas características sugerem um forte potencial para ser utilizada em processos e produtos industriais

Orientador: Flavia Maria Netto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-16T11:33:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sabadin_IsabeleSerimarco_M.pdf: 18689391 bytes, checksum: fc0347d65995a6512c7579ac02277fea (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O resumo poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The abstract is available with the full electronic document / Mestrado / Nutrição Experimental e Aplicada à Tecnologia de Alimentos / Mestre em Alimentos e Nutrição

Orientador: Marcelo Menossi Teixeira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-05T11:53:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mondego_JorgeMauricioCosta_D.pdf: 1365745 bytes, checksum: d2f496fe8deacf2a20e24327a8f483dc (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: O café é um dos principais produtos agrícolas mundiais. O Brasil é um dos maiores países produtores e consumidores de café. Assim sendo, a cafeicultura possui extrema importância econômica em nosso país. Um dos principais fatores que causam prejuízo à lavoura do café é o ataque do bicho mineiro (Leucoptera coffeella), pois Coffea arabica, principal espécie cultivada do café, é suscetível a essa praga. O Instituto Agronômico de Campinas (IAC) empreende um projeto de melhoramento de Coffea arabica, visando a resistência ao bicho mineiro, através de cruzamentos com C. racemosa, espécie naturalmente resistente a L. coffeella.Neste trabalho isolamos genes diferencialmente expressos durante o ataque do bicho mineiro a plantas de uma progênie híbrida derivada de cruzamentos entre Coffea arabica e C. racemosa. Foram construídos macroarranjos de DNA contendo 1536 ESTs de bibliotecas de subtração enriquecidas em genes preferencialmente expressos em plantas resistentes infestadas. Membranas foram hibridadas com sondas de cDNA obtidas a partir de RNA total de folhas suscetíveis e resistentes ao bicho mineiro, em diferentes momentos da infestação (controle não infestado, pósoviposição e pós-eclosão). Após análises estatísticas e clusterização hierárquica, 21 cDNAs induzidos em pelo menos um tratamento foram selecionados como diferencialmente expressos durante a infestação do bicho mineiro. A expressão diferencial de cinco genes (PR-8, CAX9, SPC25, psaH, BEL) foi confirmada através de RNA blot contendo RNA de um segundo experimento de infestação, demonstrando a eficiência dos macroarranjos de DNA na seleção de genes diferencialmente expressos. O padrão de expressão dos cinco genes citados foi verificado em diferentes órgãos do cafeeiro e durante o desenvolvimento do fruto do café. Nossos resultados sugerem que o mecanismo de resistência ao bicho mineiro é derivado de uma maior expressão basal de genes relacionados a defesa em plantas resistentes do que em plantas suscetíveis, e que plantas resistentes possuem um mecanismo de sinalização de defesa disparado pela oviposição de L. coffeella. Dentre os cDNAs selecionados, destacamos SSH101B04, cuja proteína deduzida é similar a inibidores de protease do tipo Kunitz STI (Soybean Trypsin Inhibitor). Devido a sua alta similaridade com proteínas do tipo miraculina, esse gene foi denominado CoMir (Coffea Miraculin). CoMir foi induzido após a oviposição em plantas resistentes, mas não foi induzido após a eclosão da lagarta do minador em plantas resistentes nem em plantas suscetíveis. Através de ensaios de RNA blot foi verificado que CoMir é expresso em folhas, botões florais verdes e brancos e em frutos verdes imaturos. Ensaios de hibridação in situ demonstraram que CoMir é expresso no metaxilema de folhas, de pétalas e do estigma, e no estômio, endotécio, tapete e feixe vascular da antera. Ensaios de localização subcelular demonstraram que a proteína CoMir localizou-se preferencialmente no apoplasma e no citoplasma de células de epiderme de cebola (Allium cepa). Nossos resultados sugerem que CoMir é uma proteína reguladora de proteólise durante o desenvolvimento do café, que é mobilizada para defesa após a oviposição de L. coffeella / Abstract: Coffee is one of the most important crops in the world. Brazil is one of the biggest coffee producer and consumer countries. Therefore, coffee plantations have great relevance in our country. One of the main factors that affect coffee plantations is the attack of the coffee leaf miner (Leucoptera coffeella). This is due to the susceptibility of Coffea arabica, the main cultivated species. The Agronomic Institute of Campinas (IAC) develops a Coffea arabica breeding program aiming the resistance to the infestation of coffee leaf miner, using crosses with C. racemosa, a resistant species. In this work, we have isolated differentially expressed genes during L. coffeella attack to plants of a hybrid progenie between C. arabica and C. racemosa. We have produced cDNA arrays containing ESTs from subtracted cDNA libraries enriched in genes preferentially expressed in infested resistant plants. Arrays were probed with samples from susceptible and resistant leaves, in different treatments (control noninfested, after