Submitted by Fabíola Silva (fabiola.silva@famerp.br) on 2016-10-04T14:10:11Z No. of bitstreams: 1 anacarolinabuzzostefanini_dissert.pdf: 2564521 bytes, checksum: fc9c0d25882e400f1002a6ed99657319 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-04T14:10:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 anacarolinabuzzostefanini_dissert.pdf: 2564521 bytes, checksum: fc9c0d25882e400f1002a6ed99657319 (MD5) Previous issue date: 2014-10-08 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Introduction - The head and neck squamous cell carcinomas (HNSCCs) are among the most frequent types of cancer, with more than 600,000 new cases per year worldwide. The five-year survival rate is low in this disease and one of the reasons is that patients with tumours in early stages frequently exhibit few symptoms, resulting in diagnosis delay and severe morbidity. The understanding of the molecular pathways involved in the initiation and progression of these tumors is therefore important not only for understanding their biology, but also for the development of more effective preventive and therapeutic approaches. In previous studies of our group, the kallikrein 8 gene (KLK8) was observed differentially expressed in laryngeal carcinomas and its surgical margins, which highlights its potential as a tumor marker, similar to another member of KLK family, kallikrein 3 or PSA. Objectives and Methodology - The overall objective of the present study was to investigate the participation of the kallikrein 8 in the HNSCC development. The specific objectives included (a) to investigate the phylogenetic relationships among KLKs genes using the MEGA program, (b) to analyze, by real time PCR, the expression pattern of the KLK8 gene and its most abundant isoform in HNSCC and their surgical margins, (c) to evaluate the effect of elevated expression of KLK8 in HNSCC secretome, using conditioned medium and proteomic and metabolomic approaches, (d) to develop molecular homology modeling of protein hK8 by bioinformatics tools. Results - The phylogenetic analysis of human kallikrein genes and their isoforms confirmed the idea that these genes evolved from a single common ancestor by successive tandem duplications and chromosomal rearrangements facilitated by repetitive elements. The results of gene expression analysis in tumor tissues showed that the variant 1 of KLK8 has significantly reduced levels in HNSCC, unlike the other five variables. The ectopic expression of this variant resulted in changes of cell morphology, increased proliferation, viability and migratory capacity, but no alterations in invasiveness. The data from cells with ectopic expression of KLK8 revealed small differences in their proteomes compared to control cells. Otherwise, these cells exhibited changes in their glycolytic pattern and in the effect of their secretome on the metabolism of other cells. Conclusion - This study was important to answer some questions and raise others questions about the role of KLK8 gene in carcinomas of the head and neck. For the first time, differences in expression of KLK8 isoforms were observed in HNSCC and the effects of ectopic KLK8 expression on the proteome and the secretome of HNSCC cells. / Introdução - Os carcinomas epidermóides de cabeeça e pescoco (CECPs) estão entre os mais frequentes tipos de câncer, com mais de 600 mil novos casos por ano no mundo e taxas de sobrevida reduzidas. Além de sua incidência e mortalidade altas, os CECPs são clinicamente relevantes por causa de sua morbidade, em geral decorrente do diagnóstico tardio. O entendimento das vias moleculares envolvidas na iniciação e na progressão desses tumores é, portanto, importante, não somente para o entendimento de sua biologia, mas também para o desenvolvimento de abordagens preventivas e terapêuticas mais eficazes. Em estudos prévios do nosso grupo, o gene da calicreína 8 (KLK8) foi observado com expressão diferencial entre carcinomas de laringe e suas margens cirúrgicas, o que evidencia seu potencial como marcador tumoral, como ocorre com outro membro de sua família, a calicreína 3 ou PSA. Objetivos e Metodologia – O presente projeto teve como objetivo geral investigar a participação da calicreína 8 no desenvolvimento de CECPs. Seus objetivos específicos compreenderam (a) investigar as relações filogenéticas entre os genes KLKs com o auxílio do programa MEGA, (b) analisar, por PCR em tempo real, o padrão de expressão do gene KLK8 e de sua isoforma mais abundante em CECP e em tecidos normais correspondentes, (c) avaliar o efeito da expressão elevada de KLK8 no secretoma de células de CECP, utilizando ensaios com meio condicionado e abordagens proteômicas e metabolômicas, (d) desenvolver a modelagem molecular por homologia da proteína hK8 com ferramentas de bioinformática. Resultados – A análise filogenética da família de genes das calicreínas humanas e suas isoformas confirmou a idéia de que esses genes evoluíram de um único ancestral comum por sucessivas duplicações em tandem e rearranjos cromossômicos facilitados por elementos repetitivos. Os dados de expressão gênica em tecidos tumorais mostraram que a variante 1 de KLK8 apresenta níveis significativamente reduzidos em CECP, ao contrário das outras cinco variantes. A indução permanente in vitro desta variante resultou em mudança da morfologia celular, aumento de proliferação, viabilidade e capacidade migratória, sem aumento concomitante de invasividade. Os dados obtidos sobre essas células com expressão ectópica de KLK8 revelaram pequenas diferenças em seu proteoma quando comparadas com células controle. Por outro lado, exibiram modificação no padrão glicolítico e no potencial de seu secretoma de afetar o metabolismo de outras células. Conclusão - O presente estudo foi importante para responder a alguns questionamentos e levantar outras questões sobre a função do gene KLK8 em carcinomas de cabeça e pescoço. O estudo identificou, pela primeira vez, as diferenças de expressão entre as isoformas de KLK8 em CECP e os efeitos da indução de sua expressão sobre o proteoma e o secretoma de suas células.

