Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-09-15T17:31:34Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 741877 bytes, checksum: 36895b207473017c916cda2d5d6d284d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-15T17:31:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 741877 bytes, checksum: 36895b207473017c916cda2d5d6d284d (MD5) Previous issue date: 1999-10-20 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Este trabalho consistiu em utilizar o sistema de cultivo de explantes de soja para estudar o efeito do ácido jasmônico, no sistema “in vitro”, em sementes de linhagens normais e com ausência de lipoxigenases, derivados das variedades CAC-1, Itamarati e Cristalina na síntese de lipoxigenases (LOX) e do inibidor de protease Kunitz (KTI). Ácido jasmônico foi adicionado aos meios de cultivo em que os explantes foram cultivados. As avaliações basearam-se nos efeitos do ácido jasmônico sobre o conteúdo do inibidor de tripsina Kunitz (KTI) e da atividade específica de LOX1 e LOX 2 e 3. Os explantes foram cultivados em meios de cultura líquidos, sob condições semi- assépticas, os quais continham nutrientes minerais, glutamina e sacarose. O pH da solução nutritiva foi mantido em torno de 5,0. Cada explante constou de uma vagem completamente expandida, com duas sementes de, aproximadamente, 100 mg, conectada a um segmento de caule de 45 mm de comprimento. Os explantes foram excisados a partir do quinto nó, da base para o ápice. Os tratamentos testados foram: A = 0, B = 200 e C = 400 μM de ácido jasmônico. O experimento foi conduzido sob irradiância de 80 umol de fótons m-2s-1 a 25oC, por 8 dias. O delineamento experimental adotado foi o inteiramente casualizado, com quatro repetições. Os resultados obtidos evidenciaram que nos tratamentos que receberam ácido jasmônico notou-se um aumento significativo da atividade específica de LOX e no conteúdo de KTI em sementes de variedades normais. No entanto, em explantes de linhagens triplo-nulas (desprovidas de LOX), o ácido jasmônico não aumentou o conteúdo de KTI. Estes resultados sugerem, fortemente, que a síntese de inibidores de proteases em sementes de soja é induzida por ácido jasmônico via indução da síntese de lipoxigenases e que, em sementes triplo nulas esse efeito não é observado devido à ausência completa de lipoxigenases. / This work consited in utilizing a soybean explant culture system to study the effect of jasmonic acid, in vitro system, in normal lineages and in absence of lipoxygenases, derived from varieties, CAC-1 Itamarati and Cristlina in the lipoxygenases synthesis and of proteases inhibitors. The explants were cultured in liquid medium, under semi-asseptic conditions containing mineral nutrients, glutamine and sucrose. The pH of the nutritive solution was maintained about 5.0. Each explant includs a completly expanded bean, with two seeds of approximately 100 mg each one, connected to a stem segment of 45 mm length. The explants were excized off from the fifth node to the base to apex. The evaluations were based on the effects of Jasmonic Acid, added to the culture medium on the level of tripsine inhibitor and in the specific activity of Lipoxygenase 1,2 and 3. Tested treatments were 0, 200 and 400 μM of jasmonic acid. The experiment was conducted under irradiance of 80 mmol of fotons m-2s-1 at 250C, during 8 days. The entirely randomized experimental design was used with four repetitions. The results that were obtained showed that jasmonic acid caused a significative increase of the specific activity of lipoxygenases and in the level of proteases inhibitors in seeds of normal genotypes. However, in explants of triple-null lineages (without lipoxygenases), the jamonic acid did not provocate increase in the level of proteases inhibitors. These results suggest that the synthesis of protase inhibitors in soybean seeds is inducted by jasmonic acid through the synthesis induction of lipoxygenases. / Não foi localizado o cpf do autor.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:43Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-04-30. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:50Z : No. of bitstreams: 1 Publico-10907a.pdf: 1648639 bytes, checksum: bf4fac985206b2244ac3ec1870393d34 (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:50Z : No. of bitstreams: 2 Publico-10907a.pdf: 1648639 bytes, checksum: bf4fac985206b2244ac3ec1870393d34 (MD5) Publico-10907b.pdf: 902711 bytes, checksum: 9db986617af48f452457bb57d5021d5e (MD5) / As infestinas são inibidores de serinoproteases do tipo Kazal encontrados no intestino médio anterior do barbeiro Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidae), um dos principais vetores da doença de Chagas. Neste trabalho, o cDNA do precursor das infestinas foi clonado mostrando a presença de um peptídeo sinal hipotético e sete domínios de inibidores de proteases do tipo Kazal sendo quatro correspondentes as infestinas 1-2 e infestina 3-4, e três novos domínios. Por análise em Northern blot, foi confirmada a síntese de apenas um transcrito de infestina 1-7, de aproximadamente 1800 pb, no intestino médio anterior do inseto. Os três novos domínios de infestina foram denominados de infestina 1R, 2R e 3R. As infestinas 2R-3R são 77% idênticas em seqüência de aminoácidos a infestina 1-2. Em contraste as demais infestinas, a infestina 1R apresenta duas características diferentes marcantes: 1) aminoácido