Com o crescimento populacional, a indústria avícola tem se desenvolvido rapidamente, devido à demanda de alimentos. O seu produto possui grande aceitação no mercado mundial, em função do seu valor nutricional e por não existirem restrições culturais. Entretanto, este alimento gera grande quantidade de resíduos, dentre eles, as penas. Elas são compostas principalmente por queratina, substância de difícil degradação. Neste trabalho foram utilizadas duas bactérias queratinolíticas de resíduos da indústria avícola, para se avaliar a capacidade de degradação das mesmas. Foram produzidos hidrolisados de penas por proteólise bacteriana com ambos microrganismos: Bacillus cereus (KR16) e Chryseobacterium sp. (KR6). O crescimento das bactérias em diferentes quantidades de penas, e o fator de degradação das penas comprovaram que em até 5 % obteve-se degradação para KR6, enquanto, para a KR16, obteve-se degradação até 1%. A digestibilidade in vitro dos hidrolisados foi avaliada. Observou-se que o hidrolisado da bactéria KR6 apresentou maior digestibilidade, enquanto o de farinha de penas apresentou o menor valor. A composição de aminoácidos dos hidrolisados foi determinada, sendo observadas baixas concentrações de metionina, histidina e lisina. A partir da digestibilidade in vitro e da composição de aminoácidos, foram calculados o escore de aminoácidos corrigidos (PDCAAs), o coeficiente de eficiência protéica (PER) e o valor biológico (BV). O tratamento das penas com KR6 resultou em hidrolisados com os valores mais altos de PDCAAs, PER e BV, sugerindo que este microrganismo produz hidrolisados com propriedades nutricionais superiores aos demais.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2015-10-29T13:17:38Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1434883 bytes, checksum: e3a26bffc939f9fcea78a9252481f2cd (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-29T13:17:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1434883 bytes, checksum: e3a26bffc939f9fcea78a9252481f2cd (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A resposta de plantas à herbivoria inclui a produção de compostos químicos de defesa como os inibidores de protease e metabólitos secundários, incluindo flavonóides, os quais tornam a folha menos aceitável, reduzindo a alimentação e com efeito negativo na fisiologia de insetos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a resposta fitoquímica de cultivares de soja resistentes a insetos após injúrias mecânicas e por Anticarsia gemmatalis (Hübner, 1818) (Lepidoptera: Noctuidae); além de avaliar o desenvolvimento da lagartas-da-soja alimentadas com sojas resistentes a insetos. Esses cultivares foram injuriados mecanicamente e biologicamente, e amostras dessas plantas foram analisadas em cromatógrafo para identificação e quantificação dos flavonóides. O desenvolvimento da lagarta, incluindo mortalidade e duração da fase imatura foram determinados e os inibidores de proteases foram analisados em espectrofotômetro. Os flavonóides daidzina, rutina e quercetina foram identificados nos folíolos das cultivares de soja IAC-17, IAC-24, resistentes a insetos, e na IAC-PL1 injuriadas mecanicamente e por A. gemmataliis. As cultivares IAC-PL1, IAC-17 e IAC-24 não apresentaram resposta fitoquímica dos flavonóides, após injúria mecânica e por A. gemmatalis (P > 0,05). Também não houve resposta fitoquímica dos flavonóides rutina, daidzina, quercetina, após injúrias biológicas ou mecânicas avaliados ao longo do tempo (P > 0,05). Entre os três flavonóides identificados na soja, a daidzina foi o composto majoritário nas plantas resistentes a insetos IAC-17 e 24 (P > 0,05). Comparando esses compostos entre os três cultivares de soja, a concentração de rutina foi maior na soja resistente a inseto IAC-24 em relação à susceptível IAC-PL1 e a IAC- 17 resistente (P > 0,05). A concentração de daidzina foi maior nas cultivares de soja resistentes em relação a susceptível. A concentração de rutina foi igual entre as três cultivares de soja. A mortalidade de A. gemmatalis foi maior em cultivares de soja resistentes a insetos IAC-17 e 24. A maior duração da fase larval de ocorreu em sojas resistentes. Conclui-se que as cultivares de soja, independentemente de injurias mecânicas, produzem flavonóides como uma defesa constitutiva. O desenvolvimento de A. gemmatalis é afetada por cultivares de soja resistentes a insetos como IAC – 17 e 24. / The plant herbivory response includes the production of defensives chemical compounds such as protease inhibitors and secondary metabolites including flavonoids, which makes it less acceptable sheet feeding and reducing the negative effect on insect physiology. The objective of this study