Orientador: Prof. Dr. Luciano Puzer / Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Ciência & Tecnologia - Química, 2014. / Serpina é o nome dado a uma superfamília de proteínas com grande diversidade de funções biológicas, e que tem como principal característica a inibição de serino proteases. Até meados do ano de 2002, acreditava-se que as serpinas eram exclusivas de organismos eucarióticos. No entanto, com o desenvolvimento das técnicas de sequenciamento de genomas, essas proteínas passaram a ser identificadas também em organismos procariotos. Assim com o objetivo de avaliar a capacidade de duas serpinas bacterianas (G. violaceus e M. xanthus) em inibir serino proteases foi realizado nesse trabalho a clonagem, expressão e caracterização bioquímica da atividade inibitória de duas serpinas bacterianas descritas no banco de dados de genoma "genbank". As serpinas que foram alvo de nosso estudo possuem diferentes sequências de aminoácidos na sua RCL (alça do centro reativo), visando produzir serpinas com diferentes especificidades para serino proteases. Os genes codificadores das duas serpinas foram clonados em vetor de expressão pET-28a(+). As serpinas S1 (Gloeobacter violaceus) e S2 (Myxococcus xanthus) foram expressas na cepa bacteriana E. coli Bl21 (D3), purificadas pela técnica de cromatografia de afinidade em resina de níquel Ni-NTA e obtidas na forma solúvel. Foram realizados ensaios para determinar a atividade inibitória das serpinas S1 (G. violaceus) e S2 (M. xanthus) contra as enzimas tripsina, quimotripsina, elastase, subtilisina, NS3 (dengue) e ainda da serpina S1 frente as calicreínas teciduais humanas 1, 3 e 5. A eficiência da reação de inibição da serpina S1 contra essas enzimas também foi testada na presença de glicosaminoglicanos (GAG¿s): heparina, sulfato de dermatan e sulfato de condroitina. A serpina S1 (G. violaceus) apresentou atividade inibitória frente à tripsina na ausência e também na presença dos GAG¿s heparina, sulfato de dermatan e sulfato de condroitina, sendo que na presença de heparina foi possível observar o menor valor de constante de velocidade de segunda ordem (k¿) em relação aos demais GAG¿s testados, sugerindo que a heparina atua de alguma forma na diminuição da velocidade na reação de inibição da tripsina pela serpina S1. Foi possível visualizar a formação do complexo covalente entre a serpina S1 (G. violaceus) e a tripsina por análise em SDS-PAGE 10%. Também analisamos a ação inibitória de compostos sintéticos derivados do isomanídeo frente às calicreínas teciduais humanas 1, 3, 5, 6 e 7. Nesse estudo foi possível obter inibidores seletivos para as calicreínas humanas teciduais 5 e 7, a partir dos compostos sintéticos derivados do isomanídeo e através dos estudos de docking, juntamente com a análise das estruturas das KLK5 e KLK7, foram fornecidas informações sobre as diferenças observadas entre as afinidades de ligação dos diferentes compostos derivados do isomanídeo refletidos nos resultados dos testes de inibição. / Serpin is the name given to the superfamily of proteins with wide range of biological functions, and that has as main feature the inhibition of serine proteases. Until mid-year 2002 it was believed that the serpins were unique to eukaryotic organisms. However, with the development of genome sequencing techniques, these proteins are now also been identified in prokaryotic organisms. Thus, with the objective of evaluate the ability of two bacterial serpins (G. violaceus and M. xanthus) to inhibit serine proteases was performed in this work the cloning, expression and biochemical characterization of the inhibitory activity of two bacterial serpins described in the database of genome "genbank". Serpins that have been the target of our study have different sequences of amino acids in RCL (the reactive center loop), to produce serpins with different specificities for serine proteases. The genes encoding the two serpins were cloned into the expression vector pET-28a (+). S1 (Gloeobacter violaceus) and S2 (Myxococcus xanthus) serpins were expressed in the bacterial strain E. coli BL21 (D3), purified by the technique of affinity chromatography on nickel Ni-NTA resin and obtained in soluble form. Assays were performed to determine the inhibitory activity of serpins S1 (G. violaceus) and S2 (M. xanthus) against the enzymes