hidrofóbico na posição P1 do sítio reativo do inibidor e, 2) ser processado como um domínio único do tipo Kazal de acordo com predição. Estas duas características foram demonstradas experimentalmente pela purificação da infestina 1R nativa de intestino de T. infestans a qual inibiu elastase de neutrófilos, quimotripsina e subtilisina A e a análise por espectroscopia de massas confirmou o processamento como um único domínio do tipo Kazal. A infestina 1R recombinante foi expressa em bactéria E. coli e apresentou a mesma constante de dissociação para elastase de neutrófilos em relação a proteína nativa. rINF1R também foi capaz de inibir subtilisina A, quimotripsina e proteinase K, mas não foi capaz de inibir trombina nem os ensaios de coagulação (TP e TTPA). Procurando pela função biológica de infestina 1R e atividades biologicas da molecula, verificamos que a forma recombinante foi capaz de interagir com o parasita da doenca de Chagas Trypanosoma cruzi (Kinetoplastida: Trypanosomatidae) ligando-se as formas tripomastigotas de T. cruzi e interferiu na invasao de celulas epiteliais em cultura. Na concentracao final de 10 ƒÊM, rINF1R bloqueou completamente a invasao e, na mesma concentracao, foi capaz de inibir o crescimento das formas epimastigotas em cultura. Para elucidar qual regiao de rINF1R era responsavel por esta atividade, um peptideo ciclico contendo a regiao do sitio reativo de rINF1R baseado na estrutura de SFTI-1 (Sun Flower Trypsin Inhibitor 1) denominado 1RSFTI foi sintetizado o qual tambem foi capaz de interferir na invasao celular de T. cruzi. Ensaios de invasao de celulas LLCMK2 por T. cruzi cepa Y utilizando diferentes inibidores de proteases sugerem que atividade proteolitica do tipo subtilisina pode ser importante para a invasao de celulas por T. cruzi. O perfil de expressao do precursor das infestinas alimentando artificialmente com sangue humano contendo extrato das formas tripomastigotas de T. cruzi mostrou aumento de expressao de duas vezes apos 12 h em relacao aos que se alimentaram apenas com sangue nas mesmas condicoes. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-05-27. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:27Z : No. of bitstreams: 1 Publico-00268a.pdf: 1567152 bytes, checksum: edde41fc5183eb2ec3800911222b1493 (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:27Z : No. of bitstreams: 2 Publico-00268a.pdf: 1567152 bytes, checksum: edde41fc5183eb2ec3800911222b1493 (MD5) Publico-00268b.pdf: 2029279 bytes, checksum: 0ce31c253ab625a6b402e5c0b4abffe0 (MD5) / O vírus da febre aftosa (FMDV), um patógeno que afeta animais no mundo todo, possui um RNA genômico de fita simples que, após infectar a célula, é imediatamente traduzido numa única poliproteína. Esta poliproteína produzida é processada durante a síntese em várias proteínas maduras através de peptidases codificadas pelo próprio vírus. A primeira clivagem da poliproteína viral é realizada pela Lbpro entre sua própria região C-terminal e a região N-terminal da proteína VP4. Lbpro também cliva especificamente dois homólogos dos fatores eucarióticos de iniciação (eIF) 4G, resultando na supressão da translação proteica do hospedeiro realizadas através dos mRNAs cap-dependentes. Consequentemente, o RNA do FMDV, que inicia a tradução via IRES, e não requer o eIF4G intacto, pode usar livremente a maquinaria de síntese protéica do hospedeiro para tradução viral. Nós usamos uma série de peptídeos fluorogênicos desenhados especificamente para examinar a especificidade por substratos, efeitos do pH e força iônica sobre a atividade catalítica da Lbpro e sua mutante sLbpro. Comparadas com outras cisteínos peptidases, como a papaína e catepsinas, Lbpro e sLbpro possuem muitas caracteríticas únicas como alta sensibilidade à sais e um sítio de ligação ao substrato muito específico, extendendo-se até a posição P7. Análises de dados estruturais mostraram que Lbpro liga os resíduos P1-P3 do substrato em uma conformação extendida, enquanto os resíduos P4-P7 são ligados numa curta hélice 310. A especificidade da Lbpro, revelada através dos peptídios substituídos pode ser explicada para todas as posições, exceto para P5. / Foot-and-mouth disease virus (FMDV), a global animal pathogen, possesses a single-stranded RNA genome that, on release into the infected cell, is immediately translated into a single polyprotein. This polyprotein product is cleaved during synthesis by proteinases contained within it into the mature viral proteins. The first cleavage is performed by the leader protease (Lbpro) between its own C-terminus and the N-terminus of VP4. Lbpro also specifically cleaves the two homologues of the cellular eukaryotic initiation factor (eIF) 4G, resulting in shut-off of host capdependent mRNA translation. Consequently, FMDV RNA, which initiates translation via IRES, and does not require intact eIF4G, can freely use the host protein synthesis machinery for viral protein synthesis. We used a panel of specifically designed fluorogenic peptides to examine the substrate specificity, effects of pH and ionic strength on Lbpro activity and of its shorter mutant sLbpro. Compared with other cysteine peptidases, how papain and the cathepsins, Lbpro and sLbpro possesses several unusual characteristics, including a high sensitivity to salt and a very specific substrate binding site extending up to P7. Indeed, almost all substitutions investigated were detrimental to Lbpro and sLbpro activity. Analysis of structural data showed that Lbpro binds residues P1 to P3 in an extended conformation whereas residues P4 to P7 are bound in a short 310 helix. The specificity of Lbpro as revealed by the substituted peptides could be explained for all positions except P5. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2016-01-07T13:38:16Z (GMT). No. of bitstreams: 2 deborah_santos_ioc_mest_2014.pdf: 10969644 bytes, checksum: 767880a24fd7903b2215b63c1c7ac752 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A Leishmania (Leishmania) amazonensis é um importante agente etiológico da leishmaniose tegumentar em humanos no Brasil. Este parasito apresenta mecanismos de adaptação que podem ser guiados por suas proteases onde se destacam as cisteíno-proteases (CP), sendo a CPB a mais estudada dentre as CPs já descritas em Leishmania spp. O foco deste trabalho é a região COOH-terminal da CPB (cyspep), por suas reconhecidas propriedades modulatórias sobre o sistema imune de camundongos. No presente estudo busca-se propor um modelo estrutural da cyspep visando estabelecer sua relação estrutura-função. O estudo foi conduzido por abordagem in silico, desenvolvendo o modelo tridimensional através de técnicas de modelagem comparativa, threading e métodos de novo, e analisando a estabilidade estrutural por dinâmica molecular. A associação do uso de servidores online que utilizam as abordagens de modelagem comparativa, threading e métodos de novo para predição tridimensional de proteínas foi favorável à resolução de 72 modelos da cyspep. Através de informações sobre predição de estrutura secundária e ligações dissulfeto, dos modelos gerados para cyspep, 11 foram selecionados para simulações de dinâmica molecular, sendo dois modelos obtidos por modelagem comparativa (Comp, Fugue), 5 por threading (IT1, M4, M8, L3 e SP5) e 4 por métodos de novo (Q5, Q7, D9 e R1) Os 11 modelos foram submetidos a simulação por dinâmica molecular por um tempo de 200 ns. Os modelos Fugue e IT1 também foram submetidos a simulações de dinâmica molecular sob a influência de diferentes campos de força para melhor avaliar seu conteúdo de estrutura secundária. Nossos resultados sugerem que a cyspep pode adotar uma conformação composta principalmente de folhas\2212\03B2, as quais se mantiveram estáveis após longas simulações de dinâmica molecular sob a influência de diferentes campos de força; enquanto o teor helicoidal foi rapidamente desfeito. Ainda com relação as estruturas em folha\2212\03B2, não foi possível observar padrões de dobras consenso entre diferentes modelos. Embora os procedimentos usados neste trabalho para predição de ligações de dissulfeto indicarem a possiblidade de 36 ligações entre os resíduos de cisteína (Cys17, Cys21, Cys31, Cys44, Cys52, Cys59, Cys65, Cys73 e Cys85) não foi possível constatar um consenso na predição dessas ligações / Leishmania (Leishmania) amazonensis is an important etiological agent of cutaneous leishmaniasis in humans, in Brazil. This parasite has adaptive mechanisms that can be modulated by their proteases, characterizing the cysteine protease (CP) as the most extensively studied CPB among the CPs described for Leishmania spp. This work was focused on the COOH -terminal region of CPB (cyspep), recognized for their modulatory properties on the immune system of mice. This present study aims to propose a structural model for the cyspep trying to determine its structure-function relationship. The present study was conducted by in silico to develop a three-dimensional model using comparative modeling, threading and de novo methods, and molecular dynamics to analyze its structural stability. The association of many online servers using the approaches of comparative modeling, threading and de novo methods for the prediction of the three-dimensional structure of protein was favorable for the achievement of 72 three-dimensional models for cyspep. Through secondary structure and disulfide bonds prediction, out of the 72 models generated for cyspep, 11 were selected for molecular dynamics simulations, of which 2 models were obtained by comparative modeling (Comp, Fugue), 5 by threading (IT1, M4, M8, L3 and SP5) and 4 de novo methods (Q5, Q7, D9 and R1). The eleven models were submitted to molecular dynamics simulations for a computational time of 200 ns. The Fugue and IT1 models were also subjected to molecular dynamics simulations under different force fields to better assess their secondary structure content and determine the impact of the force field on the structure. Our results suggest that the cyspep might adopt a conformation composed of mostly β-sheets, which remained stable after long molecular dynamics simulations under the influence of different force fields while the helical content was rapidly disrupted. However, it was not possible to recognize a consensus of folding patterns among the various created models. Additionally, although the procedures used in this work for predicting disulfide bonds indicated the possibility of 36 bonds between cysteine residues (Cys17, Cys21, Cys31, Cys44, Cys52, Cys59, Cys65, Cys73 and Cys85) we could not observe a consensus upon the prediction of these bonds