oviposition and after caterpillar eclosion). After statistical analysis and hierarchical clustering, 21 cDNA clones induced in at least one treatment were selected as differentially expressed during coffee leaf miner infestation. The differential expression of five genes (PR-8, CAX9, SPC25, psaH, BEL) was confirmed by RNA blot containing samples from a second infestation experiment, demonstrating the efficiency of DNA arrays in the identification of differentially expressed genes. The expression profile of these five genes was verified in different organs of coffee plants and during coffee fruit development. Our results suggest that the resistance mechanism against coffee leaf miner is derived from a higher basal expression of defense/stress genes in resistant plants, and that resistant plants have a defense signaling mechanism triggered by L. coffeella oviposition. Among the selected cDNAs, we identified SSH101B04, which deduced protein is similar to Kunitz STI (Soybean Trypsin Inhibitor) protease inhibitors. The gene was named CoMir due to its high similarity to miraculin-like proteins. CoMir was induced after oviposition in resistant plants, but it was not induced after larval eclosion in susceptible and resistant plants. RNA-blot experiments showed that CoMir was expressed in leaves, green flower buds, white flower buds and early green fruits. In situ hybridization showed that CoMir is expressed in the metaxylem vessels of leaves, petals and stigma and in the stomium, endothecium and vascular bundles of anthers. Subcellular localization assays demonstrated that CoMir was localized in the apoplasm and citoplasm of onion (Allium cepa) epidermal cells. Our results suggest that CoMir is a protein that regulates proteolysis during coffee development that is mobilized to defense after L. coffeella oviposition / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Marcos Hikari Toyama / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T00:18:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fonseca_FabianaVieira_M.pdf: 764391 bytes, checksum: 2ea9b8ea9a806b452272ef5f3e45ba17 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O uso de toxinas isoladas de venenos como ferramentas moleculares na compreensão de diversos eventos fisiológicos e patológicos tem sido comprovadas por vários trabalhos na literatura. A serpente Crotalus durissus cascavella é encontrada nas áreas de caatinga do nordeste do Brasil, desde o Maranhão até norte do estado de Minas Gerais, e apesar de pouco estudada sua picada constitui um importante problema da saúde pública (Martins et al, 1998). A agregação platequetária é bem caracterizada para a convulxina isolada do veneno de Crotalus durissus cascavella e Crotalus durissus terrificus. O objetivo principal do projeto foi avaliar a atividade de agregação plaquetária induzida por outras frações biológicas e farmacologicamente importantes do veneno total de Cotalus durissus cascavella, que neste projeto foram a crotoxina e giroxina. Através de uma combinação de varias metodologias em HPLC como exclusão molecular, troca iônica e de fase reversa conseguimos isolar os principais constituintes da crotoxina (PLA2, crotapotina e as proteínas ¿trombina-like¿) e a L-aminoácido oxidase a partir da giroxina. Durante o fracionamento do veneno total em coluna de HPLC de exclusão molecular foram detectados dois picos de atividade serino protease, um na fração giroxínica e outro na fração crotoxínica, sendo que na fração crotoxínica encontrou-se uma nova protease até então não caracterizada e na fração giroxínica foram monitoradas a atividade L-aminácido oxidase. Através da cromatografia em HPLC de troca iônica em DEAE 5PW obteve-se a fração Laminoácido oxidase cujo grau de homogeneidade molecular foi confirmado por HPLC de fase reversa. Da fração crotoxínica foram obtidos três grupos principais de proteínas (PLA2, crotapotinas e proteases) e da fração proteolítica foram isoladas três isoformas principais denominadas de F201, F202 e F203, sendo a fração F202, a fração majoritária. F202 foi obtida com maior homegeneidade molecular com massa molecular de 28kDa e mostrou uma alta quantidade de ácido aspártico, ácido glutâmico e outros aminoácidos importantes como histidina, cisteína e lisina. Esta proteína mostrou alta especificidade para BApNA e mostrou um comportamento Michaelis-Menten com Vmáx estimado em 5,64 µM/min e um Km de 0,58mM para este substrato. Neste trabalho foi investigada a habilidade desta proteína em degradar fibrinogênio e observou-se que F202 clivou ambas as cadeias a e ß. A atividade enzimática assim como a agregação plaquetária foi inibida fortemente com a incubação com TLCK, um inibidor específico para serinoproteases. O N-terminal da seqüência de aminoácidos de F202 mostrou alta homologia com outras proteínas ¿trombina-like¿, mas foi significantemente diferente da ¿trombina-like¿ isolada da fração giroxina. Crotalus durissus cascavella apresenta uma fração menos estudada denominada giroxina que tem sido descrita como uma proteína ¿trombina-like¿ como relatado por Raw et al. (1986) e Alexander et al. (1988). Neste trabalho foi demonstrado que