was to evaluate the phytochemical response of resistant soybean cultivars insect after mechanical injuries and caused by Anticarsia gemmatalis (Hübner, 1818) (Lepidoptera: Noctuidae); in addition to evaluate the development of soybean caterpillar fed with soybeans resistant to insects. These cultivars were injured mechanically and biologically, and samples of these plants were analyzed in chromatography in order to identifying and quantifying flavonoids. The development of the caterpillar its mortality and length of the immature stage were determined, and the protease inhibitors were analyzed in a spectrophotometer. The flavonoids daidzin, rutin and quercetin were identified in the leaflets of the IAC-17 and IAC-24 soybean cultivars, insect resistant, and in IAC-PL1 injured mechanically and by A. gemmatalis. The IAC-PL1, IAC-17 and IAC-24 didn’t show phytochemical response of flavonoids, after injury caused mechanically and by A. gemmatalis (P > 0.05). Also there was not phytochemical response of flavonoids rutin, daidzin, querceitna after biological or mechanical injuries assessed over time (P > 0.05). Among the three flavonoids identified in soybean, daidzin was the major compound in the resistant plants to insects, IAC-17 and 24 (P <0.05). And comparing these compounds between the three soybean cultivars, the concentration of rutin was higher in insect resistant soybeans, IAC-24, compared to susceptible IAC-PL1 and the resistant IAC- 17 (P > 0.05). The concentration of daidzin was higher in soybean cultivars resistant against susceptible. The concentration of rutin was equal between the three soybean cultivars. The mortality of A. gemmatalis, was higher in soybean cultivars resistant to IAC-17 and 24. The longest duration of larval phase occurred in resistant soybeans. It is concluded that the soybean cultivars, regardless of mechanical injuries, produce flavonoids as a constitutive defense. The development of A. gemmatalis is affected by soybean cultivars resistant to insects, such as IAC – 17 and 24.

Introdução: Rhipicephalus microplus é um parasito importante na bovinocultura. Novas estratégias de controle dependem de um maior entendimento da sua fisiologia e da relação parasito-hospedeiro, e moléculas envolvidas na aquisição e digestão de sangue são alvos interessantes. Objetivo: determinar o mecanismo de ação do inibidor de coagulação BmGTI (Boophilus microplus Midgut Thrombin Inhibitor). Metodologia: BmGTI foi obtido a partir do homogenato de intestino de fêmeas de R. microplus parcialmente ingurgitadas utilizando técnicas de cromatografia de troca iônica, gel filtração e afinidade por trombina. A atividade inibitória foi monitorada pelo ensaio de coagulação do fibrinogênio induzida por trombina. A preparação de BmGTI foi avaliada por SDS-PAGE e analisada por LC-MS/MS. A provável ORF de BmGTI foi clonada no plasmídeo pPIC9, expressa em Pichia pastoris e purificada. Diferentes razões molares de trombina:rBmGTI foram examinadas para atividade inibitória de trombina sobre a clivagem do fibrinogênio em pH 7,5. E64 foi usado para bloquear o sítio ativo de rBmGTI e o ensaio de inibição foi realizado. Diferentes razões molares de trombina:rBmGTI foram incubadas e analisadas por SDS-PAGE para verificar interações entre as proteases. A atividade de rBmGTI sobre o fibrinogênio foi analisada pela incubação de ambos. Resultados e Discussão: Baseado na m/z dos fragmentos trípticos de BmGTI sua sequência foi identificada como BmCL1, uma catepsina Llike protease ativa em pH ácido, mas sem capacidade de hidrolisar substrato sintético em pH ≥7,0. rBmCL1/BmGTI foi expressa em P. pastoris como próenzima e após ativação, a enzima foi purificada. Diferentes razões molares de trombina:rBmCL1/BmGTI foram ensaiadas; quando a concentração de rBmCL1/BmGTI estava 64 vezes maior do que a de trombina, esta apresentou atividade residual de 37%. Quando rBmCL1/BmGTI teve seu sítio ativo bloqueado por E64, não houve inibição da atividade de trombina sobre fibrinogênio. A análise do fibrinogênio por SDS-PAGE, após incubação com rBmCL1/BmGTI, mostrou que as cadeias α e β do fibrinogênio são hidrolisadas. Conclusão: A partir destes resultados, concluímos que BmGTI inibe a coagulação sanguínea pela hidrólise das cadeias α e β do fibrinogênio. / Introduction: Rhipicephalus microplus is an important parasite of cattle. New strategies for control depend on a better knowledge of its physiology and hostparasite relationship, and molecules involved in acquisition and digestion of blood meal are interesting targets. Objectives: to determine how BmGTI (Boophilus microplus Midgut Thrombin Inhibitor) inhibits coagulation. Materials and Methods: BmGTI was obtained