Made available in DSpace on 2016-03-01T13:55:36Z (GMT). No. of bitstreams: 2 raquel_souza_ioc_mest_2015.pdf: 4865061 bytes, checksum: 9a40ccd1742323bfd705d91b20d8f29a (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A Leishmania (Leishmania) amazonensis apresenta mecanismos de adaptação guiados por suas proteinases. Neste contexto, destacam-se as cisteína proteinases (CPs) onde a cisteína proteinase B (CPB) é a CP mais estudada dentre as CPs deste parasito. O foco deste trabalho é a região COOH-terminal da CPB (cyspep), gerada a partir do processamento final desta proteinase. O estudo foi conduzido em cinco fases: obtenção da cyspep recombinante (rcyspep); avaliação da antigenicidade da rcyspep em camundongos experimentalmente infectados com L.(L.) amazonensis; diferenciação in vitro dos promastigotas em amastigotas; avaliação da expressão do gene cpb ao longo da diferenciação do parasito; e detecção da cyspep nas formas promastigotas e amastigotas do parasito. O polipeptídeo rcyspep, de 14 kDa, foi obtida em sistema pET28-a e purificado para posterior produção de anticorpos policlonais específicos em camundongos. Observou-se que, durante a infecção em camundongos, há uma resposta imune humoral contra o rcyspep, caracterizada por um aumento da detecção de anti-cyspep quando comparado com animais de controle (p <0,05). Nos ensaios de diferenciação constatamos três padrões morfológicos ao logo de 96 horas de análise, em uma cinética temporal: formas alongadas com flagelo livre, arredondados com flagelo e arredondadas sem flagelo por microscopia. Adicionalmente a cultura foi analisada por citometria de fluxo demonstrando uma migração gradual da população da região R1 para região R2 do dotplot indicando uma diminuição no tamanho e aumento da granulosidade celular. Observamos que ao longo desta diferenciação ocorre um aumento da quantidade de transcritos do gene cpb, nos tempos de 48 horas (1,3 ×), 72 horas (3,2 ×) e 96 horas (3,4 ×) nas preparações de cDNA dos parasitos, quando comparada com os resultados de quantificação realizados com preparações de cDNA dos promastigotas Na continuidade deste trabalho, o anti-rcyspep foi utilizado como ferramenta nos estudos de detecção da proteína em preparações de promastigotas e amastigotas obtidas por fracionamento subcelular e no sobrenadante de cultivo por ensaios de ressonância plasmônica de superfície. Os sensorgramas obtidos nestes ensaios revelaram valores de RU de dissociação, indicativos do reconhecimento do anti-rcyspep em todas as preparações do parasito. Constatamos que as proteínas das preparações de membrana e flagelo de ambas as formas têm menor propriedade de ligar a IgG anti-rcyspep. Dentre estas, as preparações de proteína de membrana de amastigota apresentaram os menores valores de Ksat. Por outro lado, os sobrenadantes de cultivo dos promastigotas e amastigotas apresentaram menores quantidades de proteínas reagentes a IgG anti-rcyspep. Adicionalmente, constatamos que as proteínas do parasito reconhecidas pela IgG anti-rcyspep que ligam ao E-64 foram melhor detectadas nas preparações de sobrenadante de cultura de promastigotas (1,4 x 10-2 ng/mm2). O conjunto dos resultados deste trabalho indica que amastigotas de L. (L.) amazonensis apresentam maior expressão de gene cpb do que promastigota e que ambas as formas lançam o polipeptídio cyspep para o meio extracelular, porém apenas os promastigotas lançam este polipeptídio ainda associada à enzima CPB / Leishmania (Leishmania) amazonensis presents adaptive me chanisms guided by their proteinases. In this context, we highlight the cysteine proteinases (CPs) where the cysteine proteinase B (CPB) is the most studied CP among these parasites. The focus of this work is the COOH - terminal region of CPB (cyspep), gener ated during the final processing stage of this proteinase. Our study comprises five main phases: obtaining of a recombinant cyspep polypeptide (rcyspep); evaluation of the antigenicity of rcyspep in mice experimentally infected with L. (L.) amazonensis ; in vitro differentiation of promastigotes into amastigotes; evaluation of cpb gene expression throughout morphological differentiation of the parasite; and detection of cyspep in promastigotes and amastigotes of L. (L.) amazonensis. The rcyspep polypeptide, with 14 kDa, was obtained using a pET28 - a system and, subsequently, specific polyclonal antibodies were produced by inoculation in mice. We observed that, during mice infection, there is a humoral immune response against rcyspep, characterized by an increa se in detection of anti - cyspep when compared to control animals (p<0.05). During differentiation assays three morphological patterns could be observed over 96 hours of observation: elongated shapes with free flagellum, rounded shapes with free flagellum an d rounded shapes without visible flagellum. The data point to a gradual migration of the population of parasites from region R1 to r egion R2 into the dotplot indicating a decrease in size and increase in cell granularity. We observed that alongside the mor phological differentiation there is an increase in the amount of cpb gene transcripts, in time of 48 hours (1.3 ×), 72 hours (3.2 ×) and 96 hours (× 3.4), compared with quantitation results obtained with cDNA of promastigotes. Purified anti - rcyspep IgGs we re lately used as a tool to detect cyspep in subcellular fractions and culture supernatants of promastigote and amastigote by surface plasmon resonance assays. The sensorgram obtained from these assays indicate RU dissociation values that detect the recogn ition of anti - parasite rcyspep in all preparations. We