a giroxina é uma fração heterogênea composta de uma ¿trombina-like¿ e proteína LAO, a qual parece estar envolvida em várias atividades / Abstract: The use of the isolated toxins from poisons as molecular tools in the understanding of diverse physiological and pathological events has been proved by some works in literature. The serpent Crotalus durissus cascavella is found in the areas of Caatinga Northeast of Brazil, since Maranhão until North of the state of Minas Gerais, and in spite of it hasn¿t been studied a lot, its bite constitutes an important problem to the public health (Martins et al, 1998). The platelet aggregation is well characterized to the isolated convulxin of the poison of Crotalus durissus cascavella and Crotalus durissus terrificus. The main objective of the project was to evaluate the activity of platelet aggregation induced by gyroxin and crotoxin that are biological and pharmacological important fractions of the total poison of Cotalus durissus cascavella. Through a combination of various methodologies in HPLC -as molecular exclusion, ionic exchange and the reverse phase- we managed to isolate the main constituent of the crotoxin (PLA2, crotapotin and the thrombin-like proteins) and the L-amino acid oxidase from the gyroxin. During the fragmentation of the total poison in column of HPLC of molecular exclusion two peaks of serine protease were found: one in the gyroxin fraction and another one in the crotoxin fraction. In the crotoxin fraction a new protease in not characterized yet and in the gyroxin fraction was found the L-amino acid activity oxidase. Through the chromatography in HPLC of ionic exchange in DEAE 5PW that allowed to the attainment of the fraction L-amino acid oxidase whose degree of molecular homogeneity was confirmed by HPLC of reverse phase. From the crotoxin fraction three main groups of proteins (PLA2, crotapotin and proteases) were isolated, and from the named proteolyitic fraction three isoforms of F201, F202 and F203, noticing that the F202 fraction is the major one. The fraction F202 showed a high quantity of aspartic acid, glutamic acid and others amino acids very important as histidine, cysteine and lysine and so more molecular homogeneity could be obtained and with molecular mass of 28kDa. This protein whose behavior Michaelis-Menten with Vmáx measured in 5,64 µM/min and one Km de 0,58 mM to this substratum showed high specificity to BapNA. In this work was investigated the ability of this protein in degrading the fibrinogen and was observed that the F202 made the cleavage into both chains a and ß. The enzymatic activity as well as the platelet aggregation were strongly inhibited with the incubation with TLCK, a specific inhibitor to serine protease. The N-terminal of the amino acid sequence of F202 showed the high homology with other proteins thrombin-like, but it was significantly different from thrombin-like isolated fro m the gyroxin fraction. Crotalus durissus cascavella presents a fraction less studied named gyroxin that has been described as a protein thrombin-like as related by Raw et al. (1986) and Alexander et al. (1988). In this work was demonstrated that the gyroxin is a composed heterogeneous fraction of one thrombin-like and protein LAO, and this seems to be involved in some activities / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Jaime Amaya-Farfan / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-09T17:22:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nery-Diez_AnaClaudiaCoelho_M.pdf: 934583 bytes, checksum: 83182e794d4e4f53cd6b257610760e0c (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: As proteínas do soro do leite apresentam propriedades fisiológicas, funcionais e nutricionais diferentes que resultam na modulação ou melhoramento de funções bioquímicas e fisiológicas, aumentando a resistência e protegendo o organismo contra infecções ou retardando certos processos patológicos, assim como melhorando o desempenho físico. Estudos têm demonstrado melhoras em parâmetros bioquímicos e físicos proporcionados por estas proteínas. Assim, considerou-se de interesse investigar algumas das possíveis alterações ou efeitos fisiológicos, provocados pela ingestão de fonte protéica de alto peso molecular (isolado do soro do leite) e um hidrolisado enzimático dessa proteína. Além disso, levou-se em consideração o efeito da atividade física em ratos treinados em esteira, na atividade catalítica de proteases intestinais como: glutaminase, leucina-aminopeptidase, quimotripsina e tripsina e verificou-se também a possível absorção de peptídeos que constituem o hidrolisado, no intestino delgado. Na análise das atividades enzimáticas observou-se que o consumo da proteína hidrolisada promoveu diminuição da atividade da enzima glutaminase intestinal de 25 a 29%, em relação à atividade produzida pelas proteínas intactas (isolado e caseína). O treinamento, porém, teve como efeito aumentar a atividade glutaminase entre 27 e 32% para cada uma das dietas, exceto para o hidrolisado, que permaneceu sem alteração. A exaustão, por outro lado, resultou em diminuição da atividade glutaminase intestinal para quase