from partially engorged females midguts homogenate through ion exchange, size exclusion and thrombin-affinity chromatographies. Thrombin inhibition activity was measured by thrombin-induced fibrinogen clotting assay. BmGTI preparation was checked by SDS-PAGE and analyzed by LCMS/ MS. BmGTI putative ORF was cloned in pPIC9 plasmid, expressed in Pichia pastoris and purified. Different molar ratios of thrombin:BmGTI were examined for inhibitory activity of thrombin upon fibrinogen cleavage at pH 7.5. E64 was used to block BmGTI active site and inhibitory activity was assayed. Different molar ratio of thrombin:BmGTI were incubated and analyzed by SDS-PAGE to verify proteaseinhibitor interactions. BmGTI direct activity upon fibrinogen was analyzed after incubation by SDS-PAGE. Results and Discussion: Based on m/z of the BmGTI tryptic fragments it was identified as BmCL1, a cathepsin L-like proteinase active at acidic pH, but unable to hydrolyze synthetic substrate at pH ≥7.0. BmCL1/BmGTI was expressed in P. pastoris as pro-enzyme and after activation the enzyme was purified. Different molar ratios of thrombin:rBmCL1/BmGTI were assayed, and when rBmCL1/BmGTI concentration was 64-fold higher than thrombin concentration, this enzyme residual activity was 37%. When rBmCL1/BmGTI has its active site blocked with E-64, it was unable to inhibit thrombin activity upon fibrinogen. Analysis by SDS-PAGE of fibrinogen after incubation with rBmCL1/BmGTI showed that fibrinogen chains α and β were hydrolyzed. Conclusion: Based on these results, we concluded that rBmGTI/BmCL1 inhibits blood coagulation through hydrolyzes of fibrinogen chain- α and β.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, 2014. / Submitted by Larissa Stefane Vieira Rodrigues (larissarodrigues@bce.unb.br) on 2015-02-06T13:03:02Z No. of bitstreams: 1 2014_KleberVânioGomesBarros.pdf: 1798973 bytes, checksum: d4bbf2bd5af07663a0994e98cdd68737 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-02-20T18:50:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_KleberVânioGomesBarros.pdf: 1798973 bytes, checksum: d4bbf2bd5af07663a0994e98cdd68737 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-20T18:50:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_KleberVânioGomesBarros.pdf: 1798973 bytes, checksum: d4bbf2bd5af07663a0994e98cdd68737 (MD5) / O desenvolvimento de metologias que permitam a purificação de biomoléculas de interesse industral é alvo de estudo devido sua importância comercial. Foi avaliada a purificação de proteases produzidas pelos fungos isolados do Cerrado, Penicillium fellutanum e Penicillium restrictum por extração líquido-líquido em sistema de duas fases aquosas (ATPS), composto por polietilenoglicol (PEG) e poliacrilato de sódio (NaPA). As duas fases no ATPS NaPA/PEG foram formadas através da mistura dos polímeros com um sal (NaCl) e caldo fermentado de P. fellutanum ou P. restrictum. Para os sistemas formados com o caldo fermentado de P. restrictum foram estudados o efeito da massa molar de PEG (2000, 4000 e 6000 g.mol-1), concentração de PEG (4, 6, 8 e 10% p/p), concentração de NaPA (4, 6, 8, 10, 15 e 20% p/p) e concentração do caldo fermentado (25, 35 e 45% p/p) na partição da enzima a 25 °C. Os valores do coeficiente de partição (K) obtidos variavam de 0,06 a 37,73, mostrando a versatilidade do método para a purificação da biomolécula sob investigação. Na maioria dos sistemas analisados conseguiu-se a partição da biomolécula de interesse para a fase oposta àquela das proteínas totais, proporcionando assim efetiva purificação da enzima. O maior K (partição preferencial na fase rica PEG) foi obtido usando-se: concentração de NaPA igual a 20% p/p, concentração de PEG 2000gmol-1 igual a 4% p/p e concentração de caldo fermentado igual a 45% p/p. Para grande número dos sistemas analisados foram obtidos elevados valores referentes ao balanço de massa (BM) indicando a estabilidade da enzima em relação aos componentes do sistema. Diversos sistemas analisados apresentaram elevados níveis de rendimentos (η) – alguns acima de 90%. Para os sistemas formados com o caldo fermentado de P. fellutanum foram analisados o efeito da massa molar de PEG (2000, 4000 e 6000 g.mol-1), a concentração de PEG (3, 6, 8 e 10 % p/p) e a concentração de NaPA (6, 8, e 10 % p/p) sobre o coeficiente de partição (K) a 25°C. Também foi analisada a influência da concentração de Na2SO4 (5, 10 e 15% p/p) na reextração da enzima. Os valores do coeficiente de partição K obtidos variaram de 1,21 até 77,51. A partição na fase superior foi maior em sistemas com maior concentração de NaPA, maior massa molar de PEG e menor concentração de PEG. Usando a estratégia de reextração foi possível