trypsin, chymotrypsin, elastase, subtilisin, NS3 (dengue) and also the serpin S1 against human tissue kallikrein 1, 3 and 5. The efficiency of the inhibition reaction against these enzymes serpin S1 was also tested in the presence of glycosaminoglycans (GAG's) heparin, dermatan sulfate and chondroitin sulfate. S1 serpin (G. violaceus) had inhibitory activity against trypsin in the absence and presence of GAGs heparin, dermatan sulfate and chondroitin sulfate, and in the presence of heparin was observed the lowest value of the rate constant of the second order (k') compared to the other GAG's tested, suggesting that heparin acts in some way in reducing the speed in inhibiting reaction of trypsin by serpin S1. It was possible to visualize the formation of a covalent complex between S1 (G. violaceus) serpin and trypsin by SDS-PAGE 10% analysis. We also analyzed the inhibitory activity of synthetic compounds derived from isomannide against human tissue kallikrein 1, 3, 5, 6 and 7. In this study it was possible to obtain specific inhibitors for human tissue kallikrein 5 and 7 from synthetic compound derived from the isomannide and through docking studies, together with the analysis of the structures of KLK5 and KLK7, were provided information about the differences between the various binding affinities of compounds derived from isomannide and reflected in the results of the inhibition tests.

3-bromophenyl 6-acetoxymethyl-2-oxo-2H-1-benzopyran-3-carboxylate (IK9) was recently reported to be a potent inhibitor of cancer cell invasion and angiogenesis. It markedly reduced in vitro invasion of human HT1080 fibrosarcoma cells through collagen-coated porous membranes (Boyden chamber assay) and in vivo tumour growth in athymic nude mice. It was furthermore able to decrease angiogenesis ex vivo in a rat aortic ring assay and in vivo in a choroidal neovascularisation mice model. It nevertheless presents some water solubility and stability problems, which should be taken into account for further investigations. In the first part of the project, we synthesized original IK9 derivatives, modulated at the 3- and 6-positions, by introducing functional groups able to improve water solubility and metabolic stability. Their anti-invasive potency was screened in the Boyden chamber assay and the generated results highlighted some structure-activity relationships. A second part of the project was devoted to the elucidation of the actually unknown mechanism of action of IK9. Anti-invasive or anti-proliferative effects against endothelial cells, main actors of the angiogenic process, were not emphasised. We showed that IK9 acts likely not as an inhibitor of receptor tyrosine kinases (EGFR, PDGFR and VEGFR). The compound generates a weak decrease of mRNA coding for metalloproteinases (MMPs) 2 and 9, and on the other hand a substantial diminution of MMP 2 and 9 secretions by HT1080 fibrosarcoma cells. In conclusion, the consideration of anti-invasive properties together with the worked out solubility and stability profiles highlights several series, notably 6-hydroxycoumarins, 6-hydroxymethylcoumarins and coumarin-3-sulfonamides, whose interest as potential successors to IK9 is undeniable. Le 6-acétoxyméthyl-2-oxo-2H-1-benzopyrane-3-carboxylate de 3-bromophényle (IK9) est un dérivé coumarinique décrit comme inhibiteur puissant de linvasion tumorale et de langiogenèse. Il inhibe linvasion des cellules HT1080 de fibrosarcome humain in vitro à travers une membrane poreuse recouverte dune couche de collagène (test en « chambres de Boyden ») et la croissance tumorale in vivo chez des souris athymiques nues. Il est par ailleurs capable de bloquer langiogenèse, à la fois dans un modèle ex vivo danneaux daorte de rats et dans un modèle in vivo de néovascularisation choroïdale chez la souris. Il présente pour autant une problématique dhydrosolubilité et de stabilité, dont il faudra tenir compte lors dinvestigations futures. Dans une première partie du projet, nous avons synthétisé des dérivés originaux de lIK9, modulés en position 3 et 6 du noyau coumarinique, en introduisant des fonctions susceptibles daugmenter lhydrosolubilité et la stabilité métabolique des molécules obtenues. Leur pouvoir anti-invasif a été évalué dans le test en « chambres de Boyden », ce qui nous a permis de mettre en évidence différentes relations