noticed that membrane and flagellum protein extracts of both parasite forms present lower capacity to interact with anti - rcyspep IgG. The interaction coefficients of each sample with anti - rcyspep IgG w ere analyzed and we could observe that amastigote membrane protein preparations have lower Ksat values. Comparatively, the culture supernatants of amastigotes and promastigotes exhibited lower p roportions of rcyspep anti - IgG - binding proteins. Additionally, we found that parasite proteins were recognized by anti - IgG rcyspep that bind to E - 64 were best detected in promastigote culture supernatant preparations, 1.4 x 10 - 2 ng/mm2 on the chip. Collectively the results indicate that amastigotes of L. (L.) amazone nsis exhibit hi gher expression of cpb gene that promastigote and that both forms releases the polypeptide cyspep to the extracellular environment, but only promastigotes releases that polypeptide still associated with CPB enzyme

VIANA, Carolina de Araújo. Caracterização bioquímica da atividade pró-coagulante de proteases de fluidos laticíferos. 2011. 119 f. Dissertação (mestrado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2011. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-03-31T18:14:07Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_caviana.pdf: 8725116 bytes, checksum: 767aa06f3d14be0e807d03f424c5c370 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-05-18T19:57:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_caviana.pdf: 8725116 bytes, checksum: 767aa06f3d14be0e807d03f424c5c370 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-18T19:57:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_caviana.pdf: 8725116 bytes, checksum: 767aa06f3d14be0e807d03f424c5c370 (MD5) Previous issue date: 2011 / Latex proteases have grown in attention because of their ability to exhibit both thrombin and plasmin-like effects. In this study, the plant latex proteins Calotropis procera (CpLP), Cryptostegia grandiflora (CgLP) and Plumeria rubra (PrLP) were investigated in terms of these activities. For both samples were investigated for their fibrinogenolytic and fibrinolytic activity in human plasma and by incubation with human fibrinogen by measuring the clotting time, electrophoretic or spectrophotometric assays and diffusion in agarose gel. In vivo effect of CpLP on clot formation of plasma of healthy and septic mice that have been experimentally infected with Salmonella enterica serovar Typhimurium was also studied. Groups of five mice were treated with CpLP (30 mg/Kg), S. enterica (107 CFU/mL) or CpLP 24 h prior bacteria. After sacrificing animals, blood samples were examined for coagulation time, platelet content and protein profile. The protein fractions of C. procera exhibiting proteolytic activity were capable to hydrolyze fibrinogen similar to thrombin, while the protein fractions of Cr. grandiflora exhibiting proteolytic activity were capable to hydrolyze fibrinogen similar to plasmin. The samples exhibited fibrinogenolytic activity in a dose and time manner, but were not able to dissolve the fibrin clot. Procoagulant activity was eliminated by inhibition of latex proteases with cysteine proteinase inhibitor E-64. Pepstatin, PMSF and EDTA were not inhibitory. Time of clot formation of plasma in septic mice and platelet content were consistently reduced as compared to healthy animals. CpLP exhibited antagonistic effects. It statistically reversed the effects of sepsis on clot-time formation associated to preservation on platelet content. However, CpLP exhibited opposite effect on non-septic mice, inducing faster clot formation, compared to healthy animals but without changing platelet content. Results reported in this work confirm fibrinogenolytic activity associated to cysteine proteases of latex and show a very intriguing in vivo protective activity of CpLP on platelet content on septic animals with apparent benefit effect against disseminated vascular coagulation, a pivotal event associated to lethal sepsis. This effect was however not observed when CpLP was given to healthy animals. / As proteases de látex têm atraído atenção devido à habilidade de exibir atividades semelhantes à trombina e à plasmina. Neste estudo, as proteínas do látex das plantas Calotropis procera (CpPL), Cryptostegia grandiflora (CgPL) e Plumeria rubra (PrPL) foram avaliadas em termos destas atividades. Para tanto, as amostras foram investigadas quanto as suas atividades fibrinogenolíticas e fibrinolíticas, em plasma humano e por incubação com fibrinogênio humano através da medida do tempo de coagulação, ensaios eletroforéticos, espectrofotométricos, ou de difusão em gel de agarose. O efeito de CpPL in vivo, sobre o tempo de coagulação no plasma de camundongos saudáveis ou sépticos, que foram experimentalmente infectados com a bactéria Salmonella enterica sorotipo Typhimurium, também foi estudado. Grupos de cinco camundongos foram tratados com CpPL (30 mg/Kg), S. enterica (107 UFC/mL) ou CpPL 24 h antes da inoculação bacteriana. Depois do sacrifício dos animais, as amostras de sangue foram examinadas quanto ao tempo de coagulação, conteúdo de plaquetas e perfil protéico. As frações protéicas de C. procera exibindo atividade proteolítica foram capazes de hidrolisar o fibrinogênio de forma similar à trombina, enquanto que as frações protéicas de Cr. grandiflora exibindo atividade proteolítica foram capazes de hidrolisar o