direcionar a partição da protease para a fase oposta às demais proteínas, proporcionando assim uma etapa de prépurificação da biomolécula. Os resultados obtidos através dos APTS NaPA/PEG e posterior reextração com Na2SO4 demonstraram as potencialidades do método no processo de prépurificação de proteases a partir dos caldos fermentados de P. restrictum e P. fellutanum. ____________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The development of metologias allowing purification of biomolecules of industrial interest is target of study because of its commercial importance. The partition of proteases produced by fungi of the Brazilian Cerrado, Penicillium fellutanum and Penicillium restrictum, in aqueous two-phase system (ATPS) composed of polyethylene glycol (PEG) and sodium polyacrylate (NaPA) was evaluated. The two phases in ATPS NaPA/PEG were formed by mixing the polymers with a salt (NaCl) and fermented broth of P. fellutanum or P. restrictum. For those systems formed with fermented broth of P. restrictum were studied the effect of molecular size of PEG (2000, 4000 and 6000 g.mol-1), PEG concentration (4, 6, 8 and 10% w/w), concentration NaPA (4, 6, 8, 10, 15 and 20% w/w) and fermented broth concentration (25, 35 and 45% w/w) in partitioning of enzyme at 25°C. The values of partition coefficient (K) obtained varied from 0.064 to 37.73, showing the versatility of the method for the purification of the biomolecule under investigation. In most systems examined it was achieved the partition of biomolecule in the opposite phase to that of total proteins and thus provide effective enzyme purification. The highest K (preferential partitioning in PEG-rich phase) was obtained using: 20% w/w of NaPA concentration, 4% w/w of PEG 2000 g.mol-1 and 45% w/w of broth concentration. For large number of systems analyzed, high values of BM were obtained indicating the stability of the enzyme in relation to system components. Several systems analyzed showed high levels of yield (η) - some over 90%. For those systems formed with the fermented broth of P. fellutanum were analysed the effect of molecular size of PEG (2000, 4000 and 6000 g.mol-1), PEG concentration (3, 6, 8 and 10% w/w) and NaPA concentration (6, 8, and 10% w/w) over the partition coefficient (K) at 25°C. It was also analyzed the influence of Na2SO4 concentration (5, 10 and 15% w/w) in the re-extraction of the enzyme. The values of partition coefficient K obtained ranged from 1.21 to 77.51. The partition in the upper layer was greater in systems with higher NaPA concentration, higher PEG molecular weight and lower PEG concentration. By using the re-extraction strategy it was possible to partition the target protease to the opposite phase to the other proteins, thereby providing a pre-purification step of the biomolecule. The results obtained by ATPS NaPA/PEG/NaCl and subsequent re-extraction with Na2SO4 demonstrated the potential of this method in the pre-purification of proteases from the fermentation broth of P. restrictum and P. fellutanum.

Com o crescimento populacional, a indústria avícola tem se desenvolvido rapidamente, devido à demanda de alimentos. O seu produto possui grande aceitação no mercado mundial, em função do seu valor nutricional e por não existirem restrições culturais. Entretanto, este alimento gera grande quantidade de resíduos, dentre eles, as penas. Elas são compostas principalmente por queratina, substância de difícil degradação. Neste trabalho foram utilizadas duas bactérias queratinolíticas de resíduos da indústria avícola, para se avaliar a capacidade de degradação das mesmas. Foram produzidos hidrolisados de penas por proteólise bacteriana com ambos microrganismos: Bacillus cereus (KR16) e Chryseobacterium sp. (KR6). O crescimento das bactérias em diferentes quantidades de penas, e o fator de degradação das penas comprovaram que em até 5 % obteve-se degradação para KR6, enquanto, para a KR16, obteve-se degradação até 1%. A digestibilidade in vitro dos hidrolisados foi avaliada. Observou-se que o hidrolisado da bactéria KR6 apresentou maior digestibilidade, enquanto o de farinha de penas apresentou o menor valor. A composição de aminoácidos dos hidrolisados foi determinada, sendo observadas baixas concentrações de metionina, histidina e lisina. A partir da digestibilidade in vitro e da composição de aminoácidos, foram calculados o escore de aminoácidos corrigidos (PDCAAs), o coeficiente de eficiência protéica (PER) e o valor biológico (BV). O tratamento das penas com KR6 resultou em hidrolisados com os valores mais altos de PDCAAs, PER e BV, sugerindo que este microrganismo produz hidrolisados com propriedades nutricionais superiores aos demais.