structure-activité. Une deuxième partie du projet fut consacrée à létude du mécanisme daction de lIK9, qui est non identifié jusquà présent. Un effet anti-invasif ou anti-prolifératif envers les cellules endothéliales, actrices principales du processus dangiogenèse, na pu être observé. LIK9 nagit vraisemblablement pas en tant quinhibiteur de plusieurs récepteurs de type tyrosine kinase (EGFR, PDGFR et VEGFR). Le composé engendre une légère baisse de lexpression de lARNm codant pour les métalloprotéases matricielles (MMPs) 2 et 9 mais par contre entraîne une diminution substantielle de la sécrétion des MMPs 2 et 9 par les cellules HT1080 de fibrosarcome humain. En conclusion, la prise en compte simultanée de lactivité anti-invasive, de lhydrosolubilité et de la stabilité met en avant plusieurs séries de dérivés, notamment des 6-hydroxycoumarines, des 6-hydroxyméthylcoumarines et des coumarine-3-sulfonamides, dont lintérêt en tant que successeurs potentiels de lIK9 est indéniable.

Orientador: Prof. Dr. Sergio Daishi Sasaki / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2017. / O Feijão Caupi (Vigna unguiculata (L.) Walp) é uma leguminosa com importante representatividade econômica e nutricional, especialmente no Brasil. Inibidores de serino proteases, como a tripsina, já foram descritos na espécie, assim como em outras plantas. No entanto, nesta espécie, ainda não foram identificados inibidores que apresentem atividade sobre a elastase de neutrófilos humana (HNE), protease envolvida em muitos processos patológicos, como na instalação e progressão da doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC). Nesse estudo, purificamos um inibidor a partir do extrato protéico de Vigna unguiculata que apresenta atividade sobre HNE. Inicialmente, foi realizado o processo de extração alcalina de proteínas, seguido de três passos cromatográficos distintos, utilizando as colunas Hitrap-Q (Troca-iônica), Source15RPC (Fase-Reversa) e ACE18 (Fase-Reversa). Essas etapas foram acompanhadas por testes de atividade inibitória, utilizando os substratos fluorogênicos Meo-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-MCA (Elastase) e Z-Phe-Arg-MCA (Tripsina), além de ensaios da quantificação de concentração total de proteínas. Para determinar a massa do inibidor, foram utilizadas as técnicas de espectrometria de massa por MALDI-TOF e SDS-PAGE, o inibidor apresenta massa molecular de 10,99 KDa. O Ki para HNE foi determinado no valor de 9 pM. O inibidor não apresentou atividade inibitória sobre tripsina e trombina, porém foi observada atividade sobre subtilisina e quimotripsina. Estes dados indicam que o inibidor purificado trata-se de uma molécula ainda não caracterizada, devido às suas atividades inibitórias o nomeamos de Vigna unguiculata Elastase Inhibitor (VuEI). / The cowpea (Vigna unguiculata (L.) Walp) is a legume of important economic and nutritional representativeness, especially in Brazil. Serine protease inhibitors, such as trypsin, have been described in many species, as well as in other plants. In this specie an inhibitor with activity on human neutrophil elastase (HNE) has not yet been identified. This protease is involved in many pathological processes, such as the onset and progression of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). We purified and characterized an inhibitor from the protein extract of Vigna unguiculata presenting activity towards HNE. Firstly, we performed the alkaline extraction procedure for proteins followed by three different chromatographic steps using Hitrap Q (ion exchange), Source15RPC (Reversed-Phase) and ACE18 (Reversed Phase) columns. These steps were followed by the inhibitory activity tests using fluorogenic substrates, MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-MCA (elastase) and Z-Phe-Arg-MCA (trypsin), and quantitation assays of protein concentration. To determinate the size of the molecule, we used MALDI-TOF mass spectrometry and SDS-PAGE. The molecular mass of the inhibitor was 10,99 kDa. The dissociation constant (Ki) toward HNE was 9 pM. HNE inhibitor showed no inhibitory activities toward trypsin and thrombin. However, the inhibitor presented activity toward subtilisin and chymotrypsin. These datas indicate that this molecule is a novel inhibitor to HNE and we named it Vigna unguiculata Elastase Inhibitor (VuEI).