todas as dietas (média aproximada de 30%). Na avaliação das enzimas presentes no lúmen intestinal, as atividades das três proteases, leucina-aminopeptidase, quimotripsina e tripsina, foram encontradas mais elevadas na fração do jejuno, em comparação ao íleo. Foi observada uma aparente inibição enzimática da tripsina na fração jejunal pela presença de caseína. Para verificar a possibilidade de absorção de peptídeos inteiros, foi realizada uma análise in vitro com os intestinos delgados. O intestino fresco extraído foi infundido com uma suspensão de cada proteína e incubado em solução fisiológica por duas horas, na temperatura de 37°C. Após, tal procedimento, os perfis de aminoácidos e de peptídeos perfusados foram obtidos por métodos cromatográficos e eletroforéticos. Neste estudo, pode-se constatar que houve maior passagem de aminoácidos nos intestinos delgados dos grupos sedentários-exaustos e treinados, que foram infundidos com o hidrolisado e nos grupos sedentários e treinados, que foram infundidos com isolado. Em relação aos diferentes níveis de atividade física, os animais treinados, alimentados com ambas as dietas, isolado e seu proteolisado, tiveram maior passagem de aminoácidos. Conclui-se que o consumo da proteína parcialmente hidrolisada não afetou de igual forma a atividade das três proteases, tripsina, quimotripsina e leucina-aminoeptidase, sendo que o treinamento e o hidrolisado, conjuntamente, redundaram em diminuição da atividade da quimotripsina, enquanto que a atividade da glutaminase foi visivelmente diminuída pela combinação da exaustão e o consumo do hidrolisado. Por sua vez, foi possível evidenciar a passagem de peptídeos do hidrolisado, do interior, para o exterior do jejuno perfusado do rato / Abstract: The whey protein offers various physiological, functional and nutritional properties that result in the modulation or improvement of physiological and biochemical functions, thus protecting the body against infections and delaying the onset of certain pathological processes, as well as improving the physical performance. Researchers have attributed to these proteins benefits such as the improvement of biochemical and physical parameters of the exercising animal. Therefore, it was considered of interest investigate some of the possible alterations resulting from the ingestion of the milk whey proteins (whey protein isolate) as the only source of high-molecular weight protein, as compared to an intermediate-degree enzymatic hydrolyzate of this protein and the casein standard. Moreover, the effect of the physical activity on the catalytic activity of the intestinal proteases glutaminase, leucine-aminopeptidase, chymotrypsin and trypsin, of rats trained in the treadmill was taken as an additional variable. Moreover, the possible absorption of constituent peptides of the hydrolyzate from the small intestine was investigated. In the analysis of the enzymatic activities it was observed that the consumption of the hydrolyzed protein prompted a reduction of the activity of the intestinal enzyme glutaminase by 25 to 29%, in relation to the activity produced by the unbroken proteins (isolate and casein). Physical training, however, had the effect of increasing the activity of glutaminase between 27 and 32% for each one of the diets, except for the hydrolyzate, which remained unaltered. Exhaustion, on the other hand, resulted in the reduction of the intestinal activity glutaminase for most of the diets (mean of ~30%). Assessment of the enzymes present in the intestinal lumen, the activities of three proteases, leucine-aminopeptidase, chymotrypsin and trypsin, were higher in the jejunal fraction, in comparison to the ileum. An apparent enzymatic inhibition of trypsin occurred in the jejunal fraction in the presence of casein. In order to verify the possibility of absorption of whole peptides, fresh intestinal fractions were infused with suspensions of each protein and incubated in physiological solution for two hours, at 37°C. After, such process the amino acid and peptide profiles were determined by chromatographic procedures. It was observed that a greater outflow amino acids occurred in the intestines sedentary-exhaust and trained group that were infused with the hydrolyzate, and in the sedentary and trained group that were infused with whey protein isolate. With regard to the effect of the different levels of physical activity, the animals that underwent training, fed with either of the diets, isolate or its hydrolyzate, had greater amino acid outflow than the sedentary animals. It is concluded that consumption of the hydrolyzate did not affect equally the activity of the three proteases, trypsin, chymotrypsin and leucine-aminopeptidase, noticing that a combination between training and the hydrolyzate caused a decrease of the activity of chymotrypsin, whereas the activity of glutaminase was clearly diminished by a combination between exhaustion and consumption of the hydrolyzate. Evidence has been presented showing that infusion of the hydrolyzate into the small intestine of the rat results in the passage of peptides from the interior to the exterior of the intestinal wall / Mestrado / Nutrição Experimental e Aplicada à Tecnologia de Alimentos / Mestre em Alimentos e Nutrição