Submitted by Daniella Sodre (daniella.sodre@ufpe.br) on 2015-03-26T13:50:28Z No. of bitstreams: 2 Dissertação_Thâmarah_Completo.pdf: 3630312 bytes, checksum: 254c44fa854f1e011380abdfbfb972af (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-26T13:50:29Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação_Thâmarah_Completo.pdf: 3630312 bytes, checksum: 254c44fa854f1e011380abdfbfb972af (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012-04-16 / CNPq, FACEPE, CAPES e UFPE / Nasutitermes corniger é uma espécie de cupim-praga que causa danos em diversas construções. Enzimas digestivas possuem várias aplicações biotecnológicas e podem constituir alvos para o controle de insetos. O presente trabalho descreve a detecção das atividades de celulases (endoglucanase, exoglucanase e β-glicosidase), hemicelulases (β- xilosidase, α-L-arabinofuranosidase e β-xilanase), α-amilase, e proteases (tripsina-símile, quimotripsina-símile, calicreína-símile e do tipo queratinase) em extratos de intestino de operários e soldados de N. corniger. As atividades enzimáticas foram avaliadas após incubação dos extratos de intestino em diferentes temperaturas e valores de pH e com lectinas termiticidas de Myracrodruon urundeuva. A adaptabilidade desta espécie de cupins para digerir materiais lignocelulósicos foi evidenciada pelos altos valores de atividade de endoglucanase e β-xilanase. Zimografia para proteases do extrato de operários revelou que polipeptídeos de 22, 30 e 43 kDa hidrolisaram caseína. Efeito de inibidores na atividade enzimática mostrou que serino proteases foram as principais proteases presentes no intestino de operários e soldados. As atividades tripsina-símile e calicreína-símile foram detectadas em maiores níveis. Os resultados dos ensaios de estabilidade frente ao aquecimento e pH revelam a presença de aparatos digestivos distintos entre operários e soldados. As lectinas de M. urundeuva afetaram diferentemente as atividades enzimáticas e sua atividade termiticida pode estar relacionada com a modulação de enzimas digestivas. O presente trabalho é uma etapa inicial no estudo do aparato digestivo de N. corniger e estimula a purificação e avaliação do potencial biotecnológico dessas enzimas.

Submitted by Luiz Felipe Barbosa (luiz.fbabreu2@ufpe.br) on 2015-04-17T12:58:52Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação BELANY CARVALHO.pdf: 2931157 bytes, checksum: 48cbb637b3658e148b6b38876e14cf11 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-17T12:58:52Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação BELANY CARVALHO.pdf: 2931157 bytes, checksum: 48cbb637b3658e148b6b38876e14cf11 (MD5) Previous issue date: 2013-02-25 / FACEPE / Quimosina bovina é o principal agente coagulante utilizado na manufatura de queijos. Entretanto, a redução da oferta do coalho bovino e a incidência de doenças como a encefalopatia espongiforme (“mal da vaca louca”) tem estimulado a busca por novos agentes coagulantes de leite, tais como preparações contendo proteases de origem vegetal ou microbiana. Este trabalho avaliou uma preparação proteica (PP) obtida de flores de Moringa oleifera quanto às atividades caseinolítica e coagulante de leite, bem como sua aplicação como coagulante para produção de queijo. PP (480 mg de proteínas) apresentou atividade caseinolítica sobre azocaseína (37,5 U) e atividade coagulante de leite (1,9 U). Maior atividade caseinolítica foi detectada após incubação da preparação em pH 7,0 (35,5 U) e pré-aquecimento de PP a 50 ºC (94 U). Avaliação da atividade caseinolítica utilizando caseínas bovinas αs, β e κ revelou que PP promoveu extensa clivagem da caseína κ e baixa hidrólise das demais, apresentando perfil similar à quimosina (controle positivo). A atividade coagulante de leite foi detectada apenas na presença de CaCl2. Maior atividade foi observada em pH 4,0 (2,0 U) e essa atividade permaneceu estável após pré-aquecimento de PP até 50 ºC, sendo perdida após aquecimento a 70 ºC. O aquecimento prévio do substrato a 70 ºC resultou em aumento da atividade coagulante de PP (3,6 U). Ensaios enzimáticos na presença de inibidores de protease indicaram a presença de aspártico, cisteíno e serino proteases. Aspártico proteases são provavelmente as principais enzimas envolvidas na atividade coagulante de leite. A maior especificidade de PP pela caseína κ estimulou sua avaliação como coalho vegetal para a produção de queijo. Queijo coalho produzido utilizando quimosina foi utilizado como controle positivo. O queijo obtido utilizando PP apresentou conteúdo de sal similar e teor de cinzas menor que no queijo feito com quimosina. Ainda, o queijo produzido com PP se mostrou menos firme e apresentou maior umidade (72,34%) e menor conteúdo de proteínas (12,33 g/100 g) que o queijo coalho produzido com quimosina (46,37% e 23,11 g/100g, respectivamente). Com relação às propriedades organolépticas, o queijo produzido com PP foi classificado, predominantemente, como uniforme, branco, levemente ácido, levemente salgado, não-amargo e pouco duro. Em teste de apreciação as notas atribuídas pelos voluntários indicaram o queijo como bom em relação à sabor, textura e odor. Em conclusão: 1) flores de M. oleifera contêm uma mistura de aspártico, cisteíno e serino proteases com atividade caseinolítica; 2) preparação enzimática de flores de M. oleifera apresentou atividade coagulante de leite dependente de cálcio, provavelmente relacionado com a ação de aspártico proteases; 3) as proteases de flores foram mais específicas para caseína bovina κ, o que provavelmente está relacionado com a ausência de sabor amargo no queijo produzido utilizando PP; 4) o queijo produzido com PP apresentou propriedades distintas do queijo coalho produzido com quimosina.