Photorhabdus é um gênero de enterobactérias simbiontes de Heterorhabditis, um gênero de nematoides entomopatogênicos. Dentre as enzimas secretadas por P. luminescens TTO1, destaca-se PrtA, uma metaloprotease que pertence a subfamília das serralisinas. PrtS, uma protease capaz de induzir uma forte resposta de melanização no inseto, foi identificada em P. temperata Az29 mas não em P. luminescens TTO1. Neste trabalho foram detectadas e caracterizadas bioquimicamente algumas proteases secretadas pelo isolado MN7 de P. luminescens luminescens. Foram detectadas duas atividades mais proeminentes: uma de 50 kDa, e outra de 38 kDa. Com o sequenciamento do genoma desta bactéria, pudemos confirmar a presença no genoma de genes codificando proteínas de alta identidade com as descritas PrtA e PrtS, de massas similares às detectadas nas nossas zimografias. As proteases são inibidas por inibidores específicos de metaloproteases. P. luminescens MN7 apresenta secreção, portanto, de uma protease já descrita algumas vezes, e de outra presente apenas em P. temperata Az29. / Photorhabdus is a genus of Enterobacteriaceae, symbionts of Heterorhabditis, a genus of entomopathogenic nematodes. Among the enzymes secreted by P. luminescens TTO1 stands out PrtA, a metalloprotease that belongs to the subfamily of serralysins. PrtS, a protease capable of inducing a strong melanotic response from the insect, was identified in P. temperata Az29 but not in P. luminescens TTO1. In this work were detected and characterized biochemically few isolated proteases secreted by P. luminescens luminescens MN7. Two most prominent activities were detected: one with 50 kDa and one with 38 kDa. With the sequencing of the genome of MN7, we could confirm the presence in the genome of genes encoding proteins with high identity to PrtA and PrtS already described, with similar masses to those detected in our zimographies. These proteases are inhibited by specific inhibitors of metalloproteases. P. luminescens MN7 secretes a protease already described a few times, and other present only in P. temperata Az29.

Orientador: Prof. Dr. Rodrigo L. O. R. Cunha. / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia/Química, 2017. / Nos últimos anos o rol de propriedades biológicas de compostos de selênio e de telúrio tem aumentado e outras atividades, além das bem descritas propriedades antioxidantes, também vêm sendo demonstradas. Neste contexto, a inibição enzimática promovida por espécies hipervalentes de selênio e telúrio (organocalcogenanas) foi relatada para cisteína proteases, tirosina fosfatases e o proteasoma, por exemplo. Esta inibição é resultado da particular reatividade que compostos hipervalentes de telúrio e selênio apresentam com tióis. Como a quantidade de biotióis reativos em sistemas celulares é vasta e nem todos estão disponíveis para ensaios in vitro com as organocalcogenanas, é possível vislumbrar a aplicação desses compostos como ligantes em cromatografia de afinidade para a identificação de proteínas reativas a esses compostos. Para atingir este objetivo foram utilizados organocalcogenetos derivados de benzaldeído. A estrutura dos ligantes é constituída por um grupo fenilcalcogenila ligado a um derivado de poliéter funcionalizado com um grupo amina que é ancorado à uma matriz de agarose. Foram preparadas duas classes de ligantes para a modificação de agarose que diferem na estrutura do espaçador, a primeira contém uma unidade de ácido succínico entre o organocalcogeneto e o derivado de poliéter (ligantes de Classe I) e a outra, isenta dessa unidade de ácido succínico, possui um grupo amino ionizável (ligantes catiônicos de Classe II). A rota de preparação dos ligantes de classe I envolveu uma sequencia sintética de seis etapas com rendimentos globais de 26% e 19% e os ligantes de Classe II foram preparados em uma sequencia de duas etapas com rendimentos globais de 43% e 22%, para os selenetos e teluretos, respectivamente. A oxido-redução do ligante de telúrio da classe II se mostrou rápido e satisfatório nos estudos preliminares, dando bons indícios para aplicação como ligante na cromatografia de afinidade. Por fim, os ligantes foram imobilizados na agarose funcionalizada com brometo de cianogênio e avaliados com papaína, utilizada como modelo de biotiol nesse trabalho. Notadamente os ligantes de telúrio apresentaram um comportamento distinto do que os de selênio quanto à eluição da papaína da matriz sólida, requerendo maior volume de solução com agente redutor para a eluição da proteína. Coletivamente os resultados apresentados nesse trabalho demonstram que matrizes sólidas funcionalizadas com organocalcogenetos são funcionais para a retenção e liberação de biomoléculas tioladas (funcionalidade "catch & release"), abrindo perspectivas para o estudo mais aprofundado da interação entre calcogenetos com tióis e, ainda para produção, caracterização e estudo de aplicações de diversas matrizes funcionalizadas com organocalcogenetos. / In recent years the role of biological properties of selenium compounds and tellurium compounds has increased, and other activities besides the well-described antioxidant properties have also been demonstrated. In this context, enzymatic inhibition promoted by hypervalent species of selenium and tellurium have been reported for cysteine proteases and tyrosine phosphatases. This activity