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Sementes de leguminosas constituem uma das principais fontes de proteÃna na alimentaÃÃo humana e animal. Outros interesses tÃm sido despertados para o potencial nutracÃutico inerente a essas proteÃnas vegetais, uma vez que muitas proteÃnas bioativas, atà entÃo referidas apenas como fatores antinutricionais, tÃm exercido efeitos benÃficos no organismo, atuando na cura e/ou prevenÃÃo de vÃrias doenÃas. Dentre esses, destacam-se os inibidores de proteases, os quais desempenham importantes funÃÃes na defesa de plantas e apresentam propriedades biolÃgicas de interesse para aplicaÃÃes biotecnolÃgicas nas Ãreas farmacolÃgica e mÃdica. O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial nutricional e nutracÃutico de sementes de Enterolobium contortisiliquum, enfocando a purificaÃÃo e caracterizaÃÃo parcial de inibidores de quimotripsina e avaliar seu efeito antiproliferativo contra cÃlulas tumorigÃnicas humanas. As sementes de E. contortisiliquum sÃo uma excelente fonte de proteÃnas, apresentando cerca de 50% desse macronutriente em base seca. A presenÃa de inibidores de proteases em quantidades elevadas sugere que essas molÃculas possam vir a ter uma aplicaÃÃo nutracÃutica. Dessa forma, foram purificados trÃs inibidores de quimotripsina, denominados EcCI1, EcCI2 e EcCTI, os quais foram parcialmente caracterizados. As massas moleculares aparentes determinada para os trÃs inibidores à de 17, 17 e 19 kDa, respectivamente. EcCI1 e EcCI2 sÃo inibidores do tipo nÃo competitivo e apresentam ki de 4 x 10-8 e 2,5 x 10-8 M, respectivamente. Em contrapartida, EcCTI inibe a quimotripsina de forma competitiva e apresenta ki de 5 x 10-8 M. Apenas EcCTI foi capaz de inibir a tripsina (98%). EcCI1 e EcCI2 inibiram satisfatoriamente a elastase neutrofÃlica (ca. de 70%), mas nÃo EcCTI (20%). Os trÃs inibidores inibiram sutilmente a elastase pancreÃtica (ca. de 20%) e nenhum foi capaz de inibir a papaÃna. Os trÃs inibidores sÃo altamente estÃveis Ãs condiÃÃes extremas de temperatura (de 37 a 90 ÂC para EcCI2 e de 37 a 100 ÂC para EcCI1 e EcCTI ), pH (2 a 12) e DTT nas concentraÃÃes de 1 a 100 mM para EcCI1 e EcCTI e de 1 a 10 mM para EcCI2. Outros estudos sÃo necessÃrios para melhor caracterizar esses inibidores. Nenhum dos inibidores promoveu efeito antiproliferativo contra as quatro linhagens de cÃlulas tumorigÃnicas testadas / Leguminous seeds are main sources of food proteins for humans and animals. Other interests in these plant proteins concerning their nutraceutical properties have been raised, since many bioactive proteins, previously referred only as anti-nutritional factors, have exerted beneficial effects on health, acting as chemopreventive agents against several diseases. Among these are protease inhibitors, which play important roles in plant defense and have biological properties of interest for biotechnological applications in pharmaceutical and medical areas. This study aimed to evaluate the nutritional and nutraceutical potential of Enterolobium contortisiliquum seeds, focusing on the purification and partial characterization of chymotrypsin inhibitors and assess their antiproliferative effect against human tumor cells. E. contortisiliquum seeds are an excellent protein source, with about 50% of this macronutrient on a dry basis. The presence of protease inhibitors in high quantities suggests that these molecules may exert a nutraceutical application. Three chymotrypsin inhibitors, denominated EcCI1, EcCI2 and EcCTI were purified and partially characterized. EcCI1, EcCI2 and EcCTI show molecular weights of 17, 17 and 19 kDa, respectively. EcCI1 and EcCI2 are non-competitive inhibitors with ki of 4 x 10-8 and 2.5 x 10-8 M, respectively, while EcCTI inhibits chymotrypsin competitively with ki of 5 x 10-8 M. Only EcCTI was able to inhibit trypsin (98%). EcCI1 and EcCI2 successfully inhibited leukocyte elastase (about 70%), but EcCTI (20%). The three inhibitors slightly inhibited pancreatic elastase (about 20%) and none was able to inhibit papain. The three inhibitors have a high thermal stability (37 to 90 ÂC for EcCI2 and 37 to 100 ÂC for EcCI1 and EcCTI), pH (2 to 12) and DTT concentrations ranging from 1 to 100 mM for EcCI1 and EcCTI and from 1 to 10 mM for EcCI2. Further studies are needed to better characterize these inhibitors. None of the inhibitors promoted antiproliferative effect against four tumorigenic cell lines tested