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:03:04Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo1611_1.pdf: 1139279 bytes, checksum: 13fba9643abab60fece169537288d269 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os fungos queratinolíticos ocorrem em muitos habitats naturais e sintéticos. Estes microrganismos existem juntos a outros fungos que possuem uma baixa atividade pela queratina e utilizam principalmente os produtos de sua decomposição. Os objetivos do presente trabalho foram avaliar a capacidade queratinofílica e queratinolítica de fungos filamentosos isolados de amostras de água de piscinas e de solo dos filtros destas piscinas em parques aquáticos de Recife-PE, selecionar a linhagem mais promissora para a produção da queratinase, avaliar parâmetros de melhores condições para produção dessa enzima e incorporar as amostras ao acervo da Micoteca URM/UFPE. As culturas foram isoladas da água de piscinas e do solo dos filtros de piscinas do parque aquático I e apenas água de piscinas dos parques aquáticos II e III, utilizando-se as técnicas Hair Bait e diluição de água e suspensão de solo dos filtros em água destilada esterilizada. A identificação foi efetuada através de observações das características macroscópicas e microscópicas das colônias. Para selecionar a linhagem mais promissora foi utilizado o meio líquido contendo sais e pena de frango. O estudo das melhores condições de produção foi avaliado os seguintes parâmetros: temperatura, pH, tempo de produção, velocidade de agitação, concentração do substrato e quantidade do inóculo. As atividades queratinolítica e proteásica foram determinadas espectrofotometricamente a 280 e 440 nm, respectivamente. Utilizando as técnicas Hair Bait e diluição e suspensão e plaqueamento em superfície, foram isoladas 49 espécies de fungos provenientes da água e do solo dos filtros das piscinas do parque I, e 31 espécies provenientes da água do parque II e 33 do parque aquático III. Dentre as espécies estudadas para a atividade queratinolítica Paecilomyces farinosus apresentou o melhor resultado com 4,2 U/mL de atividade enzimática. As melhores condições para a produção de queratinases são: pH 7,8, 30 °C, 180 rpm, 2,0% de pena de frando, 105 esporos/mL por quatro dias. A condição adequada para se ter uma maior produção de proteases, com menor custo, seria com pH 6,2, 30 °C, 180 rpm, 2,0% de pena de frango, 105 esporos/mL por 4 dias. Em todas as amostras o resultado da atividade proteásica obtido foi menor que 1 U/mL, comprovando que para a degradação da queratina é necessário uma atividade proteolítica bastante específica. A água e o solo dos filtros das piscinas são ricos em fungos potencialmente patógenos ao homem

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-12-04T13:04:14Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese Parcial_Mircella Alecrim.pdf: 1183775 bytes, checksum: 1b7c8fa9fdd866f10828ff134fe2e253 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-12-04T13:04:39Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese Parcial_Mircella Alecrim.pdf: 1183775 bytes, checksum: 1b7c8fa9fdd866f10828ff134fe2e253 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-12-04T13:04:39Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese Parcial_Mircella Alecrim.pdf: 1183775 bytes, checksum: 1b7c8fa9fdd866f10828ff134fe2e253 (MD5) Previous issue date: 2017-09-14 / Milk-clotting proteases are important enzymes used in the dairy industry. Due to the increasing demand for cheese production, the increase in the price of animal rennet and cultural issues, the search for alternative coagulating sources, among them microbial, is necessary. The objective of this work was to investigate the production of coagulant proteases by Aspergillus flavo furcatis DPUA 1608 by the fermentation technology for the elaboration of cheese with macrofungo biomass. The culture was reactivated, authenticated and evaluated for the production of aflatoxins in solid medium. The inoculum medium was selected using SAB+GLI, SAB+SAC, BDA+GLI and BDA+SAC. The liquid fermentation medium was selected from a base saline solution (MA01). In the other media, 1% (w/v) glucose (MAGLi) and 1% (w/v) sucrose (MASac), respectively, were added. At the end of the fermentation, the biomass was separated from the crude extract by vacuum filtration. The medium and inoculum in which the best milk coagulant activity was determined were used to optimize the production of coagulant enzymes: carbon and nitrogen sources, inoculum age and size, fermentation time, temperature, agitation and initial pH of the medium. The enzymes of the selected crude extract were characterized as to pH and temperature (optimum activity and stability) and effect of inhibitors. In vitro cytotoxicity testing was also performed with the test on human fibroblasts and commercial sheep blood. At the end of the characterization, a cheese supplemented with mushroom biomass (Pleurotus ostreatoroseus) was elaborated and the physical-chemical and microbiological analyzes of the