is due to the particular reactivity of thiols with the chalcogenides atom in their hypervalent state. Apart from these enzymes, one can envisage a plenty of other potential reactive thiols in cellular systems that are prone to react with organocalcogenuranes which are still unknown. As the identification of these unknown targets would be helpful to understand therapeutical and toxicological aspects of these compounds, efforts in this direction are required. One strategy for this purpose consists in using the affinity purification technique using organochalcogenides as ligands, this is proposed in the present work. To achieve this goal, the use of organochalcogenides derived from benzylamines as ligands in affinity chromatography. The structure of this ligands contains a phenylchalcogenide moiety, a polyether spacer group functionalized with an amino group to attach it to an agarose substrate. Two different spacer classes were prepared, the first has a succinic acid spacer between the organochalcogenide and the polyether (Class I ligand); the second class has the polyether moiety directly linked to the phenylchalcogenide group and has an ionizable secondary amine (Class II cationic ligand). The preparation route of the class I ligands involved a six-step synthetic sequence in overall yields of 26% and 19%, and the Class II ligands were prepared in a two-step sequence in global yields of 43% and 22% of the selenides and tellurides, respectively. The studied oxidation and reduction reactions of Class II tellurium ligands revealed fast processes, suitable for a practical application of these novel organochalcogenides in affinity chromatography. Finally, ligands were immobilized in cyanogen bromide activated agarose and the modified matrices evaluated with papain as a model biothiol. Noteworthy, the selenide ligands released papain promptly by washing the matrix with dithiothreitol solution whereas telluride ligands showed the opposite behavior. Collectively, the results presented in this work demonstrate that organochalcogenide-modified agarose is a new class of functional materials for the retention and release of biothiols presenting a "catch & release" functionality. This work brings new perspectives for a more detailed study of the interaction between chalcogenides with thiols and also to the production, characterization and the study of novel applications of organochalcogenide-modified solid matrices.

O receptor tipo 2 ativado por protease (PAR2) é um receptor pro-inflamatório que pode ser ativado por tripsina, triptase, protease 3 produzida pelo neutrófilo e pela gingipaína (produzida por Porphyromonas gingivalis). Objetivo: o objetivo do presente estudo foi investigar a expressão do PAR2 na periodontite crônica em humanos, e avaliar se esta expressão está relacionada com a presença de atividade proteolítica no fluido crevicular. Metodologia: foram coletadas amostras de fluido crevicular gengival de indivíduos do grupo controle (sítios saudáveis com profundidade de sondagem &#8804; 3mm, ausência de sangramento à sondagem; n=40), grupo periodontite crônica com destruição de leve a moderada (n=40) e grupo periodontite crônica com destruição avançada (n=40). A expressão do PAR2 foi determinada por RT-PCR e a atividade proteolítica no fluido crevicular foi analisada utilizando-se o substrato BApNA. Resultados: observou-se um aumento significativo (p<0.001) da expressão do PAR2 no grupo periodontite em relação ao grupo controle, independentemente da severidade da doença. Além disso, no grupo periodontite houve um aumento significativo na atividade proteolítica (p<0.001) presente no fluido crevicular comparado com o grupo controle. Conclusões: concluiu-se que na periodontite crônica, há um aumento da expressão do PAR2 e um aumento da atividade proteolítica do fluido crevicular. Desta forma, sugere-se que o PAR2 pode estar envolvido com a inflamação periodontal em humanos. / Proteinase-activated receptor-2 (PAR2) is a pro-inflammatory receptor that can be activated by trypsin, tryptase, neutrophil-serine protease-3 (P3), and gingipain (produced by Porphyromonas gingivalis). Objectives: the objective of the present study was to investigate the expression of PAR2 in chronic periodontitis, and to evaluate whether its expression is related to the presence of proteolytic activity at the crevicular fluid. Methodology: gingival crevicular fluid (CF) samples were collected from subjects from control group (health sites with probing depth &#8804; 3mm, absence of bleeding on probing; n=40), chronic periodontitis group with slight to moderate destruction (n=40), and chronic periodontitis group with advanced destruction (n=40). PAR2 expression was determined by reverse transcriptase-PCR, and the proteolytic activity (PA) at the CF was quantified using the specific substrate BApNA. Results: PAR2 expression was significantly higher (p<0.001) in periodontitis compared to healthy individuals, independently of the diseases severity. In addition, in periodontitis group, there was a significantly increased proteolytic activity (p<0.001) compared with controls. Conclusions: we conclude that in chronic periodontitis there is an increased expression of PAR2 and an increased proteolytic activity at the crevicular fluid. Thus, it is suggested that PAR2 might be involved in human periodontal inflammation.