Os volumes da produÃÃo de leite estÃo crescendo a uma taxa mÃdia de 2% ao ano em todo o mundo. Este aumento da quantidade de leite està sendo canalizado para a produÃÃo de queijo, caseÃna, caseinato e outros produtos lÃcteos, resultando no aumento do volume de soro de leite. Ele representa cerca de 85-95% do volume do leite e retÃm cerca de 55% de seus nutrientes, no entanto, seu alto poder poluente levou ÃrgÃos ambientais e outras autoridades reguladoras a proibir o descarte do soro de leite nÃo tratado no ambiente. A partir de estudos sobre os componentes do soro de leite e a descoberta das propriedades tecnolÃgicas e funcionais de suas proteÃnas, a visÃo de resÃduo poluidor mudou, sendo hoje, considerado um co-produto da produÃÃo de queijo. Um dos processos que promove a melhoria de suas propriedades consiste na hidrÃlise protÃica. Este tratamento pode ser realizado pelo emprego de Ãcidos, bases ou enzimas, contudo, a hidrÃlise enzimÃtica apresenta diversas vantagens sobre a quÃmica, como a especificidade, o controle do grau de hidrÃlise (GH), as condiÃÃes moderadas do processo e a formaÃÃo mÃnima de subprodutos. O objetivo deste trabalho foi promover a hidrÃlise das proteÃnas do soro de leite, atravÃs da aÃÃo de proteases sintetizadas pelo Aspergillus oryzae IV e a secagem deste por atomizaÃÃo. Avaliou-se o efeito da temperatura e tempo de incubaÃÃo, relaÃÃo enzima:substrato (E:S), e posteriormente do pH. Determinou-se os parÃmetros que permitiram maior grau de hidrÃlise. A faixa de temperatura de incubaÃÃo estudada foi entre 30 e 50 ÂC, a relaÃÃo E:S variou nas proporÃÃes de 0,5:100 a 3,0:100. A melhor condiÃÃo de hidrÃlise (GH = 70%) obtida à 50 ÂC por 12 horas, empregando a relaÃÃo E:S de 2,0:100. Avaliou-se a influÃncia da hidrÃlise no perfil peptÃdico realizando uma anÃlise eletroforÃtica, em que confirmou-se a necessidade de estudar a hidrÃlise em diferentes valores de pH. Desta forma o pH do soro de leite foi ajustado entre 4,0 e 8,0 antes da reaÃÃo para avaliar a influÃncia deste parÃmetro sobre o grau de hidrÃlise. A amostra hidrolisada foi concentrada atà um teor de sÃlidos entre 14 e 28 ÂBRIX antes do processo de atomizaÃÃo. NÃo houve diferenÃa significativa entre as amostras atomizados avaliados quanto ao rendimento, umidade e atividade de Ãgua. AtravÃs da anÃlise eletroforÃtica, a partir dos gÃis corados em soluÃÃo de prata, foi possÃvel confirmar a aÃÃo das proteases sobre proteÃnas de diversos pesos moleculares com exceÃÃo a β-lactoglobulina. / Worldwide milk production is growing at a average rate of 2% per year. This increased amount of milk has been related to the production of larger volumes of cheese, casein, caseinate and other milk products, resulting in increased volume of whey. It represents about 85-95% of milk volume and retains about 55% of its nutrients, however, its high power pollutant led environmental bodies and other regulatory authorities to prohibit the discharge of whey into the environment untreated. From studies about whey components and with the discovery of technological and nutritional properties the status of polluter waste changed, then, nowadays, whey is considered a co-product of cheese production. One processes that promote improvement of whey properties is protein hydrolysis, characterized by the disruption of bonds of molecules protein chains releasing different sizes peptides and free amino acids. The hydrolytic treatment can be done by acids, bases or enzymes, however, enzymatic hydrolysis show many advantages in relation to chemical processes, as specificity, control of hydrolysis degree, the moderated conditions of the process and minimal formation of residual products. The objective of this study was to promote whey protein hydrolysis through the action of proteases synthesized by Aspergillus oryzae IV and spray drying this product. We evaluated the effect of temperature and time of incubation, enzyme: substrate ratio (E: S), and subsequently the pH. The parameters which have enabled higher degree of hydrolysis were determined. The temperature range studied was incubated between 30 and 50  C, the ratio E: S ranged in the proportions of 0,5:100 3,0:100. The best condition of hydrolysis (DH = 70%) was obtained at 50  C for 12 hours, employing the ratio E: S 2,0:100. An electrophoretic analysis was performed to obtain the hydrolysis influence on the peptide profile, in which confirmed the need to study the hydrolysis at different pH values. Thus, the whey pH was adjusted between 4.0 and 8.0. The hydrolyzed sample was concentrated to a solids content between 14 and 28 Brix before the atomization process. There was no significant difference regarding yield, moisture and water activity between the spray dried samples. Through the eletrophoretic analysis, from gels stained with silver solution, was possible to verify the action of proteases on proteins of different molecular weights with exception β-lactoglobulin.

A resistência que apresentam as serpentes peçonhentas às suas próprias peçonhas, assim como a resistência observada em alguns animais está bem documentada, e é atribuída a fatores solúveis presentes no seu plasma, soro ou músculo. No caso das serpentes peçonhentas estes fatores as amparam de sofrer danos decorrentes da própria peçonha. No presente trabalho foi isolado do soro da serpente Bothrops alternatus um inibidor de metaloproteases, denominado BaltMPI, mediante cromatografia em DEAE Sepharose(TM), Superdex(TM) 200, MonoQ(TM) 5/50 GL e cromatografia de fase reversa em C18, com uma recuperação proteica de 0,3%. A massa molecular determinada para o BaltMPI por SDS - PAGE foi de 60,5 kDa, e por espectrometria de massas MALDI/TOF de 42,4 kDa. Seu ponto isoelétrico, determinado por focalização