product were determined. The culture medium of the inoculum and fermentation medium that promoted higher milk coagulant activities were BDA+SAC and MA01, respectively. The milk coagulant enzymes were best produced in submerged fermentation medium according to the following parameters: age (5 days) and inoculum size (106 spores per ml medium), initial pH of the medium (pH 7), fermentation (3 days), fermentation temperature (30°C), stirring (150 rpm), carbon source (0.1% (w/v) starch and nitrogen (peptone 0.1% (w/v)). According to the proteolytic activity, the enzymes presented optimum activity at pH 7 at 50 °C. They were stable up to 40 °C and pH 5 to 9. The Zn2+ and Cu2+ ions promoted the greatest reduction of activity and iodoacetic acid was the inhibitor of higher interference. For the milk coagulant activity, the enzymes were more active at pH 7 and temperature of 45 °C. They remained stable from pH 5 to 9 and temperature from 25 to 55 °C. Zn 2+ and K + promoted increased activity and again iodoacetic acid was the inhibitor of greater interference, characterizing the enzymes as cysteine protease. There was no detection of toxicity according to the tests. The microbiological analisys is in agreement with the vigent legislation. The cheeses presented increasing in the amount of carbohidrates, protein, ashes and humidity according to the increasing of mushroom concentration. However, was also observed that the increasing in mushrrom concentration promoted the decreasing in the amount of lipids and also the total energy Aspergillus flavo furcatis DPUA 1608 has potential as microbial source of milkclotting enzymes and can be used in dairy industry to cheese manufacturing. / As proteases coagulantes do leite são importantes enzimas utilizadas na indústria de laticínios. Devido à crescente demanda para a produção de queijo associada ao aumento do preço do coalho animal e a questões culturais, as fontes coagulantes microbianas são alternativas ecologicamente viáveis. Esta pesquisa foi realizada para investigar a produção de proteases coagulantes por Aspergillus flavo furcatis DPUA 1608 e elaboração de queijo adicionado de biomassa de cogumelo comestível. Aspergillus foi reativado, autenticado e avaliado quanto à produção de aflatoxinas em meio sólido. Na escolha do meio sólido para cultivo do inóculo foi utilizado ágar glicose, peptona e extrato de levedura (SAB+GLI); ágar sacarose, peptona e extrato de levedura (SAB+SAC); ágar batata e glicose (BDA+GLI); e ágar batata e sacarose (BDA+SAC). Para selecionar o meio líquido para obtenção do inóculo e para produção do coagulante por fermentação submersa, os cultivos foram realizados em solução salina (MA01) formulada, separadamente, com glicose 1% (p/v) (MAGLi) e; sacarose 1% (p/v) (MASac), respectivamente. Ao término da fermentação, a biomassa foi separada do extrato bruto por filtração a vácuo. Nos meios de cultura selecionados foi realizada a produção de enzimas coagulantes para avaliar a influência das fontes de carbono e nitrogênio, idade e tamanho do inóculo, tempo de fermentação, temperatura, agitação e pH inicial do meio. O extrato bruto selecionado, de acordo com a atividade coagulante, foi caracterizado quanto ao pH e temperatura (atividade ótima e estabilidade) e efeito de íons metálicos e inibidores. Depois do processo de caracterização esse extrato bruto foi avaliado quanto à citoxicidade in vitro com o teste em fibroblastos humanos e sangue de carneiro comercial. O queijo foi elaborado com o coagulante caracterizado e adicionado de biomassa de cogumelo comestível (Pleurotus ostreatoroseus). Ao término do processamento, o queijo foi analisado quanto à qualidade nutricional e microbiológica. Todos os experimentos foram realizados em triplicata. Os resultados revelaram que Aspergillus flavo furcatis DPUA 1608 expressou fenótico típico da espécie e não sintetizou aflatoxinas em meio sólido. BDA+SAC e MA01, respectivamente, foram os meios de inóculo de cultivo submerso que promoveram maiores atividades coagulantes do leite. As condições que influenciaram na produção das enzimas coagulantes foram: inóculo com 5 dias de cultivo em meio sólido e, no meio de fermentação, suspensão celular de 106 esporos/mL de meio; pH 7; 3 dias de cultivo; 30°C; 150 rpm. As melhores fontes de carbono e nitrogênio foram amido 0,1% (p/v) e peptona 0,1% (p/v), respectivamente. As proteases apresentaram atividade ótima em pH 7, a 50°C. Elas foram estáveis até 40°C e em pH 5 ao 9. Os íons Zn2+ e Cu2+ promoveram a maior redução da atividade e ácido iodoacético foi o inibidor de maior interferência. As enzimas coagulantes do leite foram mais ativas em pH 7, 45°C e se mantiveram estáveis em pH 5 a 9, de 25 a 55°C. Os íons Zn2+ e K+ promoveram aumento da atividade e novamente ácido iodoacético foi o inibidor de maior interferência, caracterizando as enzimas como cisteína proteases. Tais enzimas não expressaram toxicidade. A análise microbiológica está de acordo com a legislação vigente. Os queijos produzidos apresentaram aumento do conteúdo de carboidratos, proteínas, cinzas e umidade associados à concentração do basidioma adicionado na massa do queijo. O aumento da concentração do cogumelo promoveu a redução do conteúdo de lipídeos e valor energético total. Aspergillus flavo furcatis DPUA 1608 tem potencial como coagulante de fonte microbiana para aplicação na fabricação de queijo.