Orientador: Prof. Dr. Luciano Puzer / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, São Bernardo do Campo, 2017. / Serpina é o nome dado à superfamília de proteínas com uma vasta diversidade de funções biológicas, que tem como principal característica a inibição irreversível de serino proteases. A característica estrutural mais marcante das serpinas é a presença de uma alça na sua porção C-terminal, composta por 20 aminoácidos denominados alça do centro reativo (RCL). A RCL é a região da serpina que se liga covalentemente ao sítio ativo da serino protease, promovendo a inibição irreversível da enzima pela desarticulação de estruturas funcionais essenciais para a catálise enzimática. As calicreínas teciduais humanas (KLKs) são um grupo de 15 serino proteases (KLK1-KLK15) expressas em uma gama de tecidos. A rKLK5, estudada neste trabalho, é expressa abundantemente na pele humana, e parece que exerce importante papel no processo de descamação epidermal, podendo estar relacionada à patologias, como a psoríase e dermatite atópica. Assim, nesse trabalho foi realizada subclonagem, expressão e caracterização bioquímica da atividade inibitória dos mutantes (VSR344G e VSA345G) da serpina oriunda da cianobactéria Gloeobacter violaceus, identificada pelo nosso grupo e nomeada vioserpina. Os genes codificadores da vioserpina foram previamente clonados no vetor de expressão pET-28a e por meio da técnica de mutação sítio-dirigida foram produzidos dois mutantes substituindo os resíduos de aminoácidos arginina e alanina nas posições P1 e P2 da alça do centro reativo (RCL) da vioserpina, respectivamente, por um resíduo de aminoácido glicina (VSR344G e VSA345G). O sucesso das mutações foi avaliado através de sequenciamento de DNA. As vioserpinas mutantes foram expressas na cepa bacteriana E. coli BL21(D3), purificadas pela técnica de cromatografia de afinidade em resina de níquel (Ni-NTA) e obtidas na forma solúvel. Foi possível visualizar a formação do complexo covalente entre a vioserpina e a KLK5 por análise em SDS-PAGE 10% confirmados pela espectrometria de massas. Também foi analisada a ação inibitória dos mutantes (VSR344G e VSA345G) frente a KLK5. Os valores de SI (estequiometria de inibição) apresentaram valores altos o que indica que é preciso uma concentração grande de inibidor, no caso os mutantes da vioserpina, para que a enzima tenha sua atividade inibida, apresentando-se desta forma uma inibição ineficiente frente a rKLK5. Nesse estudo foi possível obter um inibidor específico (vioserpina) para a rKLK5, podendo assim contribuir para o desenvolvimento de novos procedimentos terapêuticos para patologias envolvidas com o processo de descamação epidermal. / Serpin is the name given to the superfamily of proteins with wide range of biological functions, and that has as main feature the irreversible inhibition of serine proteases. The most striking structural feature of serpins is the presence of a loop in the C-terminal portion of the protein, composed by 20 aminoacids called Reative Center Loop (RCL). The RCL is the region of the serpin that binds covalently to the serine protease active site, which causes the irreversible inhibition of the enzyme by the disarticulation of functional structures essencial for the enzymatic catalysis. Human tissue kalikreins (KLKs) are a group of 15 serine proteases (KLK1-KLK15) expressed in a plethora of tissues. The rKLK5, studied in this work, is abundantly expressed in human skin, and seems to play an important role in the epidermal desquamation process, and may be related to pathologies such as psoriasis and atopic dermatitis. Therefore, in this work the subcloning, expression and biochemical characterization of the inhibitory activity of serpin mutants (VSR344G e VSA345G) of the cyanobacteria Gloeobacter violaceus, recently described by our group and named vioserpin, was proposed. The genes coding for vioserpin were previously cloned into the pET-28a expression vector and through the site-directed mutation technique two mutants were produced by substituting the arginine and alanine amino acid residues at the P1 and P2 positions of the serine reactive center loop (RCL), respectively, by a glycine amino acid residue (VSR344G e VSA345G). The success of the mutations was assessed by DNA sequencing. The mutant vioserpin was expressed in the bacterial strain E. coli