fibrinogênio de forma similar à plasmina. As amostras exibiram atividade fibrinogenolítica de forma dose e tempo dependente, mas não foram capazes de dissolver totalmente o coágulo de fibrina. As atividades fibrinogenolíticas foram eliminadas pela inibição das proteases dos látices com E-64, um inibidor de protease cisteínica. Pepstatina, PMSF e EDTA não se mostraram inibitórios. O tempo de formação do coágulo no plasma de camundongos sépticos e o conteúdo de plaquetas foram consistentemente reduzidos quando comparados aos animais saudáveis. CpPL exibiu efeitos antagonistas. Foi capaz de reverter, estatisticamente, o efeito da sepse no tempo de formação do coágulo associado à preservação do conteúdo de plaquetas. Contudo, CpPL exibiu efeito oposto em camundongos não sépticos, induzindo rápida formação do coágulo, comparado aos animais saudáveis, porém sem alterar o conteúdo de plaquetas. Os resultados relatados neste trabalho confirmam a atividade fibrinogenolítica associada a proteases cisteínicas de látex e mostram uma efeito protetor in vivo muito intrigante de CpPL no conteúdo de plaquetas em animais sépticos, com aparentes efeitos benéficos contra a coagulação intravascular disseminada, um evento crucial associado à sepse letal. Este efeito, porém, não foi observado quando CpPL foi dado aos animais saudáveis.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-06-27T04:22:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 345765.pdf: 1663042 bytes, checksum: f22ad918f66ad46925ac96dc3733d829 (MD5) Previous issue date: 2017 / O vírus da hepatite C (HCV) é um vírus RNA simples, com diferentes genótipos e subtipos. Aproximadamente 350 mil pessoas infectadas por HCV morrem por ano no mundo. O tratamento objetiva eliminar o HCV e prevenir complicações hepáticas. É eficiente quando alcançada a resposta viral sustentada (RVS). Em 2013, novos antivirais inibidores de protease (IP), telaprevir TVR e boceprevir (BOC), foram incorporados ao SUS. No entanto, a prática clínica foi insatisfatória e, rapidamente, esses IP foram substituídos por novos fármacos. Este trabalho objetivou analisar os eventos adversos (EA) e a efetividade do tratamento com TVR e BOC em pacientes com hepatite C, no Polo de Aplicação e Monitoramento de Medicamentos Injetáveis do Hospital Nereu Ramos (PAMMI/HNR), Florianópolis - SC. Foi realizado estudo de coorte retrospectivo observacional, com análise descritiva e estatística, baseado nos registros de prontuários, durante o período de 2012 a 2015. Foram incluídos 209 pacientes, dos quais 63,2% utilizaram TVR e 36,8% utilizaram BOC. Os EA foram semelhantes em ambos. Cerca de 90% dos pacientes apresentaram EA hematológicos. 63% necessitaram fazer uso eritropoietina, 28% de filgrastima e 9% de transfusão. Os demais eventos foram reações de pele (TVR-87% e BOC-70%), náuseas (TVR?69% e BOC-80%), alterações de humor (TVR?60% e BOC-66%) e diarreia (TVR-42% e BOC-39%). Não houve diferença estatisticamente significativa para RVS entre os dois tratamentos. O total de pacientes que concluíram o tratamento foi de 149 (71,3%), sendo que 60 (28,7%) interromperam o tratamento, 28 (13,4%) por evento adverso e 28 (13,4%) por não resposta ao tratamento. A taxa de abandono foi de 2,4% e 11,9% dos pacientes apresentaram recidiva. Ocorreu um óbito. A RVS por intenção de tratar foi de 62,8% para os tratados com TVR e de 55,8% para os tratados com BOC. Cirrose e tratamento prévio foram fatores associados a uma menor RVS. Por fim, observou-se que os IP aumentaram a efetividade do tratamento em relação à terapia com interferon peguilado e ribavirina, mas induziram um maior número de EA.<br> / Abstract : Hepatitis C virus (HCV) is a single stranded RNA vírus with different genotypes and subtypes. About 350,000 people infected with HCV die every year around the world. The treatment aims to eliminate HCV and prevent liver complications and is effective when achieve sustained viral response (SVR). In 2013 new antiviral protease inhibitors (PI), telaprevir (TVR) and boceprevir (BOC), were incorporated into brazilian Public Health System (SUS). However, the clinical practice of PI was unsatisfactory, leading to the replacement of these PI by new drugs. Thus, the present study aimed to analyze the adverse events (AE) and an effectiveness of HCV treatment with TVR and BOC at the ambulatory service of Nereu Ramos Hospital, in Florianopolis-SC. A retrospective observational cohort study was conducted. A descriptive and statistical analysis were performed, based on medical records, between 2012 and 2015. Were included 209 patients, 63.2% used TVR and 36.8 % BOC. The AE were similar in both groups. The hematological occurred in 90% of patients, which 63% needed to use erythropoietin, 28% filgrastim and 9% blood transfusion. The SVR was similar between the two treatments. The number of patients who completed the treatment was 149 (71.3%). The therapy discontinuation was 60 (28.7%), which 28 (13.4%) ocurred due adverse events and 28 (13.4%) due no response to the treatment.. The rate of abandonment was 2.4% and relapse 11.9%. One death was reported. SVR by intention to treat was 62.8% to TVR and 55.8% to BOC. Cirrhosis and previous treatments were associated factors with lower SVR. The present study has demonstrated that the PI use increased treatment effectiveness over pegylated interferon and ribavirin therapy, however, induced a greater number of AEs.