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2014-11-10T17:07:26Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Cintia Ferreira da Paixão - 2002.pdf: 501587 bytes, checksum: f00ca727b973e5102f7af9c24d03a9ee (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2014-11-10T17:07:39Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Cintia Ferreira da Paixão - 2002.pdf: 501587 bytes, checksum: f00ca727b973e5102f7af9c24d03a9ee (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-10T17:07:39Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Cintia Ferreira da Paixão - 2002.pdf: 501587 bytes, checksum: f00ca727b973e5102f7af9c24d03a9ee (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2002-12-14 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The actinomycets are Gram-positive bacterias, aerobic with rich DNA in G+C (larger than 60%) and immobile. They are found practically in all the environment, forming ramified filaments or hyphae that persist in the mycelium form. The Streptomyces constitutes 90% of the isolated actinomycets of the soils, in spite of they are also found in aquatic atmospheres and interior of some plants. They stand out for the diversity of production of hidrolytics enzymes and antibiotics, 70% of the know antibiotics are produced by those microorganisms. Aiming to clone genes with biotechnological interest, a genomic libraries of the Streptomyces sp Y7 isolated of the soil of Cerrado was constructed. After the analyses of the sequences of the genomics libraries of Streptomyces sp Y7, it was selected a plasmid named pFS8, that displayed similarity with ftsH genes. The ftsH gene encodes a metalloprotease ATPase and Zn+2 dependent, belongs to the AAA family (ATPases associated with a variety of cellular activities). It is involved with several cellular functions such as secretory proteins export and degradation of transcriptional factors (sigma 32 and Lambda CII). The data of sequencing showed that the ftsH gene was incomplete. In order to characterize if the product of this gene showed biological activity, it was made tests to evaluate the functionality of the fusions proteins in an ftsH-negative E.coli strain AR3291. AR3291 cells transformed with this plasmid showed a general growth advantage upon the cells AR3291. The protein produced did not present toxicant effects for cells AR3289, which had normal ftsH gene. The truncated protein obtained was also analyzed to prediction of the structure “coiled-coil”, that is common to the other FtsH studied, and the results showed those truncated proteins did nor form “coiled-coil” structure. We also tested whether fusion proteins decreased or inhibited the defective transfer of citosolic proteins. / Os actinomicetos são bactérias Gram-positivas, aeróbicas e com DNA rico em G+C (mais que 60%). São encontrados em quase todos ambientes, formando hifas ramificadas que persistem na forma de micélio. Os Streptomyces constituem cerca de 90% dos actinomicetos isolados de solos, apesar de serem encontrados em ambientes aquáticos e no interior de algumas plantas. Os Streptomyces são grandes produtores de enzimas hidrolíticas e antibióticos, 70 % dos antibióticos conhecidos são produzidos por esses microrganismos. Com o objetivo de clonar genes de interesse biotecnológico, foi construída uma biblioteca genômica de Streptomyces sp Y7 isolado de solo de Cerrado. A partir das análises das seqüências das bibliotecas genômicas foi selecionado o plasmídeo pFS8 que apresentava homologia com o gene ftsH. O gene ftsH codifica uma metaloprotease ATP Zn2+ dependente, pertencente a família AAA (ATPases Associadas a diversas Atividades celulares). Os dados do seqüenciamento mostraram que o gene ftsH clonado estava incompleto. A fim de caracterizar o produto do gene ftsH, foram feitos testes para avaliar a funcionalidade dessas proteínas de fusão em células mutadas para o gene ftsH (AR3291). A proteína de fusão produzida por pFS9 é capaz de recuperar o crescimento das células AR3291 e a proteína produzida por pFS8 não apresenta efeitos tóxicos para células AR3289, que não têm mutação para o gene ftsH. Também foi analisado se as proteínas produzidas por pFS8 e pFS9 formam a estrutura “coiled coil” que é comum aos outros organismos estudados. Outra característica analisada nesse trabalho foi a capacidade da proteína produzida por pFS9 diminuir ou inibir a translocação anormal de proteínas para o meio externo. Os resultados mostram que essa proteína não inibe a translocação de proteínas para o meio externo, enquanto que a proteína produzida por pFS8 apresenta efeito contrário a proteína produzida por pFS9.