isoelétrica, é 5,27. Portanto, o BaltMPI, é um SVMPIs com caráter ácido, pertencente aos SVMPIs de baixa massa molecular. Os primeiros 60 aminoácidos da região N-terminal do BaltMPI foram determinados mediante degradação de Edman, e apresentou alto grau de homologia com a sequência para a mesma região de outros SVMPIs isolados a partir do soro de serpentes peçonhentas. Outros segmentos da sequência também foram determinados após clivagem com tripsina e posterior análise por espectrometria de massas. Posteriormente realizou-se o alinhamento da sequência parcial determinada para o BaltMPI, com a sequência do BJ46a, um SVMPI proveniente da Bothrops jararaca, encontrando alta homologia entre elas. Tanto o soro da serpente, quanto o inibidor, BaltMPI, inibiram a atividade hemorrágica da Batroxase, uma SVMP da classe P-I, e a da BjussuMP-I, uma SVMP da classe P-III. Já, em relação à DHM da Batroxase, foi determinado que o BaltMPI tem uma DIHM de 5ug, e uma CE50% de 0,857ug. O BaltMPI também apresentou um efeito inibitório sobre a ação proteolítica da Batroxase, sobre os substratos: fibrinogênio, fibrina e azocaseína. Sobre a atividade fibrinogenolítica da serinoprotease BjSP, o BaltMPI não apresentou um efeito inibitório, corroborando assim com a especificidade descrita para inibir as SVMPs que possuem os SVMPIs. O BaltMPI inibiu a ação hemorrágica e proteolítica da Batroxase, ao formar um complexo mediante ligações não covalentes com esta SVMP. O inibidor BaltMPI, ao igualmente aos demais SVMPIs descritos, é estável em uma ampla faixa de pH (1 - 9), e a temperaturas elevadas, sendo que em temperaturas acima de 60°C foi observada uma diminuição na sua capacidade de inibir a atividade hemorrágica da Batroxase. A inibição da atividade hemorrágica da Batroxase, quando avaliado o potencial do BaltMPI como complemento à soroterapia, foi menor à inibição observada ao realizar os testes com incubação prévia entre o inibidor e a metaloprotease. No entanto, os resultados obtidos são promissores, reforçando o grande potencial que os SVMPIs possuem, tanto como ferramentas moleculares, como opção para o tratamento dos acidentes ofídicos, em especial o acidente botrópico, no qual as SVMPs tem papel fundamental na fisiopatologia observada, e que conduz à alta morbidade associada com este tipo de acidente. / Resistance exhibited by snakes to their own venom, as well as resistance observed in some animals has been well recorded, and has also attributed to soluble factors present in the plasma, serum or muscle. In the case of poisonous snakes, these factors protect them from damages caused by their own venom. An inhibitor, named as BaltMPI, was isolated from the snake´s serum of Bothrops alternates. This inhibitor was isolated through several chromatographic steps including DEAE Sepharose(TM), Superdex(TM) 200, MonoQ(TM) 5/50 GL and C-18 reverse phase, with a protein yield of 0.3%. Molecular mass of 60.5 kDa for BaltMPI was determined by SDS - PAGE and 42.4 kDa by MALDI/TOF mass spectrometry. Its isoelectric point, determined by isoelectric focalization, was 5.27. According to the obtained data, it was established that BaltMPI is an SVMPIs of acid character, belonging to low molecular mass SVMPIs. The first 60 aminoacids from the N-terminal region were determined by Edman degradation. This parcial sequence showed high homology to the corresponding sequence of other SVMPIs isolated from poisonous snake´s serum. Other segments from the sequence were also determined after cleavage with tripsine and MS analyses. Consequently, alignment of the partial sequence of BaltMPI with the sequence of BJ46a, a SVMPI from Bothrops jararaca, was made finding high homology. Both, snake´s serum and BaltMPI, inhibited the hemorragic activity of Batroxase, a class P-I SVMP, and of BjussuMP-I, a class P-III SVMP. When compared to the Batroxase DHM, it was determined a DIHM of 5?g and a CE50% of 0.857?g. BaltMPI also exhibited an inhibitory activity against the proteolitic effect of Batroxase on fibrinogen, fibrin and azocasein as substrates. On the fibrinogenolitic activity of serineprotease BjSP, BaltMPI did not showed inhibitory effect, demonstrating its specificity for inhibiting SVMPs that SVMPIs possess. BaltMPI inhibits the hemorragic and proteolitic action of Batroxase by forming a complex through non covalent linkages with that SVMP. BaltMPI, as well as other reported SVMPIs, is stable in a very high range of pH (1-9), and at high temperatures, although above 60°C a decrease in its inhibition capacity to the hemorrhagic activity of Batroxase. Inhibition of the hemorrhagic activity of Batroxase, when BaltMPI potencial as serum-therapy complement was evaluated, was less than the inhibition observed when tests by previously incubating inhibitor and metalloprotease were made. However, the results obtained are encouraging, highlighting the potential that these kind of proteins, SVMPIs, have as molecular tools, optional treatments for ophidic accidents, specially bothropic accident, in which SVMPs have a fundamental role in the observed physiopathology, leading to a high associated morbidity to this kind of accidents.