BL21 (D3), purified by the nickel resin affinity chromatography technique (Ni-NTA) and obtained in the soluble form. Covalent complex formation between vioserpin and rKLK5 could be visualized by 10% SDS-PAGE analysis confirmed by mass spectrometry. We also analyzed the inhibitory action of mutants (VSR344G and VSA345G) against rKLK5. The SI values (inhibition stoichiometry) presented high values indicating that a large inhibitor concentration is required in the case of the vioserpin mutants, so that the enzyme has its inhibited activity, thus presenting an inefficient inhibition in front To rKLK5. In this study it was possible to obtain a specific inhibitor (vioserpin) for rKLK5, thus contributing to the development of new therapeutic procedures for pathologies involved with the epidermal desquamation process.

IN ENGLISH Charles University Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biological and Medical Sciences Supervisors: prof. Dr. Michael Gütschow RNDr. Klára Konečná, Ph.D. Candidate: Michaela Hympánová Title of the diploma thesis: Enzyme kinetic evaluation of several potential inhibitors of certain human cysteine and serine proteases Background Cysteine and serine proteases are enzymes involved in many physiological processes. The imbalance between them and their endogenous inhibitors is associated with various diseases such as cancer and osteoporosis. Synthetic inactivators could be useful in the treatment of these enzyme-mediated pathological conditions. Therefore, there are ongoing attempts to develop low-molecular weight inactivators for therapeutically relevant cysteine and serine proteases. In the course of this thesis, compounds synthesized in prof. Gütschow's group were investigated as potential inhibitors of selected human proteases. They belong to imidazole compounds derived from N-protected cyclohexylalanine, 2-phenyl-7,8-dihydroimidazo[1,2- a]pyrazin-6(5H)-one derivatives, ,-unsaturated peptidomimetic compounds, carbamates, an N,N-dibenzylcrotonamide derivatives and peptoides. Aims This diploma thesis has been focused on the evaluation of new potential inhibitors against...

Chez la drosophile, l’activation du récepteur Toll menant à une réponse antimicrobienne peut se faire par deux voies différentes. Ces deux voies sont activées soit par des récepteurs dédiés, les Pattern Recognition Receptors (PRRs) reconnaissant des motifs moléculaires microbiens, soit par la coupure d’une molécule circulante appelée Perséphone par des protéases microbiennes extrêmement diverses sécrétées pendant une infection. Cependant, le mécanisme par lequel Perséphone est activée demeurait ambigu. Nous avons identifié une région unique dans Perséphone fonctionnant comme un appât pour les protéases exogènes indépendamment de leur origine, type ou spécificité. Une coupure dans cette région constitue la première étape d’une activation séquentielle de Perséphone ; elle permet de recruter la cathepsine circulante 26-29-p, qui va générer la forme active de Perséphone.Ces travaux montrent comment un récepteur de l’immunité innée, Perséphone, peut être activé par un signal de danger, en l’occurrence des enzymes microbiennes, et non par la détection de motifs moléculaires qui peuvent être présents dans la flore microbienne hébergée par les animaux. / In Drosophila, the antimicrobial response against infections can be triggered by two different extracellular mechanisms that both lead to the activation of the Toll receptor. These two mechanisms are activated either by the recognition of specific microbial determinants by Pattern Recognition Receptors (PRRs), or by the cleavage of the circulating serine protease Persephone by a wide range of microbial proteases secreted during infections. However, the molecular mechanism underlying Persephone activation remained ambiguous. We identified a unique region in Persephone pro-domain that functions as a bait for exogenous proteases independently of their origin, type or specificity. Cleavage of Persephone in this bait region constitutes the first step of a sequential activation and licenses the subsequent maturation of Persephone to the endogenous circulating cysteine cathepsin 26-29-p. Our data establish Persephone itself as an immune receptor able to sense a broad spectrum of microbes through the recognition of danger signals rather than molecular patterns.