Introdução: Rhipicephalus microplus é um parasito importante na bovinocultura. Novas estratégias de controle dependem de um maior entendimento da sua fisiologia e da relação parasito-hospedeiro, e moléculas envolvidas na aquisição e digestão de sangue são alvos interessantes. Objetivo: determinar o mecanismo de ação do inibidor de coagulação BmGTI (Boophilus microplus Midgut Thrombin Inhibitor). Metodologia: BmGTI foi obtido a partir do homogenato de intestino de fêmeas de R. microplus parcialmente ingurgitadas utilizando técnicas de cromatografia de troca iônica, gel filtração e afinidade por trombina. A atividade inibitória foi monitorada pelo ensaio de coagulação do fibrinogênio induzida por trombina. A preparação de BmGTI foi avaliada por SDS-PAGE e analisada por LC-MS/MS. A provável ORF de BmGTI foi clonada no plasmídeo pPIC9, expressa em Pichia pastoris e purificada. Diferentes razões molares de trombina:rBmGTI foram examinadas para atividade inibitória de trombina sobre a clivagem do fibrinogênio em pH 7,5. E64 foi usado para bloquear o sítio ativo de rBmGTI e o ensaio de inibição foi realizado. Diferentes razões molares de trombina:rBmGTI foram incubadas e analisadas por SDS-PAGE para verificar interações entre as proteases. A atividade de rBmGTI sobre o fibrinogênio foi analisada pela incubação de ambos. Resultados e Discussão: Baseado na m/z dos fragmentos trípticos de BmGTI sua sequência foi identificada como BmCL1, uma catepsina Llike protease ativa em pH ácido, mas sem capacidade de hidrolisar substrato sintético em pH ≥7,0. rBmCL1/BmGTI foi expressa em P. pastoris como próenzima e após ativação, a enzima foi purificada. Diferentes razões molares de trombina:rBmCL1/BmGTI foram ensaiadas; quando a concentração de rBmCL1/BmGTI estava 64 vezes maior do que a de trombina, esta apresentou atividade residual de 37%. Quando rBmCL1/BmGTI teve seu sítio ativo bloqueado por E64, não houve inibição da atividade de trombina sobre fibrinogênio. A análise do fibrinogênio por SDS-PAGE, após incubação com rBmCL1/BmGTI, mostrou que as cadeias α e β do fibrinogênio são hidrolisadas. Conclusão: A partir destes resultados, concluímos que BmGTI inibe a coagulação sanguínea pela hidrólise das cadeias α e β do fibrinogênio. / Introduction: Rhipicephalus microplus is an important parasite of cattle. New strategies for control depend on a better knowledge of its physiology and hostparasite relationship, and molecules involved in acquisition and digestion of blood meal are interesting targets. Objectives: to determine how BmGTI (Boophilus microplus Midgut Thrombin Inhibitor) inhibits coagulation. Materials and Methods: BmGTI was obtained from partially engorged females midguts homogenate through ion exchange, size exclusion and thrombin-affinity chromatographies. Thrombin inhibition activity was measured by thrombin-induced fibrinogen clotting assay. BmGTI preparation was checked by SDS-PAGE and analyzed by LCMS/ MS. BmGTI putative ORF was cloned in pPIC9 plasmid, expressed in Pichia pastoris and purified. Different molar ratios of thrombin:BmGTI were examined for inhibitory activity of thrombin upon fibrinogen cleavage at pH 7.5. E64 was used to block BmGTI active site and inhibitory activity was assayed. Different molar ratio of thrombin:BmGTI were incubated and analyzed by SDS-PAGE to verify proteaseinhibitor interactions. BmGTI direct activity upon fibrinogen was analyzed after incubation by SDS-PAGE. Results and Discussion: Based on m/z of the BmGTI tryptic fragments it was identified as BmCL1, a cathepsin L-like proteinase active at acidic pH, but unable to hydrolyze synthetic substrate at pH ≥7.0. BmCL1/BmGTI was expressed in P. pastoris as pro-enzyme and after activation the enzyme was purified. Different molar ratios of thrombin:rBmCL1/BmGTI were assayed, and when rBmCL1/BmGTI concentration was 64-fold higher than thrombin concentration, this enzyme residual activity was 37%. When rBmCL1/BmGTI has its active site blocked with E-64, it was unable to inhibit thrombin activity upon fibrinogen. Analysis by SDS-PAGE of fibrinogen after incubation with rBmCL1/BmGTI showed that fibrinogen chains α and β were hydrolyzed. Conclusion: Based on these results, we concluded that rBmGTI/BmCL1 inhibits blood coagulation through hydrolyzes of fibrinogen chain- α and β.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. / Made available in DSpace on 2012-10-20T21:39:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 190352.pdf: 281352 bytes, checksum: b4a4269a93a10bd03c26a7e3343b8c16 (MD5)