As cianobactérias são micro-organismos reconhecidos por seu potencial em produzir cianotoxinas que afetam não só o ecossistema e a outros organismos dos ambientes aquáticos, mas também aos seres humanos, agindo em diversos órgãos e tecidos. Cerca de 600 metabólitos secundários produzidos por cianobactérias já foram descritos na literatura, sendo que muitos deles possuem potencial biológico. Os peptídeos de baixo peso molecular, produzidos por cianobactérias chamados cianopeptídeos, dos quais se podem citar as anabaenopeptinas, aeruginosinas, microviridinas, cianopeptolinas e microgininas, são compostos provindos do metabolismo secundário de cianobactérias e são descritos como inibidores de proteases e fosfatases em alguns sistemas biológicos. Sendo assim, o objetivo do estudo foi identificar a ocorrência de cianopeptídeos em cianobactérias brasileiras e testar seu efeito de inibição da atividade sobre enzimas proteases. Os objetos de estudo foram: uma linhagem da espécie Sphaerospermopsis torques-reginae, duas de Cylindrospermopsis raciborskii, duas de Microcystis sp, uma de Oscillatoria e uma de Pseudanabena sp. A partir dos resultados obtidos pode-se afirmar que do total de linhagens analisadas, ao menos 4 destas parecem produzir os cianopeptídeos de interesse, quando avaliados por cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodos (HPLC-DAD). Em seguida, culturas de duas linhagens de C. raciborskii (uma produtora e outra não produtora de saxitoxina) foram amostradas a cada 3 dias, para a avaliação do crescimento celular, produção de cianopeptídeos e de saxitoxina e suas variantes. Não foi possível confirmar a produção de cianopeptídeos nas duas linhagens desta espécie. Por outro lado, foi evidenciado um aumento da produção de saxitoxinas quando cultivada num meio sem nitrogênio em comparação com a condição controle. Quando analisada a linhagem de Microcystis sp. (LTPNA 08), produtora de microcistinas, foi possível confirmar por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas (LC-MS) a produção de dois cianopeptídeos, sendo estes, duas microgininas. Desta forma, desenvolveu-se um método cromatográfico para a separação desses compostos e purificação por cromatografia líquida semi-preparativa, onde foi possível a obtenção de frações enriquecidas de microgininas e microcistinas-RR e LR, com cerca de 70%, 86% e 97% de pureza. Por fim, realizaram-se ensaios avaliando a atividade da enzima conversora de angiotensina (ECA) e aminopeptidase M (AMP M) com as frações isoladas de microgininas e microcistina-LR. A atividade da ECA foi ± 50% inibida pelas frações testadas de cianopeptídeos, microcistina-LR isolada e microcistins-lR comercial. A atividade da AMP M foi 100% e 24,5% inibida quando incubada com 20 µM da fração de microgininas e microcistina-LR, respectivamente. Desta forma, as microgininas isoladas de cianobactérias brasileiras, mostraram-se como importantes inibidores da ECA e AMP M, podendo, no futuro, serem utilizadas como compostos para o tratamento de patologias cardiovasculares e renais. / Cyanobacteria are micro-organisms recognized for their potential to produce cyanotoxins that affect not only the ecosystem and other organisms of aquatic environments, but also humans, acting in various organs and tissues. Around 600 secondary metabolites produced by cyanobacteria have been described in the literature; many of them have biological potential. Low molecular weight peptides produced by cyanobacteria are called cyanopeptides, among them we can cite the anabaenopeptins, aeruginosins, microviridins, cyanopeptolins and microginins, these compounds are derived from secondary metabolisms of cyanobacteria and apparently cause inhibition of proteases and phosphatases in some biological systems. Therefore, this study targeted the identification of the occurrence of cyanopeptides in Brazilian cyanobacterias and testing its effect on the inhibition of proteases activity. The targets of study were: a strain of species Sphaerospermopsis torques-reginae, two strains of Cylindrospermopsis raciborskii, two strains of Microcystis sp. and, one strain of Pseudanabena and Oscillatoria sp. From the results obtained in this study it can be stated that at least four of the total of strains analyzed appear to produce cyanopeptides of interest, when analyzed by high-performance liquid chromatography whit phodo diodo array detector (HPLC-PDA). The cultures of two strains of C. raciborskii (a producer of saxitoxin and a non-producer) were sampled every 3 days for assessment of cell growth, production of cyanopeptides and saxitoxins. It was not possible to confirm the production of cyanopeptides in strains of this species. Nevertheless, an increase in production of saxitoxins was shown when cultivated in an environment without nitrogen, as compared to the control condition. When the strain of Microcystis sp. (LTPNA 08), a producer of microcystins, was analyzed, the production of two cyanopeptides was confirmed by using liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). After confirmation, a method using HPLC-PDA was used to do the separation and purification of these compounds by semi-preparative chromatography, in which it was possible to obtain an enriched fraction of microginins, microcystin-RR and microcystin-LR with approximately 70%, 86% and 97% purity, respectively. Lastly, inhibition experiments were run with angiotensin-converting enzyme (ACE) and aminopeptidase M (AMP M) with the isolated fractions. The microginins fractions, MC-LR commercial and MC-LR isolated, showed an inhibition of ± 50% of the angiotensin-converting enzyme. The activity of AMP M was 100% and 24.5% inhibited when incubated with microginins and microcystin-LR fractions in a concentration of 20 µM, respectively. Thus, isolated microginins from Brazilian cyanobacteria have exhibited properties as potential therapeutic agents in development of inhibitors of ACE and AMP M, which can be a benefit of using these molecules in the treatment of cardiovascular and renal pathologies.