Orientador: Prof. Dr. Iara José de Mesias Reasson / Orientador: Prof. Dr. Angelica B. Winter Boldt / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Medicina Interna. Defesa : Curitiba, 23/05/2014 / Inclui referências / Linha de pesquisa: Associação genética a doenças / Resumo: MASP-2, a serina protease 2 associada à lectina ligante de manose ou ficolinas, é uma proteína-chave na ativação da via das lectinas do complemento. Diversos polimorfismos do gene MASP2 estão associados com concentrações séricas ou grau de atividade funcional de MASP-2. Neste trabalho, investigamos uma possível associação entre polimorfismos de MASP2 e concentrações séricas de MASP-2 com a suscetibilidade à febre reumática (FR) e a cardiopatia reumática crônica (CRC). Foram haplotipados 11 polimorfismos de MASP2 utilizando PCR multiplex sequência-específica em 145 pacientes com história de FR provenientes do sul do Brasil (103 com CRC e 42 sem acometimento cardíaco [FRo]) e 290 controles saudáveis. As concentrações de MASP-2 foram determinadas por ensaio de imunoadsorbância enzimática em 145 pacientes e 145 controles. Os polimorfismos p.377A e p.439H, associados à baixa produção de MASP-2, foram negativamente associados à CRC (p=0,02, OR=0,25). Em contraste, haplótipos com quatro polimorfismos, localizados do intron 9 ao exon 12 (CDVR) e associados a concentrações intermediárias de MASP-2, aumentaram a suscetibilidade a CRC (p=0,02, OR=4,9). Apesar disso, as concentrações de MASP-2 foram mais baixas nos pacientes, do que nos controles, provavelmente devido ao consumo da proteína pela ativação da via das lectinas (medianas 253 vs. 321 ng/ml respectivamente, p<0,0001). Logo, polimorfismos de MASP2 associados à concentração sérica de MASP-2 podem atuar como moduladores no desenvolvimento da FR. A elucidação do papel desempenhado por MASP-2 na suscetibilidade a FR poderá auxiliar no desenho de estratégias de prevenção e tratamento da doença. Palavras-chave: Febre reumática; cardiopatia reumática crônica; MASP-2; polimorfismos de MASP2 / Abstract: MASP-2, the serine protease 2 associated with mannose-binding lectin or ficolins, is a key protein in the activation of the lectin pathway of complement. Several MASP2 gene polymorphisms have been associated with serum levels or degree of functional activity of MASP-2. In this work, we investigated a possible association between MASP2 polymorphisms and MASP-2 serum levels with the susceptibility to Rheumatic Fever (RF) and Rheumatic Heart Disease (RHD). We haplotyped 11 MASP2 polymorphisms with multiplex sequence-specific PCR in 145 patients with history of RF from south Brazil (103 with RHD and 42 without cardiac lesion [RFo]) and 290 healthy controls. MASP-2 levels were determined by enzyme-linked immunoadsorbance assay in 145 patients and 145 controls. The p.377A and p.439H polymorphisms, associated with low MASP-2 production, were negatively associated with RHD (p=0.02, OR=0.25). In contrast, haplotypes comprising four polymorphisms, located from intron 9 to exon 12 (CDVR) and associated with intermediate MASP-2 concentrations, increased the susceptibility to RHD (p=0.02, OR=4.9). Nevertheless, MASP-2 levels were lower in patients than in controls, probably due to protein consumption by the activation of the lectin pathway (medians 253 vs. 321 ng/ml, p<0.0001). Thus, MASP2 polymorphisms associated MASP-2 production may act as immune modulators in the development of RF. The elucidation of the role of MASP-2 in RF susceptibility might help in the design of strategies for RF prevention and treatment. Keywords: Rheumatic fever; rheumatic heart disease; MASP-2; MASP2 polimorphysms.